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虾受a f b l 污染情况调查及产a f 菌检测技术的初步研究 专业。遗传学 硕士生；谢红梅 导师：贺竹梅副教授 摘要 黄曲霉毒素( 简称a f ) 是一组主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的真菌次级代 谢产物，是迄今发现的各种真菌毒素中最毒和最致癌的化合物，其中黄曲霉毒素 b l ( 简称a f b l ) 对植物、动物和人的毒性和致癌性最强。目前已有一定的研究 是关于a f 在人类食品和家禽家畜饲料中的污染，并制定了相关的限量标准，而 未见有关虾体内a f 残留的报道 为调查广东省市场中虾体内a f b t 残留情况，分两批采集了广东省部分地区 海水虾，并采用酶联免疫吸附法( 腮a ) 检测虾肝与虾肉中的a f b l 含量结 果表明，虾肝中a f b i 的阳性检出率均高达9 0 以上，虾肌肉组织中稍低，分别 为6 5 7 1 和2 7 2 7 调查结果表明虾受a f b l 污染广泛而严重，说明虾饲料可能受产a f 菌污染 严重，因此，建立快速、经济且能应用于大量样品的检测技术对于控制a f 的污 染、提高我国食品安全、提高国民健康水平以及增加出口创汇将具有很重要的现 实意义因此，本研究对鉴定产a f 菌的分子检测技术和培养基检测技术进行了 初步研究 以产a f 菌和非产a f 菌d n a 为模板，p c r 扩增a f 合成途径中的8 个基 因，结果显示，其中6 个基因能形成多个单基因p e r 组合用来鉴别黄曲霉菌或 寄生曲霉菌，且筛选出6 组多重p c r 也能鉴别黄曲霉菌或寄生曲霉菌从增加 a f 产量和增强a f 在u v 光下的荧光强度两个方面考虑，通过大量筛选培养基， 得到了三种能高效检测产a f 菌的培养基，即椰乳、豆奶和黄豆培养基，均添加 了脱氧胆酸钠作为菌生长抑制剂和甲基化b 环糊精作为荧光增强剂。产a f 菌在 椰乳、豆奶和黄豆培养基上2 8 培养2 到3 天后，u v 光下在培养基的正面或反 面均可见明亮的蓝色荧光，而非产毒菌株未见荧光。由此可见，单基因p c r 组 合、多重p c r 及椰乳、豆奶和黄豆培养基检测技术可以鉴别产a f 菌。 关键词：a f b l ，产a f 菌，e l i s a ，p c r ，鉴定培养基 s u r v e yo fa l i b lc o n t a m i n a t i o ni ns h r i m pa n dt h ep r i m a r yr e s e a r c h o nt h ed e t e c t i o nt e c h n i q u e so f a f l a t o x i g e n i cs t r a h 鸠 m a j o r ： g e n e t i c s n a m e - h o n g m e ! x i e s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f z h u m e ih e a f l a t o x i u s ( a 助ag r o u p0 f 蝴d a i yf l l n g a lm e t a b o l i t e sm a i n l yp r o d u c e db y 月m 懈a n da p a r a s i l i c u s , a t h em o s tt o x i ca n dc a r c i n o g e n i cc o m p o u n d sa m o n gt h e k n o w nm y c o t o x i n s , o fw h i c ha f l a t o x i nb l ( a 耶1 ) i st h em o s th a r m f u lt op l a n t s , a n i m a l sa n dh u m a n s o 衄af e ws t u d i e sf o ra n a t o x i nc o n t a m i n a t i o no fh n m n nf o o d s , p c 眦姆o rh v 嚣t o c kf e e d sh a v eb e e nc a r r i e do u t , a n di n t e r r e l a t e dl i m i t e ds t a n d a r d s h a v eb e e ne s t a b l i s h e d h o w e v e r , t h e r ei s r e p o r ta b o u ta f l a t o x i nr e s i d u ei ns h r i m p t os u r v e ya f b lr e s i d u ei ns h r i m po fg 蛆n g d o n gp l 讲r 缸m a r k e t s , 矾啊栅- s h r i m pw c r cc o l l e c t e dt w o t i m e sa n de n z y m e - l i n k e di m m e n o s o r b e n ta s s a y ( e u s a ) m e t h o dw a su s e dt od e t e r m i n ea 阳“t h el e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep o s i t i v er a t e si n s h r i m p l i v e rw c r cb o t ha b o v c9 0 i ti nm u s c l e 咖6 5 7 1 ，a n d2 7 2 7 。 r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t si n d i c a t et h a ta f b lc o n t a m i n a t i o ni ns l n 洒pi sb r o a da n ds e r i o u 氩 m a y b ei t i sd e et os e r i o u sa t h t o x i g e m cs t r a i n sc o n t a m i n a t i l mo fs h r i m pf e e d s o , d e v e l o p i n gf a s t , e c o n o m i c a la n dv a s ts a m p l mf i t t e dd e t e c t i o n 协曲n i q u 伪w i l lm a k e r e a l i s t i cs i g n m c a n c ef o rf o o ds a f e t y , h u m a nh e a l t h , a n di n t e r n a t i o n a lt r a d e h e n c e , i n t h i sp a p e r , p r i m a r yr e s e a r c h e s0 1 1m o l e c u l a ra n dm e d i u md e t e c t i o nt e c h n i q u e sa l s o h a v eb e e nd o l l c t a k i n gd n ao fa n 砒【i l i - l 蚋) d u c j 丑ga n dn o n a f l a t o x i u - p m d u c i n g s t r a i n sa s t e m p l a t e s ，a m p l i f i c a t i o no f8a f l a t o x i o ns y n t h e s i sp a t h w a yg e n e sw i t hp c rs h o w e d t h a ts i n g l ep c ro ft w oo rm o r ei ns i xg e n e sa n dm u l t i p l e xp c ro fs i xg r o u p sc o u l d i d e n t i f y 五肋v l 坫o rg p a r a s i 矗c u s t oe n h a n c et h ep r o d u c t i o no fa f l a t o x i n sa n dt h e f l u o r e s c e n c eu n d e ru vl i g h t , n u m b e r so fs c r e e n i n gm e d i aw e r eu s e d a tl a s t , t h r e e e f f e c t i v ea n dr e l i a b l e s c r e e n i n gm e d i a , c o c o n u t - s u c r o s e - a g a r , a n ds o ym i l k - s u c r o s c - a g a ra n ds o y - s u c r o s e - a g a rw e r ec o n f l , m c d ，w i t hs o d i u md e s o x y c h o l a t ef o r g r o w t h i n h i b i t i o na n d m e t h y l a t e db c y c l o d e x t r i n d e r i v a t i v ef o rf l u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n t a f t e ri n c u b a t i o no nt h e s em e d i af o rt w oo rt h r e e d a y s ，a t2 8 ， a f l a t o x i n - p r o d u c i n gs t r a i n ss h o w e db r i g h tb l u ef l u o r e s c e n e eo nf a c eo ri n v e r s eo f m e d i u mu n d e ru v u g h t , y e tn o n a f l a t o x i n - p r o d u c i n go n e sd i dn o t s ot h ec o m b i n a t i o n o fs i n g l cg e n ep c m u l t i p l e x - p c r , a n dt h e s et l 扛e es c r e e n i n gm e d i ac a nb eu s e da s d e t e c t i o nt e c h n i q u e sf o ra f l a t o x i g e n i cs t r a i n si d e n t i f i c a t i o n k e y w o r d s ：a f l a t o x i nb 1 ，a f l a l o x i g e n i es t r a i n s ，e l i s a , p c r , s c r e e n i n gm e d i u m i v 虾受a f b i 污橐情况调查及产a f 菌检测技术的初步研究 1 1 黄曲霉毒素概论 第1 章前言 1 1 1 黄曲霉毒素的产生与性质 黄曲霉毒素( a f l a t o x i n s ，简称a f ) 是一组真菌毒素已知能够产生黄曲霉 毒素的真菌有4 种，分别是黄曲霉菌a 印盯j 珊缸皿r v 淞) 、寄生曲霉菌卿铝珊时 p a r a s t c u s ) 、a s p e r l l u s 加砌u 和幽弘，g 矗船芦“如细嬲耐，其中黄曲霉和寄生 曲霉是黄曲霉毒素的主要产生者，我国产黄曲霉毒素的菌种主要为黄曲霉 目前已确定结构的黄曲霉毒素有a f b i 、a f b 2 、a f g l ，a f g 2 、a f m l 、a f m 2 等1 8 种，主要根据紫外光下薄层层析板上荧光的不同颜色命名，如蓝色荧光为b ( b l u e ) 绿色荧光为g ( c a e e n ) ，而m 则因为它最早在乳中发现而得名它 们的基本结构含有二呋喃环和氧杂萘邻酮( 又名香豆素) ，前者为其毒性结构，后 者可能与其致癌有关 黄曲霉毒素无臭、无味、无色，其相对分子质量为3 1 2 3 4 6 它的性质非常 稳定，一般的煮沸不能将它破坏，至少2 以上才能裂解；在低温下，即使是 枷以下也不被破坏它不溶于乙烷、石油醚，乙醚和水，可溶于氯仿、甲醇 和乙醇等在p h1 3 的强酸性溶液中稍有分解，在p h9 1 0 的强碱性溶液中能 迅速分解，但此反应可逆，即在酸性条件下又能恢复原来结构5 次氯酸钠 丙酮溶液可使a f b l 完全分解，在实验室中用此方法对器皿作解毒处理 黄曲霉毒素是一种剧毒和强致癌物质，为迄今发现的各种真菌毒素中最稳定 的一种，1 9 8 8 年即定为i 级致癌物，其毒性为氰化钾的1 0 倍、砒霜的鹋倍，其中 a f b l 含量最高，且毒性最强。其毒性的划分标准为：3 0 - 5 0p 叫酾荤，5 0 - 1 0 0p p b 中毒，1 0 0 - 1 0 0 0p p b 高毒，1 0 0 0p p b 以上极毒 黄曲霉毒素分布范围很广，几乎所有谷物、饲草和各种食品( 包括畜产品) 都可；f 乍为产黄曲霉毒素菌的生长基质花生、玉米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制 谢红梅中山大学硕士学位论文 品最易受黄曲霉毒素污染( 见图1 1 ) ，其次是小麦、高粱和甘薯。温度3 0 、 相对湿度8 0 、谷物水份在1 4 以上( 花生的水份在9 以上) 最适合产黄曲霉毒素 菌的繁殖和生长，2 4 - 3 4 c 之间，产毒量最高。 图1 1 受黄曲霉菌污染的花生和玉米 1 1 2 黄曲霉毒素的危害 1 1 2 1 黄曲霉毒素对农作物的危害 最常见的被产黄曲霉毒素菌污染的作物主要有花生、玉米、棉花、山药、阿 月浑子果实、黑胡桃、美洲山核桃树、杏仁、甘蔗等当收获前的花生、玉米和 棉花等被产黄曲霉毒素菌污染后，春天来临时，生长在这些农作物残骸上的菌产 生菌核和无性孢子进入土壤作为幼苗的初级接种体。在随后的生长季节，当环境 条件有益于疾病发生时在作物上产生高水平的二级接种体，进入人和动物的食物 链，对人和动物造成危害( s c h e i d e g g e r 等，2 0 0 3 ) 真菌毒素( 尤其是黄曲霉毒素) 的存在而造成的直接经济损失可以通过农作 物减少的数量、降低的质量、以及动物发病率的增加作估计。据世界粮农组织 ( f a 0 ) 报告，全球每年约有2 的农作物因污染严重而失去营养和经济价值。另一 方面，由真菌毒素的存在而造成的间接影响难于估计，也未得到足够的重视，譬 如说，被黄曲霉毒素污染过的农作物由于品质下降，不仅减少了市场份额，还增 加了处理和加工的费用，并增加了解毒和稀释毒性方面的费用，被污染过的农作 物用作饲料后同样会减少家禽家畜甚至水产品的市场份额，影响出口 1 1 2 2 黄曲霉毒素对人和动物的危害 2 虾受 f b t 污套情况调查及产a f 菌检测技术的初步研究 黄曲霉毒素对人的危害很严重，如k o i r a l a 等( 2 0 0 5 ) 研究了黄曲霉毒素 能引起人的肝炎、肝硬化和肝癌等疾病，也能引起其他器官和组织如肾、心肌、 肌肉、脑等的损伤g o n g 等( 2 0 0 4 ) 调查研究了贝宁湾一些西非国家黄曲霉毒 素影响幼儿生长发育的情况，但其潜在的影响机制还不清楚。最近在第三世界国 家报道了人黄曲霉毒素急性中毒综合病症的特征为呕吐、腹痛、肺水肿、惊厥痉 挛、昏迷、大脑水肿而死亡和肝脏、肾形矿脉和心脏脂肪过多它对动物的危害 也很严重，从表1 1 列出的黄曲霉毒素对某些动物的半致死剂量( u 埘可以看出它 对动物的毒性之强。 表1 1 黄曲霉毒素对某些动物的半致死剂量 陆生动物养殖厂家对这种毒素的危害很了解，许多国家已经制定了家禽家畜 饲料中可允许的a f b l 含量水平但是这种毒素对水产养殖种类的影响，目前还 没有深入的研究越来越多的研究表明，黄曲霉毒素对水产养殖种类的危害与陆 生种类相似，这方面的研究主要是对鱼类进行的黄曲霉毒素在虹鳟鱼中的严重 危害包括鱼鳃变白，减少血红细胞的数量，破坏肝脏等鲑鱼口服1 2m 鲫暖体 重) 的黄曲霉毒素可以导致胃含物的回流，进入腹腔膜的黄曲霉毒素如果超过1 2 m 班g 就可以引起血红蛋白的含量降到正常水平的如，还可以导致肠内黏膜和 血细胞的坏死，使一些器官颜色变浅，这些副作用反过来又导致鱼类生长缓慢， 饲料效果变差。 谢红梅中山大学硕士学位论文 关于黄曲霉毒素对虾类危害的研究还很少，尽管如此，有些研究已表明虾饲 料中的a v ：g 平可能出现问题。组织病理学研究发现，a f b l 能损伤虾肝胰腺，说 明虾饲料中的黄曲霉毒素可以影响到虾的产量，肝胰腺的损伤还会引发其它病 情。梁萌青等( 1 9 9 6 ) 的研究表明，黄曲霉毒素严重影响对虾生长，用含a f b l 4 7 2 p v b 和7 8 7p p b 的饲料养虾，其增重率仅为对照组的4 3 9 和4 5 4 ，而且消化率、 成活率均下降。 1 1 3 黄曲霉毒素的残留 动物摄入黄曲霉毒素后，黄曲霉毒素及其代谢产物在动物体内残留或随乳 汁、尿、粪和呼吸等排出，如不连续摄入，一般不在体内蓄积残留在动物体内 的毒素在肝脏中分布最多，含量为其它器官组织的5 1 5 倍( 周炳付等，1 9 9 7 ) 。 残留在动物产品中的黄曲霉毒素可以通过食物链导致人类的肝癌等疾病，因此人 们对黄曲霉毒素在动物体内及动物产品中的残留非常重视。 动物接触日粮中超过2 0 p p b 的黄曲霉毒素，可在肉乳和蛋中出现残留物。给 猪饲喂4 0 0p p b a f b l 连续4 周，可导致猪体t 内a f b l 的积蓄，肝、肌肉和肾中的残 留量为1 0 4 1 5 1p p b 。泌乳母牛摄入含黄曲霉毒素( 每天8 m g ) 的e l 粮2 天，乳中 出现残留物，乳中m 1 、m 2 代谢物的量与摄入b l 的量有关，通常以0 2 3 2 的 比例进入乳汁( 李秉鸿等，2 0 0 1 ) m i c c o 等( 1 9 8 8 ) 用含5 0 p p b a f b l 的饲料长期饲喂小鸡和母鸡，h p “凇测 肝中a f b l 的最高水平为0 6 1 6p p b 。 k r i u k o v 等( 1 9 9 3 ) 用含0 2 5 、0 5 、1 、2p p m a f b l 的饲料饲喂火鸡1 0 天后， h p i c 检测肝脏和肌肉组织，检测到1 1 4 3p p b 的a f b l 残留。 a g a c d e l e n ( 1 9 9 3 ) 报道，给产蛋鸡每天饲喂含5 0 0 p p ba f b l 饲料，第七天 a v e l 在鸡蛋中检测值为0 1 1 7p p b 。 h u s s a i n 等( 1 9 9 3 ) 用含5 0 或1 0 0p p ba f b l 的饲料饲喂白斑鱼，3 0 天后用 i i p i , c 检测，肌肉组织中检测到5 2 0p p b 的a f b l 残留。 o l i v e i r a 等( 2 0 0 0 ) 用含0 、1 0 0 、3 0 0 、5 0 0 p p b a v a l 的饲料饲喂母鸡8 周后， 用1 r i 肪法检测鸡蛋中a f b l 残留，结果饲喂5 0 0p p b a f b l 的母鸡下的鸡蛋中检测 4 虾受 f b i 污染情况调查及产a f 菌检测技术缒初趔塞 到0 0 5 0 1 6p p b 的a f b ! b i n t v i h o k 等( 2 0 0 2 ) 用含3p p ma f b l 的饲料饲喂鹌鹑、鸭子、母鸡和小鸡7 天，用，u c 检测它们的肝脏、蛋和肌肉中的a f b l 残留，结果在四种家禽的肝脏 中均检测到a f b l 残留，浓度从o 1 5 到7 8 3p p b ，而在蛋中均未检测出a f b l 残留， 仅在鹌鹑肌肉中检测到越砸l 残留量为0 3 8 p p b c r a t h u m b i 等( 2 0 0 3 ) 注射1 5p p b 的a f b i 于鸡体内，后用认c ( 免疫亲和柱) 净化，e t j s a 检测，结果检测到鸡体内有0 0 1 5 o 0 1 7 p p b 的j f b l 残留 1 1 4 黄曲霉毒素合成途径及途径基因 a b 矿 口 矿 弗 d 嘲 _ 晴 州 一 捌 w , - t 舯 俐 确腑阳帕 图1 - 2 黄曲霉毒素合成详细途径( 等，2 0 0 4 ) a ：黄曲霉毒素合成途径基因在染色体上的位置； b ：黄曲霉毒素合成途径及相关基因参与的步骤 5 糠一嘶叫州州卅ll哪嗍一一训孵州暮纠删枷州蚶吖 扭秘枷缮棚椰ji裤孵秘，搬jl咿咿彬川； 谢红梅中山大学硕士学位论文 a f 是一种次生代谢的聚酮化合物，其生物合成需要2 3 个酶促步骤，主要经 由以下途径： a c e t a t e + p o l y k e t i d e a n t h r a q u i n o n e s + x a n t h o n e s - wa f l a t o x i n s ( c h a n g 等，2 0 0 2 ；b e n n e t t 等，1 9 8 3 ；b e n n e t t 等，1 9 8 0 ：b h a t n a g a r 等， 1 9 9 1 ；b h a t n a g a r 等，2 0 0 3 ) 。 黄曲霉毒素生物合成的遗传学和分子生物学研究发现，黄曲霉毒素生物合成 途径有2 5 个基因参与( 见表1 - 2 ) 。粘粒和九噬菌体库的限制图谱表明：所有与黄 曲霉毒素合成有关的基因成簇排列于一个7 0k b 的真菌基因组区域( y u 等， 2 0 0 4 ) 。黄曲霉毒素的合成是包含一系列高度有序的氧化还原反应，目前比较合 理的合成途径如图1 - 2 所示。 表1 - 2 黄曲霉生物合成途径基因及其功能描述 基因曾用名酶或产物途径中的功能 ( 1 枷c o r i g i n a ln a m cf m z y m eo fp r o d u c t f u n c t i o n i n t h e p a t h w a y 删f a s - 2 f a sa t p h as u b u n i t a c e l a t ep o l y k e f i d e a # bf a s - 1 、r e , m 8 、f a s l 、# s l - 爿 e a sb e t as u b u n i ta c c t a kp o l y k c t i d e 卵c p k s a 、肼吐j p 黜a c e t a l ep o l y k c g d e 硝d n o r - ir e d u c t a n o r t o w n 可陋 n o r a 、a a d 、a d h 2 n o rr e d u c t a s e d e h y d r o g e n a s en o r t oj w n q z f r , o r - b d e h y d m g e n a s e n o r t o 舢 硝【g a v n a 、o r d - ip 4 5 0m o n o o x y g e n a s ea 幻h ：l ，n 卸曰m 删 a l c o h o ld c h y d r o g e n a h 删t o a n 锅7 n n 棚m 朔，o r d - 2 o , a d a s e 越，f 协v h a 加 e s t ae s t e r a s e删d 强c 斫k v b sv e r bs y n t h a s e、0 u 。t o v 咖 班 v e r br i c s 咖f a s cv 啪协v e r a 矾m e r - 1 d e h y d m g e a a s c k e t o r e d u c t a s e 、，e i t a 佃d m s t a l v w r a m o n o o x y g e a a s er a 协d m s r 面d d m t a 、o m t b o - m e t h y l t r a m f e n m ei 击 d m s t t o s t , d h a m s t t o 6 虾受 f b i 污染情况调查及产a f 菌检测技术的初步研究 d m 劬批柏m 衙c b d l i 汀 o - a o t s r t oo m s r , 斫p 口删，o m 口- i o - m e t h y l - t r a m f e r a i l m 璐t 岫d h o m s r o x k l o n x l u m 叫p 4 5 0o m s r m a 隅s a d a f o t , 鲫蛇 o n t a ，m - d - i m o n o o x y g e m 髓 d h o m s t t o a f b 2 m d a f c , z a f , ra m - 2 ，鲫堙m 日l 脚a a i v a t o fp a t h w a ym 羽d 柚 a z s班n 脚a c t l v a 妇p a t h w a yi g l l j j a t o g 可盯a l n t m m m e m b m m p m a mi t 峭m m s p o t l 瞻 铆口唰 p 4 5 0m o n o o x y g e n a 硒f o r m a t i o n p 4 5 0 m o m o m 胖 面矿q , p x矾t o l i v n a v rm o a o o x t g e n a h v n t o v i i a , a i m _ 皿r h v n m 啊婚啊硼声聃o v o n et o v 0 c 瑚霄 m a r b m o n o o x y g e m e o 谢m * v l 飘a b d 幅t a n 蛔一h y p o t h e t i c a l 啪由 v 姒协s t 1 2 黄曲霉毒素检测方法的研究现状 1 2 1 黄曲霉毒素的检测方法 黄曲霉毒素的检测方法概括起来主要有薄层层析色谱法、高效液相色谱法、 酶联免疫吸附法、放射免疫测定法、微柱筛选法、生物传感器法、质谱法、生物 体检测法等，目前应用较多的有薄层层析法c 1 1 l d 、高效液相色谱法o w l c ：) 和酶 联免疫吸附法( e l i s a ) ，这从中国和a 嗍美国官方分析化学家协会) 检测黄曲霉 毒素所用的标准方法( 表1 - 3 ) 可以看出 7 谢红梅 中山大学硕士学位论文 表1 - 3 中国和a o a e ( 美国官方分析化学家协会) 检测黄曲霉毒素所用标准方法 检测方法 检测对象标准名称 a o a c 标准 玉米和花生中黄曲霉毒素； a o a c 9 9 3 1 7 1 l c 花生中黄曲霉毒素a o a c 9 9 8 0 3 觐l j s a 玉米中总黄曲霉毒素( b l 、b 2 、g 1 ) ； a o a c 9 9 3 1 6 玉米、杏仁巴西坚果、阿月浑子果实中黄曲霉毒素； a o a c9 9 4 吣 花生油，阿月浑子糊、无花果和辣椒粉中a f b l 和总黄曲霉毒素； a o a c9 9 9 0 7 h p l c 要儿食品中的a f b l ； a o a c 2 咖1 6 液体牛奶中a f m l 检测。 a o a c2 0 0 0 0 8 中国国标及行业标准 食品( 牛乳及其制品、黄油及新鲜猪组织( 肝、肾、血，瘦肉) 等 食品) 中黄曲霉毒素m 1 和b l 的测定； g b t 5 0 0 9 抖2 0 0 3 饲料中黄曲霉毒素b 1 的测定方法； g b8 3 8 1 - 8 7 弧 食品( 粮食、花生及其制品，薯类、豆类，发酵食品及酒类) 中黄 曲霉毒素b l 的测定； g i v r s 0 0 9 2 2 - 2 0 0 3 食品中黄曲霉毒素b l 、岛、o i ，g z 豹测定 g l 们眄0 0 9 2 3 2 0 0 3 饲料中黄曲霉毒素b l 的测定# g b 仇7 4 8 0 - 1 9 9 8 日吼 食品( 粮食，花生及其制品、薯类，豆类，发酵食品及酒类) 中黄 曲霉毒素b l 的测定g l 坍5 0 0 9 2 2 2 0 0 3 食品( 玉米、花生及其制品催生酱，花生仁、花生米) 、大米、小 麦、植物油脂、酱油、食醋等食品) 中黄曲霉毒素的测定lo n 艇y 7 9 - 2 0 0 3 乳和乳粉中黄曲霉毒素m i 的测定； g n $ 9 8 0 - 2 3 h p l c 出口油耔、坚果及竖果制品中黄曲零毒素的检测方法；s n o 酷7 - 1 9 9 7 出口茶叶中黄曲霉毒素b i 检测方法i s n 爱醇 出r l 粮食中黄曲霉毒素b i 、啦、g l 、g 推测方法s n 0 复 徽柱筛选法 食品中黄曲霉毒素b i 、岛、g l ，龟的测定g 巧0 0 9 0 3 - 2 0 0 3 食品( 玉米，花生及其制品( 花生酱、花生仁、花生米) 、大米、小 荧光光度法 麦、植物油脂、酱油、醋等食品) 中黄曲霉毒素的测定；g b 仉8 9 7 9 嬲 乳和乳糟中黄曲霉毒素m ，的测定 g b m 8 9 8 0 - 2 0 0 3 8 虾受m i 污染情况调查及产a f 菌检测技术的初步研究 1 2 1 1 薄层层析色谱法 薄层层析色谱法( t l c ) 是前几年国内外测定食品及饲料中黄曲霉毒素的主要 方法，不少国家己把该法作为法定方法我国检测各类粮油食品及饲料中的a f b l 时一般也采用这种方法，所有有关的旧版国家标准( g b2 0 0 9 2 2 - 8 5 、g b 2 0 0 9 2 3 8 5 、g b2 0 0 9 2 4 - 8 5 、g b8 3 8 1 8 7 ) 都是依据该原理设计的1 1 晡单向展 开和双向展开法，其中双向展开法能进一步除去样品中的杂质，提高灵敏度，此 外，它省略了柱层析等净化操作步骤。王盛良等( 1 9 9 6 ) 人应用双向t t c 法对5 0 0 份酱油、调料、啤酒等食品中的a f b l 进行了检测，其中1 0 份阳性样品的检测结 果与国标检测结果相比没有显著差异，样品的平均添加回收率为1 0 0 4 4 。d u t t a 等( 2 0 0 1 ) 用1 1 c 法对印度北部地区2 5 6 份饲料样本中a f b i 含量进行了检测，结 果显示其中7 6 饲料样本中a f b i 含量平均在4 1 2 * 1 5 4p p b ，比印度法定的最高限 量3 0p p b 高阳性样品或假阳性样品从预展到定量、确证在- - ：t 央5 c m , x 1 5 锄的层 析板上即能完成，大大简化了a f b l 的检测程序，具有省时省样，操作简单，效 果比较理想的优点，缺点是检铡的灵敏度不高，当a f e h 含量较低时不易检出 1 2 1 2 高效液相色谱法 高效液相色谱法( m - l c ) 具有高分辨率、分析时间较短等优点这一检测 方法将化学分析试验与计算机技术相结合，使自动化程度得到极大的提高，在试 验空间、人力和仪器都保持不变的情况下，能检测更多的样品目前，不少研究 人员采用了免疫亲和柱与高效液相色谱相结合的方法检测黄曲霉毒素，即采用单 克隆抗体免疫亲和技术作为直接从样品中分离提纯黄曲霉毒索的特效手段，提取 液挥发干后，经衍生用h p i , c 荧光检测器测定不少研究人员采用此法分别测定 了牛奶、黄酒、小麦和果仁中的黄曲霉毒素，试验结果都比较理想测定牛乳中 的a f m l ，其检出低限达到0 0 5p p b , 测定果仁中的a f b l ，其检出低限达到0 1p i , b 这都充分说明高效液相色谱法灵敏度高，适用于微量检测 1 2 1 3 酶联免疫吸附法 9 谢红梅中山大学硕士学位论文 酶联免疫吸附法( e i j s a ) 是将抗原抗体反应的特异性与酶底物显色反应的 高效催化作用有机结合而成的免疫学技术，e l i s a 力 法用来检测黄曲霉毒素开辟 了黄曲霉毒素分析的新领域。自上世纪7 0 年代用于真菌毒素检测以后，美、英、 德、日等国很快竟相开展了这方面的研究，1 9 7 7 年即有抗黄曲霉毒素b l 的单克隆 抗体问世，时至今日，几乎所有重要真菌毒素的单克隆抗体免疫检测方法均己建 立。国内最早研究真菌毒素免疫检测方法的是中国医学科学院肿瘤研究所的孙宗 棠，他于1 9 8 3 年建立了a f b l 单克隆抗体放射免疫测定方法。1 9 9 2 年，中国科学 院上海细胞所李永镛和上海医科大学公共卫生学院殷芬、俞顺章等人合作建立了 a f b l 单克隆抗体的e l i s a ： 佥测方法。中国预防医科院营养与食品卫生研究所和江 苏微生物所也先后建立t a f b l 多克隆抗体的e u & 蝴4 定方法。北京市营养源研究 所路戈与中国医科院肿瘤研究所王德斌和卫生部食品卫生监督检验所计融等人 合作于1 9 9 4 年建立了规范的a f b l 单克隆抗体酶联免疫检测方法，该法已列为国 家标准( g b ，r 5 0 0 9 2 2 - - 1 9 9 6 ) 。该方法的建立和试剂盒的研制成功，为各有关行 业和质量监控部门提供了可靠、快速、规范的检测方法，使我国的a f b l 测定提 高到一个新的水平。 杜平华等( 1 9 9 5 ) 应用问接竞争酶联免疫吸附法测定了1 2 1 个品种1 5 5 批不同 剂型，不同品种的中药材中黄曲霉毒素的含量。任风兰等( 1 9 9 r 7 ) 采用标准化试 剂盒通过对5 5 批不同品种的中药材及含豆豉、曲类的中成药制剂污染a f b l 的含 量测定，检出含 a f b l 的中药5 3 批，检出率为9 6 。宓晓黎等( 1 9 9 8 ) 利用e l i s a 试剂盒测定了食品、饲料等样品中的a f b l 含量。其结果与t l c 法比较有较好的 相关性。且灵敏度高于 i i l - = i 去1 6 嘴。 1 2 1 4 放射免疫测定法 放射免疫测定法与e i j s a t y 法的原理相同，唯标记物不同，前者标记物为放 射性元素，后者标记物为酶，一般采用的放射性标记元素为氚( 3 d 。方法是将毒 素姐标记物与样品加抗体进行竞争性结合，除去未结合的部分，测定其放射性， 放射性强则说明样品中毒素含量低，反之毒素含量高。 1 0 虾受 f b i 污染情况调查及产a f 菌检澍技术的初步研究 1 2 1 5 微柱筛选法 微柱筛选法可用于大量样品的过筛，亦可进行半定量测定各种食品中黄曲霉 毒素b 1 、b 2 、g l 、g 2 总量该法主要利用硅镁型吸附剂( 脯n ) 吸附黄曲霉毒素 后，在3 6 5 n m 波长紫外光灯下呈蓝紫色荧光带，再与系列定量标准液的微柱管比 较进行半定量，其灵敏度为5 1 0p p b ，回收率在9 0 以匕但需要用其它的分析 方法进一步测定确认微柱筛选法特别适用于大批量样品的快速筛选测定，能迅 速可靠地筛去大量阴性样品，以便只对极少数超标样品进行测定主要是用来检 验黄曲霉毒素的存在与否以及快速筛选出超标样品，而要对黄曲霉毒素种类进行 区分定量检验，则需要对不同毒素组分进行分离，因此，微柱法并不能完成整个 检测过程，仅适用于定性检测 1 2 1 6 生物传感器法 利用竞争酶免疫反应原理设计的黄曲霉毒素传感器，由氧电极和黄曲霉毒素 抗体膜组成，将一定量的过氧化物酶标记的黄曲霉毒素加到待测试样中。酶标记 的及未标记的黄曲霉毒素会与膜上的黄曲霉毒素抗体发生竞争反应，测定标记黄 曲霉毒素与抗体的结合率便可知食品中黄曲霉毒素的含量( 高志贤等，1 9 9 5 ) 对黄曲霉毒素b l 的检出限为0 8 弘g m l ，不仅测定时闻短，而且灵敏度高。但目前 的生物传感器还存在稳定性差、性价比低和使用寿命短等缺点，此外，检测对象 成分的复杂性也使得生物传感器在食品检测中的应用受到制约 1 2 1 7 质谱法 f r i e d l i 建立了质谱法，其中黄曲霉毒素m l 的检出限为1 鸺，并对提取试 样进行简单的净化，如蒸干后再溶于甲醇水( 1 ：2 ，v r ) 溶液中，可去除其他污染物 的干扰w d l i a m 建立了两种质谱法分析农产品和生物体液中的黄曲霉毒素，其 一为经薄层色谱等净化过程的质谱分析，检出限约为1 0 5 0r i g ；其二为 h r s i m ，可直接进行混合组分的分析，并且较e i 法灵敏度提高1 倍以上 n 谢红梅中山大学硕士学位论文 1 2 1 8 生物体检测法 包括用光学显微镜追踪观察黄曲霉菌丝在部分组织的创伤位点及位点周围 小穗的生长情况的光学显微镜检测法和利用能产绿色荧光蛋白的菌株来研究黄 曲霉感染植物的部位或途径，以及检测菌数量的增加等的荧光检测法( s m a r t 等， 1 9 9 0 ) 等。 1 2 2 目前最常用的几种黄曲霉毒素检测方法比较 2 0 0 4 年，有学者用液相层析法( l c ) 、薄层层析法( 1 r i c ) 和酶联免疫吸附 法( e u s a ) 三种检测方法对密西西比河三角洲农作物和土壤中的a f b l 进行了分 析和检测，结果表明，如果不需要精确的化学定量分析，从时间和花费的角度来 说最好的方法是1 1 c 法，但e l i s a 的检测灵敏度最高而且能准确定量。 1 r i c 法不需要专用仪器，检测成本低，易于普及，所以国内外仍在使用。其 缺点是：1 ) 操作繁琐，集中处理样品时工作量大；2 ) 必须使用黄曲霉毒素标准品 且所使用的标准品浓度较高，对操作人员的身体有危害及具有较高的潜在污染 性；3 ) 灵敏度差，该法属目测半定量法，最低检出量为5p p b ，与毒理安全剂量( 约 为0 0 1p p b ) 相差很大。样品前处理繁琐，如果提取和净化效果不够理想，提取 液中杂质较多，在展开时就会影响斑点的荧光强度，而双向展开虽可避免杂质干 扰，但增加了操作步骤和时间。 h p l c 是近几年发展起来的检测方法，该法的优点是特异性强、灵敏度高、 定量准确。缺点是所需色谱仪、积分仪等价格昂贵，而且样品前处理复杂，建立 方法比较困难，不适合检测大量样品，操作时需要专门的技术人员，技术水平要 求较高，无法在基层使用。 基于抗原抗体特异性反应建立起来的酶联免疫吸附分析法0 u s a ) ，相比较 而言，具有特异性强、灵敏度高( 比薄层法灵敏度高5 0 0 倍，与h p l c 撒相当) 、分 析时间短的特点、样品前处理相对简单、一次可测定较多样本等优点。缺点是： 第一，专用试剂需低温保存。第二，若只用试剂盒检测个别样品时不经济。第三， 虽然可以使用对照标准曲线计舅t a v a l 含量，检测时可以不使用标准品，但会存 虾受a f b l 污染情况调查及产a f 菌检测技术的初步研究 在较大误差。第四，有时会有假阳性或假阴性结果，作为以抗原抗体反应为基础 建立的酶联免疫测定方法，在测定某些样品时会受到一些因素如p h i j 、重金属、 糖类、脂肪、蛋白质等的影响，从而出现假阳性或假阴性 这三种检测方法的灵敏度分别是t 1 r i a 去：用于国家标准检测的1 1 c 法，其灵敏度为5p p b ( g b 厂r 5 9 2 2 - 2 3 ) e l i s a ：用于国家标准检测的e l m a 试剂盒，其灵敏度为o o lp p b ( g 跗5 0 0 9 2 2 2 0 0 3 ) h p l c ：由于l 礤l c 的检测过程较为复杂，通常需要纯化，而为了增加其灵敏 度，通常采取了衍生的方法，因此，使用不同的纯化手段和衍生方法，其检测限 不同，检测限大约在0 0 1 - 21 腑如： 采用一般的固相萃取柱，检测限为：1p l , b ( s o b o l 盯等，2 0 ) ； 采用多功能净化柱( ，检测限为：0 5p p b ( w d s o n 等，1 9 9 1 s a k i y a m a 等，2 0 0 1 ) s 采用免疫亲和柱( i a q ，检测限为：0 0 2 - 1p p b ( s , z t t 等，1 9 9 7 d r a g a c d 等， 1 势5 ) ： 采用柱前三氟乙酸衍生高效液相色谱法，检测限为：0 0 1 2p p b ( a k i y a m 等，1 9 9 6 ；n a h j i m a 等，1 9 9 7 ；t m c k s e s s 等，1 9 9 1 ) s 采用柱后碘衍生高效液相色谱法，检测限为t1 - 1 5p p b ( r c c h 等，1 9 9 5 ； s c u d a m o r e 等，1 9 9 7 ) 比较检测黄曲霉毒素的t l c ，l 珥“痢e l i s a 法( 表1 _ 4 ) ，m j s a 法最适合于 批量检测，且灵敏度、特异性高，操作简单，安全，成本也较低 表1 i 三种黄曲霉毒素检溺方法比较 l ，2 、3 表示检测方法在各个性能上的捧名。 谢红梅中山大学硕士学位论文 1 3 产黄曲霉毒素菌检测方法的研究现状 1 3 1 分子检测 分子检测主要是利用黄曲霉毒素合成途径基因对农作物、食物中产黄曲霉毒 素菌株进行p