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透明颤菌血红蛋白基因的表达研究 专业遗传学 姓名：李昕指导教师：张义正教授 摘要 透明颤菌血红蛋白( h t r e o s c i l l ah e m o g l o b i n ，v h b ) 基因能在大肠杆菌中诱 导表达，在溶氧浓度下降时，它能使细菌细胞的生| 吏和蛋白质合成速度不会 受到太大影响。本实验室曾从环状芽孢杆菌( b a c i l l u se i r c u l a n s ) c 一2 中克隆 到几丁酶基因。该基因能在大肠杆菌中表达，并将几丁酶分泌到胞外。为了 进一步提高几丁酶基因在大肠杆菌的表达，将透明颤菌血红蛋白基因( v g b ) 插入到几丁酶基因表达质粒p c h i 后转入大肠卡1 蔺j m l 0 9r hv g b 耘因的表 达促进了转化菌的生长和提高了几丁酶基因的表达，溶氧水平越低，作用越 显著。在通氧最差时( 1 5 0 m l 7 0 r p m ) ，两者可相差1 2 1 。此外，v g b 基因的 表达与几丁酶的分泌有一定的正相关关系。 由于v g b 基因启动子不能在枯草杆菌中唐动表达，因此，根据已发表的 果聚糖蔗糖酶綦因( s a c b ) 序列设计引物，从枯草杆菌w b 6 0 0 总d n a 中 扩增出该基因的启动子片段，然后将其与v g b 基因编码区及终止子序列相连， 成功地组建了s a c v g b 融合基因。经s d s p a g e 和c o 差异光谱检测，该融 合基因在大肠杆菌中不经蔗糖诱导就可以表达。将s a c v g b 基因克隆到大肠 杆菌- 丰占草杆菌穿梭载体p s u g v 4 中，获得重组表达质粒p s u s a c v g b ，然后 转化枯草杆萄w b 6 0 0 ，转化予经2 蔗糖诱导，该基因在枯草杆菌中表达。 关键词：透明颤菌血红蛋白基因：大肠杆菌；枯草杆菌；果聚糖蔗糖酶基因 启动予克隆：基因表达 s t u d i e so nt h e e x p r e s s i o n o fv i t r e o s c i l l ah e m o g l o b i n g e n e m a j o r ：g e n e t i c s s t u d e n t ：x i nl i m e n t o r ：p r o f y i z h e n gz h a n g a b s t r a c t ar e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dw a sf i r s tc o n s t r u c t e db yi n s e r t i n gt h e h t r e o s c i l l ah e m o g l o b i ng e n e ( v g b ) i n t ot h ep l a s m i dp c h i ，w h i c hc o n t a i n st h e c h i t i n a s eg e n ec l o n e df r o mb a c i l l uc i r c u l a n sc 一2 t os t u d yt h ee f f e c to fv h b o n c e l l g r o w t ha n dc h i t i n a s ep r o d u c t i o n ，t h ee x p r e s s i o np l a s m i dw a st r a n s f o r m e d i n t oe s c h e r i c h i ac o l ij m l 0 9 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fv g bg e n e c o u l di m p r o v ec e l lg r o w t ha n de n h a n c et h ep r o d u c t i o no fc h i t i n a s ew i t h1 2 1 h i g h e r t h a nt h a to fc o n t r o lu n d e rd i f f e r e n td i s s o l v e do x y g e nc o n c e n t r a t i o n s b e s i d e s ，v g bg e n ee x p r e s s i o na l s oi n c r e a s e d t h ec h i t i n a s es e c r e t i o n i no r d e rt om a k et h ev i t r e o s c i l l ah e m o g l o b i ng e n ee x p r e s si nb a c i l l u s s u b t i l i s ，a ni n d u c i b l ep r o m o t e r ( l e v a n s u c r a s e ) w a s c l o n e df r o mb s u b t i l i s w b 6 0 0a n dl i g a t e dw i t hap r o m o t e r l e s sv g bg e n e t h er e s u l t e dg e n ei sc a l l e d s a c v g ba n dw a sd e m o n s t r a t e dt oe x p r e s si ne c o l ib ys d s - p a g ea n dc a r b o n m o n o x i d eb i n d i n ga s s a y t h es a c v g bg e n ew a st h e nc l o n e di n t oe c o l i b s u b t i l i s s h u t t l ev e c t o rp s u g v 4a n dar e c o m b i n a n tp l a s m i dn a m e dp s u - s a c v g bw a s c o n s t r u c t e d a f t e rt r a n s f o r m a t i o nw i t h 且s u b t i l i sw b 6 0 0 ；t h et r a n s f o r m a n t s s u c c e s s f u l l yp r o d u c e dv h bi n t r a c e l l u l a r l y t h ei n f l u e n c eo f v h bo nb s u b t i l 括i s u n d e ri n v e s t i g a t i o n k e y w o r d s ：h t r e o s c i l l ah e m o g l o b i ng e n e ；e s c h e r i c h i ac o b ；b a c i l l u s s u b t i l i s l e v a n s u c r a s eg e n e ；p r o m o t e r c l o n i n g ；g e n ee x p r e s s i o n 6 透明颤菌血红蛋白基因的表达研究 1 引言 血红蛋( h e m o g l o b i n ) 是那些带有血红素并能与氧可逆结合的蛋白。血 红蛋白通常位于脊椎动物血液红细胞中，但现在发现它广泛存在于生物界 中，在原核生物、真菌、植物及动物中都可以找到【2 3 1 。血红蛋白在高等真核 生物中的主要功能是携氧已得到了公认。但在原核生物中，这些含有血红素 蛋白的具体作用尚未完全确定。2 0 世纪7 0 年代，美国科学家t y r e e 等在一 种叫做透明颤菌( 1 q t r e o s c i l l a ) 的专性好氧菌中发现了血红蛋白。透明颤菌 是一种革兰氏阴性丝状专性好氧菌，属b e g g i a t o e 族，习惯生长于泥塘腐叶 等贫氧环境中。为了解决自身生长的需氧问题它能够诱导合成一种可溶性的 血红索蛋白。该蛋白为同型二聚休，亚基分子量为1 5 7 k d ，各含有一分子 的b 型血红素。它无论在光谱学性质、结构及氧合动力学性质与真核生物血 红蛋白极为相似，因此正式命名为l o t r e o s c i l l a h e m o g l o b i n ，简称v h b 【4 4 l 。 1 9 8 8 年，v g b 基因被成功克隆，并在大肠杆菌中得到表达1 2 1 , 2 7 1 。在大肠 杆菌表达实验证明它能明显促进细胞在微氧条件下的生长和蛋白质合成能 力【2 引。最初的研究表明，在大肠杆菌中，v g b 基因的表达和启动予活性受氧 调控1 2 9 】。后来，w e b s t e r 等人将启动子与报告基因c a t ，) t y l e 融合时，这些目 标基因的表达也受氧调控f 4 6 】。同时，f n r 、c r p 也参与协调v g b 基因启动子 的氧调控。k h o s l a 和b a i l e y 发现大肠杆菌r 1 1 表达的v h b 有3 5 4 5 分泌在 周质空问【3 0 1 ，这意味着它的细胞定位有助于氧向宿主细胞的运输。最新的研 究表明v h b 在胞内的定位有助于提高氧向细胞的传递【3 9 1 。尽管v h b 的作 用机理还需要进一步研究，但大多数证据显示：v h b 是以氧合态参与和氧有 关的代谢，通过将氧传递给呼吸链，而调节末端氧化酶的活性，改变氧化磷 酸化的效率，进而改变低氧条件下的代谢途径，以至影响到某些基因的表达 4 2 - 4 3 , 4 7 】。 虽然在基因调控和蛋白质功能方面v h b 的研究还有许多问题有待于进 一步解决，但v h b 应用研究得到广泛开展，尤其是其自身功能开发方面。 微生物在低溶氧条件下的生理活性通常与通气或无氧条件下的细胞不同。许 多事实表明，低溶氧水平将改变细胞生理学。同时，生物反应器的空间多相 性有可能导致极低的溶氧水平，因此在大规模细胞培养或高密度发酵如补料 分批培养和固定化细胞系统中，供氧问题尤为突出。解决该问题的传统方法 一般都局限于提高细胞生长环境中的氧气传递性质。其中包括通入纯氧、通 气搅拌优化配置以及通过加入化学物质如正十二烷或全氟碳( f o r a n e f 6 6 1 来增加液相中氧气的溶解度：解决氧需求问题的另一途径则是利用基因工程 技术来提高细胞自身对氧气的利用率。v h b 蛋白的存在是透明颤菌能在贫氧 环境f q i 存，在大肠杆简中的表选也促进了细胞存微瓴状态的生k 和蛋向质 合成。利用v h b 在其它菌种中外源表达这一基因策略来解决好氧生物发酵 过程中的供氧问题具有很大的科学意义，并可能带来巨大的经济效益。透明 颤菌血红蛋白越来越多地应用在微生物工业的许多领域，在短短二十年中取 得了明显的效果。 目前，v g b 基因在假单孢菌( p s e u d o m o n a s ) 酵母( s a c c h a r o m y c e s ) ， 欧文氏菌( e r w i n i a ) 和链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) 等获得了表达，7 只1 8 ，3 4 3 5 47 1 。v g b 在a 一淀粉酶基因工程菌中的表达可将细胞密度和a 一淀粉酶产率提高为1 4 和3 3 倍 9 , 4 1 】。v g b 在链霉菌中的表达可促进菌体生长：v g b 还能有效提高头 孢菌素c 在顶头孢霉菌中的产量【2 0 1 。另外有些发酵过程产物合成对氧十分 敏感，给发酵过程控制带来困难，而v g b 的表达可降低产物合成对氧的敏感 性降低过程能耗，这已在青霉素酰化酶基因工程菌的发酵实验中得到证实 1 1 0 】。现在，v g b 基因已经在动物细胞及高等植物中( 烟草、矮牵牛) 表达， 也取得了显著效果附4 ，3 町。 在众多外源基因表达系统中，以大肠杆菌为宿主菌已成为原核基因工程 中最具有吸引力的表达系统之一。该宿主菌遗传背景清楚，生长迅速，周期 短，可进行低成本高密度发酵。大肠杆菌缺少一个真正的分泌系统，一般情 况下，外源基因在大肠杆菌中的表达产物只能分泌到胞周间质。本实验室曾 从环状芽孢杆菌( b a c i l l u sc i r c u l a 船) c 2 菌株中克隆到几丁质酶基因( c h i l ) i s t3 。与其它几丁质酶不同的是，该酶完整的分泌信号肽可在大肠杆菌中将 几丁质酶分泌到胞外。因此，本研究考察了透明颤菌血红蛋白基n ( v g b ) 旺i l 对基因工程菌中合成和分泌几丁质酶的影响。 芽孢杆菌是一类传统的工业生产菌，多种分泌的蛋白是重要的酶制剂。 芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌，细胞壁不含内毒紊，能形成芽孢。自1 9 5 8 年 s p i z i z e n 发现枯草杆菌1 6 8 菌株能摄取外源基因以后，随着d n a 重组技术 的发明特别是金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 带抗性标志的质粒可 作为其载体的发现，芽孢杆菌基因工程的工作迅速发展。特别是枯草杆菌， 它作为很有吸引力的外源基因表达的宿主，有以下一些优点：非致病的土 壤微生物，不像大肠杆菌那样具有热源性脂多糖；有一套较成熟的分子生 物学操作方法利工具：建立了比较成熟的转化方法：很多噬菌体和质粒适合 于用作克隆载体。本实验室成功构建了的大肠杆菌一枯草杆菌穿梭载体 p s u g v 4 1 3 1 ；分泌蛋白能力强，当分泌蛋白跨过细胞膜后，就被加工和直 接释放到培养基中，这使得回收和纯化目的蛋白较为简单：良好的发酵基 础和生产技术。但在工业生产中需氧芽孢杆菌的需氧问题往往也成为获得 高产量的限制条件之一。如短小芽孢杆菌( b a c i l l u sp u m u l i s ) u n 3 i - c 4 2 为 本室分离并保存的一株蛋白酶高产菌株，它由b a 0 6 诱变所得，其胞外碱性 蛋白酶活性高。特别值得注意的是，该菌株的发酵液脱毛效果很好，且胶原 水解活性低，在皮革工业中有很好的应用前景1 2 1 。我们在对该菌株进行中试 发酵实验时，发现当细胞生长进入指数后期，由于细胞大最增巯，需氧最增 大，不仅需要增大搅拌的速度，还因为搅拌产生大量泡沫而影响发酵。如果 能将透明颤菌血红蛋白基因导入芽孢杆菌中表达，以此解决溶解氧问题应是 一种好办法。同时，虽然芽孢杆菌蛋白质分泌机制需进一步研究，但是有实 验表明，胞外蛋白分泌量和菌株通氧量有密切的关系。如a r b i g e 研究显示， 碱性蛋自酶的分泌和枯草杆菌的通氧率有联系。在商通氧条件下，胞外蛋白 酶产量可提高4 倍1 1 4 。 透明颤菌为革兰氏阴性菌，而芽孢杆菌为革兰氏阳性菌。而两者在转录 和翻译的起始、终止机制上有所差别。目前已知，枯草芽孢杆菌对s d 序列 及其侧翼序列有很严格的要求【1 邓”。外源蛋白要得到表达，多数需要更换适 合在芽孢杆菌表达的启动子。k a l l i o 和b a i l e y l 2 s l ：将v g b 基因带入枯草芽孢卡t 菌表达。他们将该基因置于枯草芽孢杆菌噬菌体s p a c 的启动子和s d 序列后 9 在枯草芽孢杆菌得到表达，实验证明在微氧条件下，v g b 的表达提高了蛋白 的分泌量和蛋白酶产量1 2 1 。经我们初步观察，也没有检测到v g b 基因在枯草 杆菌中直接表达。所以在本实验，更换了v g b 基因启动予，采用来自枯草芽 孢杆菌诱导型启动子来表达v g b 基因。 2 材料与方法 2 1 菌株和质粒 实验中所用菌株和质粒见表1 ，所用载体的物理图谱见图1 - 3 。 表1 本研究所用的菌株和质粒 s t r a i n sa n dp i a s m i d s c b 8 r a c t e r i s t i c ss o u r c e s s t r a i n s e s c h e r f c h i ac o l f j m l 0 9 b a c i l l u ss u b t i l i s w b 6 0 0 p l a s m i d s s u p e 4 4 ，h s d r l 7 ，r e c a l ，e n d a l ，g y r a 4 6 ， t h i ，r e l a1 ，l a c ，f p r o a b + , 肠c j q ，l a c z ，a m 1 5 ，t n l 0 ( t e t ) 】 n p r e ，a r p a ，e p r ，b p f , m p r ，n p r b ，c m 7a n d u s e df o rs a c bp r o m o t e rc l o n i n g p u c l 82 ；7 k b ，a m p f l a c z q p c h i 5 6 k b c h i l d n k d l p m d l 8 _ t 3 ，5 k b ，v g b 2 8 k b ，a m p 。l a c z t h i sl a b t 6 j p r o v i d i n gb y d r w o n g l 4 8 】 t h i sl a b l 6 】 t h i sl a b l 8 i a g i f t o f d r s t a r k t 2 1 1 1 a k a r a 5 9 k b ，a m p 。k a n l a c za 。e c o l t - 丑 。 p s u g v 4 t h i sl a b s u b t i l i ss h u t t l ev e c t o r o ，m d l 图1p u c l 8 的物理图谱 h i n d i 【t 5 口 i ，j s a ! i e c o r v t _ c i o n l n g 船口l b d 卅h j s m a ! k p n l s a c l e c o r l 圈2p m d l 8 - t 载体的物理翻谌 图3 p s u g v 4 穿梭载体的物理图谱 “ 2 2 培养基 1 ) l b j ：黼( 1 0 0 0 m l ) 1 6 1 胰蛋白胨 1 0 9 酵母粉 5 9 2 ) l m 培养基( 1 0 0 0 m l ) 【6 】 胰蛋白胨 1 0 9 酵母粉5 9 用1m o l l n a o h 调至p h 7 5 3 ) s o b 培养基( 1 0 0 0 m l 、 6 1 胰蛋白胨 2 0 9 酵母粉 5 9 + 1 0 0 m 9 2 + 1 0 m l n a c i 1 0 9 用l m o l ln a o h 调至p h 7 5 n a c l m g s 0 4 n a c l k c l o 5 8 9 2 4 6 9 0 5 8 9 o 3 8 9 用1m o l l n a o h 调至p h 7 0 + 1 0 0 x m 9 2 + ( 1 0 0 0 m l ) m g c l 2 6 h 2 02 0 3 3 9m g s 0 4 7h 2 0 2 4 6 5 9 4 ) s o c 培养基【6 】：s o b + 2 0 m m o l l 葡萄糖 5 ) m d 培养基( 1 0 m l ) 3 1 - 3 2 2 6 ) m m c h 培养基 3 - 3 2 1 加d d h 2 0 至n 1 0 0 m l 2 3 实验方法 2 3 1 芽孢杆菌总d n a 的分离和提取1 6 i 接一环斜面活化的菌株于5 0m l 的l b 培养基中，3 7 振荡培养1 2h ， 以4 , 0 0 0r i o m 离心1 0 m i i b 弃上清液。用溶液i ( 1 0g l 葡萄糖，5 0 m m o l l e d t a p h 8 0 2 5m m o l l t r i s - h c ip h 8 0 ) 洗涤菌体一次，加少量裂解液( 1 葡萄糖，5 0m m o l le d t a p h 8 0 ，2 5m m o l l t r i s h c ip h 8 0 ，1 m g m l 溶菌 酶) 悬浮菌体，再补充到总体积为4 m l 充分分散菌体，。予3 7 摇床轻缓摇 动l h 。再加入1 1 0 体积1 0 s d s ，混匀置于6 0 水浴保温至透明澄清为止。 再加入3 m l t e 缓冲液稀释菌体裂解物，然后用等体积的饱和酚、酚氯仿 ( 1 1 ) 、氯仿异戊醇( 2 4 1 ) 各抽提一次。取上清液加入1 1 0 体积的溶液i i l ， 然后加入2 倍体积的2 0 冷乙醇沉淀d n a 。用玻璃棒挑出，用7 0 的无水 乙醇洗涤2 次，置于室温使之自然干燥。将沉淀溶于适量的含l opg m l r n a s e a 的t e 缓冲溶液中。 2 3 2e c o l i 中质粒的提取1 6 l 2 3 2 1 质粒的大批量提取 接种e c o l i 单菌落于5 0m l 的l b 培养基巾，3 7 。c 振荡培养1 2 1 5h 。 培养葡液倒入5 0 m l 离心符巾4 ，0 0 0r p m 离心1 0 m i n ，弃l ：浦液。：j j | | 入3 m i 。 溶液i ( 1 0g l 葡萄糖，5 0m m o l le d t a p h 8 0 ，2 5m m o l lt r i s h c lp h 8 0 ) ， 充分混合，置于室温下5m i n ，加入6m l 溶液i i ( 0 2 m m o l ln a o h ，s d s1 0 g l ) ，轻轻混匀，冰浴5r a i n ，加入4 5m l 预冷的溶液i i i ( 3 m o l l k a c h a e ，p h 4 8 ) ，混匀后冰浴1 0m i n ，4 ，0 0 0r p m 离心1 0m i n ，取上清液于 另一5 0 m i n 离心管中，加入2 7 m l 一2 0 的无水乙醇，2 0 。c 静簧3 0 m i n ，4 ，0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 后弃上清液，3 7 干燥3 0 4 0r a i n ，沉淀溶于1m l1 0m m o l l ir i s h c i ( p h 7 5 ) 缓冲液或t e 缓冲溶液中，加入2 “l1 0 9 lr n a s ea ，置于 3 7 。c 处理3 0m i n 。将溶液分装于两个1 5m l 的e p 管中，依次用等体积的苯 酚、苯酚：氯仿( 1 ：1 ) 、氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 各抽提次后，按1 1 0 的体积比加入溶液i i i ，然后加入2 倍体积的一2 0 冷乙醇，2 0 静置3 0r a i n ， 1 0 ，0 0 0r p m 离心1 0m i n ，弃上清液，用7 0 的无水乙醇洗涤两次，3 7 。c 干燥 3 0m i n ，溶于5 0 0 pl 无菌超纯水或t e 缓冲液中。 2 3 2 2 质粒的小批量提取 接利te c o l i 单菌落于装有2m l 的l b 培养基的试管中，3 7 。c 振荡培养 1 2 15h 。将培养液倒入1 5m l 的e p 管中，1 0 ，0 0 0r p m 离心1 2m i n ，弃去 上清液，加入0 1m l 溶液i ，充分混匀后室温下静置5r a i n ，加入0 2m l 溶 液i i ，混匀后冰浴5r a i n ，加入0 1 5m l 溶液i i i ，混匀后冰浴1 0r a i n ，1 0 ，0 0 0 r p m 离心5r a i n ，取一k 清液加入两倍体积的无水乙醇，混匀后于。2 0 静罱 1 5r a i n ，1 0 ，0 0 0r p m 离心5m i n ，在3 7 下干燥2 0r a i n ，溶解于5 0hld d h 2 0 或t e 中，加入约1 肛gr n a s e a 后置于3 7 。c 处理3 0r a i n ，按1 1 1 0 的体积比 加入溶液i i i ，然后加入2 倍体积的2 0 c 的冷乙醇，- 2 0 ( 2 静置1 5m i n 。1 0 ，0 0 0 r p m 离心5m i n ，弃上清，用7 0 的乙醇洗沉淀2 次，于3 7 干燥3 0 m i n ， 溶于5 0u l 无菌超纯水或t e 缓冲液中。 4 2 3 3e c o l i 的质粒转化1 6 2 3 3 1 标准转化法 接种e c o l i 于2m ls o b 培养液中，3 76 c 振荡培养过夜，取0 5m l 培养 菌体接种于5 0m ls o b 培养液中，于3 76 c 振荡培养2 2 5 h ( o d 5 5 。值约为 0 4 0 5 ) 。将培养液倒入5 0m l 离心管中，冰浴1 0m i n ，4 ，0 0 0r p m 离心1 0m i n ， 弃上清液，加入1 7 m l 预冷的t f b 溶液( 1 0 0 m m o l l k c i 、4 5 m m o l l m n c i ，1 0 m m o l l c a c l 2 ，1 0m m o l lk m e sp h6 2 ) 洗涤菌体一次，离心弃上清液，加 入4m lt f b 制成悬液，冰浴1 0m i n 后加入1 4 0 ul 二甲基距砜( d m s o ) ， 在冰浴上轻轻转动5m i n ，加入1 4 0ulb 巯基乙醇，于冰涤上轻轻转动1 0 m i n ，再加入1 4 0 ul 二甲基亚砜( d m s 0 ) ，轻轻混匀后在冰浴上静置5r a i n ， 即得感受态细胞。 在预冷的e p 管中加入l - l o ul 质粒d n a ( 对于连接d n a ，样品应稀 释5 倍后作转化) ，加入2 0 0 t al 上述感受态细胞，混匀后在冰浴上静簧3 0 r a i n ，4 2 水浴热冲击3 0s c c ，冰浴上放露2r a i n ，加入0 8m ls o c 培养液。 篝于3 7 振荡培养lh 取o 1m l 涂布于加有抗生素的l m 培养基平板上， 3 7 培养过夜。若转化子很少，特别是连接d n a 的转化，可将转化细胞离 心5m i n ( 4 ，0 0 0r p m ) ，收集菌体，去掉上清液，把所有的菌体涂布在含适当抗 生索的培养基上。 2 3 3 2 高频转化法 接种e c o l i 于2m ls o b 培养液中3 7 振荡培养过夜，取0 5m l 培养 菌液接种于5 0m ls o b 培养液中，于1 8 。c 振荡培养1 8 2 4h ( o d 铷约为0 5 ) 。 将培养菌液倒入离心管中，冰浴上静黉1 0m i n ，3 ，5 0 0r p m 离心1 0m i n ，弃 上清，加入1 6m l 预冷的t b 缓冲液( 2 0 0 m m o l l k c i ，5 4m m o l lm n c i ：，1 5 m m o l lc a c l 2 ，1 2 5m m o l lk m e sp h 6 2 ) ，3 ，5 0 0r p m 离心1 0m i n ，再加入 4m lt b 缓冲液悬浮菌体，加入2 8 0nld m s o ，混匀后鬣于冰浴上1 0m i n ， 按每管0 5 1 0m l 菌液分装到1 5m l 的e p 管巾立即将这些分装好的菌 液放入液氮中保存，至少1 0m i n 后才能取出使用。这些感受态细胞在液氮中 可保存3 个月以上，仍能保持良好的感受态。 l5 转化时从液氮中取出感受态细胞，置于冰浴上解冻，将1 2ul 质粒d n a 或连接产物和2 0 0 pl 感受态细胞在1 5 m l 的e p 管中混匀，冰浴3 0 m i n ， 4 5 热冲击3 0s c c 后立即置于冰浴上，加入o 8m ls o c 培养液，3 7 振荡 培养lh 。取0 ，1 m l 涂布在含适当抗生素的l m 培养基平板上，3 7 培养过 搜。若转化二r 很少，呵将转化刿胞离心收集闺体，全部涂前m ：禽朽通当批生 素的培养基上。 2 3 4 芽孢杆菌质粒的提取1 6 l 将含有质粒的枯草杆菌接种于装有2 m l 的l b 培养基( 含相应抗生素) 中，3 7 振荡培养9h 。将培养液倒入1 5m l 的e p 管中1 0 ，0 0 0r p m 离心 1 2r a i n ，弃去上清液，加入0 1m l 含i m g m l 溶菌酶的溶液i ，充分混匀后 冰浴中静置3 0r a i n ，加入0 2m l 溶液i i ，混匀后冰浴5r a i n ，加入o 1 5m l 溶液i i i ，混匀后冰浴1 5r a i n ，1 0 ，0 0 0r p m 离心5r a i n ，取上清液，加入两倍 体积的无水乙醇，混匀后于2 0 ( 2 静嚣1 5r a i n ，1 0 ，0 0 0r p m 离心5r a i n ，在3 7 下干燥2 0r a i n ，溶解于5 0 耻l d d h 2 0 或t e 中，加入约】“gr n a s e a 后置 于3 7 。c 处理3 0r a i n ，按1 1 1 0 的体积比加入溶液i l i ，然后_ i 1 1 1 入2 倍体积的- 2 0 的冷乙醇，2 0 。c 静置1 5m i n 。1 0 ，0 0 0r p m 离心5r a i n ，弃上清，用7 0 的乙醇洗沉淀2 次，于3 7 干燥3 0r a i n ，溶予5 0ul 无菌超纯水或t e 缓 冲液中。 2 3 5 枯草秆菌感受态转化1 3 啦 取少量菌种接种于2 m l l b + 3m m o t lm g $ 0 4 肉汤培养基中，3 7 。c 过夜 培养。使o d n 。= o 2 ，将o 1 m l 培养物接予5 m l l b + 3m m o l lm g s 0 4 肉 汤培养基中，3 7 ( 2 培养3 h 至o d 6 。= 1 。取o 5 m l 此培养物加入到1 0 m l m d 培养基中，然后于3 7 * ( 2 培养4 h ，以达到稳定期。最后取l m l m d 培养物， 加1ugd n a 混匀，3 t c 振荡培养1 5 h ，然后离心收集菌体涂布m m c h 平板。 2 3 6 限制酶切和凝胶电泳 d n a 的限制酶切采用各家供应商提供的缓冲液和推荐的方法：d n a 片 段大小的检测和分离采用适当浓度的琼脂糖凝胶常规电泳，并在紫外灯下或 凝胶分析系统( g d s ) 上观察并拍照记录。 2 3 7 载体的去磷酸化和d n a 连接 载体d n a 的去磷酸化和d n a 的连接反应依照供应商推荐的方法和提 供的缓冲液进行。 2 3 8d n a 片段的回收1 6 2 3 8 1 低融点琼脂糖凝胶回收法 将待分离的d n a 在l 的常规琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴乙锭染色 后在紫外灯下观察，在待回收的d n a 带前方挖一宽约为0 7e m 的小槽，陡度 略等于待分离的d n a 带，尽可能吸干槽内的电泳缓冲液，用1 的低融点琼 脂糖凝胶灌满小槽，完全凝固后再电泳数分钟，在紫外灯下观察，待所需的 d n a 带完全进入低融点琼脂糖内，就将此低融点琼脂糖凝胶切下，装入e p 管一i i 。鹄! 于6 5 水浴中使其完全融化。用等体积的3 7 苯酚、苯酚：氯仿( 1 ： 1 ) 、氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 各抽提一次，离心取上清，在上清液中加入1 1 0 体积的3m m o l lk a c ( p h 4 8 ) 和2 倍体积的无水乙醇，一2 0 沉淀4h 以上。 1 0 0 0 0r p m 离心1 0m i n 收集d n a ，7 0 的无水乙醇洗涤，干燥后待用。 2 3 8 2 液氮冻融法 将含有待回收d n a 的样品在o 5 的常规琼脂糖凝胶上进行电泳分离 澳乙锭染色后在紫外灯下观察，在紫外灯下观察，切下含有待回收的d n a 带的凝胶，放入1 5 m l e p 管中，加o 1m l t e 缓冲液，用枪头( t i p ) 将凝 胶弄碎。加入等倍体积的苯酚，用力摇匀，! 爵! 于液氮中冷冻2 - 3r a i n ，再放入 1 7 3 7 。c 水浴中，使其融化，混匀后在反复冻融二次，1 2 ，0 0 0r p m 离心1 0r a i n ， 上清液分别用苯酚、苯酚：氯仿( 1 ：1 ) 、氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 各抽提一次， 离- t l , 取上清，在上清液中加入1 1 0 体积的3m m o l lk a c ( p h 4 8 ) 和2 倍体 积的无水乙醇，- 2 0 c 沉淀过夜。1 0 ，0 0 0r p m 离心1 0r a i n 收集d n a ，7 0 的 无水乙醇洗涤干燥后待用。 2 3 9s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳1 6 i 2 3 9 1 试剂 1 1 聚丙烯酰胺母液 3 0 丙烯酰胺，o 8 亚甲双丙烯酰胺 2 、t r i s c i s d s ，p h 8 8 ，4 在3 0 0 m l h 2 0 中溶解9 1 9 t r i s 碱( 1 5 m 0 1 l ) ，用l m o l lh c i 调校至 p h 8 f 8 ，补加h 2 0 至5 0 0 m l 。再加入2 9 s d s ，于4 c 保存1 个月。 3 ) t r i s c i s d s ，p h 6 8 ，4 x 在4 0 m l h 2 0 中溶解6 0 5 9 t r i s 碱( o 5 m o l l ) ，用l m o l t lh c l 调校至 p h 6 8 ，补加h 2 0 至1 0 0 m l 。再加入o 4 9 s d s ，于4 c 保存1 个月。 4 ) s d s 电泳缓冲液，5 t r i s 碱( o 1 2 5 m o l l )1 5 1 9 甘氨酸( o 9 6 m o l l )7 2 0 9 s d s 5 0 9 加去离子蒸馏水至1 0 0 0 m l ，使用前稀释至l s d s 电泳缓冲液 5 ) s d s 样品缓冲液。6 4 t r i s c i s d s p h 6 ，8 2 5 m l 甘油 2 0 ( w v ) 】 2 0 m l d 订 3 1 9 加去离子蒸馏水至1 0 0 m l 并混匀 6 ) 染色液 甲醇 5 0 ( v v ) r 考马斯亮蓝r 2 5 0 o 0 5 ( v v 1 乙酸 1 0 ( v v 1 h 2 0 4 0 用去离子蒸馏水配制 7 ) 脱色液 乙酸 5 ( v v ) 甲醇 1 6 5 ( v v ) h 2 0 7 8 5 2 3 9 2 步骤 1 ) 按如下配方制备s d s p a g e 凝胶，加样。先1 0 m a 恒流电泳至分离 胶，再调为1 5 m a 恒流到电泳结束。 s d s p a g e 配方 2 1 将聚丙烯酰胺凝胶用固定液固定2 h 3 1 倾去固定液，以考马斯亮蓝染色液染色4 h 4 1 倾去染色液，加入脱色液，缓慢摇动脱色。中间更换脱色液，脱色到 获得蓝色带及干净的背景为止。 2 3 1 0p c r 扩增反应 在5 0ul 的反应体积中加入上下游引物各6 0 0 n m o l l ，d n t p s2 0 0u m o l l ，m 9 2 + 1 5 m m o l l ，t a q 酶1 5 u 。扩增条件为：9 4 交性3 m i n 后开始 循环，9 4 c 变性1 0 s ，退火1 0 s ，7 2 ( 2 延伸1 0 s ，3 0 个循环，最后演示延伸 1 9 l o m i n 。 2 3 1 1 几丁质酶活性的测定1 1 6 i 参照b o i l e r 的方法进行，在1 5 m l 的e p 管中加入0 0 1 m li m o l l n a a c ( p h 4 0 ) ，再加入0 i m l1 0 m g m l 的胶状几丁质和o 4 m l 几丁质酶液， 罱于3 7 振荡2 h ，以1 0 ，0 0 0r p m 离心2m i n 终止反应。取0 3 m l 上清液于 玻璃试管并加入o 0 3 m l1 m o l lk 3 p 0 4 缓冲液( p h 7 1 7 ) 矛t lo 0 2 m l1 2 0 m g m 乙 蜗牛酶于3 7 保温1 h ，再加入o 0 7m l1 m o l l n a 2 8 4 0 t ( p h 9 8 1 ，在沸水中加 热3 m i n ，立即放冰上冷却，最后加入2m ld m a b ( 储备液：8 9 对二甲氨基 苯甲醛溶于7 0m l 冰醋酸和1 0m l 浓盐酸中，使用时以1 体积的储备液和9 体积的冰醋酸) 混合。置于3 7 水浴保温2 0 m i n 。以0 1 m l 水代替几丁质进 行以上过程零对照。立即测定o d s s s ，该值大者几丁酶活性高。几丁质酶活 测定均为3 个平行样品其结果取其平均值。 标准曲线的测定：用一系列已知浓度的n 乙酰d 葡萄糖胺( s i g m a ) 3 0 0 ul 加0 0 7 m lo 5 t o o l ln a 2 8 4 0 t ( p h 9 8 ) 。在沸水中加热3 r a i n ，立即放冰上 冷却最后加入2 m l d m a b 试剂混合，置于3 7 水浴保温2 0 r a i n 。以0 1 m l 水代替几丁质进行以上过程零对照。立即测定o d s s 5 。以o d 5 9 5 为纵坐标， 以相应的n 乙酰d 葡萄糖胺量( pg ) 为横坐标，作标准曲线。 2 3 1 2 血红蛋白的光谱测定1 2 2 ，3 3 将细胞悬浮于磷酸钠缓冲液( p h 7 2 ) 中至终浓度3 0 m g m l 。加入还 原剂连二亚硫酸钠，通入c o ，2 m i n ( 一个气泡s ) 。测4 0 0 n m 。5 0 0 n m 光吸收 值。 血红蛋白的浓度为：c = o d ( l + e ) e 4 1 9 4 3 6 = 2 7 4 m m 。1 c m 1 光谱测量由s h i m a d z uu v 2 10 0 分光光度仪进行。 2 0 3 结果 3 1 透明颤菌血红蛋白对基因工程菌几丁质酶表达的影响 3 1 1 重组质粒的构建 质粒p n k d l 含有v g b 基因，经e c o r i 酶切后分离7 0 0 b p 完整v g b 基因片 段。 质粒p c h i 经同种酶酶切和脱磷酸化处理后与7 0 0 b p 片段相连接，构建 成含有e h i l 基因和v g b 基因的克隆p c v 2 3 ( 图4 ) 。重组质粒用e c o r i 酶切分 析，结果与预期相符：p c v 2 3 酶切后产生了两个d n a 片段，大片段与p c h i 长度相同，小片段长7 0 0 b p 。 e c o r l 分离7 0 0 b p 片段 图4 质粒p c v 2 3 暌及物理图谱 图5 重组质粒p c v 2 3 的e c o r i 酶切分析 、 h i d i i i e c o r h 2 、3 分刖为p c h i 和ip c v 2 3f 内e c o r l 酶切 4 、分子量标准物d l 2 ，0 0 0 ：2 0 0 0 ，1 0 0 0 ，7 5 0 ，5 0 0 ，2 5 0 ，1 0 0 b p 3 1 2v g b 的表达对基因工程菌生长的影响 将重组质粒p c v 2 3 和p c h l 分别转入大肠杆菌j m l 0 9 ；在2 5 0 m l 三角瓶 装入不同量的培养基( 5 0 m l 和1 0 0 m l ) ，并在不同转速( 1 0 0 和7 0 r p m ) 条 件下培养工程菌以模拟不同的供氧情况来研究两种细胞生长状况( 表2 、3 ) 。 图6 、7 比较了在不同通氧条件下，v g b 表达对基因工程菌生长的影响。 随着摇瓶装置的增大和转速的下降，菌株的生长受到了明显影响。在同一生 长条件下，细菌生长初期( 6 、1 2 h ) 的差异不大。但到培养中后期，特别是 对数生氏后期，含有质粒p c v 2 3 菌株的生长明显超过了对照组p c h i 。可见 在细 胞指数生长期，由于代谢水平激增，大景细胞灼有氯呼吸可导致溶氧水 平快速下降，而v g b 基因的启动子本身受溶氧水平的调控【4 6 1 ，所以v g b 的表 达随溶氧下降而增加，通过它的积累能增加细胞的通氧，有效地弥补供氧不 足，使菌株获得了较高的细胞密度。在这两种通氧条件下，菌株j m l 0 9 ：p c v 2 3 的最大光密度值比j m l 0 9 ：p c h l 分别高1 8 5 和1 9 8 。 值得一提的是，质粒p c v 2 3 比质粒p c h i 大，而且多一种外源基因的表 达但是含有质粒p c v 2 3 菌株由于v g b 表达克服了这些生长的不利条件， 获得较理想的生长。 表25 0 m l l o o r p m 培养条件下不同时间细胞生长光密度值 2 1 5 o 5 0 煎 一 6 1 22 4 3 0 3 6 发酵时问( h ) - 一p c h i - p c v 2 3 图6 $ o m l l o o r p m 培养条件下生长曲线 表31 5 0 m l 7 0 r p m 培养条件下不同时问