（遗传学专业论文）生物破乳剂的分离、筛选及破乳特性研究.pdf

p u 川人学硕l 学位论史 摘要 生物破乳剂的分离、筛选及破乳特性研究 现代遗传与生物工程 研究生曾早指导教师刘世贵教授李大平研究员 工业乳化液的破乳是现代工业的一个重要课题。本研究工作的目 的就是为生物破乳剂的工业应用的可行性提供生物学实验依据。根据 乳化液的性质，分另采用了不同的分离和筛选策略获得了高效生物破 乳菌。针对w o 型乳化液，首先利用富集、筛选，获得了高生物活 性的生物表面活性剂。再利用建立的w ，o 型工业模拟乳状液初筛和 油田原油乳化液复筛体系，找到了3 支针对w o 型乳化液高效破乳 的生物破乳菌。根据形态及生理生化实验的鉴定有2 支菌为属棒状杆 菌属，1 支菌为芽孢杆菌属；针对o w 型乳化液，在k l j a n i y a n i 等研究的启发下，直接从枯草芽孢杆菌中筛菌。采用o a v 型工业模 拟乳状液进行初筛，通过工业机床乳化液( o w 型) 进行复筛，得到 了2 支针对o w 型乳化液商效破乳的枯草芽孢杆菌。为了进一步研 究生物破乳菌的破乳活性，本论文还重点对菌株的微生物学和生化代 谢进行了详细的研究。进行了培养基、p h 、温度、时间等环境因素对 菌株生长及破乳活力的影响测定实验，找到了有利于破乳剂产生的最 适发酵条件。在最佳条件下，针对w o 乳化液，破乳时间在2 4 h 内， 做乳率鄙人j ：8 0 ；针对o w 乳化液，破乳时间在o 1 h 内，破乳率 大于8 0 。同时我们的研究证明，针对w o 乳化液，3 株破乳菌的 l j q 川1 人学硕卜学位论文 破乳活性均与细胞本身有关，只有在细胞保持完整的前提下，细胞表 面产生的破乳荆4 具有破乳活性，这种破乳剂一旦生成，具有热稳定 性。而乳状液含水量越多，含粘土量越少，破乳速度越快，一定振荡 有利于破乳，但破乳活性受温度影响不大。针对o w 乳化液，具有 破乳效果的物质不是干细胞本身，而是存在于除去细胞的培养液旱。 这验证了具有破乳效果的是一种次生代谢产物。它的破乳活性与细胞 的完整性无关。其破乳活性与破乳温度无关，但与乳化液的含水量有 关，含水量越高越不利于破乳。本研究关于生物破乳菌的微生物学及 针对破乳活性进行的代谢过程的研究对于解决工业乳化液的破乳具 有一定的理论意义，对于开发工业生物破乳剂，代替工业化学破乳剂 具有一定的实践应用价值。 关键词：生物破乳菌生物破乳剂发酵条件破乳活性 四j 1 1 人学颀上学位论文 i s o l a t i o n ，s c r e e n i n go fd e - e m u i s i f y i n gb a c t e r i a a n d t h e i rc h a r a c t e r i s t i c so fd e - e m u l s i f i c a t i o n a c t i v i t y o n eo ft h em a j o rp r o b l e m sa s s o c i a t e dw i t 1i n d u s t r yw a st h eg e n e r a t i o n o f e m u l s i o n s d e - s t a b i l i z a t i o no f t h ee m u l s i o n si st h e r e f o r en e c e s s a r yt oi t t h e o b j e c t i v e o ft h e p r e s e n t r e s e a r c hw a st o p r o v i d eb i o l o 西c a l l y e x p e r i m e n t a le v i d e n c e sf o rt h ef u t u r ei n d u s t r i c a la p p l i c a t i o n s a c c o r d i n g t ot h eq u a l t i e so f e m u l s i o n s , d i f f e r e n tt a c t i c sw e r et a k e nf o ri s o l a t i o na n d s c r e e n i n g o fb a c t e r i at o h i g h d e - e m u l s i f i c a t i o n a c t i v i t y f o r w o e m u l s i o n s ，t h em e t h o d sw e r et oe n r i c ha n di s o l a t e o r g a n i s m s ，w e f r i s t c o l l e c t e dt h eb i o s u r f a c t a n t s f o r h i g ha c t i v i t y b y t h e p r o c e d u r e s o f p r i m a r ys c r e e n i n gi nw h i c hw oe m u l s i o n so f in d u s t r ysi m u l a n tw a s d e e m u l s if ic a r e da n do fs e c o n d a r ys c r e e n i n gi nw h ic ht h eo i1 f i e l de m u l s i o n sw a s d e e m u i s i f i c a t e d ，t h r e e s t r a i n so f d e e m u l s if y i n gb a c t e r i aw e r es c r e e n e d o nt h eb a s i so ft h e i r m o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o na n dp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l t e s r s ，t w os t r a i n so ft h e mw e r ec l a s s i f i e da st h eg e n u so f 6 b r y n e b a c t e r i u m l e h m a n no fn e u m a u na n d t h ea n o t h e rw a s c l a s s i f i e da st h eg e n u so fb a c i l l u s ；f o ro we m 0 1 s i o r s b a s eo n t h ei d e ao fk lj a n i y a n j ，r e s e a r c h w e s c r e e n e dt h e d e e m u l s i f y i n gb a c t e r i af r o mt h eg e n u so fb a c i l l u s d i r e c t l y t h e w a yo fs c r e e n i n ga ss o o na st h ef o r m e r t w os t r a i n so fb a c i l l u s f o r h i g h d e e m u s i f i c a t i o na c t i v i t yf o ro we m u l s i o n s t o i n v o s t i g a t ea n dv e r i f yt h ea c t i v i t yo ft h e s es t r a i n s ，am o r e 3 p q 川i 大学碗士学位论文 d e t a i l e d s t u d y w a sc o n d u c t e d t ot h e m i c r o b i o l o g y a n d b i o c h e m i c a lm e t a b 0 1i s m o f t h e s t r a i n s t h ee f f e c t so f t h e e n v i r o n m e n t a lf a c t o r ss u c ha sc u l t u r em e d i u m 。p h ，t e m p e r a t u r e a n dti l l l ef 0r g r o w t h a n dd e e m u s i f i c a t i o n a c t i v i t y w e r e s t u d i e d ，w e f o u dt h em o s tf a v o r a b l ec o n d i t i o n f o r o f b i o - d e e m u l s i f i e r o nt h eb a s eo ft h ec o n d i t i o n t h e s eb a c i l l u s c a r ? r e c o v e r yo f8 0 0 i 1f r o mw oe m u ls i o n sw i t h i n2 4h o u r sa n d r e c o v e r ye f8 0 o i 1f r o mo we m u l s i o n sw i t h i n0 1h o u r s a tt h e s a m et i m e ，o u rr e s e a r c hs u g g e s tt h a t ，f o rw oe m u l s i o n s ，d e e u l s i f i c a t i o na c t i v i t yo ft h et h r e es t r a i n so fd e m u l s i f i e r sh a d c o n t a c tw i t hc e l l u n d e rt h ec o n d i t i o no fk e e p i n gi n t e g r a l i t y o ft h ec e11s ，t h e yc a nd e e m u l s i f i c a t e d t h ew e r es t a b l eu n d e r h e a t i n g t h em o r ea q u i f e r o u sq u a n t i t y ，t h el e s sc l a yq u a n t i t y i s ，t h e m o r ee f f i c i e n td e e m u s i f i c a t e d a n ds u r g eh a v el i t t l e a f f e c to ne f f i c i e n t f o rt h eo we m u l s i o n s ，t h ed e e m u l s i f i e r l i e si nt h e t h ec e l l 一f r e eb r o t h i td e m o n s t r a t e dt h a tt h e d e e m u l s i f i e ri sam e t a b o l i t eo fm e t a b o l i s mw h i c hh a v en o t h i n g t od ow it hc e l1a n d t e m p e r t u r e b u ta q u i f e r o u sq u a n t i t y o f e m u l s i o n sa i f e c t e d r e m a r k a b l y f o r a c t i v i t y o f d e e m u l s i f i c a t e d t h em o r e a q u i f e r o u sq u a n t i t yi s ，t h e 1 e s s e f f i c i e n td e e m u s i f i c a t i o n t h e s t u d y o f m i c r o b i o l o g y o f d e e m u l s if y i n gb a c t e r i aa n dm e t a b o l i s mf o rd e e m u s i f i c a t i o n 。l c t iv ilyih0 f 。p r a c t i c a lv a l u einr e l a t i o n t od e v e l o p t e c h n o l o g y t os 0 1v ep r o b i e m so fd e e m u s i f i c a t i o nf o ri n d u s t r ye m u l s i o n s a n dt op r o d u c eb i 0 一d e e m u s i f i e r k e y w o r d s ：d e e m u l s i f y i n gb a c t e r i a b i o d e e m u s i f i e r f e r m e n t a ti 【1 nd e e m u s i f i c a t i o na c t i v i t y 4 列川大学硕l 学位论义 绪论 1 引言 许多工业过程常会产生乳状液，这可能是因产品本身要求具有某 些功能性质，或者是由于对油水混合物进行加工时，受到物理、化学 操作造成的结果。许多工业，如石油采收和加工，采矿和金属回收， 焦油砂中提取沥青，化工生产过程，塑料和防护涂料，以及农业( 特 别是农药和除草剂生产) ，制药，食用油脂和食品加工等方面，在其 各个不同的操作阶段，一般都出现某种类型乳状液。有时需要稳定某 种乳状液，这通常是在其中加入某些有特种用途的、适用于指定工业 领域的各种化学合成乳化剂。然而，常常又会碰到这样的情况，在加 工过程的某个阶段要特意制成乳状液形式，而在后一道工序中又必须 使之破乳。一般来说，乳状液可以分为w o 和o ，w 两种类型，如石 油工业中原油的采收过程，油精炼过程中乳化液的产生，而w o 和 0 w 的产生在成分和性质上都是变化的。为了提高石油的采收率，已 经采用了许多e o r 方法，如水驱、蒸汽驱和火驱等。不管采用那种 e o r 方法，从油层中采出的都不再是地层下的原油，而是非常复杂的 乳状液。由于驱替液中往往用到了表面活性剂，因而这种乳状液很稳 定，但最终必须使这种乳状液破乳，以便将油从水中分离出来用于精 炼。加拿大a l b e r t a 和s a s k a t c h e w a n 两地的焦油砂中石油含量可能比 整个阿拉伯半岛的探明石油储量还要高；在开采焦油砂过程中，往往 又形成了o w 乳状液。另外，在工业生产中，大机组运行过程中， 油旦发生乳化，油品的润滑作用、防护作用、液力传动作用等就会 减弱，使机组的正常运转受到极大威胁，以致造成停车停产。在医药 方面，如青霉素的生产由于发酵液中含有大量蛋白质，有机色素及其 它生物副产物，所以在萃取过程中产生严重乳化，形成o w 型乳化 液，如果不使用合适的破乳剂即使用不同的离心机也不能使两相获得 良好的分离，因此，破乳是青霉素生产中的关键技术饥目前，各个 四川大学硕l 学位论文 行业为了解决乳化现象，大多采用工业破乳剂。仅在我国每年仅消耗 破乳剂就达到数万吨。由于化学破乳剂的专一性较强，在利用商品破 乳剂时，食、l p 都耗费了大最的人力、物力投入化学破乳剂的研制和开 发。目d h 的化学破乳剂大致分为阴离子、阳离子、非离子型，其作用 机理都是通过破乳剂中的表面活性物质与原油中的物质发生作用，打 破h l b 平衡，导致油水分离。由于乳化液受活性组分、理化特征等 条件的影响，化学破乳剂在破乳过程中还存在如下的缺点：选择性强； 脱出水中含油高；需要有机溶剂做助剂。例如，在石油行业，由于油 田区域范围广，各油井采出的原油混合液其乳化特性又有明显不同， 导致破乳效率降低。近年来，由于各油田注聚采油和三元复合驱采油 规模越来越大，采出液的乳化更为严重，导致化学破乳剂的使用量大 增，此外，部分油田由于采出液特性的变化，还没有筛选到合适的破 乳剂。导致采出水中含有大量的乳化石油污染物，给下游废水的处理 达标排放增加了困难。此外，由于破乳剂高昂的成本( 1 万元吨以上) 、 水相中残留产物的难降解性带来的环境污染等一系列问题都使化学 破乳剂给企业增加了额外的成本和污染负担。 2 研究生物破乳剂的意义 近期生物科学的发展，使人类利用生物体或生物代谢反应制造产 品的技术有了质的飞跃，推动了生物化学工业的兴起。由于生物反应 过程大多足在常温、常压下进行，对能源的需求大为减少。又因生物 资源是可以再生的，与其他产业相比不易受到原材料的限制，而且投 资少、生产周期短、见效快，取得的经济效益大得多。生物产品与化 学试剂比较，它有以下优势：可生物降解，不会造成污染；无毒或低 毒：一般1 i 敛敏、可消化；日，以从工业废弃物中生产，应用于环境的 生物治理；结构多样，有可能适用于特殊领域1 6j 。目前，许多发达国 家已经把眼光投向了生物破乳剂的开发，它的高效和环保性是化学破 乳剂所无法比的。它在油污分离、去除等领域的开发、应用前景十分 广阔，国际上在这一领域的研究十分活跃，但由于技术保密的原因公 6 四川人学硕l 学位论文 j r 报道不多，而国类更少见同类研究的报道。 我们知道，表面活性剂是一类在很低浓度时能思著降低液体表面 张力的化合物。它的分子一般都是幽非极性的疏水( 亲油) 基团( 主 要是碳氢链或其取代物) 和极性的亲水基团组成。它具有润湿、分散、 乳化、破乳、消泡、去污、抗静电等作用，表面活性剂是一类品种多 样、用途广泛的精细化工产品，素有“工业味精”的美称悼j 。其中重 要的一个作用便是破乳，因此破乳剂是属于表面活性剂这个大范畴的 种。人们很早就知道，许多生物分子也是集亲水基和疏水基结构于 一一身的两亲化合物。微生物在一定条件下培养时，在其代谢过程中会 分泌出具有定表面活性的代谢产物，称为生物表面活性剂 ( b i o s u r f a c t a n t ) 。生物表面活性剂的应用价值也已经得到广泛的研究， 它们可应用于石油开采、环境治理、农业、医药、纺织、食品和化妆 品等众多工业领域一j 。k o s a r i c l l0 j 已经展望了它们在整个工业领域中的 应用前景。其中生物破乳剂将在工业生产中发挥巨大作用。 3 生物破乳剂研究的现状 大量的研究证实生物表面活性剂红血球膜的相互作用释放出红 血球中的血红蛋白，因此生物表面活性剂具有溶血的特性，通过排油 活性测定，圆圈直径大于3 c m 的菌株被认为是高活性生物表面活性 剂。而细菌对w ，o 型和o ，w 型石油乳状液的破乳，国外早在1 9 8 3 年就有报道( k o o s a r i e a ta 1 1 9 8 3 ) 。早期的研究发现，n o c a r d i a a m a r a 、 c o r y n e b a c t e r i u mp e t r o p h i l u ma t c c2 1 4 0 4 、r h o d o c o c c u sc r y t h r o p o l i s 和t o r u l o p s i sb o m b i c o l a 15 1 有破乳能力。w e s t e mo n t a r i o 大学实验室研 究证实，细菌作为生物破乳剂时，一种m m s m 无机盐培养基加上4 的烃葡萄糖提供的c 源是适合其生长的物质基础，另外他们建立了 套初步筛选生物破乳剂的方法，即利用蒸馏水、煤油和选择合适的 合成表面活性荆混合建立模拟的模型乳状液，这是一套快速、简便且 重复性好的方法，通过此方法，他们测试并比较了初筛菌的破乳能力， 从而达到初筛的目的。为了进一步研究细菌破乳剂的产生情况， 四川大学硕学位论文 w e s t e r no n t a r i o 人学实验辜还对细菌破乳荆进行r 分缴分离和抽提， 研究发现，明中性类脂的抽提溶剂或用总类脂的抽提溶剂都不能使与 细胞有关的破乳活性同细胞分离，但碱性甲醇能有效地从细胞表面除 去破乳能力，但此破乳活性在甲醇抽提液中不能重现。这个事实证明， 细菌所具有的破乳活性不可能是由因共价键断裂而从细胞中释放出 的任何单一化合物所致，而是在细胞保持完整的前提下，由存在于细 胞表面上邻近的一些化合物或基团所致。研究认为微生物细胞的疏水 性表面结构导致了破乳活性的产生，微生物细胞的疏水性可能也是导 致微生物现象如：粘连性、絮凝性、碳水化合物的利用及吞噬作用的 原因。而细菌细胞表面的疏水性的增加与细胞的p h b 成分相关。 n k o s a r i c 等针对细胞表面的疏水性提出了细胞表面的功能团和其亲 水憎水平衡决定细胞的破乳性，在此基础上，可根据需要选择微生 物作乳化稳定剂或破乳剂，或者作为一般用途的生物表面活性剂的机 理。这种机理认为细菌附着在一个乳化液液滴的油水界面上：两个液 滴絮凝，液滴之间有一个固体微生物细菌；由于界面热力学的控制及 系统内的搅动因素，细菌表面被乳化液滴润湿；乳化液滴互相接触时， 在润湿的细菌表面凝聚。然而，如果细胞表面不能被液滴明显地润湿， 则液滴的两个单元 两乳状液液滴) 就会在彼此接触和发生凝聚之前， 达到平衡位置。在这种情况中，细菌粒子是作为一种乳状液稳定剂， 而不是破乳剂。液滴与细胞表面间的平衡接触角的大小( a 和b ) 反 映了液滴对细胞表面的润湿能力，进而又表明了这种细菌细胞到底是 适合于作破乳剂还是作乳状液稳定剂。除了细菌从各种碳源合成的 p h b 有破乳活性外，葡萄糖产生的二次代谢产物也有破乳活性。1 9 9 4 年，k l j a n i y a n i 开始真jf ：尝试了使用枯草芽孢杆菌生长在葡萄糖中 的二次代谢产物做o w 型乳化液的破乳剂，发现其代谢产物( 3 一羟 基丁酮) 具有很好的热稳定性和破乳活性，它是独立于细胞而存在于 培养液中的，【纠收油的效果比微生物细胞更好。与早期报道的显示疏 水性的细菌细胞是破乳的关键因素对照，代谢产物的破乳明显与前者 的破乳机理不同，它与细菌表面的疏水性无关，它的机理研究日前还 叫川太学硕l 学位论文 1 i 太明确，但是由于它的独立性和高效性，它的应用价值更大。 综上所述，关于生物破乳剂的研究目前重要有两个分支，即“疏 水性细菌细胞的破乳”和“发酵代谢产物的破乳”，两者互不干涉， 后者主要还崩限于o w 型乳化液的破乳上。 4 我们的研究目的和技术路线 目前， 圭| 于我国生物技术应用于环境工程及石油工业的相对落 后，生物破乳利的研究在我国几乎还是一片空白，更不用说工业应用。 而生物破乳剂的独特优势，发展生物破乳剂的国际大趋势，使这一研 究课题必将成为我国2 l 世纪生物工业的一个重要分支。由于国外的 技术保密，且报道的文献多是证明微生物细胞或微生物的代谢产物有 破乳活性的存在，对生物破乳剂的产生条件、生物破乳剂的特性及破 乳活力的影响因素等关系到生物破乳剂实际工业应用的基础研究还 少见报道。 因此我们也仅仅能从国外发表的很有限的文献上获得一些启发。 从菌种筛选、分离、到破乳活性的确定和破乳活力研究过程中，我们 逐步探索一条有实际应用价值且适合我国工业条件的的技术路线，以 期为以后应用于工业生产做一些基础研究。 针对w o 型乳化液，结合c a t h e r i n e ，nm 等研究高效生物表面 活性剂研究的成果及w e s t e r no n t a r i o 大学实验室等早期研究疏水性 细菌细胞的成果，本研究室建立的筛选菌种的路线是：以m m s m 培 养基加上4 烃作为富集培养基，通过血平板和排油活性测定进行初 筛，获得了高生物活性的生物表面活性剂。在复筛时，通过建立的工 业模拟乳状液，快速、简便且重复性好的测试并比较了它们的破乳能 力，从而找到几支有高效破乳能力的生物破乳菌。实验证明，我们建 莎的整套筛选方法是科学合理的，得到的菌种对工业乳化液有比较明 显的破乳能力。而针对o w 型乳化液，在k l j a n i y a n i 等研究的启 发f ，本研究选择直接从枯草芽孢杆菌出发，采用o w 型工业模拟 乳状液进行初筛，采用工业机床乳化液( o w 型) 进行复筛，筛选出 9 i n 川大学硕i ：学位论义 有此破乳斛产生的桔草芽孢轩菌臼勺技术路线。并通过对次生代谢产物 的调控，以及自行建立的简便的化学检测方法来检测破乳剂3 一羟基 丁嗣的产生。在筛选到高效破乳菌后，本实验室的另一重点研究是生 物破乳剂的产生环境及破乳活性能力的研究，以期为以后应用于工业 生产打下更好的基础。 叫川人学坝 学位论义 第一章w o 型乳状液生物破乳剂的分离、 筛选及破乳特性研究 1 材料 1 1 菌源 中科院成都生物所微生物室保存菌种，山东胜利油田、大庆油田、 辽河油用油泥、含油废水、变质原油，南充炼油厂油泥，南充机械厂 油泥等以及其他石油污染样品。 1 2 培养基 1 2 1 生物破乳菌富集筛选培养基 ( m m s m 无机盐液体培养基) n h 4 n 0 3 k 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 m g s 0 4 7 h 2 0 微量元素溶液 蒸馏水 液体石蜡 1 2 l 灭菌1 5 2 0 分钟 微量元素溶液 c a c l 2 f e s 0 4 e d l a 蒸馏水 1 2 2 从初筛菌中分离细菌单菌落固体培养基 4 0 9 4 o g 6 o g 0 2 9 1 m l 1 0 0 0 m l 4 1 0 0 m g 1 0 0 r a g 1 4 0 m g 1 0 0 m l l j t l ) p 1 人学硕上学位论文 牛肉膏蛋白脲培养基( 细菌固体培养基) 个肉鹳 篮白胨 葡葡耱 n a c l 琼脂 蒸馏水 p h 1 1 2 灭菌1 5 2 0 分钟 1 2 3 细菌斜面固体培养基 配同1 2 2 牛肉膏蛋白胨培养基。 5 o g 1 0 o g 5 o g 5 0 9 2 0 o g 1 0 0 0 m 1 7 o 1 2 4 生物破乳菌液体培养基( 改进的m m s n i 无机盐液体培养基) n h 4 n 0 3 4 0 9 k 2 h p 0 4 4 0 9 k h 2 p 0 4 6 0 9 m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 9 微量元素溶液lml 酵母膏 1 0 9 葡萄糖 1 0 0 9 液体石蜡 4 蒸馏水 1 0 0 0 m l 1 1 2 。c 火简l5 2 0 分钟，葡萄糖蕾独灭菌后加入。 1 2 s 血半板吲体培养基( 生物表面活性剂的筛选) 牛肉膏 3 o g 蛋白胨 1 00 9 酵母膏 1 0 9 阴川大学硕上学位论文 n a c i 绵羊鲜m 琼脂 蒸馏水 1 1 2 。c 灭菌15 2 0 分钟。 1 2 6 生物表面活性剂的斜面保藏培养基 蛋白胨 酵母膏 葡萄糖 p h 5 0 9 5 0 m l 2 0 o g 1 0 0 0 m l 1 0 0 9 0 1 9 2 0 o g 5 6 1 2 7 系列p h 破乳菌培养基( 用于生长条件测定实验) 不同p h ( 4 5 ，5 0 ，6 0 ，6 5 ，7 0 ，7 5 ，8 0 ，8 5 ) 破乳菌培养 基( 除p h 外，其余与培养基1 2 1 同) 1 2 8 系列c 源的破乳菌培养基( 用于生长条件测定实验) 1 2 8 1 以葡萄糖为c 源的破乳菌培养基 n 王4 n 0 3 4 0 9 k 2 h p 0 44 o g k h 2 p 0 4 6 0 9 m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 9 微量元素溶液lml 葡萄糖400 蒸馏水1 0 0 0 m l 1 1 2 。c 灭菌1 5 2 0 分钟，其中葡萄糖单独灭菌或煮沸灭菌l o 分钟。 l 2 8 2 麒液体石蜡为c 源的破乳菌培养基 n h 4 n 0 3 4 0 9 k 2 h p 0 4 4 0 9 川川人学顺i 。学位论史 k h 2 p u 4 6 0 9 m g s 0 4 7 h 2 0 o 2 9 微量元素溶液1 m l 液体石蜡4 蒸馏水 1 0 0 0 m l 1 1 2 灭菌1 5 2 0 分钟。 i 2 8 _ 3 混合c 源的破乳茵培养基 n h 4 n 0 3 4 0 9 k 2 h p 0 4 4 0 9 k h 2 p 0 4 6 0 9 m g s 0 4 7 h 2 0 o 2 9 微量元素溶液lml 葡萄糖 2 0 0 2 液体石蜡 2 蒸馏水 1 0 0 0 m l 1 1 2 c 灭菌1 5 - - - 2 0 分钟，其中葡萄糖单独灭菌或煮沸灭菌1 0 分钟。 1 2 9 系列p l t 破乳藩培养基( 用于影响破乳的条件测定) 不同p h ( 4 5 ，5 0 ，6 0 ，6 5 ，7 0 ，7 5 ，8 0 ，8 5 ) 破乳菌培养 基( 除p h 外，其余与培养基1 2 4 同) 1 2 1 0 系列c 源的破乳菌培养基( 用于影响破乳的条件测定) 1 2 1 0 1 以葡萄糖为c 源的破乳菌培养基 配| 司1 2 盘1 ，另外加入： 酵母膏 1 0 2 1 2 1 0 2 以液体石蜡为c 源的破乳菌培养基 配同1 2 8 2 ，另外加入： 酵母膏 1 0 9 1 2 1 0 3 混合c 源的破乳菌培养基 4 四川大学硕十学位论文 n h d n 0 3 k 2 h p ( ) 4 k h 2 p 0 4 m g s 0 4 7 h 2 0 微量元素溶液 葡萄糖 液体石蜡 酵母膏 蒸馏水 1 1 2 灭菌15 2 0 分钟， 4 o g 4 o g 6 o g 0 2 9 l m l 1 0 0 9 4 1 o g 1 0 0 0 m l 其中葡萄糖单独灭菌或煮沸灭菌l o 分钟。 1 2 1 1 酵母膏葡萄糖培养基( 用于菌种鉴定中葡萄糖发酵检测) 酵母膏 1 0 0 9 葡萄糖 2 0 0 9 c a c 0 3 1 0 o g 蒸馏水1000ml p i q 值为6 8 72 1 1 2 灭菌3 0 分钟。 1 3 试剂 1 3 1 革兰氏染色试剂 1 3 1 1 草酸铵结晶紫染色液 a 液：结晶紫 9 5 乙醇 b 液：草酸铵 蒸馏水 将a 、b 二液充分溶解后混匀静置2 4 小时后，过滤使用。 1 3 12 鲁哥氏碘液 碘 2 o g 2 0 m l o 8 9 8 0 m l 1 0 9 四川大学硕l 二学位论文 碘化钾 蒸馏水 先将碘化钾溶于5 1 0 m l 蒸馏水中，再n a 碘1 o g 蒸馏水至3 0 0 m l 。 1 3 1 39 5 乙醇溶液 1 3 1 4 番红染液 2 5 番红( 沙黄、番红花红、藏红) 的乙醇溶液 蒸馏水 混合后过滤。 2 o g 3 0 0 m l 使其溶解后，加 1 0 m l 9 0 m l 1 3 2 荚膜染色试剂 l 3 2 1 黑墨水染色法试剂 ( 1 ) 6 葡萄糖水溶液 ( 2 ) 绘图墨汁或黑色素水溶液 黑色素水溶液：称取5 9 黑色素，溶解于1 0 0 m l 蒸馏水中，煮沸5 m i n ， 然后加入福尔马林( 4 0 甲醛) 做防腐剂，用玻璃棉过滤。 ( 3 ) 无水乙醇 ( 4 ) 草酸铵结晶紫染色液 1 3 2 2 刚果红美蓝染色法试剂 ( 1 ) 2 刚果红水溶液 ( 2 ) o ，0 1 o 1 明胶水溶液 ( 3 ) 1 h c l 溶液 ( 4 ) 吕氏碱性美蓝染色液 a 液：美蓝( 亚甲蓝、甲烯蓝、次甲基蓝) 0 6 9 9 5 乙醇3 0 m l b 液：k o h 0 0 l g 蒸馏水 1 0 0 m l 将a 、b 两液分别配好后混合摇匀使用。 6 叫川= 学硕匕学位论文 1 3 3 芽孢染色( 孔雀绿染色法) 试剂 1 3 3 1 齐氏石炭酸复红染液 a 液：碱性复红 0 3 9 9 5 乙醇1 0 r a l b 液：石炭酸 5o g 蒸馏水looml 1 3 3 2 鞭毛染色( 利夫森氏染色法) 试剂分别保存的染液可在冰箱中 保存几个月，室温保存几个星期仍可有效。但混合染液应该立即使用。 1 3 4 抗酸染色( 试剂) 1 3 4 1 石炭酸复红液 a 液：盐基性复红 1 0 乙醇 b 液：石炭酸 蒸馏水 a 、b 液相混摇匀备用。 l 3 4 2 酸性酒精 乙醇( 9 5 ) 浓盐酸 1 3 4 3 吕氏碱性美蓝染色液 配同i 3 2 。 1 3 53 过氧化氢试剂 1 3 , 6 生理盐水 0 3 9 l o r a l 5 o g l o o m l l o o m l 3 m l 1 4 w o 型乳化液 1 , 4 1 模拟工业w o 型乳化液的配制。3 1 i 煤油6 份，加入4 份o 1 s p a n8 0 工业用表面活性剂的稀水溶液， 鹕人学硬士学位论文 另外加入少量n a h c 0 3 粉术，高转速( 9 0 0 0 r m ) 机械快速搅拌1 0 分钟，获得稳定期超过2 0 0 小时的乳白色稳定的乳状液，经过稀释 法旧洲j e 为w o 型乳化液， 1 4 2 胜利油h 1 的w o 型原油乳状液的配制 胜利油阡 东一联原油1 0 0 9 ，加甲苯4 0 0 m l ，混合，磁力搅拌器， 转速约2 0 0 r m ，1 5 - - 2 0 分钟，获得稳定期超过2 0 0 小时的稳定的乳状 液，经过稀释法测定为w o 型乳化液。 1 5 主要仪器 1 5 1p h s 一2 5 型酸度计( 上海雷磁仪器厂) 1 5 2y x q s g 4 1 2 8 0 电热手提压力蒸汽消毒器( 上海医用核子仪器厂) 15 3t i i z 一9 5 型恒温振荡器( 太仓市医疗器械厂) 15 4k x b 一2 5 0 a 生化培养箱( 上海科析实验仪器厂，成都科析仪器成 套公司) 1 5 5j t - 2 型超净工作台( 常州第二航海仪器厂) 1 5 6x s 一1 8 型生物显微镜 南京江南光电( 集团) 股份有限公司】 1 5 7 i n - 1 0 0 b 托盘式扭力天平( 上海第二天平仪器厂) 1 5 8 t g 3 2 8 a 分析天平【上海精密科学仪器有限公司( 天平仪器厂制 造) 】 1 5 9 u v 7 5 5 b 型紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 ( 分析仪器总厂制造) 1 1 5 1 0 l d z 4 0 8 a 低速自动平衡微型离心机( 北京医用离心机厂) 1 51 1s 一4 5 0 掣| 1 籀电r 显微镜( r 本同立公司) 2 方法 2 1w o 型乳化液的生物破乳剂菌种的获得 2 1 1 采样 液体样恼：将采样瓶沈净，封口，灭菌。采集好废水样后迅速 四川大学硕士学位论文 封口。贴上标签，记录样品来源，采样时间。 固体样品：取少量有泥样，放入干净的可封口的小塑料样品袋中， 迅速封【 贴上标签，记录样品来源，采样时间。 2 1 2 利用选择培养基富集培养 2 1 21 从废水样富集适合m m s m 无机盐+ 烷烃培养基生长的细菌 将所采集水样以2 0 ( v ) 比例接入盛有1 5 0 m l 富集培养基 ( m m s m 无机盐培养基+ 4 烷烃) 的2 5 0 m l 三角瓶中，在温度3 0 ， 转速1 6 0 r m 的振荡培养条件下分别进行好氧和厌氧富集7 天，为淘 汰其他异养细菌，以后同样以2 5 b | ：例转接两次新鲜的富集细菌培养 基，并适当补加烷烃，增加富集菌的数量，更加有效地抑制伴生异养 细菌生长。连续1 5 天后，得富集培养菌。 2 1 2 2 从油泥、污泥、土壤固体样筛选m m s m 无机盐+ 烷烃培养基 生长的细菌 将所采集的固体样品l o g 接入盛有1 5 0 m l 富集培养基( m m s m 无机盐培养基十4 烷烃) 的2 5 0 m l 三角瓶中，振荡培养7 天，温度2 8 3 0 ，转速1 6 0 r m 。为淘汰其他异养细菌，以后同样以2 5 l t 例转接两 次新鲜的富集细菌培养基，并适当补加烷烃，增加富集菌的数量，更 加有效地抑制伴生的异养细菌生长。连续1 5 天后，得富集培养菌。 将各个富集培养菌液进行交叉混合富集7 天，温度2 8 3 0 * ( 2 ，转速 1 6 0 r m 。为增加筛选效果和淘汰伴生的异养细菌，以2 0 e k 例转接两 次新鲜的富集培养基。经过约7 天的筛选培养，获得生长优势细菌。 2 1 3 单菌落的分离纯化 墩富集培养液，采用平板划线分离法或稀释分离法接种于牛肉膏 蛋白胨的琼脂平板上。然后将平板放曼于2 8 3 0 c 的恒温培养箱中静 胃培养2 3 天，当平板上出现细菌菌落时。挑选单菌落，划细菌斜面。 再从斜面挑菌采用稀释分离法划牛肉膏蛋白胨的琼脂平板，同样条件 培养1 2 天，挑选单菌落。反复多次稀释划平板分离，直到镜检为纯 9 四川大学坝i ，学位论文 种，划纬 蒲祭i 【尉，保存。 2 1 4 生物表面活性剂产生菌的筛选 利用生物表面活性剂能够溶血的特性，采用血平板培养基筛选生 物表面活性剂。参照文献i l o i 制备血平板，另外注意：采用新鲜羊血， 墩血在无菌条件 = = 操作，取血后快速加玻璃珠振荡，防止血液凝固。 培养基灭菌时不加羊血，灭菌完后冷却至6 0 左右时在无菌条件下加 入新鲜的羊血，混匀后立倒到平板。 分别将分离纯化得到的细菌，接入生物破乳菌实验液体培养基 ( 改进的m m s m 无机盐液体培养基) 中，温度2 8 3 0 ，转速1 6 0 r m 振荡培养2 3 天，转接两次，得到菌液。将萤液用划线分离的方法接 种f 血平板上，2 8 3 0 。c 静置培养i 以天，观察菌落的情况。将出现 溶血有透明圈的单菌落筛选出来，挑单菌落接于生物表面活性剂的斜 面培养基上，2 8 3 0 培养1 2 天。保存斜面。 2 1 5 高表面活性优势菌的选择 2 1 5 1 摇瓶培养：将保存于生物表面活性剂斜面培养的菌种接于盛有 l o o m l 破乳菌实验液体培养基( 改进的m m s m 无机盐液体培养基) 的2 5 0 m l 三角瓶中摇瓶培养液中，2 8 3 0 c ，1 6 0 r m 振荡培养2 3 天。 2 1 5 2 生物表面活性剂排油活陛测定：取一培养皿，加水，水面上加 0 1 m l 正烷烃形成油膜。在油膜中心加摇瓶发酵液。中心油膜被挤向 四周彤成+ 圆圈，圆圈的直径与表面活性剂含量和活性成正比。筛选 出圆幽直径人f3 c m 的菌株进一步研究。 2 1 5 3 高表面活性优势菌的选择：将排油法得到的圆圈直径大于3 c m 的菌株的菌液以2 0 的接种量再次接入盛有l o o m l 生物破乳菌实验 液体培养基( 改进的m m s m 无机盐液体培养基) 的2 5 0 m l 三角瓶中 摇瓶培养液中，2 8 - 3 0 c ，1 6 0 r m 振荡培养2 3 天。反复三次重复摇 瓶培养，反复进行排油实验，筛选出表面活性稳定的菌种，保存在生 物表面活性荆的斜面培养基上。 四川大学硕士学位论文 2 1 6 ，_ i 三物破乳菌的初筛 21 ，6 1 模拟s - 业w o 型乳化液的配制( 见材料1 4 1 ) ：取1 0 m l 配制 好的稳定乳白色乳状液至带塞刻度试管中作为生物破乳菌初筛的选 择模型。 2 1 6 2 初筛方法：将筛选到的高生物表面活性的菌种按入盛有1 0 0 m l 生物破乳菌实验液体培养基( 改进的m m s m 无机盐培养基) 的2 5 0 m l 三角瓶中，于2 8 3 0 ，1 6 0 r m 振荡培养2 3 天，取全菌液进行生物 破乳实验。在含1 0 m l 模拟的w o 型乳状液的试管中加入1 2 m l 细胞 全培养液，振荡摇匀，以不加培养液的空白作为对比。室温，静止观 察破乳效果，记录破乳时间和现象，筛选出破乳效果好的菌株作为初 筛菌株保藏。 2 1 7 生物破乳菌的复筛 2 1 7 1 复筛模型的建立：采用胜利油田东一联的w o 型油乳状液( 见 材料1 4 2 ) 。取配制好的原油乳化液1 份( 含乳化油1 0 9 ，甲苯4 0 m 1 ) 在5 0 m l 刻度试管中。 2 1 7 2 复筛方法：装有原油乳状液( 含乳化油1 0 9 ，甲苯4 0 m 1 ) 的 5 0 m l 刻度试管中加入2 m l 细胞全培养液，反转振荡2 0 0 次，静置观 察破乳时间和破乳现象。细胞与乳状液的接触时闯为2 4 h ，以2 m l 蒸 馏水或不含菌的空白培养基傲空白对照。 2 1 8 破乳率的计算 2 1 8 1 针对工业模拟乳化液破乳的破乳率计算 实验的总乳化液体积为1 0 m l ，破乳完成后直接从刻度试管的刻 度读出出油的体积，记为v i ( m i ) 。 1 0 一v j 破乳率( ) = x1 0 0 1 0 2 1 8 2 针对胜利油田乳化液破乳的破乳率计算 州川大学硕i 学位论文 配制的胜利油田东一联w o 型乳状液( 见2 1 7 1 ) 的含水量： 用移液管取配制