（遗传学专业论文）人锌指蛋白基因znfd的克隆及其研究.pdf

人锌指蛋白基因z 胍d 的克隆及其研究摘要摘要锌指蛋白是指含有锌指结构的一类蛋白质，在哺乳动物中，锌指蛋白是最大的家族。本实验室获得一个人类新基因册( 基因号为n m - 1 8 2 7 6 1 ) ，该锌指蛋白基因尚未被研究。对脚基因进行s m a r t 分析，脚主要的特征是含有一个c 2 h 2 结构域，在其氨基酸2 2 8 2 4 8 的位置存在一锌指结构，本实验室便对这个新基因展开了以下几个方面的初步研究。首先，通过p c r 的方法克隆新基因2 批兕i ，经测序鉴定已成功克隆2 妣阳i 基因，证实了其在人体内真实存在。利用生物信息学方法对其核酸和蛋白质的特征进行分析，结果显示脚基因位于第5 号染色体，定位在5 q 2 3 1 。其c d n a 全长1 4 3 2 b p ，由5 个外显子和4 个内含子组成，含有9 9 0 b p 的开放阅读框，编码一个由3 2 9 个氨基酸组成，分子量为3 7 l 的蛋白。通过p c r 方法检测脚基因在人多个组织中的表达情况，结果表明脚基因在前列腺、睾丸、脑、胰、子宫中表达，且睾丸中表达量比较高。通过构建p e g f p - z n f d 真核表达载体，转染如c o s 7 细胞系，瞬时表达后用荧光显微镜观察z n f d 融合蛋白亚细胞定位，证明册基因在细胞核中表达。其次，兔抗人z m 多克隆抗体的制备。通过d n a g t a r 软件选取抗原免疫原性较高的部分o r f 序列，常规p c r 扩增后，定向克隆到原核表达载体p e t - 3 2 a 上，利用大肠杆菌r o s 讹唱a 戚( d e 3 ) 表达系统表达h i s z n f d 融合蛋白，得到相对分子质量约为4 5 l a 的融合蛋白。通过n i 离子亲和柱纯化目的蛋白免疫新西兰大白兔，获得了兔抗人z m d 多克隆抗血清。通过琼脂糖双向扩散实验检测所制各的多克隆抗体效价达到了1 ：3 2 ，且w r e s t e mb 1 0 t 免疫印迹方法鉴定抗体具有高特异性。最后，构建真核表达载体瞬时转染2 9 3 t 细胞。在册原核表达并制备多克隆抗体的基础上，进行翮基因真核系统表达的研究。常规p c r 扩增姗基因全长后定向克隆到真核表达载体p c d n a 3 一吖心，构建重组质粒p c d n a 3 t a p z n f d ，利用转染试剂盒瞬时转染2 9 3 t 细胞，通过w b s t e mb l o t 免疫印迹方法确定册基因在2 9 3 t 细胞中表达。本课题对册基因的功能做了初步的研究。确定册基因的染色体定位和基因组序列分析，并对结构域、基因表达谱和亚细胞定位进行了预测。并通过人锌指蛋白基因z n f d 的克隆及其研究摘要实验确定了基因在多种组织中表达和亚细胞定位在细胞核内。通过制备具有一定的效价、具有高特异性的多克隆抗体，为之后的实验奠定了基础。利用人工构建好的适用于蛋白质相互作用研究的真核表达载体p c d n a 3 t a p 来构建p c d n a 3 t a p z n f d 真核表达重组质粒，瞬时转染2 9 3 t 细胞，通过w 色s t e mb l o t免疫印迹方法确定册基因表达，为之后使用串联亲和层析( t a n d e m 痂i l i 付p u r i f i c a t i o n ，t a p ) 方法研究细胞水平下与z n f d 相互作用的蛋白质，进一步揭示凇这一锌指蛋白的功能打下基础。关键词：翮；锌指蛋白；原核表达；多克隆抗体；真核表达作者：史群芳指导老师：孟祥勋教授王明华副教授c l o n i n ga n ds t u d y i n go fan o v e lz i n cf i n g e rp r o t e i l lg e n e2 a b s t r a c tc l o n i n ga n ds t u d y i n go fan o v e lz i n cf i n g e rp r o t e i ng e n ez 彻u e n e 刎 a b s t r a “z i n cf - m g e rp r o t e i i l s 缸e 锄o n gt 1 1 em o s ta b 吼d a n tp r o t e i n si nm a m m a l s ，w 1 1 i c hc o n 诅i i l e dt h ez i n cf i n g e rm o t i f s an o v e lh 啪a i lg e n ez 7 ：胁，g e n ei dn m - 18 2 7 61 ，w i l i c hw a sn o tb e e ni n v e s t i g a t e d t h eb i o i n f o r i l l a t i c sc h a r a c t e rs u g g e s t e dt h a tz f di sam 锄b e ro fz i l l cf m g e rp r o t e i n t h em a i l lc o l n p l i s l l i n e n t sa r e 嬲f o l l o w s h 1 吐l i sw o r k ，w ec l o n e dn l ez r 朋叼g e n e 丘o mt e s t i s ，t l l e ni d e n t i f i e db ys e q u e n c e b i o i i l f o n n a t i c sd a t a b a s e sw e r eu s e dt 0a 1 1 a l y z ea n dp r e d i c ti t s c t i o n w bc o r l f i 吼e d廿l a t 刁忏dg e n ei n c l u d e da1 4 3 2 b p 如c l e o t i d es e q u e n c e ，h a sa9 9 0 b p 如uo p e nr e a d i n g觑吼e s ( o i 江s ) ，w 1 1 i c hw a sl o c a l i z e do nc l l r o m o s o i n e5 q 2 3 1 i tw 觞c o l p o s e do ff i v ee x o l l sa i l df 1 0 u ri n n 0 l l s t k 刁晒dg e n ee n c o d 酣ap r o t e i i l 谢t l l3 2 9a 面n 0a c i d s t h em o l e c u l a rw e i 啦锄di s o e l e 嘶cp o 缸w e r ep r e d i c t e dt ob e3 7 k da n d5 0 ，r e s p e c t i v e l y ，u s i n gs o 胁a r e i n0 r d e rt om e s t i g a t e 也et i s s u ed i 妯b u t i o no f 肿d ，也ee x p r e s s i o np a t t e mo f 脚w a sd e t e m i n e db yp c ra m p l i 矗c a t i o nu s e ac d n ap a n e lo fe i g h t e e n1 m m a i lt i s s u e s ，p u r c h a s e df b o mc l o n t e c hi i l s t i t i i t s 7 i ke x p 鲥m e n ts u g g e s t e dn l a t2 f dw 勰e x p r e s s e di np r o s t a t eg l a n d ，b r a i n ，p a n c r e 嬲，u t e m s ，s p e c i f i c a l l yh 嬲al l i 曲e ) ( p f e s s i o ni nt e s t i s t bc o n s t r u c t 诅l er e co m b i n a n t 孚- e e n 丑u o r e s c 铋c ee x p r e s s i o nv l 粥t o rp e g f p - z n f d ，t l l e nt r a i l s i e n t l yt r a i l s f e c t e di i l t 0c o s - 7c e l l w bf o u n d 蚍t h es t r o n g e s t黟e e nn u o r e s c e n c ec o n c e n t r a t e di ni l u c l e u s i l lo u re x p e r i m e n t ，、v ed e t e c tm e 吼l b c e l l u l a rl o c a t i o no fz n f dp r o t e i l li si nn u c l e u s s e c o n d l y ，p r e p a r ea i l do b t 血扒胁p o l y c l o n a la n t i b o d y p a t t 锄o fz 固o r f ss e q u e n c ew a sc h o o s e nb y 怕g t a rs o f h a r e ，w 弱c l o n e di n t 0p e t - 3 2 ap r o k a 巧o t i ce x 】) r e s s i 叻v e c t o rt of o 肌p e t 3 2 a 倒f dp l a s m i d h i s 到f dp r o t e i l lw a se x p f e s s e di ne c 0 1 ir o s 渤唱a 而( d e 3 ) i 1 1 d u c i n gb yi p t q4 5 k d am o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i nc a nb ee x p r e s s e dw i 缸lah i 曲e m c i e n c y ，t l l e np u r i f i e db yu s i n g 啦i l i t ) rc l l r o m a t o g r 印h y p u r i f i e dh i s z n f dp r o 劬w a u su s e dt oi m m u l l i z er a b b i t st op r e p a r ep o l y c l o n a ll i ic l o n i n g 锄ds t u d y i n go f an o v c lz i n cf m g e rp r o l c i ng e n e 刁啊da b s t r a c t觚t i b o d y r a b b i ts e n l i i ls p e c i f i c i 够a n di t st i t e rw e r ed e t e c t e d b yd o u b l ed m s i o na i l dw e s t 锄b l o t ，r e s p e c t i v e l y ，n l ed a t a 砌i c a t e dt i t e ra l r e a d y1 ：3 2 趾d 廿1 ep o l y c l o n a la i l t i b o d yh a dl l i 曲a l l t i g e l l i c 咄i v e n ：t u a l l y ，h 嬲c o n s t m c t e dt 1 1 er e c o m b i n a n te u k 吖o t i ce x p r e s s i o np c d n a - b 气p - z n f dt 0 慨s f e c ti n t o2 9 3 tc e l l c e l l1 y s a t ew e r ea 1 1 a l y z e db yw 色s t e mb l o tt od e t e m i n et h ee x p r e s s i o no fz n f dp r o t e i n i n 仳sw o r k ，w ec l o n e dm ez m 叼g e n e b i o i n f 0 n n a t i c sd a t a b 嬲e 锄ds o 胁a r ew e r eu s e dt oa i l a l y z ea 1 1 dp r e d i c ti t s 丘m c t i o n n e nr t - p c ra n 2 l l y s i ss h o w e dt h a t2 n f dw a se x p r e s s e di l ls e v e r a lt i 豁u e s g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i nl o c a l i z a t i o ns h o w e dt 1 1 a tz n f dl o c a t e di m c l e u s o b t a i n e d 圮p u r i f i e d 如s i o np r o t e i nz n f d ，i th a sl l i 曲锄t i g e i l i c i 够p r 印a r e dp 0 1 y c l o n a l 觚t i b o d y 廿1 a tp r o v i d e dar e l i a b l et o o lf o rt 1 1 e 6 l t l u ef e s e 砌n ep c d n a 3 - l 廿v e c t o ri su s e df o rt a l l d e m 瓶m 锣p 谢五c 撕o n ( t a p ) ，删c hi sar a p i da i l dr e l i a b l et e c h i l i q u en l a tc a l lb es u c c e s s 觚l y 印p l i e di i l 廿l ea n a l y s i so fp r o t e i n - p r o t e mi 1 1 t e r 枷o nn e 铆o r k si i lp r o k a r y o t i ca 1 1 d 砌( a r ) r o t i cc e l l su r l d e rc l o s e t o - p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s k e y w o r d s ：z ? w t d ；z i n cf i n g e rp r o t e i n ；p r o k a r ) ，o t i ce x p r e s s i o n ；p o l y c l o n a la n t i b o d y ；e u l 【a r y o t i ce x p r e s s i o nw r i t t e nb ys 1 1 iq u n 纽培s u p e n ，i s e db ym e n gx i a i l g ) 【吼，w 如gm i n g h u ai v苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。研究生签名：学位论文使用授权声明苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。研究生签名：雌日导师签名：卑日期：一够二p 扩人锌指蛋白基因z n f d 的克隆及其研究第一章第一章综述遗传信息的实现过程离不开基因表达的调控，而转录调控在基因的表达调控中具有十分重要的作用。转录调节主要通过转录因子结合基因组d n a 上特异的顺序元件完成。这些序列特异性的转录因子，一般具有两个独立的功能域：一个是d n a 结合域( d n ab i n d i n gd o m a i n ) ，将蛋白质锁定在染色体d n a 的特异位点；另一个是效应结合区( e 舵c t o r r e g u la t o 巧d o m a i n ) ，它能引导特殊蛋白质或复合体转移到这些特异位点，从而使转录受到相应的调控。大多数转录因子的d n a 结合域在序列和结构上非常保守，目前发现生物体的基因转录调控结构主要有四种形式【1 】：螺旋转折螺旋( h e l i x - 臼】m h e l i x ) 、亮氨酸拉链( l e u c i n ez i p p e r ) 、锌指蛋白( z i n cf i n g e r ) 和p 带( pr i b b o n ) 。1 9 8 3 年，r o e d e r 和b r o w n 【2 】等在爪蟾卵母细胞中发现一种能活化5 s r n a 基因的蛋白，随后m i l l 分离得了t f m a 5 s r n a 复合物，并发现每个分子t f a - 5 s i 矾a复合物含7 1 1 个锌离子，经酶切分析和氨基酸序列分析发现，其含有9 个重复结构域，每个结构域由3 0 个左右的氨基酸组成，并具有2 个c y s 和2 个h i s ，它们与z n 2 + 离子配位形成类似于手指状结构，因此成为“锌指”结构，从而开辟了一个新热点辛指类蛋白的研究。锌指( z i i l cf i n g e rm o t i f ) 是存在于真核细胞转录因子中的重要结构域之一。p a b o等对锌指下了一个定义【3 】：在调节蛋白以小段氨基酸序列中，含有几个c y s 残基，这些区域为依赖锌的d n a 结合域，它通过结合z n 2 + 自我折叠形成短的稳定的“手指”样结构。锌指蛋白是指含有锌指结构的一类蛋白质。从酵母到人体，其中人类基因组中可能有将近2 3 的序列编码含有锌指结构的蛋白质【4 1 ，因此锌指蛋白家族可以说人体中最大的一个蛋白质家族。锌指不仅可结合于d n a 和r n a ，还能与d n a i 矾a 杂交体或其它蛋白结合，控制生物体中蛋白的转录和翻译过程【5 用。而锌指蛋白是目前发现种类最多，在真核细胞中最普遍存在的一类核酸结合蛋白。由于含有锌指这种结构特点，可以选择性的结合特异的靶结构，使锌指蛋白在细胞生长、增殖、分化和调亡等过程中起重要的作用们。目前发现锌指类蛋白广泛分布在动植物和微生物中，从酵母到人体，它们对基因的调控( 抑制或激活) 都人锌指蛋白基因z n f d 的克隆及其研究第一章起重要作用。( 一) 锌指蛋白的类型根据锌指模体序列特点，可以将锌指蛋白分为5 个类别：c 2 h 2 型、c 4 型、c 6 型、c 3 h c 4 型、l i m 型【l l 】。1 c 2 h 2 型锌指1 1c 2 h 2 型锌指蛋白结构据前人的研究报道，按锌配位结构域的性质，c 2 h 2 型锌指蛋白含有最为典型的锌指模体结构，一般由2 8 3 0 个氨基酸构成，包含2 个保守的半胱氨酸残基和2个保守的组氨酸残基，具有以下同源保守序列：( 耽p h e )- x c y s x 2 4 c y s x 3 p h e x 5 l e u 1 ( 2 h i s x 2 6 h i s ( x 为可变氨基酸) 【1 2 1 。不同的锌指蛋白中所含有的锌指模体的数目相差很大，从1 个到3 7 个不等，并且以线性重复的排列方式存在于蛋白质的c 末端。1 2c 2 h 2 型锌指蛋白的分类c 2 h 2 型锌指蛋白的n 端通常伴有不同的基元。这些基元包括痘病毒锌指( p o x v i r u s 锄dz i l l c6 n g c r ，p o z ) 结构域，即b t b ( b r o a d c o m p l e x ，饥吼t r a c l ( ，a n db r i c a - b r a c ) 结构域【1 3 】；u p p e l 相关性保守盒( 1 ( r u p p e l 嬲s o c i a t e db o x e s ，k r a b )结构域【1 4 】；指形相关盒( f m g e ra s s o c i a t e db o x e s ，f a x ) 【1 5 】；f a r ( f i n g e ra s s o c i a t e dr e p e a t s ) ，z i n ( z i l l c 丘n g e rn - t e m l h l a lm o t i f ) ；s c a n 结构域【1 叼等，但这些保守区的功能尚未明确。根据所含的基元的不同，又可将c 2 h 2 型锌指蛋白分为好几个亚型。1 2 1 屯蛆结构域约1 3 的c 2 h 2 型锌指蛋白的n 末端有7 5 个氨基酸高度保守序列，被命名为h u p p e l 相关性保守盒( 跏p p e la s s o c i a t e db o x e s ) ，简称己a b 。k r a b 一般由两个外显子编码而成，分为a 和b 两个亚框，可以形成2 个n 螺旋。这种区域可以进一步分为3 个亚家族( a + b ，a + b ，和a ) ，其中a + b 亚家族最为普遍。硒乙蛆框通过d n a 结合结构域或模板d n a 结合时，它起着转录抑制的作用f 1 7 ，1 8 】。a 框由4 5 个氨基酸残基构成，是抑制转录所必须的。而b 框本身没有抑制作用，但是可以通过a 框间接的发挥抑制作用【1 9 ，2 0 】。k r a b 框还参与基因沉默，当它结合到k a p 1 t i f p 抑制子的r b c c 框上时，由于k a p 1 与异染色质蛋白h p l结合，能导致与砌屯墟型锌指蛋白结合的靶基因失活并进入异染色质，从而引起基因沉默。尽管目前对许多屯蛆型锌指蛋白的功能还不很了解，但是已经发现2人锌指蛋白基因z n f d 的克隆及其研究第一章许多成员在细胞分化和发育中起重要的作用【2 1 1 。1 2 2p o z 结构域痘病毒锌指相关结构域，即p o z 结构域，有1 2 0 个氨基酸组成，是进化上保守的蛋白质蛋白质相互作用结构域。在含有c 2 h 2 锌指的蛋白质的氨基端，大约有5 1 0 含有该结构域田1 。拥有p o z 结构域的蛋白质分子多数为转录因子，这些转录因子可通过p o z 结构域形成高度紧密扭曲结合的同源二聚体，这个同源二聚体有一个较大的疏水表面，每个单体有1 4 的表面用于二聚体的分子间作用，这种构象特别适合于同源二聚体的形成，二聚体的表面是由保守氨基酸残基构成的沟，用于和其它蛋白质分子作用【2 3 。2 5 1 。有证据显示( p o z ) 结构域在几种类型的间叶细胞中起控制细胞生长与分化的作用，人们发现一种具有p o z 结构域的转录因子f b i - 1 ，在细胞分化过程中参与细胞分化过程的活化口6 】。还可以通过p o z 结构域与p m l ( p r o m y e l o c 妒cl e u k e m i a ) 蛋白形成二聚体，影响p m l 的正常亚细胞定位口7 】。1 2 3s c a n 框s c a n 框最先在s r e z b p 、c t - f i n 5 1 、a w 二l 和n 咖曲e r1 8c d n a 等四个蛋白中被鉴定，故而得名弘8 3 1 1 。目前已鉴定出多种具有该结构域的蛋白。s c a n 框由9 6 个残基构成，富含亮氨酸，氨基酸序列分析软件预测整个结构域分成三段，使每段形成一个a 螺旋可能参与蛋白与蛋白之间的相互作用。s c a n 框富含氢键，s c a n 框还包含较多的谷氨酸残基，表明它是一个带负电的酸性结构，这往往是转录因子的一个共同特点。s c a n c 2 h 2 型锌指蛋白以同聚体或异聚体的形式与d n a结合、进行转录调控，有证据表明s q 气n 框对s c 越w c 2 h 2 型转录调控因子的功能起着非常重要的作用【3 2 。4 】。2 c 4 型锌指这种结构序列为c x 2 c x l 3 c x 2 c x l 4 1 5 c x 5 c x 9 c x 2 c 。其中前部四个半胱氨酸和后部四个半胱氨酸各结合一个锌离子。3 c 6 型锌指( g a l 4 型)c 6 型( 即g a l 4 型) 锌指结构最先在g a l 4 与d n a 结合的部位发现，许多真菌转录调控蛋白的n 端都包含有这种锌指结构。其结构模式为c x 2 c x 6 c x 5 6 c x 2 c x 6 c 。g a l 4 型锌指结构通过6 个半胱氨酸与2 个锌离子结合，中间的2 个半胱氨酸是2 个锌离子公用的，也通过a 螺旋与d n a 结合。参与精氨人锌指蛋白基因z n f d 的克隆及其研究第一章酸、脯氨酸、酪氨酸、麦芽糖和半乳糖等的新陈代谢，g a b a 分析代谢和亮氨酸的生物合成等过程的蛋白大多都具有g a l 4 型锌指结构。4 l i m 型结构域l i m ( l i n 1 1 ，i s l 1 和m e c 3 基因) 结构域由6 0 个富含半胱氨酸的氨基酸残基构成，进化上相对保守，其保守组分为7 个半胱氨酸残基和1 个组氨酸残基，结构域通式为：c x ( 2 ) 一c - x ( 1 5 ，2 1 ) - 【f y w h - h x ( 2 ) 一c - x ( 2 ) c - x ( 3 ) 【l i v m f 】。l i m结构域可结合两个锌离子，这两个锌离子随机安置，但l i m 结构域不能结合d 】妣分子。5 c 3 h c 4 锌指c 3 h c 4 锌指结构域也称为环指结构域( 砒n gf i n g e r ) ，是l o v e 血g 等于1 9 9 4定义的一种蛋白结构域【3 5 1 ，首先在人的血9 1 基因中得到描述，随后陆续在病毒、酵母、动植物蛋白中被发现，具有各种功能，如肿瘤形成，信号传导，过氧化物酶的产生，病毒感染、发育、转录调节以及泛蛋白化【3 6 1 ，富含半胱氨酸，由4 0 6 0个氨基酸残基构成。它能结合两个锌离子，锌离子被4 个半胱氨酸或3 个半胱氨酸及1 个组氨酸四分子螯合。它的通式为：c x 2 c x ( 9 - 3 9 ) c x ( 1 - 3 ) h x ( 2 - 3 ) c x 2 c x( 4 4 8 ) c x 2 c ，其中x 为任意氨基酸，可表示为c 3 h c 4 。其中的半胱氨酸和组氨酸高度保守，它不同于其它的锌指蛋白，这种区域在结合2 个锌离子的保守范围内显示出独特的跨膜排列，环指有两种变异，一种是出现在t r a f 4 和t r a f 5 的c 3 h c 3 d 序列，即基序的最后一个半胱氨酸由天门冬氨酸代替。由于天门冬氨酸也可以与锌离子结合，所以这种替换不影响环指空间结构的形成。另外一种变异c 2 t h c 4 出现在p 5 3 相关癌蛋白m d m 2 。环指家族的成员现在已经超过7 0 个，主要是一些核内调节蛋白，参与基因转录调控、聊峪修复和重组、细胞转化、肿瘤抑制。t r a f 蛋白的环指结构参与它们的信号转导过程，截取这一区域的t r a f 蛋白发挥相反的作用，成为信号转到抑制蛋白。尽管有这些不同，环指还是有相对保守的构象区域的，包括保持分子基本构象的口链，锌离子连接系统，以及保守残基部分，该部分构成了疏水的核心 3 刀。许多包含有环指的蛋白质在泛素化途径中起关键作用，如c c b l 蛋白是信号转导途径中的一种接头蛋白质，c c b l 蛋白环指结构域可以和人类泛素结合酶7( u b c h 7 ) 结合，对细胞中配体诱导的表皮发生因子受体泛素化起关键作用，c c b l蛋白还可以通过其环指结构域结合泛素结合酶( e 2 ) ，使磷酸化的底物泛素化，进4人锌指蛋白基因z n f d 的克隆及其研究第一章而从蛋白体途径降解3 8 1 。( 二) 锌指结构域识别1 与d n a 作用许多锌指蛋白会以一种序列特异性的方式与d n a 相互作用。p a v l e t i c h 等于1 9 9 1 年报道了小鼠转录因子劲钌的三个锌指与d n a 结合所形成复合物的晶体结构，首次提供了关于这方种相互作用的详细情况。在这个复合体中，锌指位于d n a 双螺旋的大沟，通过a 螺旋的1 、+ 2 、+ 3 、+ 6 位氨基酸与d n a 上的碱基形成特异性接触。每个与d n a 接触的锌指与d n a 成反平行，n 端靠近d n a 的3 端，c 端靠近5 端。每个锌指由配位的锌离子与疏水氨基酸维持指状结构，相邻的锌指单位间不存在蛋白蛋白相互作用，每个锌指的d n a 识别在很大程度上是相对独立的。锌指蛋白依靠指形空间结构，可以深入到d n a 双螺旋的大沟内【3 9 】，主要通过与d n a 相互作用行使转录因子功能。其中在第二个半胱氨酸和第一个组氨酸之间的1 2 个氨基酸残基与核酸的结合有关，一般可结合5b p 的核苷酸。大多数的锌指结构倾向于识别富含g c 的序列，特别是含有5 g n n3 的靶序列，如z 跑6 8 、g l l 、r r i x 、s p l 等，但也有一些锌指蛋白识别富含a t 的序列，如c f 2i im 】。从一级结构上很难区分它们，与e 吐叮a 的作用上也不存在太大的差异，但在与碱基接触的氨基酸位置上却存在不同。此外，序列依赖的d n a 构象，对特异性识别也有影响，尤其是对亲和力具有较大的影响。而且，有时锌指蛋白与d n a 的结合，会明显改变d n a 的结构，使之发上一定的弯曲，这样，大沟变得更适合与锌指的结合【4 1 一。2 与i 斟a 作用锌指主要是与d n a 作用，但有些也可以识别i 矾a 。在锌指蛋白超家族中，t f a 是这方面的一个典型例子。它作为一个d n a 结合蛋白，作为5 sr r n a 基因特异的转录因子发挥作用，也可以作为一个心a 结合蛋白，与5 s 删结合形成一个7 sr n a 的复合物【4 3 州。很显然“r n a 锌指与d n a ”锌指必然遵循一套不同的原则来识别各自不同的靶位点，但是在一级结构上，目前还未发现一个简单的、明显的序列特征来区分d n a 结合与i 矾a 结合锌指。3 与d n a ：i 矾a 杂交双链作用锌指除了与d n a ，融叮a 作用外，在体外锌指还可特异地与d n a ：砒峪杂交双5人锌指蛋白基因z n f d 的克隆及其研究第一章链作用。b e r g 等在1 9 9 5 年发现，s p l 对双链d n a ：r n a 的亲和力与对双链d n a 的没有差别；而一个人工设计的锌指蛋白z f q q r ，其对双链d n a ：砒蛆的亲和力甚至比对双链d n a 的还高5 倍。锌指蛋白与杂交d n a ：r n a 双链的作用，依赖于在杂交双链中r n a 的方向是与锌指蛋白的氨基端珍基端的走向平行还是反平行，而且是否是序列特异性的。锌指蛋白与d n a ：对蛆杂交双链的作用，可能具有重要的生理作用。4 与其他蛋白质作用除了结合核酸外，还有一些锌指蛋白具有与其它蛋白质相互作用的能力，如：锌指蛋白w 和p 5 3 蛋白之间有功能相关性【4 5 】，肿瘤坏死因子n 师诱导蛋白a 2 0 与n f k b 相互作用【4 6 1 。( 三) 锌指蛋白的生物学功能锌指蛋白在许多生物活动过程中发挥着作用，它可以选择性地结合特异的靶结构，调控细胞的生长、增值、分化，并与许多疾病相关，是一类重要的功能蛋白质。但锌指蛋白的功能干差万别，很多锌指蛋白基因的功能研究尚处于研究的初期，在这里仅叙述已报道的较显著的一些特点。近年来研究表明，锌指蛋白可以调控细胞的生长。如何j 对于粒细胞的发育是必须的，并在巨噬细胞所依赖的细胞因子产生过程中起重要作用【4 7 】。6 沙j 作为t l r途径调控者，大体上将即作为一个必要的调控者来抑制突发的炎症应答【4 7 】。很多锌指蛋白均与胚胎发育有关。如烈s 能激活或抑制发育和生长相关基因【4 引。2 劢j 驰在小鼠胚胎生殖细胞发育中调控西3 的必须基因【4 9 】。跏珈2 6 是大鼠牙齿颅面骨发育过程中的一个转录调控因子【5 0 1 。非洲爪蟾中的f e z 参与决定爪蟾早期神经板的形成【5 。鼠的劬参与神经系统的发育【5 2 1 。w t l 在肾脏发育中起了重要作用，鼠的刁c 2与神经胚形成相关【5 3 1 。z ：m 乃5 9 和z 即2 8 在18 2 3 周胚胎心脏、骨骼肌、肝脏、肺、肾脏和脑组织中的表达量与其发育时间相关酬。2 n 乃2 3 的表达在早胚和成体不同【5 5 】。其次，锌指蛋白在细胞增殖与分化过程中发挥重要的作用。在非洲爪蟾中发现的砌表达在尚处于早期分化阶段的视网膜锥形体细胞的胞质，并持续到成体的视网膜【铜。人基因组的z 7 归7 瓯j 以j 强j 艿t j 9 2 ，j 9 3 都在睾丸中有高表达，可能参与精子的发生【5 7 1 。在大鼠中，& 刃仅表达在睾丸中的生殖细胞，参与精子的发生【5 引。人的z k l 在辐射后高表达，促进了造血细胞凋亡【5 9 】。而z k 7 与血管内皮生长因子陋g 哺协同抑制造血细胞凋亡的作用【6 0 1 。人2 只5 在血清依赖的细胞活性中发挥6人锌指蛋白基因z n f d 的克隆及其研究第一章作用，如细胞的增殖和生长【6 。锌指蛋白与疾病相关。一些锌指蛋白同癌症的发生相关6 2 却】。如孙侗酊2 在乳腺癌，前列腺癌，胰腺癌和外阴癌中的表大量与正常组织相比明显减少【删。凇7 8 ，广泛的分布在人的各个组织中，而凇7 8 在结肠直肠癌组织中的表达较之正常组织明显增高了，进一步的研究证明，z n f 2 嬲可能是一个潜在的原癌基因【6 9 1 。2 n 心在黑色素瘤中的表达量明显升高【7 0 1 。z w 3 2 基因在甲状腺瘤中表达【7 1 1 。还有在w i l m s 肿瘤中高表达的2 w 妨限】。在呼吸系统癌症中表达的z 砣j 7 网。锌指蛋白还同其它一些疾病相关，如c 2 h 2 型锌指蛋白a 捃2 在维持肾正常组织功能起重要的作用，实验表明在g z 括2 突变型小鼠中，出现肾萎缩现象，还有细胞坏死，相邻的肾曲小管中基膜肥厚，血液尿素氮和肌酸肝的增加，这些都导致肾衰竭现象，致使小鼠过早的死亡【7 4 】。家族性地中海热基因家族z r m 眩d d ，2 d ，2 j 3 【7 5 1 。在多系统萎缩症表达的凇3 j 【7 6 1 。在糖尿病表达的删3 舻明。与肾炎相关的局沙，8 】。参与调节免疫平衡、抑制系统性红斑狼疮的彳f d 肠j 【7 9 1 。肥胖症有关的删只五z 兕脚】等等，这些例证均提示了某一些锌指蛋白基因可能与特定的疾病的发生相关。除了以上所列举的功能，一些锌指蛋白的功能在其它方面也有表现，例如人的凇刀就是一个特异的核仁内的转录抑制因子【8 。从人胚胎中得到的基因删j 8 ，在c o s 7 细胞中过表达该基因抑制了彤疆和么p j 的转录活性，这表明2 抛j 8 可能作为m a p k 信号途径的负调节产物【8 2 1 。而且目前为止，绝大多数c 2 h 2型锌指蛋白及其它类型的锌指蛋白的研究都还是刚刚起步，大多仅是克隆到了基因，功能方面的研究还有待进一步的深入。( 四) 锌指蛋白的应用锌指蛋白作为一种转录调控因子，得到了极大的关注。目前己在5 6 0 多种蛋白中发现4 1 0 0 多种不同锌指序列，使得锌指蛋白成为所有研姒结合蛋白中最庞大的一个家族，成为人们研究蛋白- d n a 相互作用的一个理想对象。而其模块性结构特点及与核酸作用的相对简单性，则使其成为研究蛋白核酸相互作用的理想材料，以及人为设计筛选新的核酸结合蛋白的最佳元件。通过调节血管内皮生长因子( y ：趺矿) 抑制肿瘤血管发生，这个信号途径经临床验证证实了对治疗肿瘤能起明显的效果。使用基于c 2 h 2 锌指蛋白( z f p s ) 的人工转录因子靶向作用于脚启动子，这为在肿瘤中调控脚提供了有效的手段陋】。在植物中发现了人锌指蛋白基因z n f d 的克隆及其研究第一章不少锌指蛋白能增强植物的耐受性。如t f a 型锌指蛋白z f d 2 5 2 在水稻耐碱耐干旱方面起很大的作用【8 4 】：t f a 型锌指蛋白s c o f 1 ，作为冷调控基因( c o l d r e g l l l a t e d ，c a 吸) 的正调节物，通过与脱落酸效应元件相互作用来调控c g 喂，增强植物的耐寒能力嗍；从矮牵牛花中得到的锌蛋白z p t 2 3 ，其在植物体内的过表达可以增强耐寒能力【8 6 1 ，根据前人的这些报道，将这些锌指蛋白转入农作物中，将其改造成工程农作物加以应用，如z 即j 酗在转基因番茄中过表达增加了番茄对盐的耐型9 7 1 。研究锌指蛋白与核酸作用方式，锌指蛋白与其他蛋白的相互作用，旨在揭示蛋白与核酸，蛋白与蛋白间的相互作用规律。设计和改变锌指结构中起关键作用的几个保守的氨基酸位点，使整个锌指的识别特异性发生变化，从而设计出序列特异的d n a 结合蛋白，为基因治疗提供了广阔前景。人锌指蛋白基因z n f d 的克隆及其研究第二章第二章新基因脚的克隆、核酸和蛋白质的生物信息学分析、基因表达谱分析及亚细胞定位随着分子生物学的高速发展，人们对计算机的依赖日益增大，由此分子生物学与计算机科学的融合产生了一门新的交叉学科一生物信息学。随着现代基因克隆技术和计算机信息的迅速发展，寻找新基因和克隆新基因的方法也不断得到发展个完善。从e s t 入手克隆新基因，是生物信息学克隆的最主要的也是最重要的途径。本实验室获得一个人类新基因册( 基因号为虹1 8 2 7 6 1 ) ，该锌指蛋白基因尚未被研究，本实验室便对这个新基因展开了初步的研究。本章首先通过p c r 技术从体内克隆得到册新基因，证实其真实存在。其次对册基因经行了c d n a 序列及蛋白质序列进行生物信息学分析，包括册基因的染色体定位、开放阅读框的判定、外显子和内含子的判定、结构域的预测、亚细胞定位的预测和基因表达谱的预测。并通过实验进一步验证了胴基因亚细胞定位在细胞核，并在多种组织中表达。1 材料与试剂1 1 材料1 1 1 质粒与细菌p e g f p c 1 真核表达载体，大肠杆菌t 0 p 1 0 由本实验室保存。1 1 2 细胞株非洲绿猴肾细胞c o s 7 细胞由本实验室保存。1 2 试剂1 2 1 主要化学试剂及试剂盒：( 1 ) 细胞培养基d m e m ( g i b c o 公司)( 2 ) 标准胎牛血清( 兰州民海生物工程有限公司)( 3 ) e s c o r tvt r a n s f e c t i o ni 沁a g e n t ( s i g m a 公司)( 4 ) t 4 d n a 连接酶( t a k a r a 公司)( 5 ) k o d p l u s 高保真1 a q 酶( 1 o y o b o )( 6 ) p m d l 9 t 载体( t a k a r a 公司)q人锌指蛋白基因z n f d 的克隆及其研究第二章( 7 ) r t 幻嘲酶( t a k a r a 公司)( 8 ) p c r 纯化试剂盒( 北京博大泰克生物技术有限责任公司)( 9 ) 质粒抽提试剂盒( 北京博大泰克生物技术有限责任公司)割胶回收试剂盒( 北京博大泰克生物技术有限责任公司)o 】) 限制性内切酶( t a k a r a 公司)a 乃4 ，6 二脒基2 - 苯基吲哚( 4 ，6 一d i a l i l i d i l l o - 2 - p h e n y l i n d o l e ，d a p i ) ( 碧云天生物技术研究所)1 8 个人的组织c d n a 文库( c l o n t e c h 公司)1 2 2 实验所需试剂及其配置( 1 大肠杆菌制备以及转化所需的溶液：o 7 5 i i l mc a c l 2 ：8 0 i i l l 去离子水中加无水c a c l 20 8 3 2 5 9 ，溶解后定容至1 0 0 m l ，高压湿热灭菌3 0l n i n ，4 保存。5 0 甘油：用去离子水配制5 0 ( v ) 的甘油，高压湿热灭菌3 0m i n ，4 保存。2 0 m 咖lx g a l ：x g a l2 0 m g 溶于1 l n l 二甲基甲酰胺( d i m e 也y l f o m 锄i d e ) ，避光2 0 保存。1 mi p t g ：2 3 8gp t g 溶于1 0i l d 去离子水，用o 2 2p m 滤器过滤，每1 l n l分装。2 0 保存。( 2 ) 其他试剂：l b 液体培养基：胰蛋白胨1 0 。0g ，酵母提取物5 0 9 ，n a c l l 0 o g ，8 0 0 m l去离子水溶解，调p h7 o ，加去离子水定容至1 l ，高压湿热灭菌3 0m i n ，4 保存。l b 固体培养基：胰蛋白胨1 0 og ，酵母提取物5 o g ，n a c l l 0 o g ，琼脂粉1 5 0 9 ，8 0 0 m 1 去离子水溶解，调p h7 0 ，加去离子水定容至+ 1 l ，高压湿热灭菌3 0n 血，4 保存。d m e m 细胞培养基配制：称取n a h c 0 32 o g ，加d m e m 细胞培养基粉末溶于9 0 0 “去离子水中，调p h 至7 2 7 4 ，定溶至l l ，0 2 2 “m 过滤除菌后4 保存。2 周后补加谷氨酰胺至终浓度o 0 0 2 m o 帆。l p b s ：1 3 7 m m n a c l ，2 7 m m k c l ，4 3m m n a 2 h p 0 4 ，1 4 7 m m k h 2 p 0 4 ，调至p h7 4 ，高压湿热灭菌3 0m i n ，4 保存。5 0 t a e 贮存液：啊s 碱2 4 2 9 ，1 0 0 m lo 5 m o l le d t a ，用冰乙酸调p h 8 0 ，l o人锌指蛋白基因z n f d 的