（遗传学专业论文）法尼基转移酶与血管内皮细胞迁移关系的研究.pdf

摘要 摘要 细胞迁移是一项基本的细胞活动，它是指细胞在接收到迁移信号或感受 到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。在此过程中细胞不断重复着向前方 伸出突触，然后牵拉胞体的动作。细胞迁移在很多生理和病理过程中起着 重要作用，很多疾病的发生与细胞迁移的异常有关。因此细胞迁移成为 当今生物学的热门研究方向。细胞迁移是一个连续的过程，其关键步骤 是细胞的极化。细胞要有效地运动，首先要确定前进的方向，而这个确 定方向的过程，其实是细胞内与运动有关的物质和各类细胞骨架的重新 分布的过程，因此细胞显出极性。血管内皮细胞分布在整个心血管系统的 内表面，是血管壁与血液之间的分界细胞，是形成心血管封闭管道系统的形 态基础。血管内皮细胞是一类功能复杂的细胞，其迁移在血管新生、伤口愈 合、内皮损伤的愈合等过程中起着重要的作用。 法尼基化是异戊二烯化的一种，异戊二烯化是一种重要的蛋白质翻译后 修饰。异戊二烯基团可以增加蛋白的疏水性，在一些情况下，异戊二烯基团 可将蛋白锚定于膜中，或者促使其与其他蛋白相互作用。法尼基化是指法尼 基转移酶在其底物蛋白羧基端的c a a x 四肽结构中的c y s 残基上加上一个法 尼基基团。人们研究法尼基化的最初动力是发现原癌蛋白r a s 需要经过法尼 基化才可以锚定于膜上，从而具有活性。因而人们试图寻找法尼基转移酶的 抑制剂，通过抑制r a s 的法尼基化来治疗癌症。法尼基转移酶抑制剂通过阻 断底物蛋白的法尼基化修饰从而抑制蛋白的生物活性，是处于研究热点的一 类有前途的新型抗肿瘤化疗药物。目前有三种法尼基转移酶抑制剂正在进行 临床试验，包括s c h 6 6 3 6 6 ( l o n a f a m i b ) 、r 11 5 7 7 7 ( t i p i f a m i b ) 和b m s 2 1 4 6 6 2 。 其中，t i p i f a m i b 等法尼基转移酶抑制剂已完成了i i 期临床实验，现开始进入 期临床研究。 本课题试图探讨法尼基转移酶在人类血管内皮细胞迁移中的作用。经过 研究我们发现法尼基转移酶在血管内皮细胞迁移中有重要作用，无论是抑制 其活性还是降低其表达水平，均能够显著抑制血管内皮细胞的迁移。法尼基 转移酶抑制剂能够明显抑制划线后细胞的极化，由于极化在细胞迁移中起着 关键作用，所以很可能法尼基转移酶是通过抑制极化来抑制血管内皮细胞的 t 摘要 迁移的。法尼基转移酶抑制剂能够在体外抑制血管内皮细胞聚集成血管，药 物浓度越高，抑制作用越明显。同时我们发现f n t b 与e b l 在胞内有直接的相 互作用，而且f n t b 的催化结构域对这种相互作用是必不可少的。法尼基转移 酶抑制剂还能够减弱e b l 在微管末端的定位。 关键词：法尼极化；法尼基转移酶；法尼基转移酶抑制剂；血管内皮细胞； 细胞迁移；细胞极化；e b l i l a b s t r a c t a b s t r a c t c e l lm i g r a t i o ni sab a s i cc e l l u a ra c t i v i t y ，w h i c hr e f e r st ot h em i g r a t i o no f c e l l si nr e s p o n s et os i g n a ls t i m u l u so rt h ec o n c e n t r a t i o ng r a d i e n to fc e r t a i n s u b s t a n c e s i nt h i sp r o c e s s ，c e l l sc o n t i n u o u s l yu n d e r g ot h ep r o c e s so fp r o t r u s i o n o ft h ef r o mf o o ta n dm o v e m e n to ft h ec e l lb o d y c e l lm i g r a t i o np l a y si m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a lr o l e si ne m b r y o n i cd e v e l o p m e n t ，n e u r a lf o r m a t i o n , a n g i o g e n e s i s ， w o u n dh e a l i n g ，t i s s u er e g e n e r a t i o n ，p l a n tp o l l e nt u b ef o r m a t i o n , i m m u n i t y ， i n f e c t i o na n dc a n c e rm e t a s t a s i s i na d d i t i o n ，a b n o r m a lc e l lm i g r a t i o ni si n v o l v e d i nt h ed e v e l o p m e n to fm a n yd i s e a s e s b e c a u s eo fi t si m p o r t a n c e ，c e l lm i g r a t i o n h a sb e e nt h es u b je c to fi n t e n s t i v es t u d y c e l lm i g r a t i o ni sac o n t i n u o u sp r o c e s s ， w h o s ek e ys t e pi sc e l lp o l a r i z a t i o n f o rc e l l st om o v ee f f e c t i v e l y t h ef i r s ts t e pt h a t t h e yh a v et oc o m p l e t ei st od e t e r m i n ew h e r et h e ”f r o n t ”i s i no r d e rt oa c h i e v et h i s ， c e l l su n d e r g or a p i dr e o r g a n i z a t i o no fc e l l u l a rm a t e r i a l sa n dr e a r r a n g e m e n to ft h e c y t o s k e l e t o n ，ap r o c e s sk n o w na sc e l lp o l a r i z a t i o n v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s d i s t r i b u t et h r o u g h o u tt h ei n n e rs u r f a c eo ft h ec a r d i o v a s c u l a rs y s t e m t h e ya r et h e b o u n d a r yb e t w e e nb l o o dv e s s e lw a l la n db l o o d ，a n dt h e r e b yp l a yc o m p l e xr o l e s t h r o u g ht h ep r o d u c t i o no fe n d o t h e l i n ，n o ，a n do t h e rv a s o a c t i v es u b s t a n c e s ， v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l sc a nr e g u l a t ev a s c u l a rs t r a i na n dm a i n t a i nn o r m a lb l o o d f l o w e n d o t h e l i a lc e l lm i g r a t i o np l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei na n g i o g e n e s i s ，w o u n d h e a l i n g ，a n de n d o t h e l i a li n j u r yh e a l i n g f a r n e s y l a t i o n i sat y p eo fp r e n y l a t i o n ，a ni m p o r t a n tp o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o no fp r o t e i n s p r e n y lg r o u pc a l li n c r e a s et h eh y d r o p h o b i c i t yo fp r o t e i n s ， a n da i di np r o t e i na n c h o r a g eo n t op l a s m am e m b r a n eo rp r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n f a r n e s y l t r a n s f e r a s e ( f t a s e ) r e c o g n i z e sp r o t e i n s w i t ha c a r b o x y - t e r m i n a l t e t r a p e p t i d ec a a x a n da d d sa ni s o p r e n o i df a m e s y lg r o u pt ot h ec y sr e s i d u e t h e o n c o p r o t e i nr a sn e e d st ob ef a r n e s y l a t e dt oh a v ea c t i v i t y f a r n e s y l t r a n s f e r a s e i n h i b i t o r sa r eu s e f u lf o rc a n c e rc h e m o t h e r a p yp r i m a r i l yd u et ot h e i ri n h i b i t i o no f r a sa c t i v i t y t h e r ea r et h r e ef t a s ei n h i b i t o r sc u r r e n t l yu n d e r g o i n gc l i n i c a lt r i a l ， i n c l u d i n gs c h 6 6 3 6 6 ( l o n a f a r n i b ) ，r 115 7 7 7 ( t i p i f a m i b ) ，a n db m s 2 14 6 6 2 i nt h i ss t u d y ，w ea t t e m p tt o e x p l o r et h er o l eo ff a m e s y l t r a n s f e r a s ei n t h e 1 1 1 a b s t r a c t m i g r a t i o no fh u m a nv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s ( v e c s ) o u rd a t as h o wt h a t f a m e s y l t r a n s f e r a s ep l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei nv e cm i g r a t i o n e i t h e ri n h i b i t i o no f i t sa c t i v i t yo rd e c r e a s eo fi t se x p r e s s i o nc a ns i g n i f i c a n t l yi n h i b i tt h em i g r a t i o no f v e c s o u rd a t af u r t h e rs h o wt h a tf a r n e s y l t r a n s f e r a s ei n h i b i t o r sc a ni n h i b i tc e l l p o l a r i z a t i o n s i n c ec e l lp o l a r i z a t i o np l a y sak e yr o l ei nc e l lm i g r a t i o n ，i ti sl i k e l y t h a t f a m e s y l t r a n s f e r a s e i n h i b i t o r sc o u l di n h i b i tv e c m i g r a t i o nt h r o u g h s u p p r e s s i n gc e l lp o l a r i z a t i o n o u rr e s u l t sa l s o s h o wt l l a t f a m e s y l t r a n s f e r a s e i n h i b i t o r sc a ni n h i b i tb l o o dt u b ef o r m a t i o ni nv i t r oi na d o s e d e p e n d e n tm a n n e r i n a d d i t i o n ，w eh a v ei d e m i f i e da ni n t e r a c t i o no fe n db i n d i n gp r o t e i n1 ( e b1 ) w i t h f a r n e s y l t r a n s f e r a s e ，a n dt h ec a t a l y t i cd o m a i no ff a r n e s y l t r a n s f e r a s ei se s s e n t i a lf o r t h ei n t e r a c t i o n f u r t h e r m o r e ，o u rd a t as h o wt h a tf a m e s y l t r a n s f e r a s ei n h i b i t o r sc a n i n h i b i tt h el o c a l i z a t i o no fe b1i nm i c r o t u b u l ep l u se n d s k e yw o r d s ：f a m e s y l a t i o n ；f a r n e s y l t r a n s f e r a s e ；f a m e s y l t r a n s f e r a s ei n h i b i t o r s ； v e c ；c e l lm i g r a t i o n ；c e l lp o l a r i z a t i o n ；e b1 i v 缩略词 缩略词 f t a s e ：f a r n e s y l t r a n s f e r a s e f t i ：f a m e s y l t r a n s f e r a s ei n h i b i t o r v e c ：v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l e b l ：e n db i n d i n g1 m t ：m i c r o t u b u l e f n t b ：f a m e s y l t r a n s f e r a s eb e l t as u b u n i t m t o c ：m i c r o t u b u l eo r g a n i z i n gc e n t e r v 法尼基转移酶 法尼基转移酶抑制剂 血管内皮细胞 末端结合蛋白l 微管 法尼基转移酶b e t a 亚基 微管组织中心 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位 论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公 开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其 他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性 声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：钐l 司矮 沙叼年多月日 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规 定，同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和 电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影 印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目 录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权 按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子 版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分 或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 彭国矮 砂帚歹月询 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用本 授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月 日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 第一章前言 1 1 1 细胞迁移概述 第一章前言 第一节细胞迁移 细胞迁移( c e l lm i g r a t i o n ) 是一项基本的生命活动，它是指细胞在接收到迁 移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。在此过程中细胞不断 重复着向前方伸出突触，然后牵拉胞体的循环过程。从1 7 世纪安东尼凡列 文虎克( a n t o n i ev a i ll e e u w e n h o e k ) 在显微镜下观察细菌的运动开始，到现 在3 0 0 多年的时间里，人们就一直试图去理解细胞迁移过程的细节以及其机 制。现在科学家对细胞迁移复杂机理的认识有了非常大的进步，但是整个过 程仍未被了解透彻，很多中间过程都未能明确。 细胞迁移是通过其细胞体本身的形变而进行的定向移动，是一种主 动的移动。这有别于其他类型的细胞的运动：如精子细胞依靠鞭毛与纤 毛进行的运动、或是各种血细胞在血液中随着血液的流动而流动。而且 相比起后两者，细胞迁移的速度要慢很多很多：以活跃的成纤维细胞为 例，其平均移动速度约为l 微米每分钟【l 】，而精子的平均游动速度则为 5 6 4 4 微米每秒1 2 j ，即大约为3 4 0 0 微米每分钟，两者约差3 0 0 0 倍；而且 细胞用力甚轻，成纤维细胞胞体收缩的力只有2 1 0 。7 牛顿【3 】。虽然如此 细胞迁移却在胚胎发育过程4 ，5 1 、神经中枢的形成6 ，7 1 、血管生成1 1 、 创伤修复与组织再生【1 2 ，13 1 、植物花粉管的形成14 1 、免疫15 1 、感染1 6 1 和 癌症转移【1 7 ，1 8 】等等生理和病理过程中起重要作用。很多疾病的发生与细 胞迁移的异常有关，像动脉粥样硬化、骨质疏松症、出生缺陷、心脏病、 某些慢性炎症反应等。也因为细胞迁移独有的运动特性，使之成为当今 生物学热门研究方向。细胞迁移同时也是目前细胞生物学研究的一个主 要方向，科学家们试图通过对细胞迁移的研究，在阻止癌症转移、植皮 等医学应用方面取得更大成果。 第一章前言 1 1 2 细胞迁移的物质基础 细胞迁移作为一个复杂的连续的生命活动，需要内外因素的配合。 外部的因素指的是细胞外的能够引起细胞迁移的包括物理的和化学的信 号刺激。内部因素则指细胞的信号传导系统和执行运动的细胞骨架和运 动相关蛋白质。细胞感受到胞外的各种刺激后，信号分子结合到膜上受 体，或者是激活与受体偶联的蛋白质g t p a s e ，或者先是激活受体酪氨酸 激酶，再激活下游的小分子g 蛋白r a s l l9 | 。当g 蛋白被激活后，它下游 的多种分子会被激活【2 0 1 。这些下游分子本身会形成网络，相互制约，或 者是相辅相成，将运动信息进一步传给细胞迁移的执行者细胞骨架 和分子马达以及其它相关的蛋白质。 g 蛋白是一个很大的家族，在细胞中扮演着信号传导开关的角色： 当它们与g d p 结合时，呈现失活状态，与g t p 结合则进入激活状态【2 1 1 。 参与细胞迁移的g 蛋白主要有3 种，r h o ，r a c ，c d c 4 2 ，他们都属于r h o 蛋白家族成员。图1 1 简单示意了这三种小分子蛋白在细胞迁移中的作 用。细胞极化发生时，r a c 和c d c 4 2 主要定位于细胞的前端，其中c d c 4 2 主要调节细胞迁移的方向，r a c 通过促使微丝聚合来促进细胞前端突触 的形成，而r h o 主要定位在细胞的后端，促使微丝和肌球蛋白收缩【2 2 。2 6 。 图1 1r h o 蛋白调节细胞的迁移【2 3 】 细胞骨架是微丝，微管和中间纤维的总称，而在细胞迁移中起主要 2 第一章前言 作用的是微丝和微管。 微丝( m i c r o f i l a m e n t ) 是由肌动蛋白( a e t i n ) 组成的直径约为7n l i l 纤维结构，所以微丝又称为肌动蛋白纤维( a c t i nf i l a m e n t ) 。肌动蛋白 单体为球形，其表面上有一个a t p 结合位点。肌动蛋白单体一个接一个 连成一串肌动蛋白链，两串这样的肌动蛋白链互相缠绕扭曲成一股微丝。 这种肌动蛋白多聚体又被称为纤维形肌动蛋白( f a c t i n ) 。微丝能被组 装和去组装：当单体上结合的是a t p 时，就会有较高的相互亲和力，单 体趋向于聚合成多聚体，就是组装。而当a t p 水解成a d p 后，单体亲 和力就会下降，多聚体趋向解聚，即是去组装。在一定条件下，微丝可 以表现为一端( + 极) 装配的速度较另一端( 极) 快，表现为一端因加 亚单位而延长，另一端则因其亚单位的脱落而减短，这种现象称为踏车 现象。微丝在结构上的极性对其行使功能是必要的。极化的细胞前沿 a e t i n 聚合产生的微丝的收缩被认为是细胞迁移的主要驱动力 2 7 - 2 9 】。 微管( m i e r o t u b u l e ) 是另一种具有极性的细胞骨架。它是由1 3 条 原纤维( p r o t o f i l a m e n t ) 构成的中空管状结构。每一条原纤维由微管蛋 白异二聚体线性排列而成。微管和微丝一样，能被组装和去组装，具有 极性，有时也表现出踏车现象。微管在细胞内起支撑作用，辅助细胞内 物质运输，与其他蛋白共同装配成纺锤体，基粒，中心粒，在细胞有丝 分裂中起关键作用，还参与组成鞭毛，纤毛神经管等结构。另外它还是 两种运载分子驱动蛋白( k i n e s i n ) 和发动蛋白( d y n e i n ) 的行走轨道【3 0 刁4 1 。 微管对细胞的迁移是必需的，破坏细胞内的微管细胞会失去极性【3 5 ，3 6 1 。 有科学家这样描述微管在细胞迁移中的作用：“稳定住细胞边缘活动的 和不活动的部分” 3 7 - 3 9 】。微管还会限制粘着斑的形成，并且会促进后者 在细胞的其它部位被重新利用，后面这种现象被称为粘着斑的周转【3 8 1 。 此外，微管作为一个庞大的骨架系统，可能通过其众多的结合蛋白调节 和影响细胞迁移的方方面面【4 叽4 引。微管和微丝之间还可以通过相关蛋白 发生相互作用【4 引。 细胞迁移作为一种运动方式，必然需要分子马达的参与。其中很重 要的一个马达蛋白是肌球蛋白。肌球蛋白是一种微丝结合蛋白，最早发 现于肌肉组织，1 9 7 0 年代后逐渐发现许多非肌细胞的肌球蛋白。肌球蛋 白除了参与肌肉收缩外，还被认为是细胞迁移所需的重要分子之一。肌 第一章前言 球蛋白非常可能参与前进的四个步骤里面胞体收缩一步。另外，在细胞 突出一端也可观察到肌球蛋白，它可能是帮助运输粘着所需要的蛋白质， 提高粘着效率。 1 1 3 细胞迁移的过程 细胞迁移是一个连续的过程，其关键步骤是细胞的极化。因为细胞 迁移是通过其细胞体本身的形变而进行的定向移动，所以细胞要想有效 的运动，首先要确定其前进的方向，否则会出现细胞体两部分同时向相 反方向运动的情况( 这在一些神经系统不发达的无脊椎动物中是可以见 到的) 。而这个确定方向的过程，其实是细胞内与运动有关的物质即上 面所提到的肌球蛋白，和各类细胞骨架物质重新分布的过程，因此细胞 显出极性，这个重新分布的过程也因而被称为细胞的极化( p o l a r i z a t i o n ) 。 图1 2 ( 引自邢艳丽等，现代生物医学进展2 0 0 7 年0 6 期) 示意了一个 细胞由非极化状态变为极化状态的一些重要变化：细胞分出前后端，箭 头所示为细胞迁移的方向，微管组织中心( m t o c ) 与细胞核的相对位置 发生变化，极化情况下，m t o c 位于细胞的前端，同时，微管，微丝都 大量聚集在细胞的前端，而且分别形成特殊的结构以促使迁移的发生。 细胞极化后，在细胞的前端微丝伸出突触。极状足伸出后与细胞前 方的底质附著，形成一种固定结构，称为粘着斑。此时，胞体主体会被 牵拉向前；最后细胞的后端与底质剥离。这样前进的4 个步骤完成，并 准备下一次循环。图1 3 形象的展示了细胞迁移的整个过程。细胞迁移 的每一步都受到上述各种物质构成的一个精巧的调节网络的控制，以保 4 第一章前言 证原料和能量的合理利用和细胞迁移的有效进行。 图13 细胞迁移过程示意图 第一章前言 1 1 4 血管内皮细胞迁移 血管内皮细胞( v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s ) 分布在整个心血管系统的内表 面，组成单层扁平上皮组织，是血管壁与血液之间的分界细胞，是形成心血 管封闭管道系统的形态基础。血管内皮细胞是一类功能复杂的细胞，其活跃 地参与血小板功能的调节，血浆促凝因子的激活、活化的凝血因子的清除及 纤溶过程 5 0 - 5 3 】，并通过其产生的内皮素、n o 等血管活性物质以调节血管张 力【5 4 1 ，维持正常的血液流变性【5 5 1 。内皮细胞迁移功能在血管新生、伤口愈合、 内皮损伤的愈合等过程中起着重要的作用【5 b 5 9 j 。 近3 0 年来肿瘤领域的最重大进展之一，是确立了血管生成( a n g i o g e n e s i s ) 在肿瘤发生和发展中的重要地位 6 0 - 7 1 】。肿瘤形成后，癌细胞本身，或周围 的结缔组织，会分泌许多促使血管新生的物质。这些物质会激活血管内 皮细胞发生下列变化：肿瘤周围结缔组织的分解破坏；内皮细胞增生； 内皮细胞向分泌促使血管新生物质的地方移动；内皮细胞重新组合成新 生血管。恶性肿瘤的侵袭性和转移特性与肿瘤血管新生密切相关。对肿瘤而 言，获得并维持本身的血供，即肿瘤血管新生是肿瘤生长、转移并具有致死 性的先决条件。当肿瘤只有2 3m m 大小时，它可依靠渗透作用从外界取 得养份，但是一旦超过这个大小，就必需新生血管来获取养份。在实验 室中，若将肿瘤细胞种在动物身上无血管的区域，肿瘤呈休眠状态；但 若种在血管丰富的虹膜区，肿瘤则可快速生长。另外，将抑制血管新生 的药物打在有肿瘤的动物身上，可显著减缓肿瘤生长；反之，若施打刺 激血管新生的药物，则加速肿瘤生长。 抗肿瘤血管新生的研究近年来成为肿瘤治疗的热点【7 2 。7 5 1 。目前以肿瘤血 管为靶标的治疗策略一血管靶向治疗已经成为重要手段，在肺癌等肿瘤的治 疗中显示了良好的前景。揭示影响内皮细胞迁移的因素对于开发新药用以抑 制肿瘤的生长、促进组织损伤的修复等都有着积极的作用l 7 6 】。 6 第一章前言 第二节法尼基转移酶 1 2 1 法尼基化与法尼基转移酶 同磷酸化、乙酰化一样，异戊二烯化( p r e n y l a t i o n ) 是一种重要的蛋白质翻 译后修饰。许多真核蛋白被异戊二烯化：在蛋白的c y s 残基和异戊二烯基团之 间形成硫醚键。异戊二烯基团可以增加蛋白的疏水性，在一些情况下，异戊 二烯可将蛋白锚定与膜中，或者促使与其他蛋白的相互作用。从低等的真核 细胞到哺乳动物系统这种修饰广泛存在。催化异戊二烯化的酶是异戊二烯转 移酶( p r e n y l t r a n s f e r a s e s ) ，现在已知的异戊二烯转移酶有三种( 见表1 1 ) ，根据 所作用底物的特性可分为两类。 表1 13 种异戊二烯转移酶性质m 1 f c g g t m i s u b u n l te o m 娜| t i o n 妇n a ，￥l m 冉l i 榭啦 s m “萨“_ h m 删h m * 嗽 l p r d l 臻埘l 如t 脯e p 扣州蟹i 靴篇毗翻滗幢薯 8k d d 盎 4 gk 1 ) a 两 屁双挖釉 r 触积两 z n 2 + m 矿+ f p p l l l 博n 獬l e 曩rl 矗f 瞄i t 钆 t r a n d 域m m ny 罩i l b 毒毒磁t c ：a a x x mm s 。q ，a 。f 4 8 k d a 脚k d a 猢 4 3 4 绚黯k d a 锄 r 4 勉汹b 譬t 4 汹 3 绷触瓣 z n 2 + 赫矿+ ，舻乃 g g p pg g p p 掰均，孙# 。r e p r 赫拍m 聱i e x 黼i r l l l m e 拼嘲，擞黼姆 一c 删r b 粕e c 拶m 啦舔 。r 脯l 。f卜c c - c x c ，c c j f x 删d 删 三种异戊二烯转移酶中，法尼基转移酶( f a r n e s y l t r a n s f e r a s e ，f t a s e ) 是最 早被发现并鉴别的【7 8 1 。法尼基转移酶是由一个4 8k d 的a 亚基和一个4 6 k d 的b 亚基组成的异二聚体，其中q 亚基与g g t a s e i 共享，1 3 亚基是特异的， 识别特异性的可被f t a s e 催化的c a a x 结构域【7 9 j 。图1 4 展示了法尼基转移 酶的结构，可以看出其a1 3 亚基均主要由a 螺旋结构组成，d 亚基包含有一个 z n 离子，组成锌指结构。 7 第一章前言 图14 法尼基转移酶结构 法尼基转移酶在其底物蛋白的羧基端的c a a x 四肽结构中的c y s 残基上 加上一个类异戊二烯基团法尼基，反应中所需的法尼基基团来自法尼基焦磷 酸( f a m e s y l d i p h o s p h a t e ，f p p ) 。f 1 缸e 的一个最重要的底物是一种小分子的 g t p a s er a s ，一种在很多种癌症中有过量表达的癌原蛋白，突变的r a s 在 3 0 n , 的人类癌症中有表达。图1 5 表示的是以r a s 为例的法尼基化反应。 图15r a s 蛋白的法尼基化 r a s 的名字来源于大鼠肉瘸r a ts a r c o m a ，是原癌基因c m s 的表达产 物，相对分子质量为2 lk d a 属于小分子的g t p a s e ，具有弱的g t p 酶 第一章前言 活性。r a s 在传递细胞生长分化信号方面起重要作用，是重要的分子开 关，参与多条信号通路的调节。r a s 蛋白的活性状态对细胞的生长、分 化、细胞骨架、蛋白质运输和分泌等都具有影响【8 。 r a s 蛋白定位在细胞质膜内表面上。由于r a s 蛋白必须经过法尼基化才 能够定位到细胞膜上( 图1 6 ) ，而只有定位到细胞膜上r a s 蛋白才能够有活 性【8 2 讲】。所以对f t a s e 进行的研究越来越多，人们期望通过f t a s e 找到一种可 能的抗癌方式【8 5 8 6 1 。现在人们已经发现几种法尼基转移酶抑制剂( f a m e s y l t r a n s f e r a s ei n h i b i t o r s ，f t i s ) 具有抗癌功效哆7 。9 1 1 ，有些甚至被作为抗癌药物进 入i i i 期临床实验阶段【9 2 。9 5 1 。但是跟人们最初的设想不同的是，f t i 的抗癌作用 并不一定需要依赖r a s 蛋白【9 6 】。r a s 基因家族包括3 中功能基因，分别编码3 类 4 种2 1k d 的蛋白，h r a s ，k i 4 a r a s ，k i 4 b r a s 和n r a s 。r a s 蛋白均可被法 尼基化，其中k r a s 和n r a s 同时可被g g t a s e i 催化【9 7 】。研究人员试图发现 另外的机n t 9 8 】。 图1 6r a s 蛋白的翻译后修饰嘲1 法尼基转移酶的另一个重要底物是4 4k d 的蛋白h d j 2 。h d j 2 是h s p 4 0 家族的一个成员，其主要功能是作为一种分子伴侣，通过结合到未折叠蛋白 及调节h s p 7 0 的活性来促进蛋白的转运和折叠。研究发现法尼基转移酶抑制 9 第一章前青 剂能够上调h s p 7 0 从而使细胞凋亡增强。 在实验中h d j 一2 的作用却是作为生物m a r k e r ，用来榆测法尼基转移酶活 性被抑制情况畔j 。通常情况下细胞内的h d j - 2 均处十法尼基化的状态，当加 入法尼基转移酶抑制剂抑制法尼基转移酶活性后，部分或全部h d j 2 去法尼 基化，因为h d j 一2 在翻译后修饰过程中会切掉一段由数个氨基酸残基组成的 多肽序列，而法尼基化对于这一过程是必须的，因此洼尼基化的h d j 2 与去 法尼基化的h d j - 2 在s d s p a g e 电泳中的位置不同，因此可以借由h d j 一2 的电泳结果判断法尼基转移酶的活性情况。 图17h d j 一2 的两种状态 图17 显示两种状态的h d j - 2 的电泳结果，左边为未加入f t i 的细胞裂 解物的h d j - 2 的免疫印迹结果，右边为加入f t i 的细胞裂解物的结果。u 表 示去法尼辇化，p 代表法尼摹化。对比可见去法尼摹化的蛋白因为没有经过 必须的切除修饰，相对分子质量比法尼基化的蛋白要人，冈此二者在电泳中 显示位镡不同。 2 2f t a s e 抑制剂 f t a s e 抑制剂( 胁e s y lt r a n s f e r a s ei n h i b i t o r s ，f t i s ) 通过阻断底物蛋白的法 尼基化修饰从而抑制蛋白的生物活性。其最初研究动力是发现原癌蛋白r a s 需耍经过法尼基化才可以锚定于膜上，从而具有活性。而且有实验证明在老 鼠中法尼皋转移酶抑制剂可以抑制肿瘤的发生而没有毒性作用【】吲。法尼酰基 转移酶抑制剂是基于识别基因损伤和干扰某些信号途径设计的用于改善目前 强烈细胞毒药物化疗的新药物。目前的临床前研究已充分认识到许多肿瘤蛋 白信号途径都包含了法尼基化的修饰。 目前f t a s e 抑制剂主要包括三类：法尼基焦磷酸( f p p ) 竞争性盯i ：f p p 为f t a s e 的作用底物，这类药物可与f p p 竞争f t a s e 的作用位点，从而抑制f t 缸e 的活性；c a a x 竞争性f t i ：f t a s e 催化法尼基反应的部位足存r a s 蛋白羧基 第一章前言 末端的c a a x 序列，因此基于c a a x 的结构特征和膜构象，设计合成出c a a x 序列的肽模拟物；同时具法尼基焦磷酸和c a a x 的竞争性f t i ：即法尼基 化反应过程的中间产物，也就是双底物类似物。这些药物现已被研究证实对 白血病和一些实体瘤具有明显的临床作用。法尼酰基转移酶抑制剂可以诱导 骨髓瘤细胞凋亡，法尼酰基转移酶抑制剂具有抑制p v 干细胞的作用。 目前有三种f t i s 在进行临床试验，包括s c h 6 6 3 6 6 ( l o n a f a m i b ) 、 r 11 5 7 7 7 ( t i p i f a m i b ) 矛l l b m s 2 1 4 6 6 2 ( 图1 8 ) 。这些f t i s 属非硫基、非多肽杂 环家族小分子抑制剂。目前，t i p i f a m i b 等f t a s e 抑制剂已完成了i i 期临床实验， 证明对急性细胞白血病( a m l ) 、慢性粒细胞性白血病( c m l ) 、骨髓增生 异常综合征( m d s ) 等具有明显的抑制效应，可用于难治、复发的a m l 的治 疗。现开始进入i 期临床研究，因此法尼基转移酶抑制剂是处于研究热点的 一类有前途的新型抗肿瘤化疗药物。本课题中主要采用的抑制剂为 l o n a f a m i b 。此外还有t i p i f a r n i b 和s c h 6 6 3 3 7 ( 为s c h 6 6 3 3 6 的类似物，但是其 活性远弱于s c h 6 6 3 3 6 ) 。 图1 8 三种f t i 结构式 第三节研究思路与方法 为了研究某一蛋白质在细胞迁移中所扮演的角色，一般来说科学家 可以将某蛋白的编码基因进行突变，或者应用r n a i 现象，或者加入该蛋 白质的阻断剂来抑制某一个蛋白质的表现，并分析此抑制对于细胞迁移 的影响，从而得知被抑制的蛋白质与细胞迁移的作用。这即为本文的基 本思路。 第一章前言 1 3 1 细胞迁移研究方法 细胞迁移作为当今生物学热门研究方向同时也是目前细胞生物学研 究的一个主要方向，其研究手段也是多种多样。目前比较多的被采用的 方法有伤口愈合实验( a r t i f i c i a ls c r a t c h e si nc e l lm o n o l a y e r s ，w o u n dh e a l i n g a s s a y ) ，b o y d e n d , 室实验( t r a n s w e l lm i g r a t i o n ) 和计算机辅助实时跟踪方法 ( c o m p u t e r - a i d e dr e a l t i m et r a c k i n g ) 等。每种方法都有自己的特色，不同实验室 一般根据自己的需要或者实验室条件选择合适的方法。 伤口愈合实验是在单层培养的细胞问制作划痕以产生愈伤区域，然 后使用显微镜观察相应时间段内划痕的愈合情况，具体的愈合时间随不 同的细胞类型、培养条件以及伤口的区域大小而不同。伤口愈合的具体 过程是伤口周围细胞向伤口部位发生极化，并伸出突触，然后细胞开始 迁移增殖并逐步愈合伤口。上述过程无论在整个组织还是在单个细胞水 平上都是类似的。伤口愈合实验因其适用范围广，操作简单易行，可重 复性高，对仪器设备的要求不高等特色，已经被作为研究细胞极化、组 织基质重排、预测细胞在不同培养环境下细胞的增殖及迁移能力的重要 手段。本课题中我们就主要采用了这种方法来进行血管内皮细胞迁移的 研究。 1 3 2 免疫荧光技术 免疫荧光技术( i m m u n o f l u o r e s c e n c e ) 是将免疫学方法( 抗原抗体特异 结合) 与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。 由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞 定位。、 免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或 抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体( 或抗原) 作为 分子探针检查细胞或组织内的相应抗原( 或抗体) 。在细胞或组织中形 成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素 受激发光的照射而发出明亮的荧光( 黄绿色或桔红色) ，可以看见荧光 所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量 技术测定含量。 1 2 第一章前言 1 3 3 血管形成研究方法 细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，e c m ) 是指由细胞分泌到细胞外 间质中的大分子的蛋白和多糖所构成的网络结构，支持并连接组织结构、 调节组织的发生和细胞的生理活动。细胞外基质的组成可分为三大类： 糖胺聚糖( g l y c o s a m i n o g l y c a n s ) 、蛋白聚糖( p r o t e o g l y c a n ) ，它们能够形 成水性的胶状物，在这种胶状物中包埋有许多其它的基质成分；结构 蛋白，如胶原和弹性蛋白，它们赋予细胞外基质一定的强度和韧性： 粘着蛋白( a d h e s i v e ) ：如纤粘连蛋白( f i b r o n e c t i n ) 和层粘联蛋白( 1 a m i n i n ) ， 它们促使细胞同基质结合。其中以胶原和蛋白聚糖为基本骨架在细胞表 面形成纤维网状复合物，这种复合物通过纤粘连蛋白或层粘连蛋白以及 其他的连接分子直接与细胞表面受体连接；或附着到受体上。由于受体 多数是膜整合蛋白，并与细胞内的骨架蛋白相连，所以细胞外基质通过膜 整合蛋白将细胞外与细胞内连成了_ 个整体。细胞外基质不只具有连接、 支持、保水、抗压及保护等物理学作用，而且对细胞的基本生命活动发 挥全方位的生物学作用。鉴于细胞外间质的多样性，细胞外间质有多方 面的功能，无论在胚胎发育的形态发生、器官形成过程中，或在维持成 体结构与功能完善( 包括免疫应答及创伤修复等) 的一切生理活动中均 具有不可忽视的重要作用。 本课题中，我们选用了b d 公司的产品m a t r i g e l 。m a t r i g e l 是从 e n g l e b r e t h h o l m s w a r mj 中瘤中提取出来的，富含胞外基质组分。还包含 l a m i n i n 和多种生长因子，如成纤维细胞生长因子矛1 ：1 t g f 1 3 等。它在4 时 以液体形式存在，当加热至u 3 7 c 后形成胶状物。体外当血管内皮细胞被铺到 m a t r i g e l 后，细胞