（遗传学专业论文）烟草中与rna干扰抑制子hcpro互作蛋白的鉴定.pdf

摘要 马铃薯y 病毒的h c - p r o 蛋白是一个抑制能力很强的r n a 干扰抑制子。为研究h c - p r o 蛋白抑 制r n a 干扰的分子机制我们试图利用马铃薯y 病毒的h c - p r o 为诱饵蛋白，通过酵母双杂交从 烟草c d n a 文库中筛选出与r n a 干扰有关的蛋白因子。利用c l o n t e c h 公司的酵母双杂交试剂盒， 在宿主萤a h l 0 9 中，通过酵母菌的自我重组把烟草叶片的c d n a 文库构建在c d n a 文库载体 p g a d t 7 - r e c 上；把h c - p r o 的c 1 ) n a 连接到载体p g b 盯7 上构建成诱饵载体，然后转化到酵母菌y 1 8 7 中。把含有c d l t a 文库的酵母菌a h l 0 9 与含有诱饵载体的酵母菌y 1 8 7 进行交配，把交配后的菌液 直接涂布到s d 一a d e l - h i s - l e u - t r p 四缺培养基上进行筛选。通过两轮四缺培养基筛选和。一x 一 半乳糖苷酶活性检测，共有1 3 6 个克隆显示a x 半乳糖苷酶活性。在这1 3 6 个克隆中，共测出 1 2 0 个c d n a 的序列，编码2 1 个蛋白因子。将这2 1 个c d n a 质粒与诱饵质粒p g b k t t - h c - p r o 一起 共转化到酵母菌a h l 0 9 中，在四缺培养基上作进一步的筛选和a x - 半乳糖苷酶活性检测，有2 0 个c d n a 质牧表现互作阳性，分别命名为s z l s z 2 0 通过核苷酸和氮基酸序列比较发现除了2 个未知功能蛋白外，其余的互作阳性因子大致可分为4 类：一类是参与植物光合作用和碳水化合 物代谢的蛋白。如：参与叶绿体分裂的p a r a 家族的a t p a s e 、参与三羧酸循环的转酮醇酶、参 与t c 循环乌头酸酶、多糖磷酸化酶和果糖激酶；第二类是一些与植物抗逆有关的因子，有山梨 醇脱氢酶、真菌及伤口诱导蛋白b a r w i n 、过氧化氢酶c a t a l o s e 以及半胱氨酸蛋白酶等：第三类 是参与基因转录、翻译和蛋白代谢的蛋白因子，有多锌指结构蛋白、2 0 sp r o t e a s o m eb e t a 亚基、 i ) n a 聚合酶家族蛋白等；第四类是有关氨基酸和氮代谢的酶。有天冬氮酸蛋白酶、谷氨酰胺合成 酶、胺氧化酶、丝氨酸苏氨酸脱氢酶等。挑选互作阳性相对较强的s z i 和s z 2c d n a 质粒作为重 点研究。 通过5 r a c e 得到了s z i 的5 端，并通过盯- p c r 扩增出了s z l 的c d n a 全长。s z i 是一个 多锌指结构蛋白，含有8 个c o i c 锌指结构n 端是连续的l c s 序列，在第7 和第8 个锌指结构之 间有一个r g g 框。另外，s z l 还有一个异构体，在近n 端缺失6 个氮基酸( 1 6 2 1 ) ，第7 位由半胱 氨酸变为甘氨酸，第3 5 位由天冬氨酸变为组氨酸。 利用与s z 2 核苷酸序列高度同源的番茄基因的核苷酸序列设计出5 端引物，用s z 2 的c d n a 设计出3 端引物，通过r t - p c r 扩增s z 2c d n a 全长，核苷酸和氮基酸序列比对结果表明：s z 2 是2 0 sp r o t e a s o m e 蛋白酶复合体的b e t a 亚基。 将s z i 和s z 2 的c d n a 分别与h c p r o 的c d n a 一起连接到免疫共沉淀载体p e s c - l e u 上，然后 转化酵母菌株i n v s c i ，经过d _ 半乳糖诱导表达后，提取酵母菌总蛋白进行免疫共沉淀。实验结 果表明，s z l 和s z 2 都能与l l c - p r o 蛋白互作。 把s z i 和s z 2 分别连接到原核表达载体p m a l - c 2 x 和p e t 3 0 a 上，构建原核表达载体 p m a l c 2 x - s z l 和p e t 3 0 a s z 2 。在大肠杆菌中都能诱导表达，并在非变性条件下纯化得到了可溶 性蛋白。 s z i 和s z 2 与植物r n a 干扰之问的联系正在继续研究。 关键词：h c p r o ，r n a 干扰，酵母双杂交，锌指结构蛋白，p r o t e a s o m e ，免疫拭沉淀 a b s t r a c t p o t v i r a ih e l p e r - c o m p o n e n tp r o t e i n a s ef l c - p r o ) o fp v yi s a p o t e n tr n a js u p p r e s s o r t o i n v 髂t i g a t et h em o l e c u l a rm e c h a n i s m i nw h i c ht h eh c - p r es u p p r e s s e sr n 灿w eu s e dt h eh c - p r oa s b a i tt os c r e e nf o ri n t e r a c t i n gp r o t e i n s 妇at o b a c c oe d n al f b r a r yi nay e a s tt w o - h y b r i ds d t e m 1 飞e b a i tp l a s m i dw a sc o n s t r u c t e dw i t ht h ef u l ll e n g t hp wh c - p r of u s e dw i t ht h ep g b k t 7d n a - b i n d i n g d o m a i n ( p g b k t t - h c - p r o , t i p + ) a n dt h e nw a st r a n s f e r r e di n t ot h ey e a s ts u a j n sy 1 8 7 1 1 ”t o b a c c ol e a f c 【i n ah b r a r yf u s e dt ot h eg a l 4a c t i v a t i o nd o m a i n ( p g a d t 7 - r e c , l e u + ) w a si nt h ey e a s ts t r a i n a h l 0 9 l e tt h el i b r a r yh o s ts t r a ma h l 0 9m a t i n gw i t ht h eb a i ts t r a i ny 1 8 7 , t h em a t i n gm i x t u r ew a s s p r e a dd i r e c t l yo ot h es d - a d 啦i i s - l e n - t r ps e l e c t i o nn l l x l i m i nt h es c r e e n ，t h e r ew e m 1 3 6p o s i t i v e c l o n e sf u rt h ea - ) ( - g s i a d o s i d s s ea c t i v i t y 1 2 0e d n ap l a s m i d sf r o mt h e1 3 6c l o n e sw e r es e q u e n c e d t w e n t y - o n ep r o t e i n sw e r ee n c o n d e db yt h e1 2 0c d n a p l a s m i d s t h e2 1p u r i f i e dc d n a p l a s m i d sw e r e r e t r e n s f o r m e di n t ot h ey e a s ts t r a i na h l 0 9t o g e t h e rw i t ht h eb a i tp l a s m i dp b g k i v - h c - p r et ot e s tt h e a - x - g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t ya n di n t e r a c t i o ns p e c i f i c i t y t w e n t ye d n ap l a s m i d sd i s p l a y e ds p e c m ca n d s i g n i f i c a n ti n t e r a c t i o n 谢t hp v yh i 唧o t w oo ft h e2 0c d n ap l a s m i ds h o ws t r o n g e ri n t e r a c t i o na n d w e r ed e s i g n a t e ds z ia n ds z 2r e s p e c t i v e l y t h e f u l l l e n g t h d ) n a o f s z la n d s z 2 w e r e c l o n e d w i t h 5 r a c e a n d r t - p c r s z le n c e d sa m u i l l z i n c - f i n g e rp r o t e i nw i t h8c c h cz i n g - f i n g e rm o t i f s ，ar sm o t i fa tne n da n dar g gb o xb e t w e e nt h e s e v e n t ha n de i g h t hf i n g e r ai s o m e ro fs z lw a sf o u n dw i t hs i xa m i n oa c i d sl o s t ( 1 6 - 2 1 ) a n dt w oa m i n o a c i d sc h a n g e d ( 7 ：s t o g ；3 5 ：d t o t l ) n e a r t h e n e n d - a b e t as u b o n i t o f 2 0 s p r o t e a s u m e w a se n c o d e d b y s z 2 s z ia n ds z 2w e r ec l o n e do nt h e p f s c - i e u v e c t o rw i t h h e - p r or e s p e c t i v e l yf o r c o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o ni ny e a s tc e l l s 1 卿c o u l db cp u l l e dd o w nb ys z la n ds 恐r e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a ts z ia n ds z 2c a ni n t e n c tw i t hh c - p m r e s p e c t i v e l y t oo b t a i np r o t e i n so fs z la n d5 2 2 , s z lw a sc l o n e do nt h ep m a l - c 2 xv e c t o ra n ds z 2w a sc l o n e d o nt h ep e t 3 0 av e c t o r t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e t r a n s f o r m e di n t oe c o l ie x p r e s s i o ns 舡a i nt b la n d b 1 2 1r e s p e c t i v e l y 1 1 mf u s i o np r e t e i n so fs z lw i t hm b pa n ds z 2w i t h6 x h i sc a nb ee x p r e s s e da f t e r i e d u c e dw i t hi p t gt h en a t i v ef u s i o np r e t e i n so f s z la n ds z 2h a v eb e e np u r i f i e d t h er e l a t i o nb e t w e e nt h es z i s z 2a n dr n a ii su o d e rs t u d i e d k e yw o r d s ：h c - p m ，r n a is u p p r e s s o r , y e a s tt w o - h y b r i d ，z i n c - f i n g e rp r o t e i n ，p r o t e a s u m e ， c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n u 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：勒永 ；| t时间：一岁年月2 加 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：薪习c l 恢 导师签名： 谚i 鸯 时间：弘尹年j 月2 知 时间： 埘年，月溺 中国农业大学博士学位论文 文献综述 第一章文献综述 r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c er n a i ) 是存在于真核生物中的由双链r n a ( d s r n a ) 引起的 基因沉默现象。r n a 干扰在真核生物的发育调控、抗病毒防御和染色质重构( c h r o n m t i n r e m o d e l i n g ) 等不同的生命过程中起羞重要的作用。r n a 沉默的核心机制就是双链r n a ( d o u b l e - s t r a n d e dr n a ) 在d i c e r 等蛋白因子作用下，形成2 1 - 2 6 b p 的小r n a ，这些小r n a 与 以a r g o n a u t e ( a o o ) 为主的一些蛋白因子一起形成r n a 诱导的基因沉默复合体( r n a - i n d u c e d s i l e n c i n gc o m p l e x e sr i s c ) ，r l s c 复台体在转录水平或转录后水平直接执行基因沉默功能。 基因沉默现象最初是在植物中发现的。1 9 9 0 年，v a nd e rk r o l 小组和n a p o l i 小组分别将d f r 基因和c h s 基因转入矮牵牛，引起了内源同源基因的沉默( n a p o l ic ta 1 ，1 9 9 0 ；, v a nd e tk m le ta 1 ， 1 9 9 0 ) ，当时称这种现象为基因共抑制( 咖p e $ i o n ) ，即外源基因和内源基因同时被沉默的现象。 后来人们将其区分为转录水平的基因沉默( t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g , t g 和转录后基因沉默 ( v e s t 仃 衄n dg e n es i l e n c i n g , f t 6 s ) 。1 9 9 2 年t 在真菌中发现了转基函抑镯( q 窖) 现象 皿o m a oa n dm a c i n o , 1 9 9 2 ) ；1 9 9 5 年c - u o 和k e m p h u e s 在线虫上用转反向基因的方法抑制线虫 p a r - 1 基因的表达，发现p a r - 1 的m r n a 也可以抑制其本身基因的表达。1 9 9 8 年f i r e 及同事僵虹， 1 9 9 s ) 在研究线虫时发现d s r n a 可以非常有效的抑制同源基因的表达，从而发现了r n a 干扰现 象( r n a i n t e r f e r e n c e ，r n 知) 。对螅干扰的发现使科学家们找到一种可在不同生物中诱导基因沉默 的简单的方法，随后相似的依赖同源序列的基因沉默现象伪o m 出嘀卜d c p e n 南lg e n es i l e n c i n g ) 在其 它许多生物体中都有发现，如：石斑鱼，果蝇，老鼠，拟南芥，涡虫，锥形虫以及哺乳动物等 ( k c n n e r d e i l 雠a l ，2 0 0 2 ；l i n d c n b a c ha n dr i c e ，2 0 0 2 ；s v o b o d ac ta 1 ，2 0 0 # ) a 近年来的研究发现r n a 沉默既是真核生物抵抗外来核酸、病毒和转座子入侵，保护自身基 因组的天然机制，也是真核生物调控基园表达和生长发育的重要帆裁。 1 1r n a 沉默的机制 引起r n a 沉默的核心机制就是双链r n a ( d s r n a ) 被d i c e r 等蛋白因子加工成2 1 - 2 6 核苷酸的 小的双螺旋r l q a ，这些小r n a 再与以a g o 为主的蛋白因子组成沉默效应子复合体( r n a ie f f c t e r c o m p l e x e s ) ，这种效应子复合体通过识别井切割与其序列互补的单链r n a 、阻止相应的m r n a 的翻译以及引起同源d n a 的甲基化和染色质的修饰等途径阻止基因表达，引起基因沉默现象 1 1 1 小r n a 的种类 根据小r n a 的来源和功能，可将其分为3 种：来自长的双连r n a 的小干扰r n a ( s i r b l a ) 、 反式澈活的干扰r n a ( t r a n s - a c t i n gs h o x t - i n t e r f e r i n gr n a ，t a - s i r n a ) 和m i c r o r n a ( m i r n a ) 。 产生s i r n a 的双链r n a 包括病毒复制的中问产物、转基因的反向重复、基因组重复序列的 转录产物和依赖于r i q a 的r n a 聚合酶 ，然后再由r d r p 扩增为大量的= 级 s i r n a ( s e a o m l a r s j r n a k 在这种扩增中，r d r p 酶利用砷m a r ys i l i n a 为引物，以将被降解的目标 m 】m 为模板来合成双链r n a 。这种由r d r 随过引物弓i 导合成的5 i r n a 能引起扩展( 印r c a d i a g ) ， 产生的蝴心 a 是由目标基因编码的，而不足由起始r j 临编码的。s i r n 脯着目标m r n a 的扩展只 发生在起始取链r n a 的5 端( $ i j e n ，2 0 0 1 吣。 另一种模式是s i r c a 的扩展不依赖弓l 物引导，单链r n a 片段的复制不需要s i r n a 为引物， s i r n a 的扩展沿着茸标r n a i 自5 和3 都可进行v u i m k t , o 等( b n g n 嘶e ta 1 ，1 9 9 8 ) 年口v a i s t i j ，e e 等 f v a i a i j 眦a 1 ，2 2 ) 分别在烟草和拟南芥上进行的实验绩果证明了这种模式。 沉驮信号的传递机制还不是很清楚，但是最近在植物上的一个研究结果揭示了植物中s i r n a 信号传导的个可能机制( y b o ，2 0 0 4 ) 。y o o ，b c 等从南瓜( p m n p k i nc u c u r b i t am a x i m a ) 和黄瓜 ( c u c u m l m to 蜩皿i ss a t i v u s ) 的韧皮部的茎藏中分离到一个小i u n a 结台蛋白( p h l o e ms m a l lr n a b i n d i n gp r o | e i n l ) p s r b p l 。这个蛋白能选择性的结合2 5 b p 的单链的小鼢i a 。植物中的s 派n a 信号 可能是翅过这个蛋白进行长距离运输。 1 1 6r n a 干扰的遗传调控 对不同生物的r n a 沉默的研究揭示了r n a 沉歉机制在抑制转座子移动、抵抗病毒的侵袭以及 在不同水平调控基因的衷迭等方面的重要功能。但是m 媳沉默机制在执行调控功能的同时，本身 也在璺着调控，在拟南芥中，d i c e r 1 i k e l ( d c l l ) 的m r n a 受到m i r 1 6 2 的调控( k a s s c h a uc ta 1 ，2 0 0 3 ) ： d a v i deb a r l e l 等也发现拟南芥的r j s c 的_ i = 要成分a g 0 1 的m r n a 是m i r 1 6 8 的敲除对象( b a r t e l ， d a v i deb a f l c l 菩也发现拟南芥的r j s c 的主要成分a g 0 l 的仃1 r n a 是m i r 1 6 8 的敲除对象( b a r l e j ， 1 0 一起，如果截去m q a 聚合酶1 i 的羧基术端结构域，就会消除r n a i 现象( s c h r a m k ee ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 1 1 5 沉默信号的扩增与传递 1 9 9 7 年由v a u c h e r e t d - i 等所做的植物嫁接试验和1 9 9 8 年r i r e , a 等再线虫上所作的试验都证 明，褂t a 沉默信号可以扩增和传递( p a l a u q u ie ta 1 ，1 9 9 7 ；f i r e ，1 9 9 8 ) 。后来分别在线虫、真蓠和植 物上发现了沉默信号扩增所需的一种r n a 聚合酶，称为鼢n 指导的砌峨聚合酶( r n a - d e p e n d e n t r n ap o l y m e r a s e s ) ，简称为r d r s 或r d r p s ( c o g o n ia n dm a c i n o ，1 9 9 9 ；d a l m a yc ta 1 ，2 0 0 0 ；m o u r r a i n ， 2 0 0 0 ；s m a r d o n ，2 0 0 0 ；s i j e n ，2 0 0 1 b ；h a l l ，2 0 0 2 ；v o l p e ，2 0 0 2 ) 。r d r s 具有与依赖d 】盼的r 1 悄最合酶 相同的模序( m o t i f ) 。线虫、拟南芥和脉胞菌( n e m x , p o r ae r a s s a ) 中都有有效的姒) r s 蒸因家族 在拟南芥中，其r d r l 和r d r 6 ( s d e l s g s 2 ) 同源基因是细胞质内由转基因和病毒入侵所引起的 r n a 沉默所必需的，但也有实验表明这两种蛋白对不同来源的病毒r n a 具有专一性：拟南芥 r d r 6 - 突变体对黄瓜花叶病毒很敏感，而对烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒不敏感；r d r l 表达降低 的烟草对烟草花叶病毒的感染性增强；r d r 2 突变体不能产生内源的s i s n a , 包括来源于反转座子 的s i l 心i a 。 r d r p | 前只在线虫、脉胞菌和酵母菌等真菌以及植物中发现，在果蝇和哺乳动物中还没有发 现。 s 氓n a 扩增模式有两种，一种是s i j e n 等根据他们的实验结果提出来的：在线虫中，双链r n a 首先被切割成很少的初级的s l r n a ( p r i m a r ys i r n a ) ，然后再由r d r p 扩增为大量的二级 s i r n a ( s e c o n d a r ys i v a ) 。在这种扩增中，r d 肿酶利用p r i m a r y s i r n a 为引物，以将被降解的目标 m 】；t n a 为模板来合成双链r n a 。这种由r d r 随过引物引导合成的s i r n a 能引起扩展( s p r e a d i n g ) ， 产生的s i l t n a 是由目标基因编码的，而不是由起始m 噙编码的。s 氓n a 沿着目标m r n a 的扩展只 发生在起始双链r n a 的5 端( s i j e n ，2 0 0 1 幻。 另一种模式是s i r n a 的扩展不依赖引物引导，单链r n a 片段的复制不需要s i r n a 为引物， s i r n a 的扩展沿着目标r n a 向5 和3 嘟可进行。v o i n n e t , o 等( 蹦印e t ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 和v a i s 蜥，e b 等 ( v a i s t i je ta 1 ，2 0 0 2 ) 分别在烟草和拟南芥上进行的实验结果证明了这种模式。 沉默信号的传递机制还不是很清楚。但是最近在植物上的一个研究结果揭示了植物中s i r n a 信号传导的一个可能机制m o ，2 0 0 4 ) 。y o o b c 等从南瓜( p u m p k i nc u c u r b i t am a x i m a ) 和黄瓜 ( c u c u m b e rc u c u m i ss a t i v u s ) 的韧皮部的茎液中分离到一个，b r h a 结合蛋白( p h l o e ms m a l lr n a b i n d i n g p r o t e i n l ) p s r b p l 。这个蛋白能选择性的结合2 5 b p 的单链的- ，b r n a 。植物中的s i r n a 信号 可能是通过这个蛋白进行长距离运输。 1 1 6r n a 干扰的遗传调控 对不同生物的r n a 沉默的研究揭示了r n a 沉默机制在抑制转座子移动、抵抗病毒的侵袭以及 在不同水平调控基因的表达等方面的重要功能。但是l a 沉默机制在执行调控功能的同时，本身 也在受着调控。在拟南芥中，d j c e r 1 i k e l ( d c l l ) 的m r n a 受到m j r 1 6 2 的调控( k a s s c h a uc ta 1 ，2 0 0 3 ) ； d a v i dp - b a r t e l 等也发现拟南芥的r j s c 的主要成分a g o j 的m r n a 是m j r 1 6 8 的敲除对象( b a r t e l ， 1 0 中国农业大学博士学位论文文献综述 2 0 0 4 ) 。通过遗传筛选在线虫中发现了两个蛋白，e r l - 1 ( k e n n e d ye ta 1 ，2 0 0 4 ) 和r r f - 3 ( s i m m e r , 2 0 0 2 ) 。这两个基因的突变都能明显地促进r n a 干扰。e r i - 1 含有一个保守的d e d d h 基序，具有3 - 5 的核酸外切酶活性，它能够降解具3 端有两个悬垂的s i r n a ，是一个s i r n a s e 。r r f - 3 是线虫四个 r d r p 成员( e g o - 1 ，n f - 1 ，r r f - 2a n dr f f - 3 ) 之一，e g o - 1 和r r f _ 2 可以扩增s i g n a ，促进r n a i ，而r r f - 3 突 变可以显著促进线虫不同组织对砒峨干扰的敏感性，因而r r f - 3 蛋白是线虫r n a 干扰的负调控予 f l n s ，2 0 0 4 ) 。 1 1 7 目前已发现的参与s i r n a 和m i r n a i 盒径的细胞因子 除了d i c e r 和a g o 家族蛋白外，现在己报道的参与r 1 妊干扰的其它细胞因子f 包括s i p n a 和 m i r n a 途径) 已有3 0 多种。新的相关因子正在被不断发现，一些原来已发现的蛋白因子的新功能 也不断被发现。最近在拟南芥上的研究发现了拟南芥的d c i m ( d i c e r - f i k e 4 ) 的功能，d c l 4 参与 植物体内乜捌r n a 的生物形成o c ta l 。2 0 0 5 ) ；s g s 2 s d e l 除了参与s i r n a 的形成外，还与其等 位基匮t s g s 3 和r d r 铲起参与m - s i r n a 的形成口e f a g i e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。原来在拟南芥中发现的双链 r n a 结合蛋白m 粥1 ，最近也发现了它的新功能，它还是一个m 讯n 甲基转移酶，能使 m i r n a m i r n a 双螺旋甲基化( y ue ta l ，2 0 0 5 ) 。表1 1 和表1 2 是目前已报道的有关r n a ：f 扰的蛋 白因子( 大部分引g u n t e r m e i s t e r t h o m a s t u s c h t 的综述，一些是笔者所加) ( m e i s t e r a n d t u s c m 2 0 0 4 ) 另外，v a l e r i e j p r o b e r t 等人在对线虫生殖细胞进行r n a i 筛选( r n a is c r e e n ) 时发现了4 个参 与共抑制作用的基因也参与r n a i 机制，它们分别是具有h m gb o x 的e g t - 1 3 、具有r g gb o x 的 p g n q 、r n a h c l i c a s er h a 一1 和核苷酸转移酶( n u c l c o f i d y l t r a n s f e r a s e ) k 1 0 d 2 3 ( r o b e r te ta 1 2 0 0 5 ) 。 1 1 中国农业大学博_ 上学位论文 文献综述 表卜1且前已发现的各物种参与r n a i 或转录基因沉默的细胞因子 蛋白名称结构域或横块功能来源物种 d i c e ra n dd i c e r1 i k cp r o t e i e d i c e r r n a s e i i i , d e a d l o n g d s r n a h o m os 印i c p a z , d s r n ap r o c e s s i n g ( h s ) d ( 聚l r n a s e m , d e a d i j ) e gd s r n ac e l e g a a s p a z , d s r n a p r o c e s s r a g( c e ) d c r - l r n a s e l l i , h e l i c c l o n gd s r n an m c k 唧咐。 p a z , d s r n a p r o c e s s i n g ( d m ) r i s ca s s e m b l y d c 田- 2 r n a j n d e a d l o n g & r n a d m c l a a o g a s t e r d s r n a e r o c 地 r i s ca s m b d r n m e m , d e a d l o n g d s r n a 丸n = l i a n a p a z 幽剐胁 p r o c e s s i n ga t ) d a l 3 r n = c l d e a d l o 雌d s r l 她 a t h a h a n a p 舵 p 帕髓s 面咤 a g o p i o t e i a f b m i l y a g o l p a z , m w l s h o r tr n a b i n d i n g h s , d m 1 p a z , f i w l a t , s p a g 0 2 p a z , f i w ls h o r tr n a b i n d i n g h s , d m 渤 p a z , p 1 w is h o r tr n a b i n d i n g h s a g 0 4 p a z , p i w ia t p i w in 啦u 删i d m a e b 廿g i n e p a z , p i w l d m r d l l p a z 即v j l n i t i t a t l o nr n a ic c p p w - 1 p a z , p v t n c e o d e 2 p a z , p f q w n c p u t a t i v er n a h c l l c a s e s a r m i t a g ed e d r i s ca s s e m b l y d m s p i n d l e e d e a d d m r m 6 2 d e a d d m s 啷 d e a d a t 啊- 1 ，2 d e a d c c m 睇1 4d e a d c t s m ( 2d e d c c r n a - d e p e n d e m r n a p o y m e m u ： s g s 2 ，s d e l r n a p o l y m e r a s e r n a a m p l i f i c a t i o n a t r d r 2 r n a p o l y r a e r a s e r n a a n p l i f i c a t i o na t e g o 1 r n a p o y m e m s e r n a a m p l i f i c a t i o n c c r r f - 1 r n a p o l y m e r a s c r n a a m p l i f i c a t i o nc c r r f - 3 r n a p o l y m e r a s e c e o d e - l r n a p c l y m e r a s e r n a a m p l i f i c a t i o nn c 】2 中国农业大学博士学位论文 文献综述 表卜2 参与m i r n a 指导的翻译调控的墨白因子已发现的rn a 沉默抑制子 蛋自名称结构域 功能来源物种 d i c e ra n dd i p 瑚p r o t e i n d i c e rr n a s e l l l , d e a d 。眦d s r b dp r c - m i r n a h s i m x e s s m g d c l 0 1 r n a s d l i , d e a d ，p a z ，d s r b d p r e - m i r n a c s p r o c e s s m g d c r 1 r n a s d l i , d e a d , p a z , d s r b d p m - m i r n ad s p r o c e s s i n g d ( 工1 r n a s e l i i , d e a d , p a z , d s r b d p r e - m i r n aa t p r o c e s s m g a g op r o t e i nf a m i l y a g 0 1 p a z p x w i s h o r tr n a b i n d i n g d m , h s a g 0 2 p a z , p i v d s h o r tr n a b i n d i a gd m 胁 a 鼢 p a z , p p q 铀o nr n a b i n d i n g i s a g 0 4 p a z , p i w l s h o ar n a b i n d i n gh s a g 0 1 p a z , p 冈l ，i a t a l c 卜1 2 p a z , f i w i c e p m a t l v er n a h d i c a s e s g e m i n 3d e a dr n a h e l l c a s e a n n i t a g e d e a dr i s ca s s e m b l yd m o t h h 蜘 d m mr n 棚 p w c t s s i n go f 州- m i r n am p a s h ar n c m n o 咖o f p r i - m i r n a d m e x p o r t j n - 5n u c l e a r e x p 硪o f p t e m i r n a h s g c m l n 4 l 缸 f m r p , f x r k h ，r g gr n a b i n d i n gd 啪 r i b o s o m a lp r o t e i n l 8 , l l l 6 0 sn b o s o m e a ld m s u b u n i t h y l l凼r b d a t h e n l m e t h y l t n t n s f e r a s em e t h y l a t l o no fm i r n a n d r n a * a t 幽啪 d g c r 8 出r b d p f i - m i r n a p r o c e s s i n g h s r n a p o l y m e r a s ei i h e t e w c h r o m a t i na s s e m b l y s c e r e v i s i a e r n a p o l y m e f x s e i vh e t e r o c h m m a t i nf o r m a t i o na t 1 2 病毒编码的基因沉默抑制子的研究 r n a 干扰是植物和动物在进化中获得的的一种防御机制。现在已经有许多试验结果证明转录 ，l 再基因沉默( p t g s ) 是动植物抵抗外来病毒入侵的一个适应性免痰系统。病毒在复制过稃中形 成的双链r n a 被核糖核酸酶l j l 切割成s i r n a ，s i 鼢m 与其它蛋白冈子形成沉默效应子复合体r i s c 1 3 以后来执行抗病毒功能。作为一种相应的对抗策略，许多病毒也产生一些蛋白因子，在不同阶段 上抑制r n a 干扰机制。 1 2 1病毒编码的r n a i 抑制子的发现及其多样性 马铃薯y 病毒( p v y ) 的h c - p r o 蛋白是第一个被发现的l t l 峨沉默抑制子( a n d a l a k s h l ，l ie ta 1 ， 1 9 9 8 ) 。p r u s s , g 等和k a s s c h a u , k 等最初的研究发现，马铃薯y 病毒的h c - p r o 蛋白可以促进自身及 一些不相关病毒在植物上的入侵和复制，并能促进病毒在植物体内的长距离运输，因此认为 h c - d m 可以抑制植物的抗病毒机制。当发现r n a ：扰是植物抗病毒的机制之一后，他们就利用实 验来验证h c - p r o 是否抑制植物的r n a i ，从而发现t h c - p m 蛋白的r n a s ：扰抑制子功能( k a s s c h a l l e ta 1 。1 9 9 7 ；p m s s e t a l ，1 9 9 7 ) 根据同样道理，1 9 9 8 年b r i g n e t i ，g 等发现了黄瓜花叶病毒( c m v ) 的2 b 蛋白也是植物的m 4 a 干扰的抑制子t 西i g a e e e t a l ，1 9 9 8 ) 。由于r n a 干扰是植物的一个普遍的 抗病毒机制，因而人们预料产生砌妣干扰抑制子可能是许多植物病毒共同拥有的应对机制。 在认识到病毒的致病因子h c - p r o 和2 b 能抑制r n a i 后，人们开始验证其他病毒的致病因子的 r n a i 抑制子功能，从而发现了一赭新的l u 蛆干扰抑制子( v o i n n e t e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。目前已发现许多植 物病毒都能产生r n a 抑制子，包括r n a 病毒、d n a 病毒、正链r n a 病毒、负链r 嫡毒和d n a 病毒都能产生r m 抑制子。在一些动物病毒中也发现了r n a i 抑制子( ue t a l 2 0 0 2 ) 。目前已发现 的病毒砌q a 沉默抑制子约有2 0 多种，但是不同病毒的抑制子的结构不同，它们的核苷酸序列和氨 基酸序列之间没有一致性，各抑制子之间没有共同的序列模块。它们在各自病毒上的生物学功能 也不尽相同。一些实验结果表明，这些删抑制子在不同的阶段和步骤上抑制r n a i 机制。 o l i v i e r v o i n 】l e t 研究室用不相关的5 个植物病毒砒姨干扰抑制子( p 1 h c - p r 0 、p 3 8 、p 1 9 、p 2 5 、 p 1 5