（遗传学专业论文）草莓体外培养再生机理及遗传转化的研究.pdf

塑查兰堡主兰竺堡兰一一 摘要 植物组织培养技术是植物体细胞遗传学的基础，对理论基础研究和植物基因工程以及农 作物品种改良等都有重大的意义。离体诱导和培养愈伤组织具有多种用途。方面可研究植 物生长发育及分化的机制、遗传变异规律；另一方面可作为植物基因工程的受体材料，生产 有价值的药用蛋白质。本研究建立了一套完整的草莓愈伤组织再生体系，探讨其分化的生理 生化基础，以及小鼠e g f 基因克隆及其植物转基因研究，主要结果如下。 一、草莓体外再生体系的建立 采用不同的植物生长调节物质( 生长素和细胞分裂素) 的浓度及其组合以及不同的光照 条件对草莓的多种外植体，如叶片、叶柄、根段、芽尖等，进行愈伤组织的诱导，产生了3 类在外形、颜色、质地、生长速率、分化能力等方面具有明显差异的愈伤组织，即松软、湿 润、灰白色的l 型，颗粒状、紧实呈浅黄色的u 型和绿色致密的l l i 型。i 型愈伤组织生长 快，但分化率低，并能在一定条件下转变为i i i 型。i i i 型具有较高的分化能力。并且通过对 它们分化过程的观察发现，其形态建成的方式是直接的器官发生，而不是通过体细胞胚的发 生再生植株。 同时，研究了激素、外植体、光照条件等因素对草莓体外培养的影响，发现产生的愈伤 组织的形态主要与培养基中的激素种类和光照条件有关，而与外植体来源无明显相关性。 二、愈伤组织分化的生理生化基础分析 主要研究了不同类型愈伤组织及其分化过程中和继代培养中的糖类、蛋白质及活性氧和 抗氧化酶活性的变化。 ( i ) l 型愈伤组织含有较高的可溶性糖，而i i 型和型则具有相对较高的蔗糖含量。 愈伤组织器官发生过程中，可溶性糖和蔗糖含量均呈现下降趋势。继代过程中可溶性总糖含 量无明显变化蔗糖含量在培养1 5 周后迅速下降。三类愈伤组织蛋白质含量差异显著，l i 型和i i i 型中的含量约是i 型中的6 倍。分化过程中蛋白质含量逐渐上升，s d s p a g e 表明 芽分化和根分化的愈伤组织中蛋白质合成量显著增强；继代培养中i i 和i i i 型愈伤中蛋白质 含量有平缓下降趋势。i 型愈伤组织中则下降较快。同时，在继代培养过程中，愈伤组织的 形态发生能力下降，i 型愈伤组织逐渐失去再生能力。这些实验结果表明，愈伤组织的再生 能力与可溶性糖的含量无关，而与蔗糖、蛋白质的含量有明显相关性。 i 浙大学博士学位论文 ( 2 ) 三类愈伤组织在活性氧代谢方面表现出极大的差别。j j 和l i l 型初生愈伤组织h 2 。2 的含量分别是i 型的5 倍和9 倍，0 2 的释放速率是3 倍和4 倍，并且具有较高的抗氧化酶 ( s o d ，c a t 、p o d ) 活性，特别是s o d 的活性，在初生i i 型愈伤组织是高达9 9 0uh “f f w ，而在i 型中只有3 6uh i 1f w 。在愈伤组织分化过程中，h 2 0 2 的水平先升高后下降， 0 2 释放速率一直下降，s o d 话性的变化趋势同h 2 0 2 一致，c a t 活性一直下降而p o d 先 降后升。培养基中添加外源h 2 0 2 能在一定程度上提高愈伤组织的再生率，而s o d 的抑制剂 d d c 则使再生率下降。 另外，在1 8 周的继代培养中，也观察到所有类型愈伤组织中h 2 0 2 含量缓慢上于 ，0 2 一 释放速率较快增长，尤其是在l 型中，培养1 8 周后其速率己明显高于1 1 型和1 1 1 型。同步检 测抗氧化酶活性，发现其活性呈现降低趋势，特剐是i 型愈伤组织在培养1 2 周时己；9 i ! 不到 s o d 的活性。这说明内源h 2 0 2 在愈伤组织的分化中起着重要作用，并且定水平的外源 h 2 0 2 能促进植物细胞的再分化。并推测，继代培养中活性氧与抗氧化酶之间的不平衡所造 成的氧化胁迫对细胞正常的代谢、生长和发育产生破坏性的影响，与其分化能力的降低存在 着直接的相关性。 综上所述，对于草莓愈伤组织的再生，活性氧可能起着双重作用，一方面，一定浓度的 活性氧对愈伤组织的再生起促进作用，甚至是启动再生过程所必须的；另一方面，培养中高 水平的活性氧可能叉会对细胞造成氧化胁迫，从而抑制愈伤组织的再生潜能。 三、小鼠e g f 基因克隆及其植物转基因研究 从小鼠肾组织中提取总r n a ，用e g f 基因的下游引物将其反转录为c d n a 第一链，利 用r t - p c r 的方法克隆到长约1 7 0 b p 的编码成熟e g f 蛋白质的基因序列，并将其构建到克 隆载体p u c l 8 中，序列分析表明所得到的片段与文献报道的小鼠e g f 基因序列完全一致。 构建了e g f 基因的植物表达载体：p c a m b i a - e g f 和p b l l 2 1 e g f 。通过农杆菌转化法得到 了转基因烟草再生植株，转基因草莓的研究仍在进行中。 关键词：愈伤组织，再生能力，糖类，蛋白质，活性氧，抗氧化酶，e g f 基因，草毽 烟草 i f ：塑奎兰堕圭兰堡笙苎 a b s t r a c t p l a n tt i s s u ec u l t u r ei sv e r yi m p o r t a n tf o rt h es o m a t i cg e n e t i c s ，a n di tc a nb eu s e d n o to n l yt os t u d yo nt h em e c h a n i s mo fg r o w t h ，d e v e l o p m e n ta n dd i f f e r e n t i a t i o no f p l a n tc e l l ，b u ta l s ot op r o d u c tv a l u a b l ep r o t e i na sb i o r e a c t o ra n d t oi m p r o v ec r o pi n b r e e d i n g i nt h i ss t u d y , p l a n tr e g e n e r a t i o nt h r o u g ho r g a n o g e n e s i so f s h o o tb u df r o m c a l l u sc u l t u r e so f s t r a w b e r r yw a se s t a b l i s h e da n d t h em e t a b o l i s mo f s u g a r , p r o t e i na n d r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) w a si n v e s t i g a t e di no r d e rt ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s m o fd i f f e r e n t i a t i o no fp l a n tt i s s u ea n dc e l li nv i t r o i na d d i t i o n ，t h ec l o n i n go fe g fg e n e a n di t st r a n s f o r m a t i o nt ot h et o b a c c oa n ds t r a w b e r r yc a l l u sw e r ec a r r i e do u t t h em a i nm a i n r e s u l t sa r ea sf o l 】o w s ； 1 t h ee s t a b l i s h m e n to fp l a n tr e g e n e r a t i o ns y s t e mt h r o u g ho r g a n o g e n e s i sf r o m c a l l u sc u l t u r e so f s t r a w b e r r y t h r e et y p e so fc a l l u sc e l ll i n e sw e r ee s t a b l i s h e dd u et ot h eg r o w t hr e g u l a t o r a d d e dt ot h em sm e d i u ma n dt h ec u l t u r e c o n d i t i o n ，a n dt h e ys h o w e dd i f f e r e n t p o t e n t i a lf o rm o r p h o g e n ya f t e rb e i n gt r a n s f e r r e dt ot h es a m er e g e n e r a t i o nm e d i u m t h e t y p eic a l l u sw a s i n d u c e dq u i c k l y , a n dw a ss o f ta n d g r a y i s hw h i t e ，w i t h a s m o o t h ， w e t - l o o k i n gs u r f a c e t h et y p ei ic a l l u sw a sl i g h ty e l l o w , c o m p a c ta n dg r a n u l a r , a n d g r e wm u c h m o r es l o w l y t h et y p ei i ic a l l u sw a sg r e e n ，c o m p a c ta n dt u b e r c u l a r t h e t y p ei c a l l u sh a dl o w e rr e g e n e r a t i o nc a p a c i t ya n dt h et y p ei l lh a d h i g h e r t h ec a l l u s e x p r e s s e dt h e i rt o t i p o t e n c yt h r o u g ht h ed i r e c to r g a n o g e n e s i sr a t h e rt h a nt h es o m a t i c e m b r y o g e n e s i s t h ef o r m a t i o no fd i f f e r e n tt y p e so fc a l l u sw e r e m a i n l yc o n t r o l l e db yt h eg r o w t h r e g u l a t o ra n dl i g h t ，a n dt h e r ei sl i t t l er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ee x p l a n t sa n dt h et y p eo f c a l l u s 2 t h ep o s s i b l er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h em e t a b o l i s mo f s u g ar p r o t e i na n dr o s ( 1 ) t h r e et y p e so f c a l l u sh a dd i f f e r e n ts u g a ra n dp r o t e i nl e v e l s t h et y p eic a l l u s p o s s e s s e dh i g h e rs o l u b l es u g a ra n dd e c r e a s e ds u c r o s e ，i nt h ec o n t r a s tw i t hi ia n di i i i i i 塑查兰堕主兰竺笙苎 c a f l u s ，t h ei ia n di i ic a l l is h o w e d6 - f o l da sm u c ha st h ec o n t e n to f w a t e rs o l u b l e p r o t e i n ，c o m p a r e d w i t ht h eic a l l u s s d s p a g es u g g e s t e dt h a t t h ep r o t e i nw a s s t r o n g l ye x p r e s s e di n t h ec f i l l u st h a td i f f e r e n t i a t e dt of o r ms h o o tc l u s t e ra n dr o o t d u r i n g t h ep e r i o do fs u b c u l t u r e ，t h es u c r o s ei nc a l l is h a r p l yd e c r e a s ei n15w e e k ，a n d l o v e ro ft h es o l u b l es u g a rk e e pc o n s t a n t t h ep r o t e i nl e v e li nt y p ei ia n di l lc a l l u s d e c r e a s e ds l o w l y ，w h i l ew h a ti nt h et y p eic a l l u sq u i c k l y t h ea b i l i t yo fe x p r e s s i o no f t o t i p o t e n c yi n c a l l id e c r e a s e d ，e s p e c i a l l yt h ec a l l u sil o s tt h ea b i l i t ya f t e r1 2w e e k s u b c u l t u r e i ts e e m e dt h a tt h e r ee x i s t e ds o m er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h er e g e n e r a t i o n c a p a c i t ya n dl e v e lo f s u c r o s ea n d p r o t e i n ( 2 ) d u r i n g t h ed i f f e r e n t i a t i o na n d d e v e l o p m e n t o fc a l l u s ，h 2 0 2p r o d u c t i o n c o i n c i d e dw i t he m e r g e n c eo fm e r i s t e m o i da n df o r m a t i o no fb u d p r i m o r d i u m i n m o r p h o g e n i cc a l l i ，s o da c t i v i t y i n c r e a s e di nt h e e a r l yr e g e n e r a t i o n c u l t u r ea n d d e c r e a s e d t h e r e a f t e r , a n d c a t a l a s e a c t i v i t yc o n s t a n t l y d e c l i n e dw h i l e p e r o x i d a s e d e c r e a s e dd u r i n gt h e5 一dc u l t u r ea n dg r a d u a l l yi n c r e a s e dt h e r e a f t e r t h ei n h i b i t i o no f h 2 0 2p r o d u c t i o nb yd d c d e c r e a s e dt h ep e r c e n t a g eo fc a l l ig e n e r a t i n gs h o o tb u d ，a n d e x o g e n o u sa d d i t i o no fh 2 0 2s l i g h t l yp r o m o t e dt h ep o t e n t i a lf o rr e g e n e r a t i o no fs h o o t b u d i nt h ef r e s h l yi n d u c e dc a l i i ，t h ei ta n di i i t y p e so f c a l l u sh a d5 - f o l da n d9 - f o l d h i g h e rc o n t e n t so fi n t r a e e l l u l a rh 2 0 2 ，a n d3 - f o l da n d4 - f o l dh i g h e rl e v e lo f0 2 一， c o m p a r e dw i t ht h eit y p eo fc a l l u s ，r e s p e c t i v e l y a l s o ，t h ec a l l ii ia n di i ih a dm u c h h i g h e ra c t i v i t i e so f a n t i o x i d a n te n z y m e st h a nt h ec a l l u si d u r i n gt h es u b c u l t u r e ，1 1 2 0 2 l e v e li n c r e a s e dg r a d u a l l ya n d 0 2 。r a p i d l y , w h i l et h ea c t i v i t i e so fa n t i o x i d a n te n z y m e s g r a d u a l l yd e c l i n e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h er o s m i g h tp l a yad u a lr o l ei nt h e r e g e n e r a t i o no fs t r a w b e r r yc a l l i o nt h eo n eh a n d ，ac e r t a i nl e v e lo fr o s m a y h a v ea p o s i t i v ee f f e c to nt h er e g e n e r a t i o n ，a n do nt h eo t h e rh a n d ，h i g hl e v e lo fr o si s i n h i b i t o r yf o rt h ee x p r e s s i o no f t o t i p o t e n c yi nc a l l i 浙大学障士学位论文 3 t h ec l o n i n go fe g f g e n ea n di t st r a n s f o r m e dt ot h et o b a c c oa n ds t r a w b e r r y c a l l u s t o t a lr n aw a si s o l a t e df r o mm o u s e k i d n e yt i s s u ea n dt h ee d n a w a s p r e p a r e d w i t hr e v e r s et r a n s c r o p t a s ef r o mt h et o t a lr n a af r a g m e n to fa b o u t17 0 b pw a s a m p l i f i e db yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) ，w h i c hw a sc l o n e di n t op u c l 8v e c t o r s e q u e n c i n gi n d i c a t e dt h a ti t s n u c l e t i d es e q u e n c ew a si d e n t i c a lw i t ht h a to fe g f g e n e o fm o u s es u b m a x i l l a r y t h i se g fg e n ew a sc o n s t r u c t e di n t o t h ec h e m i c a l p l a n t e x p r e s s i o n v e c t o r p c a m b i a l 3 0 1 a n d p b l l 2 1 t h ev e c t o r w a sm o b i l i z e di n t o a g r o b a c t e r i u m ，a n du s e df o rt r a n s f o r m a t i o no f t o b a c c ol e a f d i s k s t r a n s f o r m a t i o nw a s c o n f i r m e db yt h es h o o tf o r m a t i o no fl e a fd i s k so b t a i n e df r o m r e g e n e r a t e dp l a n t so n a m e d i u mc o n t a i n i n gk a n a m y c i n p c r a n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h ep r e s e n c eo ft h ee g f g e n ei nt h et r a n s g e n i cp l a n t s t h ec a l l u so f s t r a w b e r r yw a su s e da sm a t e r i a l st os t u d y t h et r a n s g e n i c r e s e a r c h ，b u tt h et r a n s g e n i cp l a n t sw e r en o ta v a i l a b l e k 。yw o r d s ：c a l l u s ；r e g e n e r a t i o nc a p a c i t y ；s u g a r ；p r o t e i n ；r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ； a n t i o x i d a n t e n z y m e s ；e g f g e n e ；f r a g a r i aa n a n a s s a ；n i c o t & n af 曲a c m m v 致谢 本论文的研究和撰写工作是在我的导师朱睦元教授的悉心指导下完成的，非 常感谢导师三年来对我的培养和关怀。他渊博的学识、严谨的治学态度、忘我的 敬业精神和平和的为人给我留下了深刻的印象，使我终身受益。在此论文完成之 际，向我的导师表示最衷心的感谢。 感谢潘建伟老师在平常学习和实验中对我的帮助和指导，特别是在朱老师不 在学校的一年中，他给了我们很多的勉励。感谢本实验室的王君晖老师、韩凝老 师、边红武老师在我的学业上给予的帮助和指教。 廖鸣娟博士、郑济芳博士在基因克隆方面给了我热情的帮助，师弟程汉、彭 华正在电脑软件的使用方面给予了具体的帮助，师弟林伟强在蛋白质电泳方面给 了我无私的指导，师弟吴江林在芦荟的组培上分担了我不少的工作。师妹迟万好 和唐娟娟在我实验不顺时总会细心地安慰我并力所能及地帮助我，师妹陈虹在一 些实验上也给了我帮助。在此对他们深表谢意。感谢在日常学习中陈东、刘健毅、 郑科、刘春玲、胡细莲、郑旭、叶丹、宋达峰、潘军航、华靖等师弟师妹们的支 持。 感谢杭商院的赵艳师姐和水稻所的何正权博士对我的理解和鼓励。 感谢我的室友王兆英博士三年来对我的关照，我们在一起的快乐时光是我心 里温暖的记忆。 感谢我的父母多年来的养育之恩。他们正直、善良、勤劳、达观，教会了我 很多做人的道理。感谢我的弟弟田永和妹妹田芳，多年来我们各自求学在外，但 山高水远隔不断手足深情，平时的问候和相互的鼓励是我们生活中重要的部分。 感谢我的爱人饶龙兵几年来给我的最深切的关爱和支持，苦乐与共的日子教会了 我们坚强、自信、乐观，这是我们最宝贵的精神财富。 感谢所有帮助过我的人j 田敏 2 0 0 3 ，5 于杭州 塑坚查兰堡主堂堡丝苎一 文献综述 第一章植物体内的活性氧研究进展 前言 氧是地球上所有生命有机体的赖依生存的元素。植物生命的最基本过程之一是电子转 移，氧作为主要的电子受体参与生命活动，为生物体提供所需的能量。然而，氧在植物体内 会被活化形成对细胞有伤害的活性氧。但一直以来，植物氧代谢远远比不上碳代谢和氮代谢 那样为人们所认识，直到1 9 6 9 年m c c o r d 和f r i d o v i c h 发现超氧物歧化酶( s o d ) 之后，人 们对氧代谢才有了深入的了解。 植物在长期的进化过程中，形成了一套完善的活性氧清除机制，使植物体内产生与清 除活性氧维持在一个动态平衡。氧代谢失调，氧自由基动态平衡受到破坏，植物结构和功能 就可能受损害甚至出现死亡。氧代谢的研究具有重大意义，它不仅与本学科中的许多重大领 域如光合作用、呼吸作用、植物衰老、辐射损伤、激素形成和抗逆生理等相互渗透，相互发 展：而且辐射到植物分类与演化、遗传育种、生态环境等学科。植物氧代谢的深入系统的研 究将有助于人们更清楚地认识植物生命的本质，为人类的生产实践提供有益的理论基础。 l 植物体内的活性氧 1 1 植物体内活性氧的来源 植物体内能量的来源依赖于氧化磷酸化，即线粒体电子传递的氧化还原能量转换为a t p 的高能磷酸键。线粒体是植物进行呼吸作用、能量转换和氧代谢的重要的细胞器。线粒体内 膜上存在呼吸电子传递链的各个组分，在生理条件下，从脱氢酶反应中，电子由氢裂解出来， 通过呼吸链组分最后在细胞色素c 氧化酶上以4 电子将氧还原成两分子h 2 0 。然而，当电子 在呼吸链传递过程中部分电子在途中泄露，就使氧以单价还原的形式生成超氧阴离子自由基 0 2 7 ，这种现象称为“电子漏”( e l e c t r o nu n i v a l e n t l e a k ；e l e c t r o n l e a k a g e ) 。可见，植物线粒 体呼吸链的电子漏是植物体内生成0 2 的重要来源。植物细胞中过氧化氢h 2 0 2 主要来源于 0 2 7 的歧化反应，但也可直接由氧的双电子还原生成。在有金属离子存在时，还能形成活 性更强的羟自由基o h 。相对o ：来说，这些不彻底的0 2 的还原产物具有较高的反应活性， 因此一般称为活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r o s ) 。 植物叶绿体也是形成活性氧的重要部位。叶绿体的某些还原型组分常常能将单电子传递 浙江大学博士学位论文 给基态氧分子而形成0 2 - ，这些组分如还原型的黄素( f l a v i n s ) 、喋啶( p t e r i d i n e s ) 、二酚 ( d i p h e n o l s ) 、和铁氧还蛋白( f e r r e d o x i n ) 等。叶绿体产生0 2 7 的部位是在类囊体膜p s i 的 还原侧。p s i 形成的0 2 7 既可以进入类囊体膜外的基质并通过酶促或非酶促的歧化反应和 2 h + 作用生成h 2 0 2 ：也可以在过剩的光强下，参与p s i i 捕光叶绿素复合蛋白( l h c p l l ) 的 紫黄质( v i o a x a n t h i n ) 转化为玉米黄质( z e a x a n t h i n ) 的反应过程，并在s o d 催化下将来自p s i 的0 2 7 转化为h 2 0 2 。同时，h 2 0 2 在抗坏血酸过氧化物酶作用下形成0 2 ，并与抗坏血酸、 谷胱甘肽和n a d p 的氧化还原相偶联。另外，基态分子氧在叶绿体内可吸收能量并将一个 电子激发而形成单线态氧1 0 2 ( s i n g l e to x y g e n ) 。可见，。0 2 不是基态氧的电子得失产生，不 属于自由基但它是高能态的分子氧，是光合作用中一种重要的活性氧。1 0 2 能与0 2 7 和 o h 相互转化。在疏水的非极性介质中的寿命约为2 5 1 0 - 41 0 0 1 0 。s ，而在亲水的介质中 为2 1 0 4 4 1 0 s 。因此，它有足够的时间在细胞内的亲水相和疏水相之间扩散传递，并 参与细胞内的许多重要的生命过程。 1 2 活性氧的性质 超氧阴离子自由基是基态氧接受一个电子形成的第一个氧自由基，是所有氧自由基的前 身，可以经过一系列反应生成其它氧自由基，因此具有非常重要的意义。0 2 7 既可以接受一 个电子氧化其它物质而被还原，又可以提供一个电子还原其它物质而被氧化，这是它的主要 的化学性质。0 2 7 在有机溶剂中稳定，在水中极不稳定，能快速地歧化生成h 2 0 2 。0 2 - 的 歧化反应是自身的氧化还原反应，即一个0 2 7 失去电子，另一个0 2 7 获得电子，20 2 + 2h + 一0 2 + h 2 0 2 。这个反应可自发发生，也可在s o d 参与下发生。在s o d 催化f ，反应速率 增加1 0 4 倍。较0 2 7 而言，h 2 0 z 是一较弱的氧化剂，并且较稳定，能穿透细胞膜，而o ，- 不 能羟自由基是已知的最强的氧化剂，反应性极强，寿命极短，在水溶液中仅为1 0 s ，它 几乎可以同所有的细胞成分发生反应，对机体危害性很大，但它的作用半径小，仅能和邻近 分子反应。 h 2 0 2 可以与细胞内的铁离子发生f e n t o n 反应生成羟自由基( o h ) ：h 2 0 2 + f e 2 + 一0 2 + o h + o h 。植物体内的能驱动f e n t o n 反应，这是通过h a b e r w e i s s 反应来完成的：o ，- 7 + f e ” 。0 2 + f e 2 + ：0 2 _ + h 2 0 2 一0 2 + o h + o h 。 2 浙江大学博士学位论文 2 2 1 类黄酮 体外研究表明，类黄酮可能与抗坏血酸和o 生育酚一样，能清除活性氧，但在体内能 否有此作用还未确定。类黄酮在体内主要存在于液泡中，而在植物中活性氧不能从叶绿体扩 散到液泡中，因此推测类黄酮只能在植物细胞中活性氧产生的部位或邻近部位( 如液泡或细 胞壁) 进行清除。但对于过氧化氢，因为它能够穿透细胞膜而流动，所以类黄酮对过氧化氢 的清除作用可能较其它的活性氧成分要大。c o n k l i n 等( 】9 9 6 ) 提出类黄酮在体内清除活性氧 的反应可能只是植物防御反应中的一种替补措施。然而只有当植物细胞中的h 2 0 2 水平在植 物快速生长或受到胁迫、或在幼年叶片中抗坏血酸不足、或在抗坏血酸缺失突变体中升高时， 这种替代作用才发生效用。 2 , 2 1 甘露醇 甘露醇作为氢氧根离子的清除剂早己为人们所认识。在氧化胁迫下，甘露醇可以保护巯 基酶类或其它巯基调控的叶绿体组分，如黄素蛋白、硫氧还原蛋白和谷胱甘肽。将细菌编码 的甘露醇- l - 磷酸脱氢酶的基因( m t l d ) 转入烟草中，分离转基因植株的类囊体进行的体外 实验表明，叶绿体中甘露醇含量较高，并且在h 2 0 2 处理后对照有明显的磷酸核酮糖激酶 ( p r k ) 活性( s h e ne ta l ，1 9 9 7 ) 。体外实验中，p r k 作为卡尔文循环中的巯基酶类的代表 能与o h 发生作用，在反应系统中加入甘露醇后，能通过检测p r k 的活性来验证甘露醇对o h 的清除作用。 3 植物体内活性氧的产生机制 相对植物来说，哺乳动物中的活性氧产生机制研究得鞍多且较清楚，动物中存在着一 种质膜n a d p h 氧化酶是0 2 7 合成酶，对0 2 7 的产生负责。植物活性氧产生的机制是目前 氧代谢研究的热点( s u t h e r j a n d ，1 9 9 1 ；l o wa n d m e r i d a , 1 9 9 6 ；w o j t a s z e k ，1 9 9 7 ) ，至今，虽然已 有多种r o s 的产生系统用于研究此问题，但多数仍不能成为定论，还需要进一步的确认和 鉴定。 3 i 两个较早的假说 最早的个假说是关于辣根木质部形成过程中外质体( a p 叩l a s t j c ) 中h 2 0 ：的来源。人们 认为质外体的过氧化物酶催化产生的酚类化合物和n a d 自由基将0 2 还原为0 2 = ，然后 0 2 7 歧化为h 2 0 2 。这一假说中的电子供体是细胞分泌的苹果酸( g r o s se ta 1 ，1 9 7 7 ：e l s t n e ra n d h e u p e l ，1 9 7 8 ；h a l l i w e l l ，1 9 7 8 ) 。 6 浙江大学博士学位论文 第二种假说是以法国菜豆的培养细胞为实验材料的，该细胞被诱导子( e l i c i t o r ) 引发后 产生氧化爆发，质外体中的过氧化物酶的0 2 血红素复合体被细胞分泌的还原剂还原为复合 物i l l ( c o m p o u n d1 1 1 ) 。在适当的条件下，如较高的p h 值，复合体1 1 1 水解，释放出h 2 0 2 。 在这一理论模式中，没有检测到电子供体，但被诱导细胞中还原剂的释放己检测到( b o l w e l le t a l ，1 9 9 5 ) 。 3 2n a d ( p ) h 氧化酶 第三种机制越来越引起人们的重视，它涉及到一个跨膜的0 27 合成酶，这是一种 n a d ( p ) h 氧化酶( n a d p ho x i d a s e ) ，它能从细胞质的n a d ( p ) h 传递电子到0 2 ，形成0 2 7 ， 然后0 2 7 歧化为h 2 0 2 ( d o k ea n dm i u m ，1 9 9 5 ；l o wa n dm e r i d a ，1 9 9 6 ；m u r p h ya n da u h ，1 9 9 6 ； v a ng e s t e l e ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 。在玫瑰培养细胞中，加入n a d h 和酚类化合物( 如水杨酸) ，能 刺激h 2 0 2 的产生，但加入苹果酸却无此反应。如根据第一种假说，加入苹果酸应能刺激h 2 0 2 的产生。而且，二亚苯基碘( d i p h e n y l e n ei o d o n i u m ，d p i ) 能抑制玫瑰细胞中0 2 7 和h 2 0 2 的合成( m u r p h y a n da u h 1 9 9 6 ) 。铁蛋白的阻碍剂d p i 是哺乳动物质膜n a d p h 氧化酶的抑制 齐l j ( l e v i n ee ta 1 ，1 9 9 4 ；a u ha n dm u r p h y ，1 9 9 5 ) 。至今，药理学和免疫学方面的证据都表明植物 中也确实存在一种类似动物n a d ( p ) h 氧化酶活性的蛋白质，这是两种类型的细胞活性氧产 生相似性的最有力的证据，即哺乳动物n a d p h 氧化酶的不同亚基( 如p 4 7 p h o x 、p 6 7 p h o x 、 p 2 2 p h o x 和小g 蛋白r a c 2 ) 的抗体可与植物细胞中类似分子量的蛋白质发生免疫交叉反应 ( d w y e r e ta 1 ，1 9 9 6 ；t e n h a k e ne ta 1 ，1 9 9 5 ；k i e f f e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。此外，哺乳动物中n a d ( p ) h 氧化酶的一个组分之一是g p 9 1 - p h o x 蛋白，目前与该蛋白的基因序列具有高度同源性的一个 水稻c d n a 序列己被分离出来( g r o o me ta 1 ，1 9 9 6 ) ，并在拟南芥中克隆到了该基因的全长序 列( k e l l e re ta 1 ，1 9 9 8 ) 。人们发现用专一性激发子处理番茄悬浮细胞可提高氧化酶活性，并且 质膜上p 4 7 一p h o x 、p 6 7 - p h o x 和r a c 2 的量也增加。这些证据充分说明植物活性氧的产生与 n a d p h 氧化酶相关。 n a d ( p ) h 氧化酶由4 部分构成，其中两部分是膜蛋白g p 9 1 - p h o x 和p 2 2 p h o x ，两者复 合形成细胞色素b 5 5 8 铁蛋白( 图2 ) 。另外两部分( p 4 7 - p h o x 和p 6 7 p h o x ) 是细胞质蛋白， 磷酸化后的p 4 7 - p h o x 和p 6 7 - p h o x 起与膜上b 5 5 8 结合来激活该氧化酶的活性。鸟苷酸结 合蛋白r a c l 2 和r a p l a 分别与p 6 7 - p h o x 和细胞色素b 5 5 8 作用参与n a d ( p ) h 氧化酶的组 合和活化。n a d ( p ) h 氧化酶的另一个可能的组分是分子量为4 0 k d 的蛋白p 4 0 p h o x ，但它 在呼吸迸发中的作用还不清楚。 7 塑垩查兰堡圭兰垡丝茎 一 一 旷 。 k e t i v a t e d 0 20 ； ! j n a m mn d p + 图i2 ：n a d p h 氧化酶复合体的形成与0 2 的生成( 引自w o j t a s z e k ，1 9 9 7 ) f i g1 2s c h e m a t i cm o d e lo ft h en a d p ho x i d a s ea s s e m b l ya n d0 2 7 p r o d u c t i o n ( r e c o n s t r u c t e df r o m w o j t a s z e k ，1 9 9 7 ) 。 3 3 活性氧产生的其它机制 另有研究表明，细胞壁过氧化物酶可能是植物细胞活性氧产生的另一个来源( b a k e ra n d o r l a n d i ，1 9 9 5 ) 。过氧化物酶除了作为h 2 0 2 的清除剂以外，也可与n a d p h 反应产生0 2 7 和 h 2 0 2 ，生成的h 2 晓则用于细胞壁的木质化或蛋自质的交联。偏碱性的条件有利于过氧化物 酶的活性，病原菌的侵入或激发子处理导致质外体或溶液的碱化，无疑有利于该机制的h 2 0 2 生成。在含有酚类物质、n a d h 和纯化质膜的反应体系中可测到过氧化物酶的活性氧产物， 纯化过的细胞质膜成分能氧化酚类化合物而产生活性氧。豌豆和豇豆的细胞壁盐溶成分能产 生0 2 7 ，而且过氧化物酶的抑制剂s h a m ( s “。y l h y d r o x a m i n e ) 能抑制这种0 2 生成，但 阻碍剂d p i 则对该0 2 7 生成没有明显的影响，表明该过程是依赖于n a d h 并由与细胞壁结 合的过氧化物酶介导的0 2 7 生成。另外，菜豆中也存在着k c n 敏感而d p i 非敏感型p o d 参与的h 2 0 2 合成机制( b o l w e l le ta 1 ，1 9 9 8 ) 。另外，植物中可能还存在着氨氧化酶( a m i n e o x i d a s c ) 催化的活性氧生成机制。该过程是氨氧化酶以氨或聚氨为底物生成h 2 0 2 ( a l l a na n d f l u h r 1 9 9 7 ) 。 不同的植物可能存在不同的活性氧产生机制，但同一种植物也可能具有多种活性氧的来 源途径。p a p a d a k i s 等( 1 9 9 9 ) 在烟草原生质体中发现了两种不同的n a d p h 酶活性，种对 d p i 敏感，能产生0 2 7 ，属类似哺乳动物的n a d p h 氧化酶；另一种酶活性对k c n 和n a n 3 敏感，对0 2 7 和h 2 0 2 的产生负责，为过氧化物酶类。而在葡萄原生质体中可能只存在过氧 8 浙江大学博士学位论文 化物酶生成活性氧的机制。 4 活性氧在植物中的损害作用 人们对活性氧对植物的伤害作用的认识最早来源于植物衰老的自由基学说，该学说认为 衰老是氧伤害的积累结果。即使在正常环境下，植物的生命过程也潜伏着氧伤害的累积，尽 管氧伤害是复杂而缓慢的，当它积累到一定程度，植物就出现衰老甚至死亡。实际上，衰老 的机理是既复杂且涉及学科很广的生命本质问题。衰老的自由基学说有待于进一步研究与证 实，但植物氧伤害的大量研究己引起人们普遍关注，与氧伤害有关的生理学课题已成为当今 生物科学的一个研究热点( 余叔文和汤章城，1 9 9 8 ) 。 4 1 活性氧启动膜质过氧化作用 构成生物膜双层骨架的脂质是由非极性的碳氢侧链和极性的磷酸脂两部分组成，所以膜 脂的基本成分是磷脂。膜脂的结构与运动状态决定了膜的特性与功能，膜脂分子结构受干扰 或破坏，势必也干扰或破坏与膜功能有关的各种生理功能。在植物生命活动中干扰膜结构和 功能的因素很多，膜脂的过氧化作用就是引人重视的一个因素。叶绿体与线粒体是交换基态 分子氧和富基活性氧的主要细胞器，膜脂的非极性部分对氧的溶解度大，而且活性氧在脂质 中寿命较长，因而容易引起活性氧启