（遗传学专业论文）hela细胞m期促进因子mpf的初步纯化及其对未成熟卵母细胞的体外促成熟作用分析.pdf

摘要 m 期促进因子( m - p h a s ep r o m o t i n gf a c t o r , m p f ) 是广泛存在于从酵 母到人的有丝分裂、或者减数分裂的细胞中，刺激启动细胞从g 2 期向 m 期转变的活性物质。一系列的实验证明，m p f 是由p 3 4 甜矗和周期 蛋白组成。 m p f 是自身催化的，可以通过增加小量部分纯化的m p f 、使它的 水平得到扩增，并在m 期到达高峰：m p f 可以通过显微注射的方式 直接导入单个卵母细胞后，可以引起单个卵母细胞的减数分裂。 本课题的第一个目的是为了摸索从有丝分裂的h e l a 细胞中、初步 纯化m 期促进因子( m p f ) 的合适方法，鉴定提取物、初步纯化产物中 m p f 活性物质。本实验首先利用秋水仙胺使h e l a 细胞阻滞在有丝分 裂的中期f m 期) ，在不同培养基、不同培养时间的条件下，得到不同 的有丝分裂中期指数，及阻滞的中期指数；结果表明，有丝分裂细胞 的中期指数平均为9 4 ，从而可以获得较高的含m 期促进因子的蛋白 含量。 然后通过比较饱和硫酸铵溶液在不同p n 值、及不同体积百分比 的情况下，沉淀分离蛋白质溶液的效果，所得到的结果表明，饱和硫 酸铵沉淀的平均回收率为2 3 9 4 。通过连续的s e p h d e xg - 1 5 0 、 d n a c e l l u l o s e 柱层析，及高效液相色谱( h p l c ) 分离，得到由三个波 峰组成的产物；最后利用w e s t e r nb l o t t i n g ，检测到了提取物、初步纯 化产物中的m p f 中m r 3 4 k d 的成分。初步纯化产物的生物学活性在 以后的实验中进一步分析。 第二个个目的，是为了分析h e l a 细胞m p f 提取物促进未成熟卵 母细胞、体外提前成熟的生物活性作用，并通过制备中期染色体而进 行细胞遗传学分析。将m p f 提取物显微注射到昆明小白鼠未成熟的 卵母细胞中，诱导其提前恢复减数分裂，结果表明：注射组较对照组 提前观察到了、g v b d 发生以及极体排出高的现象。并且，注射后的 卵母细胞，通过染色体的制备及显带，观察到了中期相染色体。这些 结果说明，m p f 提取物具有诱导未成熟卵母细胞提前恢复减数分裂的 生物学作用。 以上结果说明，m p f 能够为未成熟卵母细胞在体外提前成熟、提 供一定的条件：这种构想，也为植入前的细胞遗传学诊断提供了一种 新的方法。 关键词m 期促进因子( m p f ) ，未成熟卵母细胞，显微注射，生物活 性分析，有丝分裂指数 a b s t r a c t m p h a s ep r o m o t i n gf a c t o r ( m p f ) a p p e a r e d i n m a n yk i n d s o f e u k a r y o t i c c e l l s ，i n c l u d i n g m e i o t i c o o c y t e s o rm i t o t i cs o m a t i cc e l l s r a n g i n gf r o my e a s t st om a n ，w h i c ht r i g g e r e di n i t i a t i o no ft h et r a n s i t i o n f r o mg 2t om - p h a s e a v a r i e t y o f e x p e r i m e n t sd e m o n s t r a t e dt h a tm p f w a sa c o m p l e xc o n s i s t i n go f p 3 4 。抛a n dc y c l i nb 1 t h e r ew a se v i d e n c et h a tm p fa c t i v a t i o ni s a u t o c a t a l y t i c a m p l i f i c a t i o no fm p fl e v e l s c o u l db ea c h i e v e db ya d d i t i o no fs m a l l a m o u n t so f p a r t i a l l yp u r i f i e dm p f as i n g l eo o c y t ec o u l db ei n d u c e dt o r e i n i t i a t em e i o s i s b y t h em i c r o i n j e c t i o no fm p fi n t oi t t h ef i r s t o b j e c t i v eo ft h i st h e m ei s t o i n v e s t i g a t et h em e t h o d so f p r e l i m i n a r yp u r i f i c a t i o no fm p f f r o mh e l ac e l l ，a n dt oi d e n t i f yo fm p f a c t i v i t y i nc r u d ee x t r a c t sa n dp r e l i m i n a r i l yp u r i f i e df r a c t i o n s c o l c e m i d w a sf i r s tu s e dt ob l o c kh e l ac e l la tm i t o t i cm p h a s ei nd i f f e r e n tm e d i a ，a t d i f f e r e n tc u l t i v a t i o nt i m e w eh a v ea c h i e v e dd i f f e r e n tt o t a lm i t o t i c m - p h a s ei n d e x ，a n dd i f f e r e n tb l o c k e dm p h a s ei n d e x u n d e rt h e s ed i f f e r e n t c o n d i t i o n s r e s u l td e m o n s t r a t e dt h a tt h et o t a lm i t o t i cm - p h a s ei n d e xw a s a v e r a g e9 4 t h e r e f o r e t h e p r o t e i nq u a n t i t yo f m p f c o u l db e i m p r o v e d r e c o v e r ye f f i c e n c y o b t a i n e d b y s a t u r a t e da m m o n i u m s u l p h a t e s o l u t i o n ( s a s ) p r e c i p i t a t i o nw e r ec o m p a r e d a ti t sd i f f e r e n tp h ，a n di t s d i f f e r e n tv o l u m n p e r c e n t r e s u l td e m o n s t r a t e d t h a tt h er e c o v e r yo f p r o t e i n q u a n t i t yb y a m m o m i u m s u l p h a t ep r e c i p i t a t i o n w a s a v e r a g e 2 3 9 4 s u c c e s s i v ec o l u m n c h r o m a t o g r a p h i e s o n s e p h a d e x g - 1 5 0 ， d n a c e l l u l o s ec o l u m n c h r o m a t o g r a p h y , a n dh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , r e s u l t e di nf lp r e p a r a t i o nc o n s i s t i n go f t h r e ew a v e p e a k s f i n a l l y w e s t e r nb l o t t i n gh a dd e t e c t e dt h ee x i s to fm p fa c t i v i t yf r o m i i i c r u d ee x t r a c t sa n df r o mp r e l i m i n a r i l yp u r i f i e dp r e p a r a t i o n t h eb i o l o g i c a c t i v i t y o f p r e l i m i n a r i l yp u r i f i e dp r e p a r a t i o n t h a ti n d u c e si m m a t u r e o o c y t e s t or e i n i t i a t em e i o s i sw i l lb ef u r t h e rd e t e c t e di nl a t e re x p e r i m e n t s t h es e c o n dp u r p o s ei st oa n a l y s et h eb i o l o g i c a la c t i v i t yo fm p ft h a t i n d u c e di m m a t u r eo o c y t e st om a t u r ei nv i t r ot om i i ；a n dt oa n a l y s e c y t o g e n e t i c so fm e t a p h a s ec h r o m o s o m e so fi n j e c t e do o c y t e sb yp r e p a r i n g a n dd e v e l o p i n g m p fe x t r a c t sw e r em i c r o i n j e c t e di n t oi m m a t u r eo o c y t e s o fk u n m i n gm o u s ei no r d e rt oi n d u c et h e mt or e i n i t i a t em e i o s i si n a d v a n c e r e s u l t si n d i c a t e dt h eo c c u r a n c eo fg v b da n dt h ee x t r u s i o no f p o l a rb o d yi na d v a n c ew e r eo b s e r v e di ni n j e c t e dg r o u pt h a ni nc o n t r o l g r o u p s f u r t h e r m o r et h em e t a p h a s ec h r o m o s o m e s o fm a t u r eo o c y t e sw e r e o b s e r v e da f t e rb e i n g p r e p a r e da n dd e v e l o p e d s om p f e x t r a c t sp o s s e s s e d t h eb i o l o g i ca c t i v i t yt h a ti n d u c e di m m a t u r e o o c y t e s t or e i n i t i a t em e i o s i s r e s u l t sa b o v ei n d i c a t e dm p fc o u l d p r o v i d e aa c c e l e r a t i o ni n i n d u c i n gi m m a t u r eo o c y t e st or e i n i t i a t em e i o s i si na d v a n c et om a t u r ei n v i t r o t h i si d e ah a sa l s o p r o v i d e da n i n n o v a t i v ew a yf o r c y t o g e n e t i c s d i a g n o s i so fp r e i m p l a n t i o ng e n e t i c sd i a g n o s i s k e yw o r d m p h a s ep r o m o t i n gf a c t o r , m i c r o i n j e c t i o n ，b i o l o g i c a l a c t i v i t ya n a l y s i s ，m i t o t i ci n d e x ，i m m a t u r eo o c y t e s ， 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南 大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本 研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说明。 作者签名：盔jj 盘堡 日期：垫垒年二月卫日 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文；学校可根 据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 储獬：掣翩獬眵蹶一山l 目 主要英文缩写注释说明 a p s ：a n a m o n i u m p e r s u l f a t e a t p ：a d e n o s i n e 5 - t r i p h o s p h a t e b s as t a n d a r d ：b o v i n es e r u ma l b u ms t a n d a r d e m e m ：e a g l e m i n i m u m e s s e n t i a lm e d i u m e d t a n a 2 ：e t h y l e n e d i a m i n e t e t r m t c e t i c a c i d e g t a ：e t h y l e n eg l y c o l - b i s ( 1 3 - a m i n o e t h y le t h e o n ，n ，n ，n , t e t r a a c e t i ca c i d f b s ：f e t a lb o v i n es e r u m g v b d ：g e r m i n a l v e s i c l eb r e a k d o w n h c g ：h u m a nc h o r i o n i cg o n a d r o t r o p i n h p l c ：h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m p f ：m - p h a s ep r o m o t i n g f a c t o r p c c ：p r e m a t u r e c h r o m o s o m ec o n d e n s a t i o n p m s f ：p h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e e p m s g ：p r e g n a n tm a l e s e r u mg o n a d r o t r o p i n s d s ：s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t e m e d ：n ，n ，n ，n ，t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r i s ：t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e t d r ：t h y m i d i n e v i 过硫酸胺 三磷酸腺苷 牛血清白蛋白标准品 e a g l e 极限必需培养基 乙二胺四乙酸二钠 z , - - 醇一双一( 2 一氨基乙基) 四乙酸 胎牛血清 生发泡破裂 人绒毛膜促性腺激素 高效液相色谱层析 m 期促进因子 染色体提前浓缩 苯甲基磺酰氟 孕马血清促性腺激素 十二烷基硫酸钠 四甲基乙二胺 三羟甲基氨基甲烷 胸腺嘧啶核苷 实验技术路线图 1 m p f 的初步纯化 s e p h a d e x 融1 5 0 柱层析 d n a - c e l l u l o s e 柱层析 s d s p a g e 电泳分析， m p f 蛋白溶 液浓度的测 定 2 m p f 诱导未成熟卵母细胞体外成熟的生物学作用 上上 从m 期的h e l a 细胞中提取m p f 蛋白小白鼠未成熟卵母细胞的获取 上上 将m p f 提取物显微注射到未成熟卵母细胞 上 未成熟卵母细胞的培养 i 发生g v b d 和 排出极 卵母细胞染色体 体的观察及细胞记数_ 1 铄本的制作 上上 统计分析 常规染色体g 式 v i l e f 蛋 ， 养 懈 靴 刿 撇 葑 刚 肿 脯 自 日 e 姗 拥 谥ml+r刹 丫宁一 瓢 骱 勰 硼 期 鼢 e k f 眦 恤 黼 硕士学位论文前言 刖舌 m p f ( m a t u r a t i o n o rm i t o t i cp r o m o t i n gf a c t o r ) 即成熟分裂或有丝分裂促进因 子，最初被认为是来源于静止在中期的、蛙类卵子细胞质中的活性物质，在缺 乏蛋白质合成的情况下【l ”，能诱导卵母细胞提前恢复减数分裂；因此，被称为 成熟促进因子( m a t u r a t i o np r o m o t i n gf a c t o r ) 。后来，发现这种活性物质广泛存 在于，从酵母到人的有丝分裂、或者减数分裂的细胞中，刺激启动细胞从g 2 期到有丝分裂期的转变，因此，这种因子被称为m 期促进因子( m p h a s e p r o m o t i n g f a c t o r1 ，而不仅仅是为成熟促进因子。 m p f 活性最初是由m a s u i 等人【1 1 ( 1 9 7 1 ) 在非洲蟾蜍( x e n o p u s ) 未受精的卵子 中检测到，从中提取细胞质，并显微注射到两栖类的充分成长的卵母细胞中， 能引起卵母细胞成熟为未受精的卵子，并把这种活性物质描述为成熟促进因子。 后来k i s h i m o t o 等人【2 1 ( 1 9 7 6 ) 黼( s t a r f i s h a s t e r i ap e c t i n i f e r a ) 成熟的卵母细胞 中抽提细胞质，注射到未成熟的卵母细胞，几乎1 0 0 出现g v b d ( g e r m i n a l v e s i c l eb r e a k d o w n ，生殖泡破裂1 。这就表明；在这些卵母细胞中，核膜破裂在 某些细胞质因子的控制之下。更近，对小r ( m o u s e ) 成熟的卵母细胞的研究也表 明g v b d 在细胞质的控$ 1 ( b a l a k i e r 3 1 等1 9 7 7 ) 。 m p f 活性不仅出现在成熟的卵母细胞中，而且出现于两栖类胚胎的早期卵 裂阶段，此时，胚胎经历高度同步化的细胞分裂。w a s s e r m a n d i 等( 1 9 7 6 ) 在r a n a p i p i e n 卵子受精后的9 0 分钟，检测到了m p f 活性。s u n k a r a q 等( 1 9 7 9 ) 用n 2 0 阻止h e l a 细胞，使之停留在有丝分裂期，从有丝分裂的细胞中提取细胞质成分， 显微注射到非洲蟾蜍( x e n o p u s ) 的卵母细胞，来检测其中有丝分裂因子的活性， 结果表明：哺乳类有丝分裂细胞的有丝分裂因子，能诱导两栖类卵母细胞的减 数分裂，出现g v b d ，染色体浓缩。这就说明，在有丝分裂、减数分裂、染色 体提早浓缩( p c c ，p r e m a t u r ec h r o m o s o m ec o n d e n s a t i o n ) 时，调节核膜破裂、染 色体浓缩的那些因子在动物界似乎是相似的。 m p f 水平在细胞周期中具有波动性，在m 期达到高峰。w a s s e r m a n t a 等( 1 9 7 8 ) 研究表明；m p f 在r a n ap i p i e n 卵子受精3 0 6 0 分钟后，m p f 活性检测不到， 硕士学位论文 9 0 分钟后，m p f 活性重新出现，1 2 0 分钟达到高峰，1 5 0 分钟后又开始下降。 m p f 活性在受精的非洲蟾蜍( x e n o p u s ) g g 予 ，也是周期性的出现，g 2 m 期转 变过程中达到高峰。s a n k a r a 5 】等r 1 9 7 9 ) 从h e l a 细胞的g l 期、s 期的提取物中， 没有发现m p f 活性，早、中g 2 期活性处于低水平，晚g 2 期快速增加，在有丝 分裂期达到高峰。这就说明，在h e l a 细胞周期中，存在m p a ( m a t u r a t i o n p r o m o t i n ga c t i v i t y ) 水平的周期性变化。这也就证实了与两栖类早期 卵裂胚胎的一致性。g e r h a r t l 6 1 等( 1 9 8 4 ) 首先在非洲蟾蜍( x e n o p u sl a e v i s ) 卵母细 胞的成熟分裂中，发现了m p f 活性的周期性变化。m p f 活性在g v b d 前出现， 在第一次减数分裂结束时，快速消失。在第二次减数分裂的中期，m p f 重新出 现，此时，成熟分裂静止。在卵子受精后，m p f 活性快速消失，在第一次卵裂 前期重新出现，在有丝分裂的中期转变时，活性最高。用戊二酰亚胺环己酮 ( c y c l o h e x i m i d e ) 将细胞阻止在间期阶段，m p f 保持低水平；当用细胞静止因子 ( c s f , c y t o s t a t i cf a c t o r ) 将细胞阻止在中期，m p f 保持高水平。这说明m p f 与驱 动细胞周期的摆动性反应有关，因此，m p f 被认为是m 期事件的启动中心。 m p f 的基本特性，最初是由w a s s e r m a n 4 1 等( 1 9 7 6 ) 从两栖类r a n ap i p i e n 卵 子中提取m p f ，通过显微注射到非洲蟾蜍( x e n o p u sl a e v i s ) 卵母细胞，诱导 g v b d 来分析其活性而确定，发现这种因子一种对m g z + 依赖、c a 2 + 敏感、对热 易失活的蛋白质，用蔗糖密度梯度离心表明，这种因子存在于三种不同的密度 梯度之中。 m p f 的纯化，l o h k a 等人1 1 0 1 ( 1 9 8 8 ) 利用硫酸胺沉淀和六个柱层析步骤，已 将非洲蟾蜍( x e n o p u sl a e v i s ) 卵母细胞m p f 提取物纯化3 0 0 0 多倍，发现m p f 活性与分子量分别为3 2 k d 和4 5 k d 的两种蛋白质相关；将这种纯化产物注射 到亚胺环己酮处理的卵母细胞，在2 个小时内能诱导g v b d 。l a b b e 等【l “ 1 2 1 ( 1 9 8 8 ，1 9 8 9 ) 对成熟的海星卵母细胞m p f 提取物纯化后，发现m p f 活性与分 子量分别为3 4 k d 和4 7 k d 的两种蛋白质相关。后来的实验表明此二种蛋白分 别是c d c 2 基因的产物和周期蛋白。 m p f 作用的生化基础是蛋白质磷酸化，当m p f 出现在细胞中或者被注射 入卵母细胞中，随即出现蛋白磷酸化水平增加( m a l l e r 等【”1 ，1 9 7 7 ，d o r e e 等1 1 4 1 1 9 8 3 ) ，包括出现新的磷酸蛋i ! t ( m a l l e r a n ds m i t h ，1 9 8 5 ) ；而且在缺乏几种理论上 2 硕士学位论文 的磷酸酶抑制剂时，尤其是b 一甘油磷酸钠的情况下，m p f 不能从细胞中提取 出来，表明m p f 可能含有一种蛋白激酶。纯化的m p f 表现出蛋白激酶的活性， 能够磷酸化m r 4 5 k d 的蛋白和组蛋白h l ，c a s e i n ，磷酸酶抑制因子( l o h k a 等 f 1 9 1 1 9 8 8 ) 。 m p f 的一种组成是c d c 2 基因产物p 3 4 “c 2 的同源蛋白。 c d e 2 基因是裂殖酵母细胞周期中，作为m 期关键的调节基因，在有丝分 裂周期的两个位点发挥作用。第一个调控点位于g l 期，被称为“起始点”； 第二个调控点在g 2 期，决定细胞何时启动有丝分裂。 c d e 2 编码一种m r 3 4 k d 的磷酸蛋白，s i m a n i s 掣”1 ( 1 9 8 6 ) 根据e d c 2 d 基因 可预见的氨基酸序列而合成的三种多肽，将多肽偶连到钥孔嘁血蓝素上( k e y h o l e l i m p e th e m o e y a n i n ) ，并用来免疫兔子，然后用e l i s a 法将血清进行抗体的筛选； 用含抗体的血清检测s p o m b e 细胞的蛋白提取物，结果表明：含抗体血清识别 了一种3 4 k d 的蛋白，为e d c 2 基因产物所预期的分子量。进一步的免疫沉淀试 验表明，e d c 2 基因产物是一种3 4 k d 的磷酸蛋白，并且具有蛋白激酶的活性。 l e e 等 1 6 ( 1 9 8 7 ) 犀jh e l a 细胞的e d n a 文库及互补方法，克隆了人c d c 2 h s 基因，已经测出了它的序列，编码一种与s p o m b e c d c 2 有相同分子量的蛋白质， 它们的氨基酸残基6 3 足一致的。根据它的序列，在其2 6 4 3 1 1 的核苷酸位置 上，对应的氨基酸编码e g v p s t a i r 所代表的多肽，而得到的抗体称为p s t a i r 抗体。用这种p s t a i r 抗体，d r a e t t a 掣17 1 ( 1 9 8 7 ) 在h e l a 细胞中检测到了一种人 p 3 4 州c 2 的同源蛋白，分子量为3 4 k d ，等电点约为8 0 。l e e 等【怕1 ( 1 9 8 7 ) 用这种 抗多肽血清，在人结肠癌细胞株h t 2 9 中，检测到了一种m r 3 4 k d 的蛋白；在 s p o m b e 细胞、h e l a 细胞衍生来的h e b 7 a 细胞株、人j 6 t 细胞、d a u d ib 细胞 中，b u t l e r 人胚胎成纤维细胞中，也检测到了一种m r 3 4 k d 的蛋白。这些数据 表明：3 4 k d 的蛋白很可能是c d c 2 h s 基因的产物。 g a u t i e r 等【1 8 1 ( 19 8 8 ) 用这种p s t a i r 抗体在非洲蟾蜍卵子提取物中，也检测 到了单一的蛋白质；在非洲蟾蜍未受精的卵子的、高度纯化的m p f 中，也特异 性的识别了m r 3 4 k d 的蛋白成分( 以前认为是3 2 k d ) ，这种蛋白与人c d c 2 h s 基因编码的p 3 4 甜。2 共迁移。高度纯化的产物成分中，如果保留有m p f 全部活 硕士学位论文前言 性，那么就含有m r 3 4 的蛋白。进一步的证明是；用p s t a i r 抗体，在纯化的 m p f 中，免疫沉淀了一种3 4k d 的蛋白。l a b b e 等【1 2 1 ( 1 9 8 9 ) 也用这种p s t a i r 抗体，在成熟的海星卵母细胞的高度纯化的m p f 中，特异性的识别了m r 3 4 k d 的蛋白成分。这些结果表明：纯化的m p f 含有一种与p 3 4 酣畦密切相关的蛋白。 这种免疫沉淀物中，也发现含有纯化的m p f 中m r 4 5 k d 的蛋白成分，这就提 示：这两种蛋白作为一种复合体而存在，导致了它们的共沉淀。p s t a i r 抗体是 很特异性的，主要针对于从酵母到人的、完全保守区域而提取出来的，用它检 测到了一系列真核细胞的、初制提取物中大约3 4 k d 的单一蛋白。 用生物化学方法，在非洲蟾蜍卵母细胞中纯化了p 3 4 。“的同源蛋白，是 m p f 的组成；用遗传学方法，在裂殖酵母中克隆了编码p 3 4 。她的e d c 2 基因， 在调节基因网络中，作为控制有丝分裂启动的一个元素。这样，两条独立的工 作线，导致了鉴定了一种作为启动有丝分裂的、关键组成的单一蛋白。 周期蛋白是m p f 的另一种组成成分。 周期蛋白最初是由e v a n s 等a t l 9 1 ( 1 9 8 3 ) 在海生无脊椎动物的胚胎中鉴定出 来，他们通过比较a r b a c i a 卵子受精前和受精后的蛋白质合成方式，表明有 类蛋白在受精后5 小时高速合成，卵裂之前消失；并且通过连续的标记实验表 明，这种蛋白的周期性波动，是由于周期性的破坏和连续的合成所引起，并这 种蛋白被称为周期蛋自。现在己知存在于许多分裂中的真核细胞内( s o l o m o n 等 2 0 1 ，1 9 8 8 ) 。 周期蛋白的作用，最初是由s w e n s o n t 2 1 1 ( 1 9 8 6 ) 等提出，用显微注射法，将 蛤蟆( c l a m ) 的周期蛋白a 的m r n a 注射到非洲蟾蜍卵母细胞中，诱导其进入减 数分裂的m 期。这一发现表明，周期蛋白a 的上升，在促进细胞进入m 期， 起了直接和生t 里( n a t u r a l ) 的作用。进一步的证据来自于m u r r y 等人【2 2 1 ( 1 9 8 9 ) 的实 验，他们从非洲蟾蜍卵子中提取一种被称为“周期性提取物( c y c l i n ge x t r a c t s ) ” 的物质，使加入这种提取物的精子核( s p e r mn u c l e i s ) 至少可以完成3 个细胞周期， 通过检查精子核的形态，而确认细胞周期的进展过程，在两个周期之间取样、 进行分析，证明了周期蛋白水平的周期性变化。为了证明周期蛋白能诱导有丝 分裂，他们制备了一种被称为“依赖m r n a 的提取物( m r n a d e p e n d e n te x t r a t s ) ”， 4 硕士学位论文 前言 在此提取物中，内源性的m r n a 用r n a s e 破坏，只加入周期蛋白的m r n a ， 结果表明，周期蛋白的合成，是m 期所必需的、唯一的蛋白合成，并且能够诱 导精子核的有丝分裂。 周期蛋白的合成，对于驱动胚胎细胞周期进入有丝分裂，是必需的；而周 期蛋白的降解，对于从有丝分裂中退出，也是必需的；这就提示：周期蛋白在 激活m p f 和保持m p f 活性，有一种作用( m u r r y 等【2 ，1 9 8 9 ) 。但是检查周期蛋 白被推导的氨基酸序列，提示它们并不是蛋白激酶( p i n e s 等【2 4 】，1 9 8 7 ) ，然而，蛤 膜周期蛋白的免疫复合物带有一种相关的蛋白激酶活性，从而推断，周期蛋白 可能作为有丝分裂诱导因子的组成而与c d c 2 蛋白激酶相联系。来源于蛤膜提取 物的共沉淀实验表明：周期蛋白和p 3 4 础2 在生理上相联系( d r 踮t t a 【2 5 1 ，1 9 8 9 ) 。当 纯化的海星m p f 中m r 4 7 k d 的蛋白成分，序列被测出来、并被发现是一种周期 蛋白之后，则直接证明了周期蛋白是m p f 的一部分( l a b b e l 2 6 】，1 9 8 9 a ) 。 在h e l a 细胞中，p i n e s 2 7 1 等f 1 9 8 9 ) 用抗细菌表达的周期蛋白的抗1 1 0 清，识别 了干十m r 6 2 k d 的蛋白质，比所期望的4 9 6 2 2 k d 大得多。并且通过h e l a 细胞 的同步化、免疫印迹分析表明：这种m r 6 2 k d 的周期蛋白，在g 2 期增加到g 1 的2 0 倍；在g d m 峰后突然下降；进入g 1 期，周期蛋白下降到不可检测的水 平。h e l a 细胞的周期蛋白类似b 型周期蛋白。实验表明：h e l a 细胞周期蛋白与 p 3 4 甜吐免疫共沉淀( c o i m m u n o p r e c i p i t a t e d ) ，周期蛋白与p 3 4 。她的这种联系，是 细胞周期依赖的，在g l 期，虽然合成了周期蛋白，但不与p 3 4 “相联系。 周期蛋白对p 3 4 c d 以蛋白激酶的激活是所必需的。在裂殖酵母的有丝分裂期， c d c l 3 + 缺失防碍激酶的激活( m o r o n o 等【2 8 1 1 9 8 9 ) ；在非洲蟾蜍的提取物中，破坏 周期蛋白m r n a ，防碍m p f 活性的出现( m u r r y 等2 2 1 1 9 8 9 ，m i n s h u l l 等【2 9 1 1 9 8 9 ) 。 周期蛋白在p 3 4 甜吐激活后的m 期也有连续的作用，在裂殖酵母，部分功能的突 变体c d c l 3 1 1 7 允许p 3 4 叫吐激活，但仅仅有丝分裂的一些方面发生( h a g a n 等 3 0 1 ， 1 9 8 8 ) ，如染色体浓缩，但是间期微管骨架并不重新构成有丝分裂的纺锤体。 周期蛋白是一类结构上相似的蛋白，含有一个相对保守的1 0 0 个氨基酸的 区域，这个区域被称为周期蛋白框( b o x ) ，这个框对于c d k 的结合和激活是必 需的。周期蛋白有两个主要家族，一个是g l 周期蛋白家族，由周期蛋白c 、d 一、 e 组成：o l 周期家族对于细胞通过g l 期进入s 期是重要的。另一个周期蛋白家 硕士学位论文 前言 族，由有丝分裂的周期蛋白构成，包括周期蛋白a 和b ，这些蛋白有利于细胞 通过有丝分裂期。周期蛋白a 在s 期d n a 合成时起了关键作用，周期蛋白b 与p 3 4 叫以联系在一起形成m 期促进因子，确保细胞快速、不可逆地进入有丝分 裂，激发染色体浓缩，核解体。破坏周期蛋白b 诱导细胞从有丝分裂期中退出。 p 3 4 e d c , 2 ( c d k ) 除非与相对称的周期蛋白b 结合在一起，否则是无活性的( t r t m 等 3 1 1 ，1 9 9 8 ) 。 m p f 诱导m 期的分子机制，涉及到p 3 4 毗2 蛋白激酶的激活：而p 3 4 甜吐蛋 白激酶的激活，与p 3 4 d 吐脱磷酸化相关，如在在海星、非洲蟾蜍、哺乳类细胞， 裂殖酵母细胞。一旦p 3 4 甜吐被激活，它导致m 期的许多事件，包括染色体浓缩， 细胞骨架重组，核膜破裂，细胞形态改变。而且高活性的p 3 4 咄2 能将细胞保持 在m 期状态【3 4 1 。 在体外受精或者卵细胞质内精子注射的助孕过程，从体内取出的卵细胞， 部分可能为未成熟卵母细胞，在体外培养时，存在成熟过程停止或者成熟过程 延迟的情况。 本研究想通过对m p f 的生物学活性分析，希望能找到一种能促进未成熟卵 母细胞体外成熟的物质。通过分离纯化m p f ，结合显微注射的方法，通过在体 外成熟培养，以达到诱导未成熟卵母细胞完成第一次减数分裂、加速第一极体 排出，促进细胞进入第二次减数分裂的中期、完成体外成熟的作用。 硕士学位论文 第一部分m 期促进冈子( m p f ) 的初步纯化 第一部分m 期促进因子( m p f ) 的初步纯化 m 期促进因子( m p f ) 最初的制备是粗制的细胞提取物或者部分纯化的成 分，其中a d l a k h a ”1 等用低赫低渗和高盐的方法，分别提取了细胞质中及染色 体上的m p f 活性成分，分别称为细胞质提取物和细胞核提取物，并且发现染色 体上的m p f 成分是细胞质中的3 倍。后来，j a c k m a n 等证明，m p f 活性首先出 现与细胞前期的中心体上，然后快速进入细胞核中【3 6 j 。 m p f 的纯化，开始于w u 等 7 】( 1 9 8 0 ) 对非洲蟾蜍o ( e n o p u sl a e v i s ) 卵母细胞 m p f 提取物的纯化，此时m p f 被纯化2 0 5 0 倍，在s e p h a c r y ls - 2 0 0 层析中表 现为1 0 0 k d 大小的蛋白质。随后，n g u y e n g i a l s 】等( 1 9 8 6 ) 也对非洲蟾蜍( x e n o p u s l a e v i s l 卵母细胞m p f 提取物的进行了纯化，首次使用三个柱层析，结果纯化了 2 0 0 倍，用考马斯亮蓝( c o o m a s s i e b r i l l i a n tb l u e ) 染色，主要表现出分子量大小为 6 2 k d 、5 3 k d 、4 9 k d 、3 9 k d 、3 7 k d 的五条多肽。a d l a k h a 等【卅( 1 9 8 5 ) 对h e l a 细 胞的有丝分裂因子的提取物用亲和柱层析，结果也纯化了2 0 0 倍，表现出分子 量为4 0 1 5 0 k d 的几种蛋白质，主带为5 0 k d ；但用有丝分裂特异性的单克隆 抗体，识别了几种多肽，而并没有识别5 0 k d 的主带。最后，l o h k a 等b o ( 1 9 8 8 ) 利用硫酸胺沉淀和六个柱层析步骤，已将非洲蟾蜍( x e n o p u sl a e v i s ) f j 母细胞 m p f 提取物纯化3 0 0 0 多倍，发现m p f 活性与分子量分别为3 2 k d 和4 5 k d 的 两种蛋白质相关；将这种纯化产物注射到亚胺环己酮处理的卵母细胞，在2 个 小时内能诱导g v b d 。l a b b e 掣1 1 1 2 ( 1 9 8 8 ，1 9 8 9 ) 对成熟的海星卵母细胞m p f 提取物纯化后，发现m p f 活性与分子量分别为3 4 k d 和4 7 k d 的两种蛋白质 相关。 本研究中，我们尝试首先用秋水仙胺把h e l a 细胞阻滞在有丝分裂的前中 期，从中提取含m p f 活性物质的蛋白质，然后经过饱和硫酸铵的沉淀，以及连 续的s e p h a d e xg - 1 5 0 凝胶柱、d n a c e l l u l o s e 亲和柱层析，以及高效液相色谱 分离( h p l c ) ，初步纯化m p f 提取物产物；然后检验初步纯化产物中m p f 成分 是否存在。 硕士学位论文 第一部分m 划促进因子( m p f ) 的初步纯化 1 材料和方法 1 1 仪器设备 台式离心机( e p p e n d o r f 公司) 冷冻离心机( h i t a c h i 公司) 冷冻干燥仪( 北京四环科学仪器厂) 蛋白垂直电泳仪( 北京六一仪器厂) w d 9 4 0 5 b 型水平摇床( 北京六一仪器厂) 7 2 2 s 分光光度计( 上海精密科学仪器有限责任公司) 2 5 m l 玻璃培养瓶( 国产) 1 5 m l 、5 0 m l 离心管( c o m i n g 公司) 分子成象仪( v i l b e rl o u r m a t 公司) s e m i d r ye l e c t r o p h o r e t i c t r a n s f e rc e l l ( b i o - r a d 公司1 恒温二氧化碳细胞培养箱( f o r m a 公司) l g y 一1 0 型恒温水浴箱( c o l ep a r m e r 公司) 玻璃层析柱( 北京鼎国生物技术中心) 高效液相色谱仪( 美国w a t e r s 公司) 普通光学显微镜( 国产) 1 2 材料与试剂 1 2 1 细胞培养试剂 h e l a 细胞( 人宫颈癌细胞株) ，本实验室保存； e a g l e m e m 培养基，r p m i1 6 4 0 ( g i b c ob r l 公司) ，f c s ( t b d 公 司) ，t d r ( f l u k a 公司) ，c o l e e m i d ( s i g m a 公司) ，秋水仙胺( s i g m a 公司) ，0 2 um 过滤器( c o m i n g 公司) o 0 5 t r y p i n 0 0 3 e d t a ( g i b c o - b r l 公司) ，1 0 d m s o ( s i g m a 公司) ； 1x p b s ：n a c l8 9 ，k c l0 2 9 ，n a 2 h p 0 41 4 4 9 ，k h 2 p 0 40 2 4 9 ，加蒸溜水 8 0 0 m