（遗传学专业论文）水稻品系间杂交种dna甲基化的遗传变异及转座子的激活.pdf

摘要 d n a 胞嘧啶甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，广泛存在于高等动植物中，并在 维持基因组稳定性、调节基因表达等方面起着重要作用。有遗传分化的种间或品系间的 有性杂交作为一种胁迫方式可以影响后代的甲基化模式，从而改变后代的性状，对作物 改良和研究甲基化作用机制具有重要意义。转座子是基因组内可移动、可扩张的遗传元 件。研究特定诱导条件下转座子的转座有助于我们全面的理解转座子转座的生物学意义 和功能。转座子的转座活性能否遗传给有性后代以及是否继续激活也是一个值得研究的 问题。此外，大量研究表明，d n a 甲基化和转座子活性之间存在某些相关。本文研究发 现，杂交诱导水稻品系间杂交种d n a 甲基化发生遗传变异及转座子的激活。主要结果如 下： 1 利用m s a p 技术对水稻纯系亲本和杂交种的d n a 进行甲基化分析。所用的材料为 粳稻母本2 个，父本6 个，共1 2 种杂交组合，每种组合取5 株f l 代，共8 4 株实验材 料。结果表明：水稻纯系和杂交种的甲基化平均水平在1 2 5 1 4 9 ；杂交种f 1 代的 甲基化总体水平与母本非常接近；甲基化模式主要以内侧胞嘧啶的甲基化为主；十二个 杂交组合的f l 代均发生了不同程度的甲基化变异，其中有三个组合f 1 代的甲基化平均 变异频率明显高与其他组合，它们是( 0 卜1 2 4 早z 一3 56 ，8 3 6 ) ，( 8 9 4 5 早z 一3 5 6 ，9 5 9 ) ，( 8 9 4 5 早z 一2 96 ，1 0 7 ) 而其他九组f 1 代的甲基化平均变异频率只在 ( 2 2 4 5 9 4 ) ；有十个组合f 1 代的甲基化升高频率明显大与甲基化降低的频率，而 另两个组合的甲基化升高频率却明显小于甲基化降低的频率。这两个组合是( 8 9 4 5 早 z 一3 56 ) ，( 8 9 4 5 早z 一2 9 古) ；通过对甲基化变异的特异带的测序分析发现，变异的 序列有的与己知功能的基因或推测蛋白同源，有的与某些蛋白的启动子或内含子序列同 源，有的没有同源性；甲基化变异位点在水稻1 2 条染色体上均有分布，其中l 号、7 号、1 1 号染色体上分布的最多；8 号染色体上分布的最少。 2 将甲基化变异较大的三个组合及其杂交种进行s o u t h e r nb l o t 杂交分析。结果表 明：杂交导致多个转座子激活，包括趔，z 毋彤馏j 勋d 7 ，以s 蚂，弧焉5 ，凇以2 ；删馏 的激活不完全伴随着胁g 的协同激活：删馏的激活状态可以遗传给f 2 ，也可以出现 新的激活；乃订7 的激活状态也遗传给f 2 ，但未发现新的激活；三个组合的反交f 1 代 未发现舰激活，暗示正反交之间的差异。 根据以上几方面的研究结果，认为杂交在分子水平上，除导致经典的染色体重组外， 还诱导水稻d n a 的甲基化变异以及基因组内源转座子和反转座子的转座激活。因此，本 文研究结果为作物杂交育种提供了新的理论依据。 关键词：杂交；转座子激活；d n a 甲基化；表观遗传变异；水稻 东北师范大学硕士学位论文 文献综述 1 d n a 甲基化的分子生物学研究进展 1 1d n a 甲基化 真核生物基因组最常见的一种d n a 共价修饰形式是d n a 甲基化( d n a m e t l i y l a t i o n ) ，是表观遗传学的一个非常重要的方面。d n a 甲基化是最早发现的修饰途径 之一，它广泛存在于多种生物体中1 。在真核生物中，d n a 甲基化主要形成5 一甲基胞 嘧啶( 5 m c ) ，在原核生物中，n 6 甲基腺嘌呤则是甲基化的主要形式。 在动物中，5 一甲基胞嘧啶主要存在于c p g 二核苷酸对，在d n a 双链中呈对称分布。 哺乳动物体细胞中约有2 5 一1 1 6 的胞嘧啶被甲基化。植物中，大约有2 0 3 0 的 核基因组d n a 胞嘧啶处于甲基化状态嚏1 ，对称的c p g 和c p a ( t ) p g 被证明是甲基化 频率最高的口1 ，基因组内也有c p c p g 中外侧胞嘧啶甲基化，但频率低于以上两种h 5 1 。 不同种属植物的甲基化有很大不同阳1 。烟草中约3 0 9 6 的胞嘧啶是甲基化的，拟南芥中只 占约4 ，目前已基本清楚植物基因组中c p g 甲基化、c p n p g 甲基化和非对称甲基化有 不同的酶促系统控制，且具有不同的生物学功能。 甲基化是真核生物基因沉默的主要机制之一。通过失活其自身的d n a 片段，包括转 座子来保护基因组口8 1 。最明显的例子是对模式植物拟南芥的研究，研究表明d n a 甲基化 降低时转座子发生了转座行为凹，1 0 1 。d n a 甲基化或保守的d n a 甲基转移酶存在于大多 数真核生物中，真核生物的d n a 甲基转移酶与原核限制修饰系统具有结构同源n ，所 以利用d n a 甲基化进行基因组防御的所有生物体都有共同的祖先。 动植物有c 0 0 p t e dd n a 甲基化来调控所选的内源基因n 羽。植物d n a 甲基化用于基 因组印记和调控重复基因的表达“1 3 1 ? ，而动物用于基因组印记、x 染色体失活和肿 瘤抑制剂基因失活n 羽等方面。 1 2d n a 甲基化的发生机制 各种d n a 甲基化酶决定了d n a 甲基化作用的发生和甲基化水平的高低。真核生 物的d n a 甲基化转移酶根据它们的序列同源性和功能可以分为4 类。d i m l t l m e t l 类， d i n t 2 类，c m t 类和d n m t 3 类。 ， 第一类，d 衄t l m e t l 家族编码c p g 维持甲基化酶和低水平的c p n p g 的甲基化口7 埔1 酶活性，d n m t l 最初在小鼠中分离，其类似物m e t l 在拟南芥中发现。它们主要维持 甲基化。 第二类，d n m 也在哺乳动物、裂殖酵母和果蝇中发现，没有表现出明显的建立或维 持甲基化模式的功能。这些蛋白没有体外的活性，在去除d 加a t 2 突变体中没有整体甲基 化的降低。因为裂殖酵母和果蝇基因组中没有检测到胞嘧啶甲基化，所以这类甲基化转 东北师范大学硕士学位论文 移酶的类似蛋白功能还不清楚。 第三类，植物中特有的是染色体甲基化酶c m t s ，它们与m e t l 家族的不同在于在 甲基化转移酶的i 和i v 结构域中插入了一个与染色质结构有关的区域。玉米的缺失突 变体有明显的c p n p g 甲基化降低。这一现象解释了与动物相比植物基因组中存在较多 的c p n p g 甲基化，c m t s 是植物中特有的维持甲基化的一类酶，这类酶对于异染色质 的甲基化有重要的作用。m e t l 参与c p g 的维持甲基化，而c m t 3 对于i 埘1 c p g 的甲 基化必不可少。生化上，还不清楚c m t 3 具有维持或从头甲基化活性。然而，c m t 3 的 产物可能是n o n c p g 上发生从头甲基化的系统的组成之一。因为c i i n 3 突变体转化野生 型c m t 3 基因后，p a i 基因又发生了甲基化u 引。 第四类，删是最近在鼠、人类和鱼中发现的，它是从头甲基化酶。在玉米和拟 南芥中存在大量的类似于d i 珊旧的蛋白，该酶在胞嘧啶甲基化转移酶的保守区有重排， 拟南芥的基因组中有多个结构上类似于哺乳动物的d n a 甲基化转移酶d 1 1 1 i l t 3 s 啪一订的基 因。当它们发生显著的结构域重排，就有d n am t a s e 催化活性，因此被称为d r m l ， d r m 2 和d r m 3 口2 1 。失去d r m l 和d r m 2 基因功能的突变不影响原有的在f w a 或s u p 位 点的甲基化，但阻止了这些序列上由于反向重复序列诱导的从头甲基化，这说明d r m 基 因是从头甲基化酶曙引。 还有一类d d m l ( d e c r e a s e di 1 1d n am e t l l y l a t i o n ) ，编码s n f 2 s w l 2 家族的解旋酶， 它是d n a 依赖的a t p a s e ，它具有转录共激活、转录共抑制、染色质凝聚或d n a 修复的 活性。d d m l 可能通过与甲基化结合蛋白的相互作用使m e t l 易于接近作用位点。 在植物中，d n a 的甲基化状态可以遗传给后代，这种遗传可以影响发育的基因以及 着丝粒的重复序列，r d n a 束和c a c l i a 转座子家族等。 与d n a 甲基化相比，关于d n a 去甲基化( d e m e t h y l a t i o n ) 的研究相对较少。d n a 去甲基化的机制，既可以是被动过程，也可以是主动过程，也有可能被动和主动作用共 同存在n 叫。d n a 被动去甲基化是由于在d n a 复制过程中维持型d n a 甲基化酶被抑制或 缺乏所造成，而d n a 主动去甲基化则需要特异的酶促反应n 州嘲。在小鼠中受精后合子的 全基因组范围的去甲基化是一种主动机制，而随后的分裂阶段则发生d n a 被动去甲基 化n 叫。拟南芥中d n a 主动去甲基化是靠d e m e t e r ( d m e ) 和r e p i 通s s o ro f s i i 皿呵c i n g l ( r o s l ) 实现的，d m e 具有d n a 糖苷酶( g l y c o s y l 勰e ) 和a p 裂解酶 ( a p l y 硒e ) 双重功能n 峨啪阶删。无嘌呤( 印u r 陆c ) 或无嘧啶位点( a p y r i m d 砸cs i t e ) 常称为a p 位点。d n a 糖苷酶以碱基切除修复( b 弱ee x c i s i o nr 印a i r ，b e r ) 方式进行 修复。d n a 糖苷酶切开n 一糖苷键，特异切除5 一甲基胞嘧啶并留下无碱基位点( a b 硒i cs i t e ) ， a p 裂解酶切开无碱基位点，将d n a 链切开，然后由d n a 聚合酶添加未甲基化的胞嘧 啶，d n a 连接酶将链连上。d m e 在生物体内和体外都具有5 一甲基胞嘧啶d n a 糖苷 裂解酶活性，它能从含c g 、c n g 和c n n 序列中切除5 一甲基胞嘧啶n 蛐啪1 。依赖d m e 3 的去甲基化作用是在拟南芥胚乳发育过程中建立基因组印记的一种途径n 鼽瑚“删。r o s l 也具有5 一甲基胞嘧啶d n a 糖苷酶裂解酶双重活性 1 9 0 一1 9 2 ，它能对s 枞引发的 d n a 超甲基化过程和转基因的转录水平的基因沉默( t g s ) 起抑制作用n 州蚴。 2 东北师范大学硕士学位论文 含有m 的反转座子乜。j 3 | u r 型反转座子可进一步分为t y l c 叩i a 和t y 3 g y p s y 两类。 而非l t r 型反转座子可以分为长散元件( l i n e s ) 和短散元件( s i n e s ) l t r 型反转 座子有不同长度的长末端重复序列( l t r s ) ，其长度在1 0 0 b p 到l k b 左右。l t 黜不编 码蛋白质，但含有对转座起重要作用的启动子和终止子。反转座子编码多种蛋白质，其 中以三个主要基因为主，即g a g ( 种属特异抗原) 、p o l ( 聚合酶) 和硫( 整合酶) 。g a g 基因编码的蛋白质参与反转录转座子r n a 的成熟与包装，使反转录转座子r n a 适合于 整合入基因组。p o l 基因编码反转录酶和r n a s eh ，这是反转座子的复制和转座所必需 的。i n t 所编码的整合酶使d n a 状态的反转座子整合到染色体的新位点上。t y l 一c o p i a 和t y 3 一g y p s y 两类反转座子的明显区别在于血和p o l 基因的排列顺序不同。非l t r 反 转座子比l t r 反转座子简单。其中的l i n e s 也包括和l 1 r 反转座子相同的蛋白质。l i n 黜 有g a g 和p o l 基因，但是缺乏确定的整合酶基因。s 脏s 是一类与其它不同的反转座子， 不具备编码能力。所有已知的s i n e s 都来源于聚合酶的转录本，利用特殊的功能转座。 反转座子在植物基因组中分布广泛，拷贝数很高。例如： t y l c o p i a 类元件，野大 麦的b 触也1 和玉米的0 恤e 1 及h u c k - 2 以2 0 ，0 0 0 2 0 0 ，0 0 0 拷贝存在口“7 5 7 剐，1 y 3 g y p s y 类的c 玳f h l 一1 在玉米基因组中以2 0 0 0 0 个拷贝存在，l i n ed e l 2 拷贝数达到 2 5 0 ，0 0 0 ，s 眦t s 在烟草中有5 0 0 0 0 拷贝。有文献表明反转座子存在于异染色质区包括 着丝粒在内，而且拷贝数很高口刀，基因区内也有零散的分布。前人的研究也频繁发现基 因侧翼区含有与l 1 r 反转座子相关的序列。一般认为，反转座子含量的差异可能是 植物基因组大小高度变异的原因之一。拟南芥这样的小基因组，反转座子只占4 8 ，而 在玉米的大基因组里占到5 0 一8 0 口训。反转座子拷贝数增加是由于转座复制机制造成的， 在植物基因组扩张中起重要的作用呻1 ，但植物基因组内重复序列的存在也能在反转座子 之间优先重组以减少基因组大小刚。l t r 反转座子l t r 之间的重组产生一个l t 黜，可以 减少特殊转座子的拷贝数幻。因此，在一定基因组内反转座子拷贝数不仅是转座激活的 结果，也是基因组减少新插入拷贝数的结果。 转座子( t r a i l s p o l l s o 邶) ，是由d n a 介导的，含有末端插入重复序列( t 酏) ，由识 别短末端重复序列( t 风) 的转座酶介导的“切”和“粘贴( c u t 锄dp 嬲t e ) 的机制转 座，一般并不增加拷贝数( 但也有例外) 。根据转座的自主性，这类转座子又可以分为 自主性转座子和非自主性转座子。自主性转座子具有能够编码转座酶的基因，可以自主 转座，如玉米中a c 、m u 、s p m ，拟南芥中d 1 1 p l i 和金鱼草中t a m 等。另一类为非自主 性转座子，这类转座子本身不具有编码转座酶的基因，需要在自主性转座子提供转座酶 的情况下才能转座，如玉米中的d s 转座子。非自主性转座子来源于自主性转座子，是 内部缺失或重排的自主性转座子。就目前发现的几种d s 转座子均为a c 的衍生物。在结 构上，它们共同的特征是缺失了a c 中一段编码转座酶的序列。由于缺失的程度不同， 就获得了不同的d s 转座子，d s 本身不能自主发生转座，而是要在a c 提供转座酶的情 况下才能发生转座，d s 一旦发生转座后，由于缺少转座酶，而不能再发生切离和重新 插入。同一家族的各成员的t 取存在某种程度的序列同源，而长度( 一般为6 1 3 b p ) 和 结构保守。编码转座酶的元件识别各自家族的t 酏，致使t 风中间的d n a 序列跳出， 6 东北师范大学硕士学位论文 t 0 嘶s t 1 让汜m i t e s n m 1 ”1 。有优先插入到t 1 a 或t a a 的重复序列的偏好。御以g 的序列 是高度保守的。相对其它m i t e s 以千计的拷贝数n 1 2 1 1 3 3 来说，舰p 垤的拷贝数异常低。 基因组序列分析和s o u m 锄b l o t 都表明，舻垤在粳稻( 却d 以泐) 基因型“日本晴”的拷 贝数为6 0 8 0 个，而籼稻( 如妣曲基因型“9 3 l l 中只有1 4 个拷贝。s o u m e mb l o t 结 果显示，两个水稻亚种的共同祖先普通野生稻o m 邱o g o n 只有几个卯垤拷贝。这说 明从o m f i p 0 9 0 n 中分化后j a p o i l i c a 中，l 尸打曙有明显的扩增。很显然，托p 确雪m i t e s 在 水稻向栽培种的驯化中，曾在一定的条件下被激活才使这两个亚种存在如此大的拷贝数 的差异。这与m c c l i i l t o c k ( 1 9 8 4 ) 即的“基因组冲击可能激活转座子的“g e n o m i cs h o c k ” 理论是相一致的。 真核生物中存在很多m i t e s 家族。很多m i t e s 都与已知的转座子家族相互关联n 1 7 u 8 1 1 钆啪h 2 u 。与其它m i t e s 一样，肌尸垤没有编码能力，因此不能催化自身的转座，需 通过它的自主型转座子的转座来提供n u 1 1 1 4 1 。水稻的序列分析找到了尸觇g 和尸d 馏， 它们与，胪垤序列上相关的，能编码转座酶。尸垤长度为5 3 1 4 b p ，它的两端分别有2 5 3 b p 和1 7 7b p 与卯垤序列相同，很显然，舻垤是由尸孵内部序列在近期删除而来。 p d 馏长度是5 1 6 6 b p ，与卯垤和尸垤有相同的1 5 b p 的t 酏和相似的末端序列。 除 了两端相似外，p 垤和肋馏在内部序列的两个o r f 也有很高的同源性，其中的o 飓 与玉米的p 元件的转座酶有显著的相似性。而p 元件与也属于t o u r i s t - l d 【em i t e 家 族。o r f 2 中的n 2 ，n 3 ，c 1 区都是高度保守的。而究竟p 垤和n 馏哪个或全部是 舻垤在特定的条件下转座的自主型转座子n 1 1 1 2 1 目前的研究还没有定论。 2 3 转座子与基因组进化 转座子的移动，尤其是l t r 类反转座子和m i t e s ，在植物基因组中产生大量突变。 玉米a d l l 基因内b s l 转座子插入突变就是一个例子n 翻。以同样方式，植物中第一个激 活的反转座子t n t l 在插入烟草n i 舰t er e d u c 协e 基因后被分离n 翱。自此，人们发现多个 例子来证明反转座子插入编码区产生表型突变n 哳1 。转座子在非编码区的插入也能产 生突变，它们插入到内含子中，导致组织特异性选择剪切功能蛋白，从而使不同组织内 的功能蛋白产量有差异n 施1 盯一绷。在有些情况下，在基因内或基因附近插入转座子序列 对基因的表达具有更复杂的影响，因为l n 己内转录启动子、调控子及终止子的存在， 也能修饰基因的转录或者转录后的终止n 1 3 0 1 。 在生物进化过程中，除了转座子插入致突变的变化外，转座还能够造成基因组的扩 张。转座子拷贝数的高低可能是植物基因组大小多样性的主要原因。一些小基因组植物 如拟南芥其反转座子仅占基因组的4 8 ，所以推测其基因组较小的原因可能是由于缺 乏转座子的扩增晦。而大基因组如玉米中转座子能达到8 0 n 3 1 抛h 删。至少在一些情 况下，抑制植物基因组中转座子的扩增的某些机制的缺乏或不足以抑制转座的发生，导 致了基因组的扩大。有些转座子的插入的特异性，就可能形成了大基因，例如有些转座 子常常插入到内含子中或接近5 或3 端，而有些转座子的插入往往远离基因区，这 就造成了异染色质区的扩大。特定的物种的异染色质区的组织取决于它其中的转座子的 8 东北师范大学硕士学位论文 化的，比如果蝇，它同脊椎动物和高等植物相比就易发生更多转座引起突变。这些发现 引发人们提出了阳订真核生物的d n a 甲基化可能起到防御内源转座子引起的对基因组有 害影响的作用。 m c c l 缸o c k 最早发现了表观遗传调控转座子n 4 1 1 。此后，人们在植物界广泛地开展 了这方面的研究工作。首先发现的植物基因受表观遗传调控的是玉米转座子。玉米的启 动子的甲基化变化导致转座子a c 和e s p m 从活跃到沉默，再到活跃n 虬1 船】，这种变化影 响了转座子的所有的转座行为，包括转座、染色体断裂和基因表达的调控。活跃或者不 活跃的状态通常是可遗传给后代的。在r o b e r t s o n 的突变体n 伽a d l 4 4 1 和e n s p m n 4 司现了可 逆的转座子活性和d n a 甲基化的相互关系。d n a 甲基化对转座子活性的调控，也影响 附近区域的寄主基因的表达n 蚰1 4 刀。 影响表观遗传状态的基因的突变能引起内源的拟南芥转座子激活。最明显的例子是 对模式植物拟南芥的研究。拟南芥的d d m l 基因( d e c r e 邪ei i ld n am e l v l a t i o n1 ) 是 编码类似于染色质改构因子s w l 2 s n f 2 的a t p 酶n 缇ld d m l 基因的突变导致了甲基 化降低。在低甲基化的d d m l 突变体中，很多原来沉默的重复序列转录水平激活口4 9 啪 州。除了转录激活外还导致了至少两类内源的转座元件m u l e 汹1 和c a c t a 的高频率转 座。这两类转座子在野生型中是不活跃的。d d m l 突变可能影响了染色质状态。转座子 活跃通常与低甲基化和转录激活有关。实际上c a c 元件和其他的重复序列一样在d d m l 植株中是低甲基化和有转录激活的。大量的实验证据也证明了这一点，但是否单有转录 激活就能足以诱导转座子转座还有待进一步研究。 大量研究结果表明，d n a 甲基化对于维持转座子的沉默是必需的。转基因的转 录沉默( t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，t g s ) 和转录后沉默( p o s t 咖s c r 枷伽mg e n es i l e n c i l l g ，t g s ) 都证明了d n a 甲基化对于防御转座子活跃、保持正常发育 状态是是必需。也有的研究表明转座子s b ( 脚垤b 删砂) 的序列中的c p g 甲基化增加 了其转座频率乜引。增强转座的机制还和染色质结构有关。由此可见，转座子的转座是受 到复杂的体系调控的。 沉默的转座子可以被激活然后将其活跃的状态遗传给后代n 4 1 1 ，活跃可能是暂时的， 有时能持续几代的连续激活然后沉默。虽然d n a 甲基化已经在玉米中有所阐述n 4 3 1 惦1 5 羽， 但这种表观遗传激活转座子的潜在分子机制还不清楚。d n a 甲基化可以随着聊叮a 复制 而遗传，因为半甲基化的d n a 可以由d n a 甲基化转移酶d 衄t l m l 催化。 4 本研究的背景、目的和 x 东北师范大学硕士学位论文 表观等位基因，有利于适应性强的表型筛选n 睁1 6 0 l 。表观遗传的调控对各种内在和外部的 胁迫是否都有对应的反应，变化的程度及新获得的甲基化的遗传，对于阐明d n a 甲基化 的基本的生物学功能来说都是需要研究和明确的问题。 种内杂交作为生物界最为广泛的繁殖方式，可以综合亲本种的适应性或创造出新的 适应性，丰富基因库、拓宽生境，进而促进基因组进化和新种形成。同时种内杂交也是 一种胁迫因素，能够引起杂交后代中发生广泛的表观遗传学变异，如d n a 甲基化、组 蛋白乙酰化、组蛋白磷酸化及转座子激活等，从而获得新的可遗传的性状。通过对这些 发生表观遗传学变异的后代的研究，我们可以从中筛选具有优良抗性的后代并应用于生 产实践中。因此对杂交诱导的d n a 甲基化变异的研究，可以为作物遗传改良提供新的 思路。 水稻中有研究发现一个品系间杂种的9 6 的甲基化位点表现为遗传，而变异的位点 是4 n 6 1 1 沉默的转座子可以被激活然后将其活跃的状态遗传给后代口别，活跃可能是暂时的 ( 局限于激活当代) ，有时能持续几代的继续激活然后沉默。虽然d n a 甲基化已经在玉 米中有所阐述n 6 2 m 6 ，但这种表观机制调控转座子活性的确切机制还不清楚。 本论文目的是以模式作物水稻亚种粳稻为材料，大规模的研究杂交种的甲基化水平 和模式的遗传和变异，以及杂交条件下能否引起转座子激活和其活性状态的传递。希望 通过本研究揭示杂交引起d n a 甲基化的变异特点，并试图揭示d n a 甲基化改变与转座 子活性之间的关系。最后，希望本文研究结果能够为作物杂交育种提供新的理论依据。 东北师范大学硕士学位论文 1 u 的t 4l i g 弱e ，其余位p c r 水，3 7 酶切6 l l r ，8 连接4 1 1 r ，4 过夜。( a d 印t c r 见表1 ) 2 2 1 2 预扩增 2 5 肛1 反应体系包括1 xp c rb u 彘r ，0 3 m 】d n t p ，3 斗l 酶切连接产物，o 3 i n m 各 心汀p ，毋a 引物和劬2 幽。引物各3 0 n g ，5 ut a g 聚合酶。9 4 变性2 分钟，按以下参 数扩增3 0 个循环，9 4 3 0 s ，5 6 3 0 s ，7 2 8 0 s ，最后7 2 延伸5 m i l l 。( 预扩增引物见 表1 ) 2 2 1 3 选择性扩增 用0 1 x 的t e 按1 ：2 0 稀释预扩增产物作为p c r 反应模板，2 5 l 反应体系包括1 xp c r b u 脑，1 2 5 i n md n t p ，3 u 1 连接产物，e + 3 引物5 n g ，h m + 3 引物3 0 1 1 9 ，2 ut a g 聚合酶。按 以下参数扩增循环，一轮扩增参数：9 4 3 0 s ，5 6 3 0 s ，7 2 8 0 s ，以后每轮循环温度 递减o 7 或1 ，扩增1 2 轮或1 0 轮：最后按以下参数扩增2 3 轮，9 4 3 0 s ，5 5 3 0 s ，7 2 8 0 s ( 所用引物见表2 ) 表1 m s a p 所用接头和预扩增引物 t a b l e1 a d a p t e r s 锄dp r e 锄p l i f i c 撕o np r i 删璐o fm s a _ p 接头序列 艮d ri a d a p t e r i 上 ：c 0 足i 觚郾t e r l i 础2 i 不砌e d 肋确t e r l i 预扩增引物 髓d ri 十a h m 峋 5 c t c g t a g a c t g c g t a c c 3 5 aa 订g g l = a c g c a g t c 3 5 g a t c a t g a g t c c t g c t 3 5 c g a g c a g g a c t c a t g a 3 5 g a c t g c g t a c c a a t t c a 3 5 a t c a t g a g t c c t g c t c g g 3 表2 m s a p 选择性扩增引物组合 t 曲l e2 m s a ps e l e c 竹e 唧l i f i c a t i o n 砸m 懿 1 兄组不t c t 2 兄组不t c g 3 局m t c c 4 丑z 怯t t c 5 h 儡二t t g 6 h 组不1 t a 1 h f 眦g k 8 h ( 不t g t 9 岛儡不t g c 1 0 础 乒t a c ( a ) e a a c ( b ) e a a g ( c ) e a c a ( d ) e a c t ( e ) e a c c ( de - a c g ( g ) e a g c ( h ) e - a g g ( i ) e - a g a ( j ) e - a t c 1 3 东北师范大学硕士学位论文 ( 5 ) 终止显影：在显影液中直接添加等体积已回收的固定终止液，停止显影并固定影 像。 ( 6 ) 固定完全后，即醋酸和碳酸钠反应完全( 溶液不再有二氧化碳产生) ，用双蒸水洗 涤凝胶2 次，每次至少2 分钟，凝胶板从水中取出后，竖起控水凉干。 ( 7 ) 照相，统计条带切特异条带。 2 3 目的性片段的回收、克隆及测序 2 3 1 特异性目的片段的回收 将在a f l p 胶上表现变异的带从胶中切下，并溶解在1 t e 中。并以该片段作为 p c r 的模板，按照原m s a p 选择性扩增程序和引物组合进行扩增，将所得p c r 产物进 行1 琼脂糖凝胶电泳，切割目的带并进行纯化( 使用北京鼎国公司生产的胶回收试剂盒， 按操作按说明书进行) 。 2 3 2 特异性目的片段的克隆 ( 1 ) 连接 取2 山经纯化的p c r 产物用于连接反应，使用p r o m e g a 公司生产的p m d 1 8 t v r e c t o r c l o i 血g 趾进行，按载体插入片段1 ：3 的比例直接克隆到砖仍1 8 t 载体中，总反应 体积为1 0 山。 ( 2 ) 感受态细胞的制备 使用大肠杆菌菌株d h 5 0 c 为受体菌。取一7 0 保存的菌种1 0 p 1 转入1 0 血l b 液体 培养基中，3 7 振荡培养过夜。然后取2 i n l 过夜培养物转入4 0 m ll b 液体培养基中于 3 7 振荡培养约两小时，至o d 5 5 0 m m = o 3 。将培养物于7 0 0 0 i p m 离心2 m m 收集细胞。 之后在冰上用1 2 体积( 2 0 m 1 ) 预冷的o 0 5 m o 儿c a c l 。重悬细胞，置于冰上2 0 i 血后于 7 0 0 0 r p m 离心2 i n i n 收集细胞。然后将细胞重悬于1 1 0 体积( 伽) 预冷的0 0 5 i n o 儿 c a c l 2 ，此时的细胞即可用于转化。 ( 3 ) 感受态细胞的转化及a 互补筛选 取2 0 山感受态细胞，冰浴1 0 分钟。在无菌条件下加入2 山连接产物，轻旋混匀后 置于冰上3 0 m i i l 。4 2 水浴热击细胞2 i n i n ，每管中加0 8 血s o c 液体培养基，3 7 培 养1 h 。取1 0 0 山培养液涂于表面涂有x g a l 和d t g 的娜l b 平板上，3 7 恒温培养 1 2 1 6 小时，至菌落长至直径为卜2 衄，然后每个平板随机选取若干个半个白色克隆 进行p c r 筛选。 ( 4 ) 阳性克隆的p c r 检测 挑取白色克隆的菌体放入1 0 0 山双蒸去离子水中，9 5 加热5 曲为模板，利用载 体上含有的通用引物( m 1 3f o n a r d & i 汩e r s e 引物) 对所选克隆进行逐一扩增。2 5 “l 的反应体积中包括：d n t p 4 0 m l n o 儿，1 p c r 反应缓冲液，每种引物5 岫儿，模板3 p 1 ， 2 5 m i n 0 ，m g c l 2 ，用灭菌双蒸水调至反应体积为2 5 山后进行p c r 扩增。9 4 变性5 分钟后进入循环：9 4 变性1 m i n ，5 5 复性1 曲，7 2 延伸1 5 l n i n 共3 0 个循环后， 于7 2 1 0 i 血。将p c r 产物进行1 琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。 1 5 东北师范大学硕士学位论文 将所选带有目的片段的另一半阳性克隆加入到含6 岬的l b 液体培养基中，3 7 振 荡培养过夜，将培养物分为等体积的两部分，一部分用于保存，另一部分用于测序。 2 3 3 特异性目的片段的同源性探寻 测序由上海生工公司进行。所得序列结果在n c b i 网站 ( h t t p ：州m n c b i i 山n n m 9 0 v ) 利用b l a s t ( b 鹊i cl 0 c a l 舢i g 帆e n ts e a r c ht 0 0 1 ) 方法对 m 数据库( g e n b 锄k + e m b l + d d b j + p d b ) 进行同源性探寻。 2 4s o u t h e m 杂交分析 2 4 1d n a 酶切： 分别用劢口i 、肋以棚等限制性内切酶酶切样品d n a ：酶切体系5 0 肛l ，样品d n a3 u g ， 酶量3 u u g 。3 7 ，1 2 小时。采取过量及过夜酶切是为了保证酶切完全。 表3 用于扩增6 个水稻转座子的引物 t a b l e 3 p r i 皿e r su s e dt oa m p l i f yt h ep r o b ef r a 鲫e n to f6a c t i v em o b i l ee l e m e n t si nr i c e 2 4 2s o u t h e m 印迹 酶切产物经1 琼脂糖凝胶电泳( 电压为1 v c m ，1 2 h ) 分离，在紫外灯下切去多余的 胶体。凝胶在0 2 5 m o 儿的h c l 中预处理7 分钟使d n a 脱嘌呤，弃去h c l 后用蒸馏水 冲洗几次，然后以0 4 m 儿的n 幻h 为转移液，用毛细管法将d n a 转移到h y b o n d 矿 尼龙膜( 舢l 姗) 上，转移过夜后取出自然干燥，常温保存备用。 2 4 3 探针的分离 制备探针的引物是根据n c b i 上提供的水稻基因组序列设计的，所用引物见表2 ， p c r 产物通过测序验证。 2 4 4 探针标记、s o u 廿1 e m 杂交及杂交信号的检测 使用a m 哪h a mp h a 衄i a 公司生产的g e n ei n l a g e s 灿印h o sd n c tl a b e l l 通gs y s t e m 试剂盒进行探针的标记，具体操作见试剂盒说明书。 1 6 东北师范大学硕士学位论文 杂交及杂交信号的检测包括以下步骤： 将膜和标记好的变性探针加入杂交液中，6 0 杂交炉内杂交过夜。( 杂交液成份： 5 s s c 、0 1 ( w ) s d s 、5 硫酸葡聚糖、1 2 0 体积的l i q u i d b l o c k ( 试剂盒提供) ) 。 6 0 条件下洗脱液i ( 成份：1 s s c 、o 1 ( w ，v ) s d s ) 中1 0 分钟，洗脱液i i ( 成份：0 5 s s c 、o 1 ( w v ) s d s ) ，洗4 0 分钟。 将膜放入溶液i ( b u 虢r a 稀释l o 倍的l i q u i db l o c kr e g e m ) 中，室温洗涤1 小时； 溶液i i 中( 成分：a n t i n u o r e s c e i l l 一a pc 0 n j u g a t e 用含有o 5 b s a 的b u f | f e r 稀释5 0 0 0 倍) 室温振荡1 小时；用溶液i i i ( 含有0 3 t w e e n 2 0 的b u 自衙a ) 室温 振荡洗膜两次，每次1 5 分钟；最后取适量的检测液检测。 暗室内进行压片、显影、停影和定影。 1 7 东北师范大学硕士学位论文 结果与分析：口7 卜。叫7 】1 7 i 1 水稻亲本纯系及其杂交种的d n a 甲基化水平和模式的遗传和变异研究 将纯系亲本和杂交种f 1 代共1 2 个组合共6 8 个样品的基因组d n a 进行 眈被iq 劲口i iv s 根i + 坛p i 双酶切，分别经变性聚丙烯酰胺凝胶( p a g e ) 电泳， 利用十对引物组合扩增，十二个杂交组合得到清晰的谱带数目约5 0 0 条( 参见图2 ) ，数 据统计详见附表l 。 砌口i i 和尬p i 识别相同的四核苷酸位点c c g g ( 真核生物中主要的甲基化位点) ， 但对甲基化的敏感程度不同：却口i i 对内外侧胞嘧啶甲基化均敏感，即不能消化甲基化 的c c g g 位点，但对内外侧胞嘧啶的半甲基化不敏感，即能消化半甲基化的c c g g 位 点；尬p i 对外侧胞嘧啶甲基化和半甲基化均敏感，即不能消化外侧胞嘧啶甲基化的 c c g g 位点m 刀。 因此，在p a g e 胶上得到的谱带数即是被检测到的c c g g 位点数。在任何一个c c g g 位点，任一材料的e + h 和e + m 两种酶切都可能出现四种谱带情况：1 刖- h 和e + m 两 种酶切中都有带；2 e + h 有带，e + m 没带；3 e + h 无带，e + m 有带；4e + h 和e + m 两种酶切中都没带。四种带型反应如下信息：第一种该c c g g 位点为非甲基化位点；第 二种是该甲基化外侧胞嘧啶半甲基化；第三种是该c c g g 位点内侧胞嘧啶甲基化；第四 种较复杂，有三种可能性即不存在c c g g 位点，另外也可能是该位点c c g g 外侧胞嘧 啶甲基化，内外侧胞嘧啶同时甲基化。因此励口i i 和尬p i 这两种酶只能准确识别前三 种情况，因此我们实验统计的甲基化水平可能比实际的要低，但一些资料表明n 舶1 7 2 1 两 种酶所不能识别的上述甲基化类型出现的频率非常低，根据此原则我们根据实验统计的 谱带计算了亲本和杂交种的甲基化水平模式的遗传和变异。( 附表1 ) 数据表明母本o 卜1 2 4 的甲基化总体水平在1 2 5 ；8 9 4 5 的甲基化总体水平在 1 4 9 ：父本z 2 9 ，z 4 2 ，z 8 1 的甲基化总体水平基本一致，约在1 3 2 ；乙5 0 在1 2 8 ； z 3 5 ，z 2 7 约在1 4 2 ；杂交种f 1 代的甲基化水平是：十二个杂交组合中有七个组合的 f 1 代的甲基化总体水平均与母本非常接近；有两个组合与父本接近( 这两个组合的父 母本身的甲基化水平也很接近) ；另外还有三个组合的甲基化总体水平与父母本都有差 异。( 图1a ) 在这十二个组合中内侧胞嘧啶甲基化水平为7 2 1 1 2 9 ；外侧胞嘧啶半甲基化水 平为2 0 0 9 6 4 7 5 。可见甲基化模式主要以内侧胞嘧啶的甲基化为主。( 图1b ) 甲基化变异的c c g g 位点数统计结果表明十二个杂交组合的f 1 代均发生了不同程 度的甲基化变异，其中有三个组合f 1 代的甲基化平均变异频率明显高与其他组合，它 们是( 0 1 一1 2 4 早z 一3 56 ，8 3 6 ) 、( 8 9 4 5 早z 一3 5 杏，9 5 9 ) 、( 8 9 4 5 早z 一2 9 东北师范大学硕士学位论文 6 ，1 0 7 ) 而其他九组f 1 代的甲基化平均变异频率只在( 2 2 4 5 9 4 ) ：另外，有八 个杂交组合f l 代单株之间甲基化变异频率有差异，有四个杂交组合f 1 代单株之间基本 相同。( 图1c ) c c g g 位点中内侧胞嘧啶甲基化的位点成为c g 位点：外侧胞嘧啶的甲基化位点成 为c n g 位点；内外侧同时甲基化的位点即是c g 位点，也是c n g 位点； 有十个组合f 1 代的c g 和c n g 的甲基化升高频率明显大与其甲基化降低的频率，而 另两个组合f 1 代的c g 和c n g 的甲基化升高频率却明显小于其甲基化降低的频率。这两 个组合是( 8 9 4 5 早z 一3 5 各) 、( 8 9 4 5 早z 一2 96 ) ，正好是甲基化平均变异频率明显 高的三个组合中的两个。( 图1de ) * * 堆 蘧 晕 醐 o 0 uu i窖毒害 l 一一一盆一 内侧胞嘧啶甲基化 外侧胞嘧啶半甲基化 口母本 囵父本 口f 1 平均 l o 1 2 个组合 1 9 日 组合l 习 吣 吣 啡 吣吣 吣 鹏 嗍 叫 8 6 4 2 o 8 6 4 2 0 l l l l l 东北师范大学硕士学位论文 3 杂交对转座子的影响 杂交使后代的甲基化发生了大量的变化，那么对转座子的影响如何呢? 3 1 杂交诱导水稻f l 代的魄及其可能的自主性转座子喈的转座激活 人们利用胁迫的方法1 a 1 1 3 ，1 1 司诱导了第一个激活的m r r e 水稻的。 ，胪觇页i n i n j a _ t i l r e - 尸咖e r ) 转座子为此我们对三个甲基化变异较大的杂交组合及其f 1 代植株 进行，舻垤及慨转座酶的可能供体尸耐1 3 蚓的活性检测。提取单株旗叶的基因组 d i n a ，采用脚，l 砌酶切，进行s o u t h e mb l o t 分析，所用探针为全长的，竹p 咖雪和转座子 p 垤的片段( 图3 ) 。 图3 中a 是三个杂交组合基因组d n a 的觑h d 酶切后与卯以g 的杂交结果。 玑p 咖炙a b 0 8 7 6 1 5 1 ) 中不含有肺玎砌的酶切位点，所以变异的杂交带很可能反映，护垤 元件在某位点的插入或缺失。杂交检测发现三个杂交组合的f 1 代均发生了舻以g 谱带 的缺失或增加，杂交激活了胍p f 馏转座子。 这三个组合的反交未发现，胪垤的激活( 图3d ) ，体现了正反交的差异，推测可能 与细胞质的作用或者与像基因印记类的表观遗传学现象有关。 图3 中b 和a 是同一张膜，是与p 以g ( a b 0 8 7 6 1 6 1 ) 的一段杂交结果。在舰p 以g 发 生变化的三个组合当中，只有一个组合发生了尸垤的协同转座变化。另外两个组合f 1 代中均未发生尸垤的转座， 图3 的结果证实了舻觇g 尸垤在杂交处理的水稻f 1 代中的转座激活。舻加g 有亲 本原有带的消失，也有新带的出现。m p 垤变异的同时p 豫显示出不同的变化( 图3 a ， b ) ，这种s o u m 锄b l o t 显示的带的“得与“失 同时发生，符合转座子剪切再粘贴的 机制n 弛啪j 7 3 3 。因此，以上的结果证实了杂交导致的m p 垤的转座，也确认了，舻垤转 座酶的可能供体p 坛。 从，舻咖g 转座程度上看，第二个组合f 1 代明显高于另外两个组合。我们推测，出现 这一结果的原因可能与尸：f ：馏所编码转录酶有关。图3 中a 也显示了三个杂交组合f 1 代杂 交谱带的不同，说明细胞内发生了不同的转座事件。 3 2 杂交f 1 代咖激活特性在f 2 代中的遗传 杂交f 1 代激活了卯垤，这种活性能否在后来的世代里保持下去? 为了求证这个问 题，我们选f 1 代激活的三个单株( 分别来自三个杂交组合) 分别套袋自交，每个单株 随机选1 8 个f 2 代单株提取幼嫩叶片基因组d n a ，勋口i