（遗传学专业论文）微生物酶法制备d对羟基苯甘氨酸的研究.pdf

微生物酶法制各d 一对羟基苯甘氨酸的研究 缩写表 a b b r e v i a t i o n s 英文全称英文缩写中文名称 d - p - h y d r o x y p h e n y l g l y c i n e d l - p - h y d r o x y p h e n y l h y d a n t o i n d - h y d a n t o i n a s e n - d e c a r b a m o y l a s e n - c a r b a m y l - d - p - h y d r o x y p h e n y l g l y c i n e c a l fi n t e s t i n a la l k a l i n ep h o s p h a t a s e o p e nr e a d i n gf r a m e i s o p r o p y l t h i o b d - g a l a c t o s i d e d - p - h p g d ，l - p h p h d h a s e n c a s e c - p - h p g c i a p o r f i p t g n 对羟基苯甘氨酸 d l 对羟基乙内酰脲 n 乙内酰脲酶 n 脱氨甲酰基水解酶 n - 氨基甲酰对羟基苯甘氨酸 牛小肠碱性磷酸酶 开放阅读框 异丙基硫代b d 半乳糖 河南大学2 0 0 5 届硕士研究生论文 摘要 对羟基苯甘氨酸( d - p - h y d r o x y p h e n y l g l y c i n e ，d - h p o ) 是临床上广泛使用的半合成b 一内 酰胺类抗生素的重要结构部分。在工业生产上可利用d ，卜对羟基苯乙内酰m ( d , l - p - h y d r o x y - p h e n y l h y d a n t o i n ，d , l - 1 4 p h ) 为原料经m 乙内酰脲l 敏d - h y - d a n t a i n a s e ，d h a s e ，e c3 5 2 2 ) 和 n 脱氨甲酰基水解酶( d - d a r b a m o y l a 辩，d c a s e ，e c 3 5 1 6 ) 水解而获得。对一株能转化d , l - 对羟基苯乙内酰腮为d 对羟基苯甘氨酸的菌株m m r 0 0 3 进行了细菌分类学鉴定，该菌为皮 氏伯克霍尔德氏菌( b w 轴础如r 妞p 妇嘲。实验通过s o u t h e r n 杂交，部分文库构建和筛选， 并经一系列亚克隆溅序分析，获得一长度为1 3 7 4 b p 的完整开放阅读框，编码4 5 8 个氨基酸的 n 乙内酰腮酶基因。用该基因序列构建的高表达质粒p x z p h 2 转化e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) ，经 i p t g 诱导后，检测到弘乙内酰滕酶活性。该基因编码的氨基酸序列经b l a s t 同源比较分析与 放射形土壤杆菌n r r l b l l 2 9 1 所产相应酶有8 5 的同源性。以d b 对羟基苯乙内酰脲为底 物测得的表达酶的活力0 6 6 u n d ，比出发菌株m m r 0 0 3 提高了2 倍。 d 型氮基酸是半合成青霉素和头孢菌素的重要中间体，目前主要是由相应的乙内蕺繇经 舍有两个酶- - d - 乙内酰脲酶、n - 脱氨甲酰基酶的微生物转化获得。这两个酶首先把乙内酰腙 转化为n 氨基甲酰一对羟基苯甘氨酸( n - c a t b a m y i - d - p - h y d r o x y p h e n y l g l y c i n e , c p h p g ) ，然后 再转化相应的d 型氨基酸。我们试着寻找更快更有效的转化菌株，把来源于皮氏伯克霍尔德 氏菌( b u r k h o l d e r i ap i c k e t t i i ) 的表达该两种酶的两个基因同时克隆到大肠杆菌中，获得共表 达两种酶的基因工程菌株，两个基因的顺序是d c a s e 基因在d h a s e 基因的前面，同一个启动 子。重组的菌株能够稳定的表达两种酶，并且能够有效的转化乙内酰脲到相应的d 型氨基酸。 并且这种d c a s e 基因在d h a s e 基因之前的构建方式在2 2 时培养比在3 7 c 能够获得更高的生 物量和酶活。该基因重组均同样的生物量和酶活比现有的生产菌株皮氏伯克霍尔德氏菌 ( b u r k h o m e r i ap i c k e t f f t ) 转化底物的效率提高两倍以上。并且发现这样的转化效率和第二个 酶的表达水平有直接关系，表明在现有的工业生产条件下第二个酶的浓度是整个转化过程中 的限制固素。 关键词：皮氏伯克霍尔德氏菌，n 乙内酰腮酶，n - 脱氨甲酰基酶，乙内酰脲，n 对羟基苯甘 氨馥，克隆，表达，共表达。 微生物酶法制各d 一对羟基苯甘氪酸的研究 a b s l r a c t d - p - h y d r o x y p h e n y l g l y c i n e ( d p l - i p g ) i s o n eo f t h ei m p o r t a n ts i d ec h a i ni nt h es e m i - s y n t h e t i c - l a c t a ma n t i b i o t i cm o l e c u l e sw i d e l yc l i n i c a l l yu s e di nt h ew o r l d i ti s p r o d u c e db ye n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f d - h y d a n t o i n a s e a n d d - d e c a r b a m o y l a s e f r o m d k p h y d r o x y p h e n y t h y d a n t o i n ( d , l - m h ) as w a i nm m r 0 0 3 ，u s e df o rd - p - h p gp r o d u c t i o ni ni n d u s t r yw a sc l a s s i f i e d 8 5 蜀眦妊b 砌p i c k e f f i ib ym o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o na n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o n t h eg e n e e n c o d i n gt h ed - h y d a n t o i n a s ee r l z y m ew a sc l o n e d s e q u e n c e da n de x p r e s s e di n 棚i c k d c o l i t h en u c l e o t i d es e q u e n c eo ft h e5 0k bi n s e r to fs u b c l o n ep x z - t o t a lw a sd e l e h n i n e d o n eo p e n r e a d i n gf r a m eo f1 3 7 4b pw a sf o u n da n dp r e d i c t e dt oe n c o d eap o l y p e p t i d ec o n s i s t i n go f4 5 8 a m i n oa c i d si ns i z e t h ea m i n oa c i ds e q u e n c ea l i g n m e n to fd - h y d a n t o i n a s e 丘b u r k h o m e r i a p i c k e t t i i s h o w st h e 8 5 h o m o l o g o u sw i t ht h ec o r r e s p o n d i n ge n z y m ef r o mj 蛔, r o b a c t e r i w n r a d i o b a t c e rn r r lb 1 1 2 9 1 t h ed - h y d a n t o i n a s e g e n e ( d h a ) h a r b o u r e di nt h ep l a s m i dp x z p h 2 i n e c o l ib l 2 i o e 3 1w h i g h l ye x p r e s s e db y 狂r i gi n d u c t i o n t h ed - h y d a n t u l n a s ea c t i v i t yf o r d , l - p - h y d r o x y p h e n y l h y d a n t o i n i s0 6 6 u m lb r o t h , w h i c hi s2 - f o l di n c r e a s ec o m p a r e dt ot h a to f 也e p a r e n ts t r a i nb u r k h o l d e r i a p i e k e t t i i d - a m i n o a c i d s ，i m p o r t a n ti n t e r m e d i a t e si nt h ep r o d u c t i o no fs e m j s y n t h e t i cp e n i c i l l i n e sa n d c e p h a l o s p o 洳s ，a l ec u r r e n t l yp r e p a r e df r o mt h ec o r r e s p o n d i n gh y d a n t o i n sm i n gb a c t e r i a lb i o m a s s c o m a 啦t w oe n z y m e s h y d a n t o i n a s ea n dc a r b a m y l e s e t h e e n z y m e sc o n v e r tt h eh y , k m t o i n s f r i s ti n t on - c a r b a m y l - d - p - h y d r o x y p h e n y l g l y c i n e a n dt h e ni n t oc c 岍髓p ( i n d i i l gd - a m i n oa c i d s i n 羽1a t t e m p tt os e l e c tm 0 孵e f f i c i e n tb i o c a t a l y s t s t h eh y d a n t o i n a s ea n dc a r b a m y l a s eg e n e sf r o m b u r k h o l d e r i a p i e k e t t i i w e r ec l o n e di ne s c h e r i c h i ac 以a c h i e v ea c o - e x p e r s s e ds t r a i n s t h eg e n e s w e 坤a s s e m b l e dt og i v et h ec a r b a m y l a s eg e n e p r e c e d i n gt h eh y d a n t o i n a s eg a n e t h er o m b i n a n t s t r a i n s s t a b l y a n d c o n s t i t u t i v e l yp r o d u c e dt h et w oa l 巧a n de f f i c i e n t l yc o n v e r t e dt h e c o r r e s p o n d i n gh y d a m o i n su n t op - h y d r o x y p h e n y l g l y c i n ea n dp h e n y l g l y c i n e t h eo r d e ro fg e n e s w i t h i nt h eo p e r o na n dt h eg r o w t ht e m p e r a t u r eo f 1 1 1 es t r a i n st u r n e do u tt ob ei m p o r t a n tf o rb 弛 e l l z y h ma n dd - m i n oa c i dp r o d u c t i o n t h ec o n f i g u r a t i o nw i t ht h ec a r b a m y l a s eg e n ep r e c e d i n gt h e 2 河南大学2 0 0 5 届硕士研究生论文 h y d a n t o i n a s eg e n ew a s t h em o s te f f i c i e n to n ew h e nt h eb i o m a s sw a s g r o w n 越2 2 r a t h e r t h a n3 7 t h i sb i o m a s s p r o d u c e dd - a m i n o a c i dt w i c ea se f f i c i e n t ya st h ei n d u s t r i a ls t r a i no f b l w k h o l d e r i a p i c 南e t t i t t h ee f f i c i e n c y w a sf o u n dt ob ec o r m l a t e dw i t ht h e l e v e lo fc a r b a m y l a s e p r o d u c e d ，i n d i c a t i n gt h a tt h ec o n c i g n t r a t l o no f t h i se a l z y m ei st h er a t e - l i m i t i n gf a c t o ri nd - a m i n o a c i dp r 0 0 u c t i o nu l l d e rt h ec o n d i t i o n su s e do n 趾i n d u s t r i a ls c a l e k e y w o r d = ：b w - k h o m e r i a p i c k e t l i i , d - h y d a a t o i n a s e ，n - c a r b a m y l a s e , h y d a n t o i n , d p h y d r o x y p h e n - y l s l y c m a ，c | o n e , e x p r e s s i o n , c o - e x p r e s s e d 3 微生物酶法制各d 一对羟基苯甘氨酸的研究 第一章前言 引言 自从1 9 2 8 年青霉素( p e n i c i l l i n ) 被发现以来，从此开创了利用抗生素治疗病原菌感染 的新时代。然而，随着耐药菌株的出现和耐药机理的研究，为对付临床耐药菌株的b 一内酰胺 酶对青霉素、头孢菌素类药物的破坏作用以及提高药物的疗效，半合成p 内酰胺类抗生素的 研制和开发受到广泛重视，并不断有新的药物问世。其中氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ) 、阿 莫西林( a m o x y c i l l i n ) 即是由青霉素母核6 一氨基青霉烷酸( 6 - a p a ) 分别和侧链d - 苯甘氨酸 ( d - p h e n - - y l g l y c i n e ) 、d - 对羟基苯甘氨酸( d - p - h y d r o x y p h e n y l g l y c i n e ) 缩合而成。 类似的半合成原则也应用于头孢类抗生素( c e p h a l o s p o r i n e ) 半合成工业中。以7 一氨基头 孢烷酸( 7 - a c a ) 作为起始材料之一，在7 一位氨基分别连接上述二种侧链，即可得到半合成 头孢菌素类临床药物头孢氨苄( c e p h a l e x i n ) 和头孢羟氨苄( c e f a d r o x i l ) 。因此，d - - 苯甘 氨酸、d 一对羟基苯甘氨酸与6 - a p a 、7 - a c a 成为半合成b 一内酰胺类抗生素生产中的几种重要 原料中间体。由于这些半合成b 一内酰胺抗生素具有抗菌活力强，广谱低毒等特性，已成为i 临 床控制细菌感染的首选药物，统计表明这类抗生素的年世界消耗量约3 0 亿美元( s y l d a t kc ， 1 9 9 0 ) 。目前，从自然界发现的氨基酸种类达3 0 0 余种，其中。9 0 属l 型氨基酸，所有构 成蛋白质的氨基酸均为l 型。1 0 左右的d 型氨基酸，主要存在于糖类化合物中，如细胞壁 t a b l e l e m 驴i c p 硼o 器l b r o 叫i c 曩i 坤p u n - _ h b 删p 州- 嘶n nce姆ei比ymcs u b s w a 把b 删o l n of m d u d a 【蝴山 r dl i - l y d 蚰t o i n 玛噎呲瞳m 啪d u 如州h 曲如d + + 瑾p - 碣咕啪叽t 嘲圳曲” h y 山啊”虹盯w i f l l o m 畸由眦妇d 州搬叫曲吲n o d d 瑚i * h e c a r b l m o y l u e l - t o q o p l m n r 越矗岫址挑饵耵喊眦a 斜l a d l - n - a c 嘲4 硼血咐靠i 趣 + + l 描嘶；帅- m e e s m m 砧d l - a m i n o w d 嘲s+ 4 - d 1 b 呻p h m m 妯。雌p t i d 特d l c 哺鲫n i d o 蒯咖s + d - v a l i u o a m i d m ed e - a m i n o c i d 删d 群+ n 盯l n ”哪蛔m l y j 秣 s 呻懈 f u n m i c i d 一 + k a 暑坤批 n 卵蜘哪s y n 也鹤el - s e r i n e , 砒 + i - t 聊瞳o p i 啪 l - s 啊i l 砖扯k 帅1 + l s d a q 咖 n 虾幻p l 哪阻驷v 啦，i l 山k ，虹叫i 岫蛔 一 + “t i y i 出l p l i 眦 b _ 1 n o 硝聃l 咖w r 谢向，m 山脚m 妇 + l - t y m s i 砧 码叽r 峨仍刖w 哪哪- o lm m 帅j a + l - d o p a r e d u c t i v e 瑚i 删佣d d 哼出。群曲i o 靠 a - k e t o i d s + m a 班眦m 沁l 枷r “上l 控i 站 ( n a d i - l - d e i 煳d e m ) r m n s m 妯耐o i lt w i n a s e sa - k e 协a c i d s+ - i - l p h e n y i a l a n i n e o qp 蛔h - 妇l t )i i , - i b a r o x y o h e 吣m e 4 河南大学2 0 0 5 届硕士研究生论文 肽聚糖中的d 一丙氨酸和d _ 谷氨酸等。在生物体内，l 型氨基酸经消旋酶作用而产生相应的d 型氨基酸，它们一旦形成即参入到肽链中，很少游离存在。鉴于d _ 氨基酸形成的肽或其它化 合物不能被肽酶等作用，比较稳定。因此，d 一氨基酸在医药、农药、食品等方面有广泛 应用而受到极大关注。表1 中列出了酶催化法所生产的多种具有重要工业价值的光活性d 或 l 型的氮基酸】。 1 脚t 羟基苯甘氨酸性质特征 对羟基苯甘氨酸( d - p - h y d m x y l p h e n y e i n e 即d - h i m ) ，外观为白色结晶粉；分子量1 6 7 2 。 熔点2 4 ( 分解) ，比旋度一1 5 5 1 6 1 c ，微溶于乙醇和水，含量9 8 ，易溶于酸和碱溶液 生成盐。 2 m 对羟基苯甘氨馥合成 对羟基苯甘氨酸其生产工艺有化学法、酶分法与酶转化法。 2 1 对羟基扁桃酸法 2 0 世纪9 0 年代国内外研究较多的是对羟基扁桃酸法，该合成法生成d l 一对羟基扁桃酸 的产率7 6 一明，但常用溶剂萃取分离的效果不理想，氮化产率6 5 。特别是拆分技术要 求高常用的非对映异结晶拆分法和诱导结晶拆分法往往效果不佳。将得到的d l 对羟基苯甘氨 酸用特殊的拆分剂直接拆分，适用的拆分剂价格昂贵；将其醇化或者乙酰化之后再拆分，可 采用廉价的拆分剂，但工艺复杂。对羟基苯海因路线反应条件温和，产品质量好，生产成本 低，特别是酶法拆分省去了消旋过程，有利于提高收率、降低成本和减少三废，是今后的发 展方向。用苯酚、乙醛酸在碱性条件下反应得到d l _ 对羟基扁桃酸，将其在氯化铰一氨水溶 液终加压氨化得到d l 一对羟基苯甘氨酸，然后化学拆分得到d - - 对羟基苯甘氨酸。 2 2z i 醛酸法 乙醛酸法为原料合成d l - p _ 量瞒，工业上分一步合成和两步合成。一步合成成本偏低，而 两步合成更受重视。其反应流程为： 第一步：苯酚和乙醛酸在碱性条件下反应后，乙醛酸几乎完全反应，用盐酸调p h 至6 0 ， 未反应的苯酚用甲苯萃取，回收利用。接着调p l i 到1 5 ，减压脱去大部分水分；用乙酸乙酯 提取，减压蒸馏，制得纯品中间体对羟基扁桃酸，熔点8 2 - - 8 4 1 2 。 5 徽生物酶法制各d 一对羟基苯甘氨酸的研究 第二步：对羟基扁桃酸与醋酸反应，再经氨解，而得到d l - p h p g ，收率9 l ，但反应时 间太长，氨水应器回流2 1 h 。有人将该反应于高压釜内进行，反应温度1 2 0 一1 2 5 c ，可将氨 解反应缩短到1 5 h ，氨与对羟基扁桃酸摩尔比为1 0 ：1 时，反应收率9 2 以上。 乙醛酸一苯酚一铵盐一步合成法是近几年国内外开发的新工艺，所用的乙醛酸量为 3 2 m o l 、苯酚0 1 3 m o l ，及与苯酚等摩尔氮基磺酸、催化剂等，在5 5 c 下反应完成后，用氨水 调节p i i = 5 6 ，经冷水冷却、过滤后水洗、干燥得成品，纯度9 9 。再经过酶法分离得到对 羟基苯甘氨酸。此法原料易得、价格便宜，但发应时间较长2 4 h ，收率为5 3 9 。 在拆分技术上，近几年国内外，常用得有化学拆分法、诱导结晶法、不对称转化法和酶 拆分法。 化学拆分是先将d l p h p 6 在甲醇中以硫酸催化制成甲醛，然后在溶剂中加入拆分期加热 制成d l p h p g 甲酯拆分剂盐晶种，在一定的温度下分布拆分得d 或l 一异构体盐经消旋化 后再重复拆分d 一异构体盐需经水解，中和得d l 屯。常用得拆分剂有手性酒石酸和樟脑 碳酸。 诱导结晶法是利用非对映异构体拆分剂盐得物理性质差异，进行分布拆分而得单一光学 异构体。常用得拆分剂有手性酒石酸、樟脑碳酸，3 - - 澳樟脑碳酸及非手性拆分剂。将消旋 d l - p h 毽与拆分剂在含水醇溶剂中加热制成非对映异构体拆分剂盐的过饱和溶液，然后分别 加入d 或l p 珏p g 拆分剂盐晶种，逐步降温进行分布诱导析晶，分别可获得d 或l - - 异构体 盐，l - - 异构体盐经消旋化后重复拆分，d - - 异构体盐经一步碱处理即得d - l t l 。该法不必将 d l - 阱制成衍生物，反应步骤减少，拆分一步收率可达9 0 ，降低拆分成本，是其优点。 但仍是分布拆分工艺，拆分操作仍较繁，在拆分过程中另一光学异构体易夹带析出是其缺点， 难应用于工业化大规模生产。 不对称转换法是近年来应用于n 一氨基酸拆分领域先进的拆分技术。可采用手性或非手 性试剂作为拆分剂，在醛类催化剂的作用下使消旋化和拆分在合适的溶剂中同步完成，随着 其中一溶解性小的光学异构体不断析出，来完成不对称转换过程，获得高收率、高光学纯度 的单一光学异构体。利用手性试剂进行拆分，如g 一酒石酸、d 一樟脑碳酸( d - c s ) 、d 一3 一 澳樟脑磺酸( d _ b c s ) 、( + ) 一1 一苯基乙磺酸r ( + ) 一p e s j 等，具有转化率及光学纯度高的优 6 河南大学2 0 0 5 届硕士研究生论文 点”3 。据文献报道，采用d - s c s 为拆分剂，以醋酸为溶剂，水杨醛催化不对称转换拆分d l - p i i p g ， 一次拆分收率可达9 9 9 ，d p h p g 的制备总收率为9 3 0 6 ，光学纯度) 9 9 9 6 。反应如式( 1 ) 所 示。 1 i l t ( 1 ) 水夤醛 ” k 盐l 蛆叶即g d d 0 8 若采用( + ) 一p e s 为拆分剂，利用l - - p h p q ( + ) - p e s 盐在2 0 c 以下的水中的溶解度 是d - p i 瞄( + ) - p e s 盐的8 0 倍的性质，先加热制成d - p i 矾；( + ) 一p e s 盐的过饱和水溶液，然后 逐渐降温使其形成的d - p h i 吣( + ) - p e s 盐很快从水溶中析出，而l - p i 聪( + ) - p e s 盐在热溶液 中进行差相异构，随着形成的i y - p i t p g ( + ) - p e s 盐不断的析出而完成不对称转换过程。 d - p h i p g ( 4 - ) - p e s 盐的收率可达9 1 2 ，光化学纯度为9 7 哦d - p i 鹏( + ) - p e s 盐经氨水中和后 可得9 1 蹦的收率的i 卜p h p g d - p h i ) 6 的制备总收率为8 9 4 。反应如式( 2 ) 所示。 一州+ n 心 饼 j o - p t 1 p 虽然采用1 2 王上手性拆分剂拆分d l - p h p g 效果好，但价格昂贵，来源困难。因此，经对 该拆分方法的深入研究，选用价格廉易得的非手性拆分剂，在催化剂的存在下加热进行不对 称转换拆分得d p 踟，获得较满意的结果。其拆分收率为8 2 ，d - - p h i ，g 的制各总收率 为7 3 8 ，光化学纯度 9 8 。 另一种方法是将d l - p h i ，g 先铜成甲醣，然后用胁酒石酸最为拆分剂进行不对称转换得 d - p h p g d - 酒石酸盐，再经碱永解，酸中和后得d - p h p g ，拆分一步收率为7 6 ，d - p h p g 剖备总收率为6 0 删1 。该法优点是工艺条件温和。拆分操作简便；缺点是多了甲酪化和酯 水解两步反应，制备总收率较低。 采用不对称转换法拆分得d - p i - i p g ，其优点是拆分和消旋化同步完成，其过程可连续进 行，拆分母液和拆分剂可重复使用，减少了拆分设备台套数，简化操作，使生产成本大大降 7 微生物酶法制各d 一对羟基苯甘氨酸的研究 低。 酶拆分法，自2 0 世纪9 0 年代以来，国外普遍采用酶法拆分技术生产d - p h p g ，国内对 该法进行了深入研究，并已实现产业化。该法是采用d l “+ ) 对羟基苯海因在乙内酰脲酶的 作用下进行不对称水解开环称n 一氨甲酰一d 一棚，再经化学水解或甲酰水解酶酶解得 d - p t i p g 。其反应过程如式( 3 ) 。 n h c o n h o 旬 p 啪 氯甲t 承解i t t n e n o , 1 4 + d l 一对羟基荤海菌n 一氟甲 d - p i - i p g 酶法工艺有一菌一酶法、两菌两酶法、一菌双酶法，其中以一菌双酶法最优嘲。一菌双 酶是利用假单孢菌p s e u d o m o n a ss p 2 2 6 2 菌株，在体内同时产生的乙内酰脲酶和氨甲酰水解 酶，对d l - - p h p g 进行不对称开环、水解反应一步操作丽制得d - p h p g 。由于d l 一对羟基 苯海因水中溶解度低，在p h 8 5 的水中溶解度也仅为0 3 5 ，因此反应液体积较大，反应速 度慢，可加入1 0 的d m s o 助溶剂，以减少反应溶剂的总体积，也使转化速率增加了5 倍， 酶法转化率可达1 0 0 。酶法反应条件温和、转化率及光学纯度高、成本低、对环境污染小 是其优点。缺点是该法先需经微生物发酵制备粗酶液，若控制不当易染茵；乙内酰脲酶与氨 甲基水解酶活性不匹配，乙内酰脲酶的活性要高于氨甲基水解酶，中问产物n 一氨甲基一d p ，g 滞留，致使反应时间较长【9 l 。国内目前多采用液相酶法工艺，而国外多采用固相酶 法生产d - h p h g 。固定化酶技术是将游离的水溶性酶固定在某一固体载体上装在反应器中， 可连续化生产，反应易控制且操作简便。在固相酶生产工艺中酶的活力损失少，反应过程中 酶不会流失，产物易于分离，产品质量和产率高。固定化酶可以长期使用，如德国g m b h 公司的固体酶每批酶可循环使用2 0 0 次以上，但价格昂贵。 2 3 生物群法 酶法是采用已二醛为原料，经氧化生成乙醛酸后不经分离直接加入苯酚与尿素，下一步 生成对羟基苯乙酰腮。再用假单孢菌与土壤杆菌为酶源。选择性生成氨基甲酰( h p h ) 再水 解生成氨基甲酰。以化学水解脱去氨基甲酰基后的对羟基苯甲酸。利用自行从土壤中分离的 假单孢菌产生的酶，在诱导剂的作用下，在发酵及酶转化的最佳工艺条件下可生成高产率的 8 河南大学2 0 0 5 届硕士研究生论文 对羟基苯甘氨酸。生物拆分法是当前园内提倡的一种拆分方法，国外已广泛应用化学酶法制 备对羟基苯甘氨酸工艺，并且利用荧光假单孢菌9 8 0 6 作为酶源，使拆分收率达到4 8 。该 法经济，适合大规模生产，目前我国有些企业已开始采用生物拆分技术。 海因酶能选择性地将外消旋d l - 舜j 羟基苯海因中d 型水解为n 一氨甲基一d 一对羟基苯 甘氨酸( n c - d - p h p g ) ，残留l 一羟基本海因在中性或碱性条件下，迅速自发消旋为d l - 剐 羟基苯海因。因此d 蝴十羟基苯海因最终接近完全转化为d - - p h p g 。酶拆分法包括一步酶一 步化学法和两步酶法。前者是用海因酶将d l - p h p g 水解为n - d - p h p g ，再用化学法将其水 解为d - p h p g 。随着n 一氨甲基水解酶在自然条件中被发现，两步酶法生产d - p h p g 已成为 研究地热点，最新分离出的p s e u d o n m a s p 2 2 6 2 和a g r o b a c t e r i u ms p 1 p 1 6 7 l 菌株，能同时产 生海因酶和氨甲酰水解酶，这就为一菌双酶一步酶法生产d - p h p g 奠定了基础【“。 3 截生物酶法制鲁m 对羟基苯甘氨酸的研究进晨 手性化合物的研究已成为立体化学、药物化学中最重要最活跃的部分 1 1 l 。获得手性化合 物的方法不外乎非生物法和生物法两种。其中徽生物在生物催化的手性合成中有着重要的作 用。它是利用徽生物中特定的酶或直接利用完整细胞，将人工合成的非天然化合物进行生物 转化，转化液经分离纯化得到所需产品。 d 氨基酸及其衍生物广泛应用于医药等领域，是合成抗菌和抗病毒药物、人工甜味剂、杀虫剂 以及拟除虫菊醣的重要中间物 1 2 ：1 特别是作为b 内酰胺类抗生素和多种多肽类激素及农药的 主要侧链的n 对羟基苯甘氨酸( d - p - h y d r o x y p h e n y l g l y c i n e ，d - p - h p g ) ，更受到学术界与产业界 的关注。微生物酶转化法是以d l 对羟基苯海因慨巾栅h ，d l - - p - - h y d r o x y p h e n y l h y d a n t o i n ) 作为底物，利用微生物中特定的尊或者是利用其完整细胞将其转化为d - p - h p g ，如f i 9 1 所示。 3 1 单酶法( 又称一步酶一步化学法) ： 单酶法是利用微生物体内产生的d 一海因靴h a s e ) 将d l - p - h p h 水解成为氨甲酰 对羟基苯甘氨酸o l c d _ p 叫册g ) 【t 3 1 。同时，在酶反应条件下，l 一型底物消旋，最终使底物利 用近i g g ，最后用化学法将n c d p 删水解脱去氨甲酰基得到d - p - h p g 。 3 2 双酶法制备d p 一如，g ： 随着d 一氨甲酰水解酶( 1 ) c a s e ) 在微生物体内被发现，双酶法生产n _ p 硼已成为研究 9 徽生物酶法制各d 一对羟基苯甘氨酸的研究 的热点【“】。1 9 7 9 年o l i v i e r i 等首先报道了一株a g t o b a c t e r i u mr a d i o b a c t e r 同时具有d 一海 因酶和d 一氨甲酰水解酶活性【1 ”。最新分离出的p s e u d o m o n a s s p 2 2 6 2 和如”幻甜e “s p i p 一1 6 7 1 菌株能够同时产生d - - 海因酶和d 一氨甲酰水解酶，这为一菌双酶一步生产沪d 堋p g 奠定了基础【。双酶法较之单酶法有许多优点：采用具有双酶的微生物作为生物催化剂， 将其与底物在单个反应器中孵育就能直接转化出d _ 矿哈。摩尔收率也较单酶法高，可达 l o o 。避免了有毒的n a n 0 2 的使用。还可推广到对删0 2 不稳定的氨基酸( d _ 瓜氨酸) 的酶法合成中。 一- l ! ：- - _ i ：1 。一_ _ i l ! ! ：- 。1 f 。+ 。e 一， 一， f i 9 1 单酶法或双酶法生产d - p - h p g 的方案 双酶法制备n p m ，g 的反应体系有两种：一种是利用两种细甩它们分别只产生一种酶 旧；另一种是利用一种细胞它可同时产生两种酶”1 。j o o h o p a r k 等对这两种体系进行了研究， 证明后一种体系具有更高的生产效掣”1 。这不仅是因为在细胞培养上后者更为方便更重要的 是由于细胞膜对中间产物即n c - d - p - h p g 的通透性差，在前一种体系中会造成中间产物的大 量积累，降低了州p g 的生产效率。而在后者中就不存在有中间产物的运输问题。 3 3 一菌多酶法制备d - p - i - m g 在单酶法和双酶法中，底物对羟基苯海因发生自发消旋的ph 为碱性。而碱性环境对于口 氨甲酰水解酶来讲是不利的，它使得d 一氨甲酰水解酶对氮离子的抑制非常敏感，而氨离子正 是n 氨甲酰水解酶脱酰胺的副产物。r u n s e r 等人通过实验证明对n 氨甲酰永解酶真正产生 1 0 河南大学2 0 0 5 届硕士研究生论文 抑制作用的是n h 3 而不是n h 4 + ，n h + 对口氨甲酰水解酶几乎没有抑制作用畔”。这是因为 在碱性条件下反应的副产物主要以n h 3 的形式存在，而酸性条件下的主要存在形式n h 4 + 。因 此，维持中性或酸性的反应环境对d 呻一h p g 的生产是有利的。早在1 9 9 0 年时r u n s e r 等人 发现对于菌株如即加c t e 打s p i p - 1 6 7 1 由d l 砷_ 壬) h 转化为d _ p - h p g 的最适ph 值为酸 性环境，而在同样的ph 条件下观测不到化学意义上的自发消旋现象汹。这就意味着该菌株 体内存在着一种重要的海因消旋酶，它可以在ph 为酸性时迅速的将底物去消旋。此外，a n j a w i e s e 等人也在心地m 6 a c t 盯8 u r e s c e n sd s m3 7 4 7 中发现了海因消旋酶瞄】。研究表明在具 有高海因酶和氨甲酰水解酶活力的菌株中，消旋酶是非常有用的，因为在这些菌株中，对羟基 苯海因的消麓是d _ p 删生产中的瓶颈。 3 3 生物酶的获得一菌株的选育 酶能催化多种非天然有机化合物发生转化反应，其中有些反应是化学法难以或不可能完 成的并且在生物转化反应所用的酶几乎都来源于徽生物渊。徽生物生物转化的优点是不需要 尊的分离纯化和辅酶再生。因此如何筛选到含有所需酶的微生物就显得尤为重要。目前已经 分离到的同时具有n 海因酵和肛氨甲酰水解酶活性的双酶徽生物分属于土壤杆菌、假单胞 菌属、节杆菌、芽生杆菌属和无色杆菌属。 3 3 1 海因酶产生菌的筛选 摇瓶筛选方法，该方法是对已经分离到的纯种细胞进行摇瓶培养，然后通过离心收集 菌体制成菌惫液作为酶源。最后通过c 法或改进的c e c e m 法以对羟基苯海因作为底物 测定海因酶的醇活，从而确定酶的有无以及醇活的高低，达到筛选目的。这是一种非常耗时和 繁琐的筛选手臣因为其要求首先要获得大量的经过纯培养的菌株然后分别进行液体培养、收 集菌体、测定酶活。 固体平板快速筛选法，鉴于摇瓶筛选方法的不足，1 9 8 6 年a i l d 障m o r i n 等人建立了固 体平板快速筛选方法，又称作双层琼脂法。它是将待鉴别的菌株在含有海因或其衍生物的固 体琼脂培养基上于2 7 下培养1 8 2 4 小时，然后在每个平板上覆盖上一层1 0 1 左右含有 5 a l l 对羟基苯海因和1 5 琼脂的t r i s - h c l 缓冲液( ph 为8 0 、温度为“) ，接着在3 7 下培养2 4 小时。培养完毕后直接在菌落上清加i o u l 左右的1 0 p d a b ( d i m e t h y l a m i n o b e n _ 微生物酶法制各d 一对羟基苯甘氨酸的研究 z a l d e h y d e ，6 nh c l 配置) 进行检测。阳性菌株的菌落在5 1 0 秒内就会呈现出特异的黄色。 该方法也存在有不足的地方，它不能排出细菌自身分泌的黄色物质带来的干扰，而且耗时依然 较多。 微孔快速筛选法，微孔快速筛选法在原理上与平板快速筛选法相同。它是将待检测的 细菌在平板培养基上于2 8 培养2 l 小时，然后挑取少量菌体至装有l o o u l 底物浈( 含有1 的对羟基苯海因) 的徽孔内，混匀后，在3 7 下温育半小时，然后在每孔内加入l o u l 左右的1 0 p d a b ，高酶活的菌株会立即呈现出特异性的黄色。该方法适用于大量菌株的定性筛选不适 合少量菌株问精确定量筛选比较，因为从平扳转移到微孔反应体系中的细菌的量不易定量控 制。 选择性培养基筛选法，它是以海因或其类似物作为唯一氮源来筛选产海因酶的菌株。 是目前田际上普遗采用的一种筛选方法。如r u n s e r 等以d l - 5 异丙基海因作为唯一氮源筛选 到了一株可同时产生d 峨和d c , a s e 的、具有强立体专一性的将d i 呻删转化为d - 唧b 的土壤杆菌钾。妇 州研ls p i p - 1 6 7 1 鲫。 底物类似物抗性筛选法，该方法是以对底物类似物的抗性作为选择性标记来筛选海 因酶高产突变菌株的。其原理是当一种能使微生物致死或抑制其生长的底物类似物存在时， 不产或低产酶的菌株就被杀死或抑制生长，只有那些能产生大量酶从而将底物类似物作用掉 的菌株才能生长。这样就可以大量淘汰经过诱变处理后产量低的菌株提高了诱变育种的效 率。 氨甲酰水解酶产生菌的筛选，筛选m 氨甲酰水解酶产生菌通常所使用的方法是i ；l “ 氨甲酰n 对羟基苯甘氨酸为唯一氯源来进行选育的。如h i r o k a z un a n b a 等人以这种方法成 功的从土壤中筛选到了一株产n 氮甲酰水解醇的土壤杆菌d g m 妇把帕s p k n k 7 1 2 鸪! 。 3 3 2 工程菌的研究 野生型菌株中n 海因酶和m 氨甲酰水解酶的酶活较低，满足不了工业化生产的需求。人们 已经构建出了基因工程菌来解决这个问题洲。如l i z h i q i a n g 等和y u n p e n g c h a o 等分别将 p s e u d o m o r u 2 s p u t i d a 中的【卜海因酶基因和伽6 a 绷”f 埘l r a d i o b a c t e r n r r lb 1 1 2 9 1 中的d 氮 甲酰水解酶的基因在大肠杆菌中获得了高效表达”“。r e n a t ag - f i f a n t i n i 等还将编码两种酶的 河南大学2 0 0 5 届硕士研究生论文 基因构建共同一质粒并转化大肠杆菌进行获得了两酶稳定商效表达的工程菌。 但是人们发现在ec o l i 中异源蛋白的过量表达通常会导致不溶的无生物活性的蛋白聚 集物即通常所说的包涵体的形成。y p c h a o 等认为这是由于外源基因所表达出的新生 多肽得不到有效包装并由此形成的不完全折叠的多肚中间体的迅速积累造成的。y p - c h a - - o 等通过将含有分子伴侣基因d n a j d n a k 的质粒与含有d 海因酶基因的质粒一同或 者是含有分子伴侣基f f a g r o e l g r o e s 的质粒与n 氮甲酰水解酶蒸因的质粒一同转化大肠轷菌， 分别获得了以溶解形式存在n 海因酶或m 氨甲酰水解酶，并且活力分别提高了四倍醐。d - 氨 甲