（遗传学专业论文）拟南芥中一个多氯联苯抗性基因的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 多氯联苯( p c b s ) 是一类典型的环境持久性有机污染物，具有极强的生物 累积性、难降解性和极大的生物毒性。利用植物修复p c b s 污染已逐渐成为热 门话题。研究p c b s 在植物体内的转化和降解途径，对于植物修复p c b s 污染 具有重要意义。 本实验室通过e m s ( e t h y lm e t h a n es u l f o n a t e ) 诱变得到了一个拟南芥抗多 氯联苯的突变体。本文以该突变体为研究对象，通过图位克隆定位突变基因； 通过高效液相色谱分析p c b s 在拟南芥内的羟基化；通过构建与p c b s 早期代 谢可能有关的基因的过量表达和干涉载体转化拟南芥，来研究p c b s 在拟南芥 体内的早期转化途径。 实验结果表明：1 ) 找到了突变的基因q u a l ( a t 3 9 2 5 1 4 0 ) 。该基因是一个 1 ，4 半乳糖醛酸转移酶基因，是果胶合成的关键基因，其突变引起半乳糖醛酸 和葡萄糖醛酸积累；2 ) 在拟南芥中检测到了o h p c b s ，证实了在拟南芥中p c b s 能被羟基化；3 ) u g t ( u d p 葡萄糖醛酸转移酶) 基因过量表达的转基因拟南 芥对p c b s 的抗性略弱于u g t 基因干涉株系；g a e 6 ( u d p 葡萄糖醛酸异构酶) 基因过量表达的转基因拟南芥对p c b s 的抗性略强于g a e 6 基因干涉株系； q u i t 过量表达株系对p c b s 的抗性明显下降，由此可以推测，p c b s 在拟南芥 中的早期代谢可能与半乳糖醛酸含量有关，半乳糖醛酸含量如何影响拟南芥对 p c b s 的抗性还有待下一步实验研究。 关键词：多氯联苯，拟南芥，图位克隆，羟基化，半乳糖醛酸 一i i 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ( p c b s ) a l eh i g l l l yp e r s i s t e n ta n dt o x i cs u b s t a n c e s ， a n da r ee x t r e m e l yb i o a c c u m u l a t i v e i ti sh o ti nt h ew o r l dt os t u d yh o wt ou s ep l a n t s t or f f n l o v et h ep c b si nt h ec n t i r o n m c n t a n di tw i l lb eu s e f u l lt ok n o wc l e a r l yh o w t h ep c b sb i o t r a n s f e ri np l a n t w cg a i nam u t a n t ，i n d u c e db ye m s ，w h i c hi sr e s i s t a n tt op o l y c h l o r i n a t e d b i p h e n y l s i nt h i sa r t i c l e ，t h em u t a n ti s s t u d i e di ns e v e r a lw a y s w em a pt h e r e s i s t e n e eg e n eb ym a p - b a s e dc l o n i n g ；d e t e c tt h eh y d r o x y l a t i o no fp c b sb yt h e m e a n so fh p l c ；o v e r - e x p r e s sa n dr n a i n t e r f e r et h er e l a t e dg e n e si nt r a n s g e n i c p l a n t st os t u d yh o wt h ep c b sb i o t r a n s f e ri np l a n t t h er e s u l t sa sb c l o w s ：1 ) w em a pt h em u t a t e dg e n e - q u a l ( a t 3 9 2 5 1 4 0 ) t h i s g e n ee n c o d ea1 ，4 - g a l a e t u r o n o s y l t r a n s f e r a s ew h i c hi sv e r yi m p o r t a n ti nt h e s y n t h e s i so fp e c t i n i nt h i sm u t a n t ，g a l a c t u r o n i ca c i da n du d p g l u c u r o n i ca c i da l e m o r et h a nu s u a l 2 ) w ed e t e c tt h eh y d r o x y l p c b si na r a b i d o p s i s ，a n di ta p p r o v e s t h a tt h ep c b sc a nb eh y d r o x y l a t e d 3 ) t h et r a n s g e n i cp l a n t sw h i c ht h eg e n e - u g t ( u d p g l u c u r o n o s y l t r a n s f c r a s c ) i so v e r e x p r e s s e d 伽g r o w b e t t e ri nt h e p c b s c o n t a i n e dp l a t e s ，a n ds od o e st h et r a n s g e n i cp l a n t sw h i c ht h eg e n e - g a e 6 ( u d p d g l u c u r o n a t e4 - e p i m e r a s e ) i si n t e r f e r e d b yc o n t r a r i e s ，t h et r a n s g e n i cp l a n t s w h i c ht h eg e n e - g a e 6i so v e r e x p r e s s e da n dt h eg e n e - u g ti si n t e r f e r e dg r o ww o r s e a n dt h et r a n s g e n i cp l a n t sw h i c ht h eg e n e q u a li so v e r e x p r e s s e da l s os h a w i n c r e a s e dr e s i s t a n c et op c b s o u rw o r kd e m o n s t r a t e st h a tg a l a c t u r o n i cp l a y sa i m p o r t a n tr o l ei nt h eb i o t r a n s f e ro f t h ep c b si nt h ep h n t t h ed e t a i lm e c h a n i s mw i l l b es t u d i e di nt h ef u t u r e k e y w o r d s ：p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ，a r a b i d o p s i s ，m a p - b a s e d c l o n e ， h y d r o x y l a t i o n ，g a l a c t u r o n i c 一i i i 一 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得迸姿盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：盔l 硐 签字日期：沙7 年易月f 厂日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解澎姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘鲎可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名哮包到积 签字日期：一了年6 月f 厂日 导师签名： 签字日期卅年石月岁，日签字日期孑侈1 年乡月，j 日 浙江大学硕士学位论文 致谢 本论文是在导师王君晖副教授的悉心指导下完成的。论文从选题、方案制 定到结果分析，每一个细节都凝结着导师的心血和智慧。三年来导师在学业上 给予我精心的指导，生活上关心和帮助我，这些都使我受益终生。导师所表现 出的对科学事业的执着追求，开拓创新的精神，严谨踏实的工作作风以及积极 进取的生活态度都令我钦佩，值得我永远学习。在论文完成之际，谨向导师致 以衷心的感谢! 在本论文的完成过程中，还得到了实验室朱睦元老师，韩凝老师，边红武 老师的指导和帮助，在此向几位老师表示感谢。实验室的各位同学，特别是林 伟强、王丽辉、金炜元、杨燕君、佘文静、朱宇斌、金海燕几位同学，在实验 上给予我极大的帮助，在我遇到困难时，帮我出谋划策，鼓励我，支持我，是 他们的帮助和支持使我度过难关，顺利完成本文。衷心感谢他们l 另外，要特别感谢浙大思源毒素中心的吴世华老师以及实验平台的陈云龙 老师。没有他们的大力支持和帮助，本文不可能顺利完成，在此由衷表示感谢! 最后，感谢我的父母，谢谢他们的养育之恩，谢谢他们一直支持我! 鲍烈明 2 0 0 9 年5 月 浙江大学硕士学位论文 第1 章文献综述 1 多氯联苯简介及其动植物毒性 多氯联苯( p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ，简称p c b s ) 是由一个或多个氯原子取 代联苯分子中的氢原子而形成的一类理化性质十分稳定的氯代烃类化合物( 毕 新慧等，2 0 0 1 ) ，曾作为电容器和变压器的绝缘油、蓄电池、复写纸、油墨、涂 料润滑剂、防火剂、粘结剂、石蜡扩充剂、燃料分散剂以及农药延效剂等被广 泛应用于电力工业、塑料加工业、化工和印刷业等领域( 林玉锁等，2 0 0 0 ) 。通 过废物排放、储油罐泄露、挥发和干湿沉降等原因进入环境，广泛积累于土壤、 水、沉积物和大气中，成为环境中最重要的污染物之一( a l e o c ke ta 1 ，1 9 9 5 ； w e t m i n g c ta 1 ，1 9 9 4 ) 。据有关资料估计，到目前为止，整个生物圈中残留的p c b s 约为1 o x l 0 8k g ( r o b i n s o ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。p c b s 可以通过食物链传递和浓缩富集 ( 江艳等，2 0 0 4 ) ，对人类健康危害极大( 石碧清等，2 0 0 5 ) 。由于p c b s 具有 强毒性、致癌性、致畸性和致突变性，p c b s 成为环境中广受关注的一类重要 的污染物，许多国家已把p c b s 列入优先控制的有机污染物名单。1 9 7 9 年，美 国国家环保局( u se p a ) 将p c b s 等七种工业混合物列入优先监测物黑名单。 2 0 世纪7 0 年代p c b s 被限制或禁止生产使用，2 0 0 1 年5 月被列为关于持久 性有机污染物的斯德哥尔摩公约1 2 种特别有害的持久性有机污染物( p o p s ) 之一( 余刚等，2 0 0 1 ) 。 p c b s 的植物毒性效应研究较少，但也有相关报道。近些年来的研究表明， p c b s 对植物的毒害作用体现在下述几个方面：1 ) p c b s 对植物植株生物量和 细胞生长有影响。桐花树( a e g i c e r a sc o r n i c u l a t u m ) 幼苗的茎高、茎径等生物 量在p c b s 处理下有明显提高( 刘亚云等，2 0 0 6 ) 。对于浮游植物，p c b s 能够 通过抑制细胞分裂降低藻类的生长速度( f i s h e re ta 1 ，1 9 7 5 ) ；2 ) p c b s 能够影 响植物的光合作用。一些藻类在p c b s 的处理下，碳素固定和同化下降导致光 合作用效率明显下降( e w a l de ta 1 ，1 9 7 6 ) 。p c b s 可以破坏叶绿体的超微结构， 降低藻类的叶绿素含量( m a h a n t y , 1 9 7 5 ) 。p c b s 还能够破坏膜功能，增加膜的 流动性，损伤藻类细胞及叶绿体和线粒体等细胞器超微结构，导致光合作用下 降；3 ) p c b s 还对群落结构有影响。暴露在p c b s 下的浮游植物群落结构会发 一1 一 浙江大学硕士学位论文 生改变( m o s s e re ta 1 ，1 9 7 2 ) 。4 ) 除此之外，还有少量的研究结果表明p c b s 对植物抗氧化酶活性有影响( 刘亚云等，2 0 0 7 ) 。另外，p c b s 污染下植物的突 变率明显提高，显示了一定的关联，不过并未得到明确证实。 p c b s 对动物的毒害作用研究较多，动物实验研究表明，生物毒性体现在 以下四个方面：1 ) 致癌性：国际癌症研究中心已将多氯联苯列为人体致癌物质， “致癌性影响”代表了多氯联苯存在于人体内达到一定浓度后的主要毒性影响。 1 9 9 2 年f a l c k 等人对6 3 名白种女性乳腺癌患者进行了乳房组织切片检查，结果 表明组织中的p c b s 平均浓度比正常人高5 0 6 0 ，且此差异性具有统计学意义 ( k n e r re ta 1 ，2 0 0 6 ) 。2 ) 生殖毒性：p c b 能使人类精子数量减少、精子畸形的 人数增加，人类女性的不孕现象明显上升。有研究发现，女性受孕能力下降可 能与食用大量被p c b s 污染的鱼类有关( b u c ke ta l ，2 0 0 0 ) 。女性体内p c b s 的 浓度与流产、早产的发生几率呈正相关( a t s d r , 2 0 0 0 ) 。接触p c b s 可能影响 子代性别比例( 李霜2 0 0 5 ) 。3 ) 神经毒性：p c b 能对人体造成脑损伤、抑制 脑细胞合成、发育迟缓、降低智商( 李霜，2 0 0 5 ) 。4 ) 干扰内分泌系统：有研究 表明有p c b 暴露的人比无暴露的人的血清中的甲状腺素体积明显要高( e m m e t t e ta 1 ，1 9 8 8 ；l a n g e re ta l ，1 9 9 8 ；o s i u se ta l ，1 9 9 9 ) 。 2 植物修复多氯联苯污染 如何去除环境中的p c b s ，已经成为人们普遍关注的问题。传统去除p c b s 的方法主要有物理方法、化学方法和微生物方法。常规的物理和化学修复技术 成本太高，一般可以用于点源污染的治理，不适合大范围推广；微生物技术可 广泛用于点源和面源污染的治理与修复，但需要的条件比较苛刻，首先特定的 微生物只能降解特定的p c b s ( c h a n ge ta 1 ，1 9 9 2 ) ，其次需要较高的p c b s 浓度 以维持群落的稳定性，再次微生物活性受环境条件的影响太大，对p c b s 的降 解能力很不稳定( 李森等，2 0 0 4 ) 。植物修复由于具有上述方法没有的优点，因 此在众多的修复方法中，越来越显示出优势，引起了研究者的广泛关注。 植物修复( p h y t o r e m e d i a t i o n ) 技术是指利用植物及其根际微生物去除、转化 和固定土壤、底泥、地下水、地表水以及大气中的有毒化合物的一种新兴技术 ( s u s a r l ae ta 1 ，2 0 0 2 ) ，是当前生物修复( b i e m e d i a t i o n ) 研究领域中的热点。与 其它环境污染处理技术相比，植物修复具有很多优点如操作比较简单、投资相 - - 2 - - 浙江大学硕士学位论文 对较低、生态风险小、对人类和环境副作用小( 钟哲科等，2 0 0 1 ) 。植物修复仅 需太阳能驱动，使其能量消耗和费用都大大减少；不需要特定的处理场地，原 位就可以永久清除污染物，对于浅层轻度污染的区域非常有效( s c h n o o re ta 1 。 1 9 9 5 ) ；即使一些环境污染物在植物体内大量积累，也可以通过转移植物而清除 ( 夏会龙等，2 0 0 3 ) ，在环境保护中具有重要的理论价值和广阔的应用前景( 旷 远文等，2 0 0 4 ) 。植物修复对于重金属和放射性核污染、有机污染物中的氯代化 合物、炸药和石油烃等所造成的污染，有显著的修复效果。近年来，许多学者 开始研究植物对不易降解的有机污染物如多氯联苯( p c b s ) 和多环芳烃( p h a s ) ( e p u r ie ta 1 ，1 9 9 7 ；s h i m pc ta 1 ，1 9 9 3 ) 等的修复潜力，并取得了不小的成绩。 植物修复有机污染物的机理主要是利用植物对有机污染物的吸收及根际圈 较强的降解、固化作用( 魏树和等。2 0 0 3 ) ，而植物修复p c b s 的机理相对来说 比较复杂。它可能涉及到多种机制的协同作用，但一般来讲，植物修复p c b s 主要有3 种机制：直接吸收p c b s ，并将其转化为非植物毒性的代谢物累积于 植物组织中或直接降解成无害的无机物；释放促进p c b s 降解的酶；植物与根 际微生物的联合作用加速p c b s 的降解。 2 1 植物直接吸收和转化p c b s 植物通过自身的新陈代谢活动来实现对有机污染物的吸收、转化和代谢。 目前所知，植物代谢有机污染物的方式与微生物不同，通常是化合物首先被激 活，然后被共轭，最后被贮存于植物组织中( l e ee ta 1 ，1 9 9 2 ；m a c e ke ta 1 ，2 0 0 0 ) 或进一步代谢。由于p c b s 存在多种同系物，使得植物代谢p c b s 的情形变得 更为复杂( r y s l a v ac ta 1 2 0 0 3 ) 。p c b s 被植物吸收后，植物细胞代谢p c b s 至 少可以通过以下5 种可能的途径( e s t i m e 。1 9 9 9 ) ( 图1 1 ) ：1 ) 被植物细胞色 素酶( p - 4 5 0 ) 羟基化后，产物被排到细胞外空间或进行下一步反应；2 ) 进行糖 基化，化合物被储存在液泡中或进一步代谢；3 ) 部分被代谢，代谢物能作为植 物细胞的组成成分；4 ) 不完全的代谢产物可以形成其他的产物被植物利用；5 ) 进一步可以矿化为c o s 和h 2 0 释放。 学术界的研究表明，p c b s 先被吸收进入植物体内，然后进行代谢。一贯 的观点是代谢过程可能是分以下几步进行的：第一步是羟基化，第二步是羟基 化合物被共轭，主要是被一些亲水基团共轭，很有可能是糖基化( b u t l e re ta 1 ， 一3 一 浙江 学碰学位论文 1 9 9 2 ；w i l k e ne t 缸，1 9 9 5 ) 。第三步可能是共轭化合物被植物利用，或者储存， 或者被进一步处理，被植物体内的一些酶分解，这些酶可能涉及过氧化物酶、 漆酶、双加氧酶等酶系，目前这一步及其以后的过程都处在研究阶段，机理尚 不清楚。但是，最近的实验表明，羟基化的p c b s 被甲基化成为甲基羟基- p c b s ( r e z e k 眦m 2 0 0 8 ) 。一一 二五晶 已丑o 圈1 - | ：p c b s 在檀物中的降解造径推蔫。实线衰i b 证实存在虚蟪表示未经实。其中关于糟 萋化的过程是a 是葡萄糖醛融化存在疑问，学术界还没有证实 w i 墩e n 等用1 4 c 标记的p c b l 来大豆细胞组织培养中的代谢过程，结果在 酸解大豆组培代谢“c p c b l 的产物中，检测到1 种二羟萋和6 种不同的单羟 基化合物( w i l k e n d d ，1 9 9 5 ) ：用”c 标记的p c b 5 2 来研究在小麦细胞组织培 养中的代谢过程，结果在水解小麦细胞组培代谢“c f c b 5 2 的产物中，发现4 种单羟基和3 种二羟基化合物。k u c e m v a 等研究发现p c b s 被龙葵的根毛吸收 4 由 浙江大学硕士学位论文 后，单氯联苯的代谢产物为单羟基氯代联苯和双羟基氯代联苯，二氯联苯的代 谢产物为单羟基二氯联苯( k u c e r o v a e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 r e z e k 等利用烟草w s c 3 8 愈伤组织作为实验材料，用质谱气相色谱究烟 草愈伤组织内的p c b s 代谢过程，发现了羟基化的多氯联苯，以及甲基羟基 多氯联苯，并因此认为是o 转甲基酶( o m t s ) 参与了羟基多氯联苯的后续代 谢( r e z e ke ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 目前为止，关于植物中羟基多氯联苯的糖基化过程目前还没有明确报道， 但是在动物研究中，羟基多氯联苯被葡萄糖醛酸化已经被证实，这是我们在植 物研究中可以借鉴的。 2 2 酶在p c b s 降解过程中的作用 酶在p c b s 的代谢过程中起着巨大的作用，没有各种酶的参与，就没有p c b s 的代谢。植物中的一些常规酶系可以增加p c b s 的可溶解性( s a n d e r m a n n , 1 9 9 2 ) ，从而增加了它们被吸收利用的可能性。植物对p c b s 的转化是通过植物 体内的羟基化酶、糖基化酶、o 甲基化酶以及各种过氧化物酶来进行的( m a c e k c ta 1 。1 9 9 8 ) ，可能还涉及到漆酶，双加氧酶等。细胞色素酶p 4 5 0 能代谢p c b s ， 使其转化为羟基化p c b s ( p u r le ta 1 ，1 9 9 7 ；s t i b o r o v ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。糖基化酶在动 物实验中被证实是葡萄糖醛酸转移酶，植物中还没有明确报道。近期的实验表 明，植物中羟基化的p c b s 会被甲基化，o 甲基化酶参与了p c b s 在植物体内 的代谢过程。 目前的研究证实，过氧化物酶是植物代谢p c b s 的主要酶( c h r o m ae ta 1 ， 2 0 0 2 ；k o l l e re ta 1 ，2 0 0 0 ；s t i b o m v ae ta 1 ，2 0 0 0 ；s t i b o r o v ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。过氧化物酶 是由许多具有特异性的酶作用物组成的酶系( s t i b o r o v ae ta 1 ，2 0 0 0 ) ，它的总活 性是几种过氧化物同工酶联合活性的表现( m a c e ke ta 1 ，1 9 9 6 ) 。研究表明，从 植物中分离出的过氧化物酶能代谢p c b s ，代谢产物有氯代羟基联苯、羟基联 苯、氯代三联苯、氯苯和安息香酸等( c h r o m ae ta 1 ，2 0 0 3 ；k o l l e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 k u c e r o v a 等的研究表明p c b s 在植物体内的含量高低与过氧化物酶的含量有明 显关系，过氧化物酶含量越高，p c b s 含量越少，证明过氧化物酶降解了p c b s ( k u c e r o v ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。m a c k o v a 等在研究植物细胞对p c b s 的生物降解中也 发现，一些过氧化物同功酶参与了p c b s 的代谢( c h r o m ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 一5 一 浙江大学硕士学位论文 除了过氧化物酶外，还有一些酶对p c b s 的降解起着重要作用。白腐菌对 p c b s 的降解实验证明，木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶以及双加氧 酶在p c b s 的降解过程中起到重要作用( f u j i h i r oe ta 1 ，2 0 0 9 ) 。通过基因的同源 性比对，植物体内也存在着这几种酶，p c b s 在植物体内的代谢是否涉及到这 些酶具有研究价值。 植物不仅可以通过酶的作用在自身体内代谢p c b s ，还可以释放酶到环境 中，这些酶或者具有明显的催化作用，可直接降解p c b s ，或者可以促进根际 微生物群降解p c b s ( c u n n i n g h a me ta 1 ，1 9 9 3 ；w e n z e le ta 1 ，1 9 9 7 ) 。脱氢酶就是 这样一种酶。c h e k o l 等的研究表明，植物的存在显著提高了土壤中脱氢酶的活 性，从而提高了土壤中p c b s 的生物降解水平( c h e k o le ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 表1 1 ：在p c b s 降解过程中起作用的酶 p c b s 代谢第一步第二步后续步骤 酶的种类羟基化( o h - )糖基化甲幕化分解 细胞色素酶p 4 5 04 ( 动植物中均有) u d p 葡萄糖醛酸4 ( 动物中有报道， 转移酶植物中未见报道， 推测) 口甲基化酶 ， 木质素过氧化物酶，( 白腐菌) 锰过氧化物酶4 ( 白腐菌) 漆酶4 ( 白腐菌，直接 作用o h p c b s ) 双加氧酶4 ( 白腐菌) 脱氢酶 4 ( 植物根际微生 物中) 2 3 植物与根际微生物的联合作用 根际是受植物根系影响的根土界面的一个区域，是植物土壤微生物与其 环境条件相互作用的场所( 王书锦等，2 0 0 2 ) 。根际与无根系土体的区别在于受 一6 一 浙江大学硕士学位论文 植物根系代谢活动的影响，微生态环境更适合于环境微生物的生存和繁殖 ( s c h n o o re ta 1 ，1 9 9 5 ) 。一方面，植物根系巨大的表面积为微生物提供了寄宿 之处，使植物根际微生物的数量明显多于周围土壤( 吴辉等，1 9 9 3 ) ；另一方面， 植物向根系输送氧气和释放根系分泌物( 糖类、氨基酸、有机酸、脂肪酸、甾 醇、生长素、核苷酸、黄烷酮及其他化合物) ( j a v o r s k ie ta 1 ，2 0 0 9 ) ，其中有些 分泌物( 如酚类、有机酸、醇、氮) 可以为那些能降解有机污染物的微生物的 生长和存活提供充足的养分( b e t t s ，1 9 9 8 ) ，因而能促进微生物的生长、繁殖和 代谢活动( c u n n i n g h a me ta 1 ，1 9 9 5 ；s c h n o o re ta 1 ，1 9 9 5 ) 。植物根系分泌物中的 某些化合物，如类黄酮、酚类和萜烯等能以联苯一样的方式，作为微生物的生 长基质，促进微生物对p c b s 的降解( d o n n e l l ye ta 1 ，19 9 4 ；g i l b e r te ta 1 ，19 9 8 ； h e r n a n d e ze ta 1 ，19 9 7 ；t a n d l i c he ta 1 ，2 0 01 ) 。 c h e k o l 等的研究表明，植物的存在明显提高了土壤中微生物的数量和活 性，进而提高了土壤中p c b s 的降解水平( c h e k o le ta 1 2 0 0 4 ) 。m e h m a n n a v a z 研究了根际土壤中的p c b s 在植物微生物土壤的相互作用下的生物转化效应， 最后他们得出植物根系和微生物的联合作用能促进被p c b s 污染的土壤的修复 的结论( m e h m a n n a v a ze ta 1 ，2 0 0 2 ) 。s i n g e r 以及t a n d l i c hr 的研究都证明了植 物的存在增加了p c b s 的生物降解效果( s i n g e re ta 1 ，2 0 0 3 ；t a n d l i c he ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。 目前人们还只考察了为数不多的植物品种对p c b s 的降解能力，而且研究 重点也集中在植物对p c b s 降解的效果方面，对在植物体内降解p c b s 的过程 和分子机理研究还不够深入。拟南芥作为模式生物，其基因组序列已经全部测 序完成，所有基因都已标记清楚，因此在分子机理的研究上有独特的优势。我 们可以通过基因芯片辨认在p c b s 代谢过程中被上调的基因，通过生物信息学 研究结合动物和微生物实验分辨哪些基因在p c b s 代谢中起到关键作用，再通 过转基因等生物工程手段调整相关基因的表达量来达到高效清除p c b s 的效 果。 3 多氯联苯在动物和微生物中的转化 鉴于p c b s 在动物中的初期转化以及在微生物中的降解研究都比较深入， 了解p c b s 在动物和微生物中的转化过程对研究植物修复p c b s 有很重要的借 一7 一 浙江大学硕士学位论文 鉴意义。 3 1 p c b s 在动物中的早期生物转化 相比于植物，人们对p c b s 在动物体内的转化途径就研究得比较深入。目 前，p c b s 在动物体内的早期转化途径已经清楚，通常来说，p c b s 在动物体内 的早期转化途径主要涉及两个步骤：1 ) p c b s 吸收后被细胞色素p 4 5 0 转化为 羟基- p c b s ；2 ) 羟基p c b s 被糖基化，这个步骤基本上是被确认为葡萄糖醛酸 化。 h a r a g u c h i 在研究p c b s 在小鼠组织中的代谢物时，发现了p c b s 被羟基化， 并且存在于各个组织( 血液，肝等) 中( h a r a g u c h ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 。k a t o 在研究 p c b s 对小鼠血清中甲状腺素水平是否有影响时，检测到了羟基化的p c b s ，表 明p c b s 被羟基化( k a t oe ta 1 ，2 0 0 4 ) 。p c b s 被羟基化有可能是p c b s 对动物产 生毒性作用的第一步，也是p c b s 在动物体内代谢开始的第一步。 d a i d o j i 等在研究小鼠肝脏等器官对p c b s 的毒性反应的时候，发现了 o h p c b s 被糖基化( d a i d o j i c ta 1 ，2 0 0 5 ) 。他们通过在酵母a h 2 2 中表达u g t 基因( u g t l a l 、u g t l a 3 、u g t l a 5 、u g t l a 6 、u g t i a 7 、u g t 2 8 1 、u g t 2 8 3 和u g t 2 8 1 2 ) ，并对它们在o h p c b s 进行暴露处理，检测到了糖基化的p c b s ， 证明了在小鼠中，o h p c b s 可以被u d p 一葡萄糖醛酸转移酶进行糖基化。j a m e s 等斑用点叉尾鲴( c h a n n e lc a t f i s h ) 作为实验材料，用1 4 c 标记葡萄糖醛酸，最 后在动物肝和肠中检测到了带有1 4 c 的糖基p c b s ，证实了o h p c b s 被u g t 催化进行了葡萄糖醛酸化( j a m e se ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 3 2 微生物降解p c b s 微生物降解是生物修复( b i o r e m e d i a t i o n ) p c b s 污染的主要手段。目前对 微生物降解p c b s 的研究已经比较深入，主要的降解机制也基本达成了共识( 赵 晓祥等，2 0 0 7 ) ，基本上是通过以下途径实现降解p c b s ：首先是高氯代的p c b s 通过厌氧微生物进行脱氯，变成低氯代p c b s ，其次低氯代p c b s 通过加氧酶的 作用，分子氧在p c b s 的无氯环或带较少氯原子环上的2 ，3 位发生反应，形成 顺二氢醇混合物。其中主要产物为2 ，3 二羟基4 苯基- 4 ，6 二烷烃。二氢醇经 过二氢醇脱氢酶的脱氢作用，形成2 ，3 二羟基联苯。然后，2 ，3 二羟基联 一8 一 浙江大学硕士学位论文 苯通过2 ，3 二羟基联苯的双加氧酶的作用使其在l ，2 位置断裂，产生间位开 环混合物( 2 羟基- 6 - 氧6 苯一2 ，4 二烯烃) 。间位开环混合物由于水解酶的作用使 其发生脱水反应生成相应的氯苯酸( s y l v e s t r e ，1 9 8 5 ) 。 ho h c l c i c l c l c l c l c l c l c l 图l - 2 s 徽生物中p c b s 降解机理 微生物降解p c b s 的过程，实质上是各种酶作用的结果。除上述提到的加 氧酶、脱氢酶、双加氧酶、水解酶等在p c b s 降解中起作用外，白腐菌分泌的 木质素过氧化物酶也能分解p c b s ，但是这种酶只能在碳源和氮源受到抑制时 才能分解p c b s ( l a j o i ee ta 1 ，1 9 9 4 ) 。白腐菌分泌的另一种酶漆酶，也能分解 p c b s ，这是最近发现的一种能分解p c b s 的酶( f u j i h i r o e ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 4 结语 p c b s 对环境存在着巨大危害，对p c b s 污染的环境进行修复，已日趋成为 国内外的研究焦点。在众多的修复方法中，p c b s 的植物修复越来越显示出其 独特的优势。植物不仅本身能从环境中吸收、积累与降解p c b s ，而且能通过 促进根际微生物的活动加速p c b s 的生物降解，因此是比较有前途的修复p c b s 的技术之一，但由于植物修复是一个崭新的研究领域，国际关于植物修复p c b s 的研究还处于起步阶段，降解的机理尚不清楚，利用拟南芥这一模式植物，借 鉴p c b s 在动物和微生物中的降解途径，对p c b s 降解机理进行研究，对植物 修复p c b s 污染有很好的指导意义。 一9 一 乎建 浙江大学硕士学位论文 1 实验材料和试剂 第2 章实验与方法 1 1 实验材料 拟南芥：c 0 1 0 型，w s 型 1 2 试剂和仪器 试剂： d n a 提取：2 x c t a b 缓冲液，氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，异丙醇、7 0 酒精， 无菌蒸馏水 质粒小提：溶液i ，i i ，i i i ，氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，t er n a s e 溶液 p c r ：d n t p s ，1 0 xb u f f e r , m g c l 2 ，t a x id n a p o l y r n e r a s e ，引物文中具体列出 e n t r y 以及l r 反应：e n t r y 反应试剂盒，l r 反应试剂盒 质粒转化大肠杆菌以及农杆菌制作：大肠杆菌t o p l 0 感受态，农柑菌 g v 3 1 0 1 感受态，l b 培养基( 固，液) ，s p ( 盐酸壮观霉素) ，k a n ( 硫酸卡那 霉素) ，利福平 转基因试剂：真空浸润液，表面活性剂 种子发苗试剂：b 5 培养基( 固) ，1 0 n a c i o ，7 0 酒精，p c b 2 8 ( 2 ，4 ，4 ) ， p c b l 8 ( 2 ，2 ，5 ) ，o h p c b ( 4 o h 2 ，2 ，5 ) 提取叶绿素：8 0 丙酮 仪器：6 5 。c 水浴锅，3 7 。c 水浴锅，3 7 c 水浴锅，紫外分光光度仪，可见光 分光光度仪，真空泵，p c r 仪，超净工作台，高效液相色谱仪 2 实验方法 所有分子生物学实验按分子克隆手册或产品说明书操作。 2 1 突变体的获得 本实验室制作了拟南芥e m s 突变体库，有2 0 个p o o l 。取2 0 个p o o l 一定 比例的种子( w s 背景) ，放在干净的1 5m le p p e r d o r f 管，先用7 0 乙醇泡3 m i n ， 再用l o n a c l 0 泡1 0 m i n ，然后用无菌水洗涤5 遍，最后用2 0u l 枪头点在 一10 浙江大学硕士学位论文 b 5 培养基上。封好的培养皿在4 c 冰箱春化2 天后，放到组培室光照培养，8 天后观察表型。在第5 号p o o l 发现拟南芥地上部分愈伤化的突变体，并且移到 土中，不育致死。把5 号p o o l 的其他苗都种在土中，找突变体携带者。其他苗 成熟收种子再发苗发现在第5 3 个培养皿是突变体携带者，突变体占到1 4 ，是 隐性突变。因其在p c b s 上显示抗性，命名为p c b l 突变体。 2 2 突变体作图群体的得到 突变体携带者回交3 次，再与拟南芥生态型( c 0 1 0 ) 杂交。得到f 2 发苗 挑选突变体。 2 3 作图群体混合样品基因组d n a 的提取 挑取1 0 0 株差不多大小的小苗，吸干水分。 加液氮至研钵四分之三处，同时用研磨棒轻压组织，将其压碎。等液氮快 干时，迅速研磨。再加液氮研磨一次后，将粉末装入1 5 m le p p e n d o r f 管中。 加入7 0 0 j t 1 6 5 c 预热的2 x c t a b ，混合均匀。 6 5 。c 水浴一个小时以上，期间颠倒e p p e n d o r f 管一次，使组织重悬。 加入等体积的氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，轻轻颠倒几次混匀，1 2 0 0 0r p m 离 心1 0 m i n ，除去蛋白质。 同上操作，再用氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 抽提一次。 取上清，加入等体积的预冷的异丙醇，- - 2 0 c 冷冻3 0 m i n 以上。1 2 0 0 0 r p r a 离心1 0 m i n ，沉淀d n a 。 弃去上清，加入l m l7 0 的酒精洗涤d n a ，之后室温晾干。 加入2 0 mt er n a s e ，3 7 保温2 h ，除去r n a 。 测定d n a 浓度后，取一部分稀释到2 0 0 n g l _ d 保存到4 c ，剩余的一2 0 冻存。 2 4 作图群体单株苗基因组d n a 的提取 用镊子夹取一株p c b l 小苗，擦去根部培养基后，放入1 5i n l 的e p p e n d o r f 管中，置于冰浴。 用自制的研磨棒先对小苗进行轻微研磨，然后加入5 0 p l6 5 。c 预热的2 c t a b 进行充分研磨，最后加入2 5 0 1 x l2 x c t a b ，并用其冲洗研磨棒。 一1 1 浙江大学硕士学位论文 小心将磨碎的组织与c t a b 混匀后，6 5 保温1 h 。期间每隔1 5 m i n ，小 心颠倒e p p e n d o r f 管一次，将植物组织再次重悬。 加入3 0 0 p 1 氯仿，轻轻颠倒几次混匀，1 2 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，吸取上清到 新的e p p e n d o r f 管中。 向上清中加入两倍体积( 6 0 0 “1 ) 的异丙醇，- - 2 0 冻存6 0 m i n 。 1 2 0 0 0 r p m 离心i o m i n ，沉淀d n a ，弃去上清。 用7 0 的酒精冲洗沉淀后，室温晾干。 加入3 0 dt er n a s e ，3 7 保温2 h ，除去r n a 用紫外分光光度仪测取d n a 样品浓度，稀释到2 0 0 n g p l ，4 c 保存备用。 2 5 利用1 0 0 株苗的混合d n a 进行粗略定位 s s l p 标记的p c r 扩增( 具体反应体系见表2 - 1 至表2 - 4 ，引物及退火温 度见表2 1 0 ) ： 反应采用2 0 p l 体系，其中m g c l 2 浓度随引物对不同而有所变化。 表2 - 1 适用标记：f 2 1 m 1 2 ( 1 - 1 ) ，n g a l 7 2 ( 3 - + ) ，n g a l 6 2 ( 3 1 ) ，n g a 8 ( 4 - + ) ， c i w 6 ( 4 - 1 ) ，d w 7 ( 4 2 ) ，p h y c ( 5 2 ) ，n g a l 3 9 ( 5 - + ) 2 0 0 r i gt e m p l a t ed n a 10 1 _ l i mp r i m e r l o b u f f e r 1 0 m mm 们田s 2 5 m m m p 5 0 p lt a qd n ap o l y m e r a s e d d h 2 0 l p i 0 5 + o 5 p l 2 p l 0 5 p l 1 6 t t i 0 2 p l 1 3 7 m t o t a lv o l u m e 2 0 p l 表2 - 2 适用标记：c i w l l ( 3 2 ) ，c t r i 2 ( 5 一1 ) 2 0 0 n gt e m p l a t ed n a 1 0 t r i mp r i m e r l o b u f f e r 1 0 m mm q t p s 2 5 m m m 矿 5 0 i _ t lt a qd n ap o l y m e r a s e d d h 2 0 l m 0 5 。卜o 5 p l 2 p l 0 5 i t l 2 o i l l 0 2 p l 1 3 3 p l t o t a lv o l u m e 2 0 t