（遗传学专业论文）新型防御素基因的克隆与原核表达研究.pdf

四川大学硬士学位论文 新型抗菌肽基因的克隆和原核表达研究 遗传学专业 研究生：杨毅指导教师：高荣教授 摘要 近年来由于抗生素的不规范使用等多种原因，细菌耐药问题日益严重，人 们正努力从各个方面来解决，其中机体天然产生的抗菌肽( a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e ) 由于其对耐药菌的强大抗菌作用而受到人们的关注。抗菌肽是一种阳离子小分 子多肽，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。防御素( d e f e n s i n ) 是 抗菌肷中较为重要的一种，主要来源于皮肤、呼吸道等的上皮组织，是正常机 体抵抗外界病原微生物入侵的重要防线。 为了构建具有广谱高效的抗菌肽基因，获得新型抗菌融合蛋白，本实验采 1 用了改进的重叠区基因拼接法对牛的b 防御素3 ( b n b d 3 ) e d n a 和人的a 防 御素3 ( h n p 3 ) e d n a 分别加以改造。在去除b n b d 3 的终止密码子和m 岬3 的起始密码子的基础上，在b n b d 3 的5 端引入 b a m h i 酶切位点，并在h n p 3 的3 端引入e c o r i 酶切位点，同时在二者之间加上s e r - s e r - g l y s e r - g l y s e r 柔 性连接肽序列。利用多次p c r 扩增出目标片段，并构建了 p g e x - 4 t - 1 一b n b d 3 h n p 3 原核表达载体，经质粒p c r 以及b a m h i e c o r l 双酶 切鉴定，测序结果证实b n b d 3 h n p 3 融合基因已成功克隆至原核表达载体 p g e x _ 4 t - l 。 将已构建的b n b d 3 ，m 岬3 融合蛋白表达载体质粒转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，用2 y t 培养基培养，以i p t g 诱导融合蛋白表达，经s d s p a g e 分 析表达蛋白分子量符合预期的3 4 9 k d a 。融合蛋白的表达产物在细胞破碎的上 清中以可溶形式存在，将带有g s t 标签的融合蛋白用亲和层析法纯化。融合蛋 白在体外抗菌实验中表现出了明显的抑制大肠杆菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球 菌和肺炎球菌生长的抗菌活性( p o 0 5 ) ，表明我们所构建的b n b d 3 h n p 3 融 四川大学硕士学位论文 合抗菌肽是一种新型的具有抗菌活性的蛋白，为开发抗感染制剂或抗生素替代 品奠定了基础。 关键词：抗菌肽，b n b d 3 ，h n p 3 ，克隆，融合基因 2 四川大学硕士学位论文 c o n s t r u c t i o na n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o no fn o v e l f u s i o ng e n eo fb o v i n en e u t r o p h i lb e t ad e f e n s i n3 a n dh u m a n a l p h ad e f e n s i n3 m a j o r ：g e n e t i c s c a n d i d a t e ：y iy a n g t u t o r ：p r o f r o n gg a o a b s t r a e t a sar e s u l to f t h ea b u s eo f a n t i b i o t i c s ，t h ep r o b l e mo f d r u g - r e s i s t a n tb a c t e r i ah a s b e c o m ed e t e r i o r a t e d t h en a t u r a la n t i b a c t e r i a lp e p d d eh a sb e e nr e c e i v e dm a n y c o n c e r i n sf o ri t ss t r o n ge f f e c to na r u gr e s i s t a n tb a c t e r i a a m i b a c t e r i a lp e p t i d e sa r e c a t i o n i cm o l e c u l e st h a tp l a ya l li m p o r t a n tr o l e i ni n n a t ei m m u n i t ya n da c q u i r e d i m m u n i t y d e f e n s i ni sam a j o rm d m b e ro ft h ea n t i b a c t e r i a lp e p t i d cf a m i l y , s e c r e t e d i ns k i n , r e s p i r a t o r yt r a c ta n do t h e re p i t h e l i a t i s s u e s ，a n dav i t a ld e f e n s ea g a i n s tt h e i n v a s i o no f e x o t e r i cm i c r o o r g a n i s m i no r d e rt oc o n s t r u c tn o v e la n t i b a c t e r i a lf u s i o ng o n et h a th a sb r o a d e ro r e n h a n c e db i o a c t i v i t yo v e rt h eo r i g i n a ld o n o r s ，w es p l i c e dt h eg e n e so fb o v i n e n e u t r o p h i lb e t ad e f e n s i n3 ( b n b d 3 ) a n dh u m a na l p h ad c f e n s i n3a m 印3 ) b yo v e r l a p e x t e n s i o n m e a n w h i l e t h es t o pc o d o no f b n b d 3a n dt h es t a r tc o d o no f h n p 3w e r e d e l e t e d t h er e s t r i c t i o ns i t e so fb 册ma n de c o r lw e r ei n t r o d u c e da tt h et w oe n d s o ft h i sf u s i o ng e n e 1 1 艟r e c o n s t r u c t e db n b d 3a n dh n p 3g e n e sw e r ec o n n e c t e d t o g e t h e rv i a al i n k e r s e q u e n c ee n c o d i n gs c r - s e r - g l y - s e r - g l y - s c ra m i n oa c i d r e s i d u e s n ”p c ra m p l i f i e dp r o d u c to ft h ef u s i o ng e n ew a sc u tb yb a r n a n d 点0 d r je n d o n u c l e a s e sa n dt h e nc l o n e di n t ot h ep g e x - 4 t - 1e x p r e s s i o np l a s m i d 四川l 大学硕士学位论文 w h i c hw a sd o u b l ed i g e s t e dw i t ht h eb a r n ma n de c o r i t h es c r e e n e do u t t r a n s f o r m a n t sw e t c o n 血u e db yd o u b l ed i g e s t i o na n dp l a s m i dp c r t h e s e q u e n c i n gr e s u l tp r o v e st h a tt h i sf u s i o ng e n eh a sb e e ni n - f r a m ed o n e dt o p g e ) “l t 1 1 1 圮b l 2 1 ( d e 3 ) e c o l ic o m p e t e n tc e l l s 毗t r a n s f o r m e dw i t ht h ec o r r e c t r e c o m b i n a n t s ，i n c u b a t e dw i t h2 x y tc u l t u r ea n di n d u c e dt oe x p r e s st h ef u s i o n p r o t e i nb yi p t g t h ee x p r e s s e dp r o t e i no ft h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw a sa s s a y e d b ys d s - p a g e 1 1 圮r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i nw a sp r e s e n ti nt h e s u p e r n a t a n to fl y s e dc u l t u r ei nas o l u b l ef o r mw i t h3 4 9 k d am o l e c u l a rw e i g h t r e v e a l e db ys d s p a g ea n a l y s i s t h eg s t - t a g g e df u s i o np r o t e i nw a sp u 硒e ab y a f f m i t yc h r o m a t o g r a p h y i ni nv i t r ot e s t s ，t h i s f u s i o np r o t e i ns h o w e de v i d e n t i n h i b i t i o ne f f e c ta g a i n s te c o l i ，s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a a n d s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e ( p 0 0 5 ) t h e s es u g g e s t e d t h ec o n s t r u c t e d b n b d 3 h n p 3f u s i o nd e f e n s i nm i g h tb ee m p l o y e dt od e v e l o pan o v e le f f e c t i v e a n t i m i c r o b i a la g e n ta n ds u b s t i t u t ef o ra n t i b i o t i c si nt h ef u t u r e k e yw o r d s ：a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e ，b n b d 3 ，h n p 3 ，c l o n e ，f u s i o ng a n e 4 四川大学硕士学位论文 刖吾 自抗生素被批准用作饲料添加剂后，为畜牧业发展起了巨大的推动作用， 但随着饲用抗生素的普及应用，其副作用逐渐突出。一是病菌产生耐药性问题； 二是滥用抗生素不但加大了饲料成本，而且引起动物免疫机能下降，体内菌群 失调，发生内源性感染或二重感染，死亡增多；三是畜禽产品中的药物残留问 题，而且给生态环境造成毒性。因为饲用抗生素的长期使用造成对全球环境污 染并直接危害人类的健康，所以早在1 9 9 2 年瑞士就禁止使用饲用抗生素，欧盟 1 9 9 9 年1 月起通过立法禁止抗生素作促生长剂使用，今后的发展趋势是尽量不使 用抗生素。人们一方面对传统抗生素进行结构改造降低细菌的耐药性，另一方 面正在不断研究和开发新型抗菌药物。目前一种新型的抗菌药物抗菌肽作 为传统抗生素的可能替代物以其无比优越的特性正受到研究者的关注。它是宿 主产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽( b a l si le ta 1 1 9 9 9 ；m i l n e r s m ，e ta 1 1 9 9 9 ) ，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内，除有非特异性抗细 菌、真菌、病毒等病原体作用外( b e l l ml ，e ta 1 2 0 0 0 ；h a n c o c kr e ，g ta 1 2 0 0 0 ) ， 还有抗肿瘤细胞作用。抗菌肽抗菌谱广，对多重耐药菌、肿瘤细胞、艾滋病毒 有杀伤作用。因此有着广阔的开发应用前景，是目前国际学术研究的活跃领域 之一。 哺乳动物防御素是哺乳动物内在防御系统最大的成员，它是- 二类富含半胱 氨酸的阳离子活性肽，可形成3 对分子内二硫键，分子量为2 6 k d a ，依据其半胱 氨酸空间排布及二硫键大小及形成的方式不同，哺乳动物防御素家族主要被分 为a 、b 两个亚类防御素广泛表达于哺乳动物的组织细胞中，在体外，微摩尔 浓度的防御素具有广泛的抗菌活性，可以抵抗细菌、真菌，甚至一些被膜病毒。 它们首先侵入病原微生物的带负电荷的磷脂膜来发挥抗菌功能。同时，哺乳动 物防御素还可以调节体内适应性免疫及其他抗微生物免疫的活性。 人中性粒细胞肽( h u m a nn e u t r o p h i lp e p t i d e s ，h n p ) 是人体免疫细胞中一 类主要的a 防御素。体外实验显示，h n p 具有广泛的抗菌谱及极强的抗菌活性。 纯化的h n p 在浓度为1 0 峙，l 1 0 0m g l 时，可有效杀伤多种微生物，如革兰阳 性细菌( 如金黄色葡萄球菌、链球菌等) 、革兰阴性细菌( 如大肠杆菌、鼠伤 寒沙门菌等) 、真菌( 如白念珠菌、新型隐球菌等) 、包膜病毒( 如单纯性疱 四川大学硕士学位论文 疹病毒、h i v 病毒等) 、分枝杆菌、梅毒螺旋体和钩端螺旋体等。此外，h n p 还具有细胞毒、趋化作用、调理吞噬作用、参与补体激活等生物学活性。h n p 3 是i - i n p 家族中极为重要的一员，占到了总i - i n p 的2 0 。 在牛外周血嗜中性粒细胞中，已发现并克隆到了了1 3 种b 防御素，统称为 牛嗜中性粒细胞b 防御素( b o v i n en e u t r o p h i lb e t ad e f e n s i n ，b n b d ) 这1 3 种 同源肽都呈高度阳离子态，并具有同表皮抗菌肽相一致的保守序列。它们对沙 门氏菌和大肠杆菌都有很好的抑止作用( s e l s t e d m e , e t a l 1 9 9 3 ) 。其中b n b d - 3 含量最为丰富达到了约2 2m g 1 0 1 0c e l l s 。b n b d 作为机体防御性物质参与天然 免疫应答，不仅具有对病原体的直接杀伤作用，还具有化学趋化作用( r o b e r t b a l s 2 0 0 0 ) ，以及与其他蛋白酶( 如溶菌酶) 的协同作用，其抗菌活性和对白 细胞的趋化活性的发挥与组织中所含p 防御素的浓度有关。在感染的局部，口 防御素被大量诱导表达和释放，对病原微生物造成直接的杀伤作用，一旦经过 扩散而浓度降低后，就会丧失杀菌活性，于是发挥其趋化活性，募集更多的白 细胞到达感染组织局部以清除入侵的病原微生物( d u n m ，e t a l 2 0 0 2 ) 。 美国马盖宁制药公司于1 9 9 0 年开始对蛙类皮肤分泌物中的抗菌肽蛙皮素 ( m a g a i n i n a ) 进行结构与分子设计，筛选出一种对病毒和肿瘤细胞均有较好杀 伤作用的小肽m a i 7 8 ，目前已进入临床期实验阶段。据报道，国内邓小娟等 人从柞蚕中运用层析技术分离纯化得到的抗菌肽对耐药性很强的金黄葡萄球菌 具有杀菌作用。近2 0 年来，人们对昆虫抗菌肽已有了比较系统的理论和应用研 究，但有关畜禽抗菌肽基因工程应用研究方面的报道较少。 仔猪腹泻、奶牛乳房炎及各种病毒性疾病如猪瘟、鸡新城疫等一直是棘手 的疾病，严重影响畜牧业和养殖业的发展。鉴于高等动物肠道抗菌肽在动物体 内表达分泌量有限，加上现代畜禽饲养业日益呈集约化，病原传播和入侵及各 种应激作用日益强化，使得畜禽肠道表达量有限的抗菌肽更难以对动物自身的 保健起很大作用。融合蛋白是利用基因工程技术构建的人工蛋白，可以优化蛋 白性能，甚至产生新功能。两种抗菌肽融合成一种新的蛋白，两者可以取长补 短，也可兼两者之长，扩大融合抗菌肽的抑菌谱，或使其对某些菌的活性显著 提高，出现双因子简单合用所不具备的生物学效应。因此，我们进行了b n b d 3 和h n p 3 融合基因的构建，在大肠杆菌中进行了表达，并初步研究了融合蛋白 6 四川大学硬士学位论文 在体外的抗菌活性，为研制新型的高效抗感染制剂，开发抗生素替代品，奠定 了良好的基础。 四川大学硕士学位论文 第一部分b n b d 3 和h n p 3 融合防御素基因的构建 摘要 为了构建优于供体的，具有广普高效的新型抗菌肽基因，并获得融合蛋白， 本实验采用了改进的重叠区基因拼接法( g e i l es p l i c i n gb yo v e d a pe x t e n s i o n ， g s o e ) 对牛的8 防御素3 ( b n b d 3 ) 成熟肽c d n a 和人的a 防御素3 ( h n p 3 ) 成熟肽e d n a 分别加以改造。在去除b n b d 3 的终止密码子和i - i n p 3 的起始密 码子的基础上，在b n b d 3 的5 端引入b a m h i 酶切位点，并在矾p 3 的3 端引 入e c o r i 酶切位点，同时在二者之间加上s e r - s e r - g l y - s e r - g l y - s e r 柔性连接肽序 列。利用多次p c r 扩增出目标片段，并构建了p g e x 4 t 1 b n b d 3 h n p 3 原核 表达载体，经质粒p c r 以及b a m h i e c o r i 双酶切鉴定，测序结果证实 b n b d 3 m n p 3 融合基因已成功克隆至原核表达载体p g e x 4 t - 1 。 关键词：b n b d 3 ，h n p 3 ，s o e i n g ，融合基因 1 引言 仔猪腹泻、奶牛乳房炎及各种病毒性疾病如猪瘟、鸡新城疫等一直是棘手 的疾病，不利于畜牧业的发展。研究表明，抗生素添加剂的使用严重破坏了动 物肠道的微生物平衡，并易在动物体内残留，严重影响了畜产品的品质和人类 的健康。然而，由于抗菌肽分子小，分离提纯存在一定的困难，故天然资源有 限。随着对抗菌肽结构与活性的关系、抗菌肽作用机制及其基因表达调控机制 认识的不断深化，设计一种高效的、有利于人类健康的抗菌肽作抗生素替代品 是完全可行的。化学合成是获得抗菌肽的主要手段，但化学合成抗菌肽成本高， 所以，我们利用基因工程手段实现了两段抗菌肽基因的拼接。 重叠区扩增基因拼接法( g s o e ) 是利用p c r 技术在体外进行有效的基因重 组和定点突变，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，该技术使用简易，可利 四川大学硕士学位论文 用这一技术很快获得其他依靠内切酶消化的方法根本难以做到的产物。g s o e 法的基本原理是向p c r 产物内掺入一段新的、在原模板内不存在的序列。引物 只需与模板有效结合而不必完全匹配，特别是5 端的序列。任何与原模板不匹 配的碱基都将掺入到p c r 产物中 a 和b 防御素主要存在于哺乳动物中，它们的一级结构序列存在明显差异， 对二硫键形成方式也如前所述有所不同，但二者的三维结构极其相似。a 防御 素主要存在于中性粒细胞( 即髓源性防御素) 和小肠潘氏细胞( 即肠源性防御 素) 在中性粒细胞( p m n ) 内，髓源性防御素含量丰富，是中性粒细胞非赖 氧杀菌机制的重要组成部分( 方文慧等，2 0 0 0 ) b 防御素分布较广，机体多种 组织上皮细胞均可合成b 防御素。 近年来国内外近年来国内外先后报道了有关抗菌肽基与其它相关基因融合 的克隆和表达，但少见有关将两种均有抗菌活性的蛋自融合表达的报道本研 究通过基因重组，以融合的形式将两种类型的防御素：人a 防御素3 ( m 0 3 ) 和牛b 防御素3 ( b n b d 3 ) 连接到大肠杆菌高效表达载体上，进一步探讨融合蛋 白的抗菌活性。以期找到抗菌活性更高，作用范围更广的重组蛋白。 2 材料和方法 2 1 材料 2 1 1 质粒和宿主菌 大肠杆菌d h 5 a s u p e 4 4m a cu 1 6 9 ( 巾8 0 1 a c z a m l 5 ) h s d r l 7 r e c a le n d a l g y r a 9 6t h i lr e l a l 】由本室保存。 p g e x - 4 t 1 ：购p h a r m a c i a 公司，其物理图谱见图1 1 。 9 四川大学硕士学位论文 怨掷，g a s i c o d o n s 图1 1p g e ) 【- 4 t 一1 载体的物理图谱 f i g 1 1p h y s i c a ll a a po fp g e x - 4 卜1v e c t o r 2 1 2 主要试剂 p f ud n a 多聚酶以及栅混合物：购i 刍f e r m e n t a s ( m b i ) 限制型内切酶( b a m h i ，e 幻) ：购自f c r m e n t a s ( m b i ) 牛小肠碱性磷酸酶c i a p ：购f l f e r m e n t a s ( m b i ) t 4 d n a 连接酶：购f l t a k a r a d n a 提取试剂盒( d n ae x t r a c t i o nk i t ) ：购自f e r m c n t a s ( m b i ) 2 1 3 培养基 l b = 胰蛋白胨1 0g l ，酵母抽提物5g l ，n a c l1 0g l ，用i nn a o h 调节 p h 至7 5 。 s o b ：胰蛋白胨2 0g ，l ，酵母抽提物5g l ，n a c io 5 8g l ，k c lo 3 8g l ， m g s 0 4 7 h 2 0o 2 5g l ，m g c l 2 6 h 2 0o 2 0g l ，用1 nn a o h 调节p h 至7 0 。 s o c ：s o b + 2 0m m 0 1 l 葡萄糖 o 兰瞄 趱洲 n；薹一腑瞄“l - 帆 四川大学硕士学位论文 2 2 方法 2 2 1 叠拼引物的设计与合成 根据分别编码b n b d 3 和i - i n p 3 的成熟肽的c d n a 碱基序列，设计并人工 合成了五条引物，p l 含有b a m h i 酶切位点；p 2 的3 端含有一段与p 1 的3 端互补的序列；p 3 的3 端含与p l 和p 2 扩增产物的正义链3 端互补的序列， p l 和p 2 扩增产物与p 3 反应后所得产物的正义链3 端与p 4 的3 端互补，p 5 含有终止密码子，并引入点幻r i 酶切位点以利于原核表达载体构建。p 1 p 3 主 要扩增b n b d 3 基因；p 4 p 5 主要扩增i - i n p 3 基因，并在两段基因中插入t c c a g tg g tt c cg g a a g t ，即编码s e r - s e r - g l y s e r - g l y s e t 的柔性连接肽序列， 以利于b n b d 3 和h n p 3 各自的空间折叠。由于引物大小在5 0 7 0 b p 之间，为 了避免发夹结构和引物二聚体的形成，引物设计时对部分密码子做了同义突变。 p l ：6 9 b p 5 缶c 鱼鱼堑塑c ( 砌m h i ) a ：r ( a a g g a g l a a g a a a t c a t g l a a c c l - g c c g t a t a a a t a g a ( 而c t t c t ( 玎u t g c c a 觚 a 3 p 2 ：5 7 b p 5 - g t g c c a a t c t g t c t c g t g c c 玎c c a g g g c a c c t r a t r i3 | g 蕊c a c a g h a g c c t c t a t r r - 3 p 3 ：7 0 b p 5 - 丑鱼坌丛g i 鱼鱼甾l i n k e r ) c c a c g a c c t g c a g c a t i t t a t t c g g g ( j c c c g a a a c a g g t g c c a a t c t g t c t c 3 p 4 ：7 0 b p 5 一t t c c a t a g c g t c g t t c t c c t g c a a t g c a c g c t g g t a t t c t g c a a t a ( 论 a g t c a c t t c c g g a a c c a c t g g a 3 p s ：7 0 b p 5 c g g 匹丛鱼( e c o r i ) t c t a g a t t a g c a g c a g a a t g c c c a g a g t c t t c c c t g g t a g a t g c a g g t g c c a t a g c g t c g r r - 3 上述引物由上海生工合成。 四川大学硕士学位论文 2 2 2 重叠区扩增基因拼接 包括四轮连续的p c r ，均采用热启动法，反应体系如下： 第一轮p c r ( 5 0 山) 在薄壁p c r 管中加入3 8 5 m 的d d h 2 0 ，l p , 11 0m md n t p ，2 5 j dp 1 ，2 5mp 2 引物( 各为t o p m o l p d ，1 0 x p c r 缓冲液( m 矿+ f 粥g ) 5 m ，p f u p o l y m c r a s e 0 5 u 。 第二轮p c r ( 5 0 m ) 在薄壁p c r 管中加入1 2 5 m 的d d h 2 0 ，l m1 0 m md n t p ，l 山p 3 引物( 1 0 p m o l p d ，第一轮p c r 产物2 0 1 - l 1 作为模板，1 0 x p c r 缓冲液 m g + 预混) 5 m ， p f up o l y m c m s e0 5 u 第三轮p c r ( 5 0 | 1 1 ) 0 线性扩增：在薄壁p c r 管中加入1 2 5 m 的d d h 2 0 ，l m1 0m l v ld n l e1 山 p 4 引物( 1 0p m o l i , d ) ，第二轮p c r 产物2 0 山，1 0 x p c r 缓冲液( m 9 2 + 预混) 5 t t l ，p f up o l y m c r a s e0 , 5 u 。 o 对数扩增：在薄壁p c r 管中加入4 5 5 m 的d d h 2 0 ，l m1 0m l v l ( 烈1 p ，l 山1 p l ，l p 4 引物( 各为1 0p m o l i d ) ，0 步中p c r 产物l m 作为模板，1 0 x p c r 缓冲液( m 矿+ 预混) 5 皿，p f up o l y m e r a s eo 5 1 j 。 第四轮p c r ( 5 0 1 1 1 ) 0 线性扩增：在薄壁p c r 管中加入1 2 5 山的d d i - 1 2 0 ，1 m1 0m l v ld n t p ，l 山 p 5 引物( 1 0p m o l i d ) ，第三轮p c r 产物2 0 j d ，1 0 x p c r 缓冲液 m g + 预混) 5 m ，p f up o l y m c r a s eo 5 u o 对数扩增：在薄壁p c r 管中加入4 5 5 m 的d d h 2 0 ，l h l1 0m l v ld n t p ，l m p i ，l p , 1p 5 引物( 各为1 0p m o l t d ) ，0 步中p c r 产物1 m 作为模板，1 0 x p c r 缓冲液 m g + 预混) 5 m ，p f up o l y m e r a s co 5 u 。 1 2 四川大学硕士学位论文 p c r 反应程序见下表 循环反应参数 第一轮p c rl 9 4 ( 3 r a i n ) 3 09 4 ( 20 0 s ) ，5 8 c ( 3 0 s ) ，7 2 ( 2 0 s ) l 7 2 o m i n ) 第二轮p c r1 9 4 ( 3 r a i n ) t o u e h d o n w1 0 9 4 1 2 ( 3 0 s ) ，5 4 4 4 c ( 3 0 s ) ，7 2 ( 2 0 s ) 2 0 9 4 1 2 ( 3 0 s ) ，4 4 ( 3 0 s ) ，7 2 ( 2 0 s ) 1 7 2 x z o m i n ) 第三轮p c r l 9 4 1 2 ( 3 r a i n ) t o u e h d o n w1 0 9 4 0 0 s ) ，6 5 5 5 c ( 3 0 s ) ，7 2 ( 2 0 s ) 2 0 9 4 c ( 3 0 s ) ，5 5 c ( 3 0 s ) ，7 2 1 2 ( 2 0 s ) l 7 2 c ( 1 m i n ) l 9 4 ( 3 r a i n ) 3 0 9 4 1 2 ( 3 0 0 ，6 8 1 2 ( 3 0 s ) ，7 2 ( 2 0 s ) 1 7 2 ( 1 r a i n ) 第四轮p c r l 9 4 c ( 3 r a i n ) r e l u c h d o n w1 0 9 4 1 2 ( 3 0 s ) ，6 0 5 0 ( 3 0 s ) ，7 2 ( 2 ( 2 0 s ) 2 0 9 4 ( 2 ( 3 0 s ) ，5 5 ( 2 ( 3 0 s ) ，7 2 c ( 2 0 s ) l 7 2 ( 1 m i n ) 1 9 4 ( 3 r a i n ) 3 0 9 4 ( 3 0 s ) ，6 8 c ( 3 0 s ) ，7 2 ( 2 ( 2 0 s ) t 7 2 o m i n ) 1 3 四川大学碗士学位论文 2 2 3 扩增片段回收 使用p l 和p 5 两对引物以最后扩增到的目的片段为模板进行p c r 反应，扩增 产物进行2 的琼脂糖凝胶电泳，紫外观察根据5 0 b pi a d d e rm a r k e r 标示，目 标条带单一为预期的2 6 2 b p 左右，遂按照d n a 提取试剂盒操作步骤直接：h p c r 产物中纯化回收扩增产物。加入3 倍p c r 产物体积的吸附缓冲液，然后加入5 山 硅粉悬液，5 5 。c 温浴5 分钟，每2 分钟颠倒混合一次使硅粉保持悬液状。1 2 ，0 0 0 r p m 离心5 秒钟，弃上清；加入5 0 0 1 x l 的洗涤液，打散沉淀，1 2 ，0 0 0r p m 离心5 秒， 弃上清，重复3 次；用枪头洗去残留的液体，并在室温下将沉淀干燥1 0 1 5 m i n 以去除残留的乙醇。 j n , k s o i _ d 无菌双蒸水悬浮沉淀，5 5 。c 温浴5 分钟，离心收集 上清于一干净e p 管中，- 2 0 c 保存，取l 山进行电泳，检测纯化效果和估计回收 效率。 。 2 2 4 质粒p g e x - 4 t _ 1 的小量提取 接种含p g e x _ 4 t - l 的于2 m ll b 培养基( 含1 0 0p g n da m p i c i l l i n ) 3 7 。取 1 5 m l 培养的菌液于e p 管中，1 2 ，0 0 0r p m 离，c , q m i n ，弃上清液。加入o 5 m l s t e 溶 液( 1 0m l v lt r i s i - i c ip h 8 0 ，1 0m l v ln a c i ，1me d t ap h 8 0 ) 馄匀，1 2 ，0 0 0r p m 离t m m i n , 弃上清；加1 0 0 ：溶液i ( 5 0n 1 m 葡萄糖，2 5m l v lt r i s h c ip h 8 0 ， 1 0m me d t ap h 8 0 ) 充分混合，加3 , 2 0 0 斗i 溶液i i ( 0 2mn 彩h ，i s d s ) 轻 柔混匀，室温放置5 m i n ，再n a 1 5 0 h l 溶液i l l ( 5m k a c6 0 m l ，冰乙酸1 1 5 m l ， 2 8 5 m lh z o ) ，轻柔混匀后冰浴1 0 m i n 。1 2 ，0 0 0r p m 离- t = i q o m i n ，取上清液，加 入0 6 倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置1 0 m i n 。1 2 ，0 0 0r p m 离，t ) q o m i n ，弃 上清液，7 0 的乙醇洗两次，干燥沉淀，溶于5 0 1 t ld d h 2 0 中。加入0 5 止r n a s e a ( 1 0m g m l ) ，3 7 水浴3 0 分钟；取2 m 电泳观察，剩余2 0 c 保存。 2 2 5 原核表达质粒的构建， 2 2 5 1p c r 产物的酶切及回收 纯化p c r ：2 物进行2 0 m 体系的丑册h i 和髓d 融双酶切，e p 管中加入1 5 m 纯化 片段，2 m1 0 x t a n g o 缓冲液，0 5 mb a m h i ，0 5 de c o r i ，补h 2 0 至2 0 m 。3 7 c 水 浴2 4 , 时后，用d n a 提取试剂盒直接回收酶切片段。 1 4 四川大学硕士学位论文 2 2 5 2p g e x - 4 t - 1 载体的制备 提取p g e ) “t 1 质粒3 0 1 a l 加入4 m1 0 x t a n g o 双酶切缓冲液，l l lb a m h i ， 1 me c o r i ，补h 2 0 至4 0 m 3 7 水浴2 小时后，加入5 m1 0 x 碱性磷酸酶缓冲 液，l m 碱性磷酸酶，补水至5 0 m ，然后3 7 处理l 小时。用d n a 提取试剂 盒直接从反应液中提取纯化载体 2 2 5 3b n b d 3 h i q p 3 , v 段与p g e x 一4 t - 1 的连接 按照片段与载体分子量浓度5 ：l 进行连接反应。取回收纯化的p g e x - 4 t - 1 载体2 5 l l ，加入回收的酶切过的p c r 产物片段5 m ，l m 删a 连接酶，l 山1 0 x 连接缓冲液，0 5 山d d l - 1 2 0 ，1 6 ( 2 水浴过夜连接。 2 2 5 4 高频感受态细胞的制备 参照分子克隆的方法进行，稍作改动。从划线平板上挑取e c o l id h 5 c t 单菌落，接种于2 m ls o b ，3 7 ( 2 振摇培养约1 0 d x 时；取0 5 m l 过夜培养的菌液接 种于5 0 mi s o b ，于1 8 1 2 振摇培养1 8 d , 时至菌液o d 6 0 0 达到o 6 。培养液冰浴3 0 分 钟后，5 , 0 0 0r p m4 c 离，t ：, l o 分钟收集细胞，去上清后，用l m l 预冷的t b 缓冲液 ( 0 2m o l lk c l ，o 0 5 4m o llm n c h ，0 0 1 5m o l lc a c h ，0 0 1 2 5m o l lk 匝s ) 悬浮菌体，再加入1 4 m l1 _ b ，冰浴l o 分钟，5 , 0 0 0r p m4 1 2 离，g , l o 分钟，去上清， 用4 r a lt b 悬浮细胞，滴加2 8 0 r d 二甲基亚砜( d m s o ) ，冰浴1 0 分钟后分装成小 管，液氮冻存。 2 2 5 5 连接产物的转化 自液氮中取出感受态细胞，室温解冻；取2 m 连接产物与2 0 0 1 t l 感受态细胞 混匀，冰浴3 0 分钟，4 2 热冲击9 0 秒，冰浴2 分钟，加8 0 0 ms o c ，3 7 c 缓慢 摇振1 小时，5 , 0 0 0r p m 离心5 分钟，去上清，剩余5 0 m 上清悬浮细胞，涂布于含 1 0 0 肛g i i l la m p 的l b 平板，3 7 c 倒置培养1 8 ：j 、时。 2 2 5 6 重组质粒的筛选 提取转化子质粒，选较空载大的质粒进行b a m h i e c o r i 双酶切：1 0 体系 四川大学硕士学位论文 中加入质粒8 m ，1 0 x t a n g o 缓冲液l 山，b a m h 0 5 叫，e e o r io 5 1 1 1 ，3 7 水浴 3 小时。然后进行2 的琼脂糖凝胶电泳，e b 染色，紫外光下观察，采用凝胶分 析系统分析，确定酶切片段的大小。 进一步做质粒p c r 扩增验证：在薄壁p c r 管中加入o 5 m 重组子质粒作为模 扳，5 m1 0 xp c r 缓冲液 m d + 预混) ，1 11 0m md n t p ，2 mp 1 ，p 2 混合引物 ( 各1 0p m o l l _ l 1 ) ，p f u 聚合酶0 5 u ，补水至5 0 1 x l 体系。将上述溶液配制好以后 充分混合，按以下条件扩增：9 4 预变性3 分钟后，9 4 3 0 s 、6 8 3 0 s 、7 2 2 0 s 共3 0 个循环，然后7 2 延伸1 分钟，取1 1 产物电泳检测。 选取正确的重组予，命名为p g - s m ，保存重组予菌种，取一管送i n v i 舡o g e n 公司进行序列测定。序列测定结果采用d n a t o o l s 5 1 进行分析。 3 结果 3 1p c r 扩增产物的鉴定 通过4 轮p c r 实现了对两段基因片段以及连接肽序列的拼接( 图1 2 ) ，第一轮 p c r 得到l o o b p 片段，第二轮p c r 得n 1 5 5 b p 片段，第三轮p c r 得到2 0 7 b p 片段， 第四轮p c r 得到2 6 2 b p 片段，以5 0 b pl a d d e r 做对照，大小均与预期相符( 图1 3 ) 。 p 15 ， p l + p 2 p 1 + p 2 + p 3 + p 4 p l + p 2 + p 3 + p 4 + p 5 一p 31 l 第二轮p c r p 4 第三轮p c r j5 第四轮p c r 目的片段 图1 2 重叠区扩增基因拼接法( s e e i n g ) 获得, b i q b d 3 h n p 3 融合基因示意图。 f i g 1 2s o ii c i n gt h e 帅0 3a n d1 4 n p 3g e n e sb yo v e rl a pe g t e n $ i o n 1 6 四川大学硕士学位论文 图1 3 四轮p c r 结果的电泳图谱( 2 慨琼脂糖凝胶) ，f i g 1 3e l e c t r o p h o r e s i so ft h ep c rp r o d u c t sf r o m 即t op 5 l a n e r ：5 0 b pl a d d e rm a r k e r ：l a n e l ：p i + p 2 坤3 + p 4 + p 5 ；l a n e 2 ：p ! + p 2 + p 3 + p 4 l a n e 3 ：p i * 崆+ p 3 ：l a n e 4 ：p 1 + p 2 3 2 重组原核表达质粒的构建 将p g e h t - l 进行b a m h f e c o r i 双酶切，去磷酸化处理后，同2 2 2 b a m h i 和 髓d r j 双酶切的第四轮p c r 片段在t 4d n a 连接酶作用下进行连接反应。连接产 物转化d h 5 a 感受态细胞，抽提转化子质粒，插入正确的质粒可以用b a m h i 和 e c o r i 酶切出约2 6 0 b p 的片段。进一步用p c r 鉴定，得到含b n b d 3 h n p 3 片段的 重组质粒，命名为p g b h 3 ( 图1 4 ) 。 1 7 坚型查堂堡主兰竺丝兰 图1 4p o