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基于毛细管电泳荧光标记的玉米品种s s r 高通量检测体系的建立研究 摘要 本实验基于毛细管电泳s s r 荧光标记，在d n a 快速提取、p c r 扩增及p c r 产物检测等 方面建立了一套高通量玉米品种s s r 标记检测体系，为大批量玉米品种检测及大规模玉米 品种d n a 指纹库构建奠定了基础。并用不同的s s r 引物对1 5 份自交系进行类群划分，探 讨引物的选择对分析结果的影响，为玉米品种检测在引物的选择上提供理论依据。本实验 研究结果如下： 1 本实验探索了适用于玉米品种鉴定及d n a 指纹库构建的玉米品种d n a 快速煮沸法， 用快速煮沸法提取了玉米种子胚、胚乳；水培初生根、侧根：种子出苗后的初生根、侧根、 胚芽鞘、胚轴、叶片等组织d n a ，结果表明，种子胚、胚乳组织；水培2 4 d 水培初生根、 例根绢织；出苗l “5 d 的胚芽鞘、胚轴组织用快速煮沸法提取d n a 效果较好。而且快速煮 沸法提取的d n a 完全可以用于毛细管电泳荧光标记检钡b 2 由于a b l 3 7 3 0 x ld n a 分析仪的灵敏性很高，普通的p c r 扩增反应条件不适应其检 测系统。通过调整p c r 各反应成份的量以及循环条件，最终确定一套适合该检测系统的p c r 扩增及检测体系。 3 本实验用毛细管电泳荧光标记检测法和变性p a g e 银染检测法同时对1 9 2 份玉米品 种7 个s s r 位点检测分析，并比较这两种s s r 检测方法的异同。两种方法检测的片段大小 基本一致。变性p a g e 银染检测法的仪器及试剂成本较低，适宜少量材料的检测分析，尤 其是s s r 标记的筛选；但其操作过程烦琐，影响因素较多，而且效率较低。毛细管电泳荧 光检测法具有高通量、高效率、数据精确、检测系统灵敏等优点，适用于大批量材料的检 测分析。 4 本实验以从网上筛选的1 6 3 对s s r 引物对1 5 份国内骨干自交系进行类群划分。1 6 3 对s s r 引物中，有2 2 个引物扩增失败或者出现严重的缺管现象，其余的1 4 1 对s s r 引物 分别检测到2 8 个a l l e l e ，共检测到6 6 5a l l e l e ，平均每个引物检测到4 7 个a l l e l e ， 各引物的p i c 值为0 2 4 0 8 4 4 ，平均p i c 值为0 6 8 。选择不同的引物对1 5 个自交系进行 聚类分析，结果表明，选用不同的s s r 引物对1 5 份自交系的聚类分析结果影响较大。 关键字：玉米；s s r ；毛细管电泳荧光标记；类群划分 e s t a b l i s h m e n tah i g ht h r o u g h p u td e t e c t i o ns y s t e mo fs s rm a r k e r sf i t t i n gf o r m a i z ev a r i e t yb a s e do i lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t hf l u o r e s c e n c e a b s t r a c t t h er e s e a r c hb a s e do nc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t hs s rf l u o r e s c e n c em a r k e r s ，ah i 曲 t h r o u g h p u td e t e c t i o ns y s t e mf i t t i n gf o rm a i z ev a r i e t yi d e n t i f i c a t i o nw a se s t a b l i s h e df i n a l l ya n d t h ed e t e c t i o ns y s t e mw a so p t i m i z e df r o ms c r e e n i n gs s rm a r k e r s ，p c ra n dd e t e c t i o np r o t o c o l s a n dd n ae x t r a c t i o n t h es y s t e mw o u l db ea p p l i e di nm a i z ev a r i e t yi d e n t i f i c a t i o na n d e s t a b l i s h i n g d n a f i n g e r p r i n t i n g p o o l o f g r e a ts c a l e m a i z e v a r i e t y t h er e s u l t ss h o w e d t h a t ： 1 aq u i c kd n ae x t r a c t i o nt e c h n i q u ew h i c hw a sf i t t i n gf o rm a i z ev a r i e t yi d e n t i f i c a t i o na n d e s t a b l i s h i n gd n af i n g e r p r i n t i n gp o o lw a se x p l o r e d ，a n dt h et e c h n i q u ew a sw e l la p p l i e di nt h e f o l l o w i n gt i s s u e sf o rd n ae x t r a c t i o n ：e m b r y o ，e n d o s p e r m ；r a d i c e l ，c o l e o p t i l e ，h y p o c o t y lf r o m g e r m i n a t e d1 3d a y sm a t e r i a l t h ee x t r a c t i o nd n a i sa u i t a b 忙f o rc a p i l l a r y4 。s e gc r g , p f l c f g s i 。aw i t h f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o ns y s t e m 2 。a sh i 翡s e n s i t i v e n e s so f a b l 3 7 3 0 x ld n a a n a l y z e r ，c o m m o np c ra m p l i f i c a t i o n r e a c t i o ns y s t e mw a sn o ts u i t a b l ef o rt h ed e t e c t i o ns y s t e m as y s t e mf i t t i n gf o rp c ra m p l i f i c a t i o n r e a c t i o na n dd e t e c t i o nw a se s t a b l i s h e df i n a l l yt h r o u g ht h er e g u l a t i o no fp c r c o m p o s i t i o na n d c y c l e s 3 s e v e ns s rp r i m e r sa n d1 9 2m a i z eh y b r i dw e r eu s e dt oc o m p a r a t i v e l ya n a l y z es s r m a r k e r sb e t w e e nc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s w i t hf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o na n d d e n a t u r i n g p a g e ( p o l y a e r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i s ) s i l v e r - s t a i n i n gd e t e c t m n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t s s rm a r k e r sf r a g m e n ts i z e se x p l o r e db yt w od e t e c t i o ns y s t e m sw e r er e l a t i v e l ys i m i l a r c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sw i t hf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nh a st h ea d v a n t a g e so fh i # a c c u r a c y , s e n s i t i v e n e s s , c o s te f f e c t i v e n e s sa n dh i g ht h r o u g h p u t t h e r e f o r e , t h e c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i sw i t hf l u o r e s c e n c e d e t e c t i o ns y s t e mi ss u g g e s t e dt ob es u i t a b l ef o rs c a n n i n ga n da n a l y z i n gl a r g e - s c a l em a t e r i a l w h i l ed e n a t u r i n gp a g e s i l v e r - s t a i n i n gd e t e c t i o nw o u l db eu s e di ne x a m i n i n gaf e ws a m _ p i e s , e s p e c i a l l yi ns c r e e n i n gs s r m a r k e r s 4 1 6 3p a i r so fs s r p r i m e r ss e l e c t e df r o mt h ei n t e r a c tw a ss c r e e n e db yu s i n g1 5i m p o r t a n t i n b r e dl i n e sw i d e l yu s e di np r o d u c t i o n 。毡t h e1 6 3 p a i r so fp r i m e r s 。2 2s s rp a i r sd i dn o ta m p l y o r “n u l la l l e l e , 2 - 8a l l e l e sc o u l d b ed e t e c t e di nt h eo t h e r1 4 1p r i m e r s ，w i t hat o t a lo f6 6 5a l l e l e s ， a na v e r a g e o f 4 7a l l e l e s p e r l o c u s a m e a n p o l y m o r p h i s m i n f o r m a t i o nc o n t e n t o f o 6 8 w i t ha r a n g eo fo 2 4t o0 8 4 4w a so b s e r v e d 1 5i n b r e dl i n e sw e r ec l u s t e ra n a l y z e du s i n gu p g m a m e t h o db yd i f f e r e n ts s r p r i m e r s ，t h ed u s t e rr e s u l t ss i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c e db yt h es e l e c t i o no f s s r p r i m e r s k e yw o r d s ：m a i z e ；s s r ；c a p i l l a r ye l e c t m i p h o r e s i sw i t hf l u o r e s c e n c e ；h e t e r o t i cg r o u p i n g 首都师范大学硕士毕业论文 1 引言 玉米是我国重要的饲料、食品及工业原料作物，其产量和质量水平在国民经济发展中 有着举足轻重的影响。现在，我国玉米育种研究和种子生产经营开始向商业化转移，越来 越多的企业投资玉米产业。由于玉米种子生产蕴涵着巨大的经济利润，使得种子市场中的 剽窃现象十分猖撅。在种子生产和品种归属上，侵权行为越来越严重，产权纠纷案件频频 发生：一些不法经营者以假冒真、以次充好，坑农、害农现象大量出现，极大地损害了农 民和国家的利益。快速准确地进行玉米品种检测对于种子质量标准化、品种审定、假种辨 别、产权纠纷均有重要作用。 1 1s s r 分子标记 1 1 1s s r 标记概述 微卫星d n a 又称为简单序列重复( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，s s r ) ，s s r 是由1 6 个核 苷酸，如( c a ) n 、( g a g ) n 、( g a c a ) n 等重复1 0 2 0 次不等的首尾相连的串联重复序列。s s r 是短的串联简单重复序列，是由核心序列与两侧的侧翼序列构成。微卫星核心序列的重复 数与该座位的等位基因数有很强的正相关，序列重复次数越多，其变异性越大，则该微卫 星座位的等位基因数目就越多。不同物种中，微卫星序列的含量各不相同，在人类基因组 中约有3 0 0 0 0 拷贝以上的微卫星序列，其中，哺乳动物基因组中微卫星序列的含量大约是 植物基因组的2 l o 倍。并且各种微卫星序列的丰度在不同物种中也各不相同。例如，在 人类及哺乳类动物基因组中，最丰富的微卫星序列是( a c ) n ；而在植物基因组中则以( a t l n 最多( w a n g ，1 9 9 4 ) 。在真核生物基因组中，二核苷酸微卫星序列最为丰富，三核苷酸 微卫星序列的含量比二核苷酸微卫星序列大约低1 0 倍，而四核苷酸微卫星序列则相对较 少( m azq ，1 9 9 6 ) 。微卫星序列属于中等程度重复序列，一般分布于真核生物基因组中。 但是，这种随机均匀并不是完全均匀，微卫星通常出现在染色体端部的频率高于染色体着 丝粒部位，而且在编码区及非编码区均有分布，对于不同核心序列的重复序列，又有其分 布的偏好性和特异性。水稻基因组中微卫星序列的分布频率及其分布特点的分析表明，g c 丰富的三核苷酸微卫星序列在蛋白质编码区较多，而a t 丰富的三核苷酸微卫星序列却没 有这种特点。此外，二和四核苷酸微卫星序列更多分布于非编码区、基因间隔区，其中( a t ) n 微卫星序列常常与微型反向重复转座元件家族分布在一起( t e m u y k h ，2 0 0 1 ) 。 关于微卫星序列的起源，一般认为是由原微卫星序列通过复制滑移使序列长度增加形 成的，而原微卫星序列则可能来源于随机点突变。虽然从复制滑移假说角度来看，在物种 基于毛细管电泳荧光标记的玉米品种s s r 高通量检测体系的建立研究 进化过程应该可以产生较长的微卫星序列。但是，实际上生物体内的微卫星序列并不能无 限延长。w i e r d l e 等( 1 9 9 7 ) 将不同长度的微卫星序列导入酵母中进行复制，短的微卫星序 列突变时，主要是基本重复单位的增加，而长的微卫星序列则主要表现为基本重复单位的 丢失。还有人认为微卫星序列的长度及其分布是微卫星序列的复制滑移和随机点突变在进 化过程中的共同作用的结果，二者通常在基因组中处于一种平衡状态( k r u g l y a k ，2 0 0 0 ) 。 目前的研究发现，进化过程中不同物种的错配修复系统有差异，它们对不同序列类型的 错配有着不同的修复效率( s e h l t t e r e r ，2 0 0 0 ) 。这可能就是造成不同物种中不同微卫星序列 的丰度各不相同的主要原因。s s r 侧翼序列位于核心序列两侧，为保守的特异单拷贝序列， 能使微卫星特异地定位于染色体的特定部位，核心序列重复数差异则形成微卫星高度多态 性，如某个体基因组中一对同源染色体相对位置( 侧翼序列相同) 上的重复单位数相等，该 个体在该位点的基因型是纯合的，重复数不相等则是杂合的。人们可以利用侧翼序列来设 计与之互补的引物对。特异的微卫星位点通过p c r 被扩增出来，再根据不同等位基因之间 的长度差异，利用高分辨率的聚丙烯酸胺凝胶电泳( p a g e ) 技术将它们区分开来。 1 1 2s s r 的形成原因 有报道指出，s s r 在植物种间以及种内群间、个体间存在高度多态性，在微卫星位点 上检出等位基因的数目与微卫星的长度有较好的线性关系。微卫星的重复次数越多，检出 的等位基因数目越多。引起s s r 突变的分子机理尚在讨论中，目前较为流行的观点认为， 这种突变是d 滑移n as l i p p a g e ) 和d n a 复制修复系统共同作用的结果。该假说认为，微 卫星序列在复制过程中新生链和模板链之间有时会发生局部解链和重新配对。重新配对 时，新生链和模板链偶尔会错位而产生错配，d n a 聚合酶在这种错配的d n a 链上继续合 成，就会导致新生链的长度发生变化。如果这种错配不被体内的d n a 复制修复系统正确 修复，下一轮复制时就可以产生序列长度突交了的双链d n a ( h e a l e ，1 9 9 5 ；s c h l t t e r e r ， 1 9 9 2 ) 。d n a 滑移频率本身受多种因素的影响。其中，微卫星序列的长度与序列的突变率 呈正相关，并且这种相关性不是简单的线性关系。w i e r d i e 等利用酵母系统研究微卫星序列 的突变率时发现，长度为1 0 5 b p 的g t 微卫星序列的突变率比1 5b p 盼、g t 微卫星序列高出 5 0 倍( w i e r d i e ，1 9 9 7 ) 。但是，如果微卫星序列内部含有与基本重复单位不一致的间插碱 基时，突变率将大大降低( h e a l e ，1 9 9 5 ) 。离体实验还发现，滑移突变具有方向性：基本 重复单位的增加或减少一般发生在序列的37 端。在体内复制滑移还受所在染色体位置及 其侧翼序列的影响甚至年龄和性别都会影响到微卫星序列的突变率( k u n k e l ，1 9 9 3 ： e u e g r e n ，2 0 0 0 ) 。 2 首都师范大学硕士毕业论文 s s r 突变机理还有其它假说主要包括：一是不均等交换机理，指在有丝分裂或减数分 裂时姊妹染色体之间或减数分裂时同源染色体之间的不均等交换所致；第二是重组假说； 三是认为在d n a 聚合酶的校对功能上，通过d n a 聚合酶的校对而产生简单重复序列，而 不是去讨论单独错配的修复系统( s t r e i s i n g e r1 9 8 5 ) 。现在为人们所接受最多的是滑动学 说，其次是不均等交换机理( 徐晓立，2 0 0 2 ；孙伟，2 0 0 1 ) 。 1 1 3s s r 的类型 按照重复单位的碱基数可将微卫星分为l 6 核苷酸重复类型，其中二核苷酸重复有4 种类型：( a t ) n ( t a ) n 、( a g ) 坝t c ) n 、( a c ) n j ( g t ) n 、( g c ) n ( c g ) n ；三核苷酸重复有1 0 种类 型：( a a t ) n ( t a t ) n 、( a a o ) n ( t c t ) n 、( a a c ) n ( t g t ) n 、( a t g ) n ( t c a ) n 、( a g t ) n ( t a c ) n 、 ( a o o ) n j ( t c c ) n 、( a g c ) r d ( t g c ) n 、( a c g ) r y ( t c g ) n 、( a c c ) n ( t o g ) n 、( g g c ) r g ( c g c ) n ； 四核苷酸重复类型有3 2 种( j u r k e ，1 9 9 5 ) 。所有类型的微卫星中以单核苷酸重复和二核苷酸 重复的微卫星在基因组中出现的频率最高。同一重复类型中不同的碱基重复多态性也不一 致。大豆中大于1 5 个重复单位的( g a ) n 的多态性较低，而较多的( a t ) n 重复的s s r 具有较高的多态性信息量( m a h i n u r ，1 9 9 2 ) 。 另外，w e b e r ( 1 9 9 0 ) 按照微卫星核心序列结构的不同将微卫星标记分为三种类型：( 1 ) 完全型( p e r f e c o ：指核心序列以不间断的重复方式构成的微卫星；( 2 ) 不完全型( i m p e r f e c t ) ： 指在微卫星的核心序列之间有几个非重复碱基，但其两端的连续重复的核心序列重复次数 大于3 ；( 3 ) 复合型( c o m p o u n d ) ：指两种或两种以上的串联核心序列由几个连续的非重复碱 基分隔开，但各种连续性的核心序列重复次数不少于5 。 1 1 4s s r 标记的引物来源 微卫星d n a 分析成功与否的关键因素有两个，一是p c r 扩增的效果，另一个就是侧 翼序列引物的来源。一般来说，微卫星扩增的引物来源有四个：一是直接应用已发表的微 卫星d n a 引物；二是使用近缘种的引物；三是通过筛选d n a 序列数据库，或筛选克隆文 库的简单重复d n a 序列，借助于计算机软件进行引物设计；四是最好也是最根本的方法， 即构建基因组文库。再根据微卫星位点两翼的序列来设计引物。如果一个核心基元中没有 任何核苷酸替换的重复序列，具有1 5 次或更多次的重复单位，那么这种重复序列可以用 来设计微卫星的p c r 引物，但要注意以下情况的重复序列是不适合用于引物设计的：重复 次数太低；重复不完全；重复位点太靠近插入片段的末端；侧翼序列的g + c 含量太低( 3 5 0 b p 的d n a 片段用常规的p c r 程序扩增后用毛细管电泳荧光标记检测 法检测的结果，分子量标准( g s 3 7 3 05 0 0 ) 3 3 4 两种检测方法灵敏性的比较 p c r 产物稀释1 0 倍后用常规的变性p a g e 银染检测法检测谱带就比较弱，稀释到2 0 倍时p c r 产物难以检测到，如图3 2 1 所示。而p c r 产物即使稀释3 0 0 倍后用毛细管电泳 荧光标记检测法检测的结果仍然能够正常分析。毛细管电泳荧光标记检测法的灵敏性要远 高于常规的变性p a g e 银染法，在微量的p c r 产物分析中表现了强大的分析能力。 图3 2 1p c r 产物稀释不同倍数用变性p a g e 银染 检测法检测的结果 1 未稀释，2 稀释2 倍，3 稀释5 倍，4 稀释l o 倍， 5 稀释1 5 倍6 稀释2 0 倍 3 3 5 两种方法的工作效率比较 分析相同的1 9 2 份玉米杂交种，每份品种选3 个重复。根据引物片段大小的分布及标 记的颜色，将7 个引物的扩增产物混点，毛细管电泳荧光标记检测法只需要电泳6 块9 6 孔板，2 小时就能完成1 9 2 份样品7 个s s r 位点的电泳检测。分析1 9 2 份样品7 个s s r 位点用变性p a g e 银染法检测共需要电泳7 7 块板，每人每天能完成4 块板，共需要约2 0 天的时间。使用毛细管电泳荧光标记检测法能大大提高玉米品种s s r 标记的检测效率。 3 3 6 讨论 毛细管电泳荧光标记检测法与变性p a g e 银染检测法的分辨率都能达到1 b p ，两种方 法检测到的数据具有一致性，而且两种方法检测到的等位基因数目相同，不同实验室用这 两种不同方法检测到的数据均能整合到一起，实现了各实验室数据的交流。 由于毛细管电泳荧光标记检测法系统自动化程度很高，能自动灌胶、上样、电泳和收 基于毛细管电泳荧光标记的玉米品种s s r 商通量检测体系的建立研究 集数据，与蒋通蛇交性p a g e 银染系统相比，省去了赞时、费力、有毒害的配制聚丙烯酰 胺凝狡| ；l j 瑟锻染等操俸步骤，将搡箨赣扶低效率、太强度的工终串释放出来。 掰且这种自 动化程度的提高，不仅省去了人力，搬商了工作效举，也避免了这些操作中的人为误差， 从面增强了嶷验结果的稳定性和可重复性。弗且毫缨管电泳荧光标记检测法的系统软件能 校正各毛绸管阔翡电泳差舞，麸最大裰度上减少了寓验的系统谖麓。 用变性p a g e 银染梭测法分析样鼯时，不同样晶d n a 的片段大小要与融知分子量 m a r k e r 微e 较，或者是将繇个弓l 物所蠢鲍等位基因的标准样品点农每块胶板上佟参照，待 分析样品d n a 片段与参照样品徽眈较来统计实验数据。在分耩的材料耜位煮较多时，如 何整合各胶板的数据以及保证数据的准确性是一个很棘手的问题。人工用肉眼来统计同一 胶板中相寓拔逶，且相差2 4 砸鲍d n a 片段时，突验数据会产爱一定匏误差，这裁大丈 的降低了数据的准确性。在毛细管电泳荧光标记检测系统中，g e n e m a p p e r 软件熊标示出各 引物的所有等位基因，只需要统计待分析的样品的片段大小与哪热等位基因的一致就可以 了，这样更麓纯了数据的绞诗与分辑。 变往p a g e 银染检测法每次点样爨为5 曲，每次燕验均必颓保证重复一次，每5 吐上 样时加入l l a l 变性上样缓冲液，将粘壁、扩增时挥发锋消耗因素考虑进去，l o 乩体系为最 奎体系。瑟羲镪管电泳荧必标记捡溅法艨嚣的样品爨极少，每次上襻量蠢l g l 耀释3 0 售 p c r 产物，将粘壁、扩增时挥发等消耗蹰素考虑进去，5 a l 体系为箍小体系，避样便极大 节约了成本。郝晨阳等( 2 0 0 5 ) 用多重p c rs s r 荧光标记分析技术和常规的变性p a g e 银染 技本分撰5 0 0 0 傍裴方冬，l 、麦襻暴、7 8 个往点嚣，辩这嚣秘方法豹费震设了毙羧，结果表 明，完成5 0 0 0 7 8 个反应，在不考虑仪器成本的前提下，这两种方法的费用熬本持平， 但毛细管电泳s s r 荧光标记分析技术的效率显著高予变性p a g e 银染检测法。 p i n a r 等( 2 0 0 3 ) 剥溺滚缨管毫溶荧澎猿记检测浚农5 0 h 蠹裁竞残了1 9 8 镑梯菇终1 0 0 0 个位点的分析。毛细管电泳荧光标记检测系统建立的高通量高效率、高精确性的d n a 自 动分析技术，尤其适用于大规模材料的分析研究。常规的变性p a g e 银染检测法由于无需 舄蠢鹣实验役器，瑟量试裁成本逢较必低蒎，在分撰少量懿耪辩爱愆经济逶溺，笼其是s s r 标记的筛选时。因为普通合成的引物能保存3 5 年时间，而荧光标记引物只能保存1 2 年， 并且普通引物的合成成本远远低于荧光标记引物。建议在实验中可以将这两种方法有效的 缓台起来，糕臻霉援戆交瞧p a g e 锻荣羧溪法簿选s s r 拣运，鼹入选嚣s s r 标记采蔫荧 光标记，在分析少量材料时，使用变性p a g e 银染检测法，对于大量材料的检测分析时， 用毛细管电泳荧光标记检测法来完成。 首都师范大学硕士毕业论文 3 4 引物的选择对1 5 份自交系类群划分结果的影响 聚类分析是以相似或距离数据为基础形成超度量树的一类方法，它依据数据本身( 而不 是事先的定义) ，将目标进行分组。聚类分析是多元统计分析的一类，被数值分类学家应 用于生物分类上。长期以来，研究者们提出了多种不同的聚类方法，如类平均法( 也称为 非加权配对算术平均法，u p g m a ) 、加权配对算术平均法( w p g m a ) 、最短距离法、最长距离 法、中线法、重心法、离差平方和法等。不同的聚类方法的运算过程都一样，所不同的只 是当类群合并以后新距离系数的计算方法。上述聚类分析方法中，应用最广的是u p g m a 法， 该方法比较直观和简单，运算速度快，其缺点是当分子进化速率变异较大时，在建树过程 中会引入系统误差。而分子进化速率在种内各群体间变异不会太大，因此用u p g m a 法对亲 缘关系较近的群体进行聚类分析具有较高的准确性。本实验根据遗传相似值矩阵，按u p g m a 法对1 5 份自交系进行聚类分析，并探讨了引物的选择对类群划分结果的影响。 3 4 1s s r 多态性的分析 1 6 3 对s s r 引物有2 2 个扩增失败或扩增有严重缺管现象，1 4 1 对s s r 引物在1 5 份自 交系间分别检测到2 8 个a l l e l e ，其检测到6 6 5a l l e l e ，平均每个引物检测到4 7 个 a l l e l e ，各引物的p i c 值为0 2 4 0 8 4 4 ，平均p i c 值为0 6 8 ( 见表3 4 ) 。 表3 41 5 份自交系扩增的1 6 3 对s s r 引物、等位基因数、p i c 基于毛细管电泳荧光标记的擞米品种s s r 黼通量检测体系的建立研究 u m e l 3 0 6 u m e l 5 1 2 b n l 9 1 6 7 1 p h i 2 2 7 5 6 2 u m e l 0 6 4 b n l 9 2 3 31 u m e l 7 9 7 u m c l 5 3 8 p h i 4 0 2 8 9 3 u m e 2 0 9 4 p h i 9 6 1 0 0 b n l 9 1 2 5 u m c l 2 6 1 u m c l 8 2 3 u m c l l 8 5 b n l 9 1 2 1 u m e l 8 8 4 b n l 9 1 0 3 6 + m m c 0 1 9 1 + b n l 9 1 0 4 5 u m c l 7 9 8 + b n l g l 3 3 5 b n l 9 15 2 0 u m c 2 1 0 5 u m c 2 0 7 1 b n l g l1 4 4 b n l g b n l g b n l g 6 4 7 4 4 7 4 5 2 + + + + + + + 山 2 0 7 2 0 s 2 0 8 2 0 9 3 3 0 1 3 0 2 3 髭 3 0 3 3 0 4 ( a c ) 1 6 ( g c g ) 6 ( a g ) 2 1 ( c t ) 8 a g ( 1 6 ) ( a c ) 2 0 ( a l o ( t a ) 7 ( t o ) 8 f 哟3 6 ( o c ) 8 f r c ) 8 ( a 0 ) 1 4 ( g a ) s n 2 ( g a ) 5 2 ( a g ) 2 3 ( c z ) 2 8 ( a o ) 2 1 ( c c a t ) 4 ( a t o t ) 5 a o ( 2 3 ) a g 0 3 ) a g ( 2 2 ) 70 。7 9 1 5 0 7 7 6 20 4 9 8 6 o 。7 1 l 70 8 2 7 30 。5 5 1 30 6 3 l 5o 5 3 40 。7 2 9 30 4 3 5 0 7 2 9 60 7 8 2 40 5 8 2 40 6 4 3 60 7 3 6 50 5 2 4 5o 7 6 4 20 。4 5 9 0 5 7 8 0 8 2 7 0 6 3 1 o 8 1 8 0 7 7 3 0 7 4 7 0 7 4 7 3 8 盼 谚 j h h n n n 髓 甜 窨 娩 j 睢 晒 饰 k k l l l k l 置 袅 幺 互 羔 乏 麓 盖 置 复 乞 + + + + + + + + + 十 + + + + + + + + + 十 + 十 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 十 + + 4 s 3 7 5 6 6 首都j | f i 范大学硕士毕舭论文 p h i 0 5 3 u m c l 3 0 7 b n l g l5 0 5 p h i 0 7 3 u m c l 3 9 9 b n l 9 1 9 7 b n l 9 1 7 5 4 b r d g lt 8 2 u m c 2 0 0 8 u m c l 6 3 9 b n l 9 1 4 9 6 + u m c 2 0 4 8 + p h i 0 7 2 4 - u m c l 7 5 9 u m e l 7 5 7 u m c 2 1 4 8 + u m c l 2 9 4 + u m c l 9 2 6 n c 0 0 4 + p h i 0 2 1 + u m c l 6 5 2+ n 0 0 0 5 + p h i 0 2 6 + u m c l 0 8 8 + b n l 9 1 2 6 5 + b n l 9 2 2 9 1 + b n l 9 1 9 2 7 + u m c l 8 0 8 + u m c 2 0 0 9 + 山士 + + + + + + 3 。0 5 3 0 5 + 十 + 3 0 5 3 。0 5 3 。0 7 3 0 7 3 。0 9 3 0 9 3 0 9 + + + + + + 山 + + +十+ + + + 士 + 3 3 0 9 3 1 4 4 0 l ， 4 o l 4 0 1 4 0 2 4 。0 3 4 0 3 4 0 3 4 。0 4 4 0 5 4 0 5 | 。0 5 4 0 5 4 。0 6 4 。0 7 4 0 8 4 0 8 ( a t g ) 6 ( a g ) 2 7 ( a g ) 1 9 ( t g t c c ) 4 ( a g ) 1 8 ( t c ) 6 3 5 s 4 0 6 4 9 0 6 8 4 0 7 9 2 0 4 7 0 。5 4 o 7 l 0 7 4 7 o 5 2 0 。5 6 0 7 6 5 o 。7 7 3 0 6 8 4 ( c g g ) 4 f r c c ) 7 ( c t ) 1 6 6o 7 9 1 o 5 42 1 6 ( t a ) 3 2 a g c t c t o 。7 s s r 弓l 秘平垮p i c 蘧为0 。7 8 5 ，瘸4 4 怼雩l 憋遴磐聚类分爨缭袋麴蘧3 。2 5 。 图中可看出，以遗传相似蘸数0 7 4 为标准，s w l 6 1 l 、b 7 3 、m 0 1 7 、丹3 4 1 、太4 1 1 各自成 一群；黄c 与e 2 8 归入旅大红骨群；窳8 9 、1 7 8 、8 7 1 、京5 0 1 、齐3 1 9 归入p 群：黄改 群与藏大簸蠢黎逮铸关系燹透一些。 ( 2 ) 1 5 份自交系用p i c o 7 韵4 4 对均匀分在染色体上的s s r 引物分析结果 4 4 对p i c o 7 的4 4 对s s r 标记聚类图 。f f f i 1 q 面i 州 图3 2 6 4 4 对p i c o 5 时，该座位为高度多 态座位，0 2 5 p i c 0 5 时为中度多态性座位，p i c o 2 5 时为低度多态座位( 牛荣，2 0 0 1 ) 。 本实验的1 2 2 个微卫星位点上的平均p i c 为0 6 9 ，属高度多态。在遗传连锁分析中，p i c 值大于0 7 的微卫星d n a 为最理想的选择标记( h e a m e ，1 9 9 2 ) ，因为在这种情况下，双亲 在该位点通常是杂合的，在其后代中可以清楚地观察到等位基因的分离，但不能仅根据标 记的多态性信息量( p i c ) 来预测标记识别多样性的能力。 本实验结果表明引物在染色体上的分布、多态性高低| 三( 及数量的选择对聚类分析结果 影响较大。在进行类群划分s s r 引物的选取上，要保证引物在染色体上均匀分布，并且具 有适中的多态性。由于本实验每个类群中选取的的自交系数目不同，而且部分类群选取的 材料较少，只有l 份自交系材料，这些因素使聚类分析结果容易受到一些实验条件的影响， 从而影晌了结果的可靠性，而且部分所选的自交系遗传背景比较复杂，导致这些材料进行 类群划分时结果波动较大。在进行引物数量对聚类分析结果影响实验中，本实验研究用的 引物在剔除重复位点后只剩下8 l 对，综合考虑引物在每条染色体上均匀分布，并且具有 一定的多态性，使最后能入选的最多引物量只有5 0 个，由于所能选择的引物数量较少， 因而引物数量对聚类分析结果的影响分析受到了很大的限制。 盐丁乇到冒吧环，t 7 3 5 怀1 l 剐丑不丽l 叩a a k 俩强堕但删件糸州足且研， 结论： 1 采用玉米单粒种子快速煮沸法提取种子胚、胚乳，水培的幼根组织，发芽1 3 d 的 胚芽鞘组织以及发芽3 1 5 d 的胚轴组织提取的d n a 扩增检测效果较好，与传统的液氮提取 法和玉米单粒种子快速提取法提取的d n 扩增结果相比，无明显差异，而且快速煮沸法提 取1 0 0 份d n a 只需3 0 分钟，大大缩短了d n a 提取时间，提高了工作效率。并且种子在提取 胚乳组织的d n a 后，可以继续种植，不会影响种子以后的生长。 2 综合考虑p c r 反应的各影响因素，本实验最终确定了适用于毛细管电泳检测系统的 p c r 扩增体系。与常规的p c r 扩增体系相比，新体系主要在d n a 模板量、p c r 循环数、p c r 反应成分浓度上做了调整，使p c r 产物检测峰值高低控制在毛细管检测系统校正范围内， 并且减少p c r 非特异扩增产物。通过分析9 6 份自交系和1 9 2 份玉米单交种，确定了毛细 管电泳荧光标记检测系统各引物的b i n ( 相当于等位梯度m a r k e r ) 。 3 比较毛细管电泳荧光标记检测与变性p a g e 银染捡测两种s s r 榆测方法，两种方法 的检测结果片段大小基本一致。变性p a 6 e 银染检测法检测法检测玉米品种s s r 标记受到 玻璃板、银染条件等因素的影响，而且效率较低，但其仪器及试剂成本较低，适宜少量材 料的检测分析，尤其是s s r 标记的筛选；毛细管电泳荧光标记检测法则具有高通量、高效 率、数据精确、检测系统灵敏、检测系统影响因素少等优点，适用于大批量样品的分析检 测。 41 4 1 对s s r 引物在1 5 份供试自交系中分别检测到2 8 个a l l e l e ，共检测到6 6 5 a l l e l e ，平均每个引物检测到4 7 个a l l e l e ，各引物的p i c 值为o 2 4 0 8 4 4 ，平均p i c 值为0 6 8 。本实验结果表明引物在染色体上的分布、多态性高低和数量的选择对类群划分 结果有较大的影响。 结果有较大的影响。 首都师范大学硕士毕业论文 参考文献 【1 】a l e xb e l k u m ，s t e w a r ts c h e r e r ，l o c ka l p h e n s h o r t - s e q u a n e ed n ar e p e a t si np r o k a r y o t i c g e n o m e s m i c r o b i o l o g ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y ，1 9 9 8 ( 6 2 ) ：2 7 5 2 9 3 【2 1a s h l e yct ，w a r r e nstt r i n u c l e o t i d er e p e a t se x p a n s i o na n dh u m a nd i s e a s e j a r m ur e vg e n e t ， 1 9 9 5 ，2 9 ：7 0 3 - 7 2 8 【3 】a y r e snm ，m c c l u n gam ，l a r k i npd ，b l i g