（遗传学专业论文）肌球蛋白x对神经轴突生长的调控.pdf

摘要 在神经系统发育过程中，新生神经元的轴突要经历一定的距离才能到达预定靶区， 与靶区神经元建立突触联系进而形成精密复杂的神经系统网络。神经元的正确迁移及其 轴突生长方向的精确导向是形成脑内神经细胞环路的基础。然而，轴突发育异常通常会 导致多种神经系统疾病，包括先天性智力障碍和癫痫等。因此，研究轴突生长的分子机 制对神经系统疾病的治疗具有重要的意义。 肌球蛋白x ( m y o s i nx ，m y ox ) 是肌球蛋白家族中的一个成员，1 9 9 4 年通过p c r 技术首次在内耳中克隆到m y o s i nx 的基因。m y ox 为脊椎动物所特有的一种动力蛋白， 在全身大多数组织中表达，包括神经组织。在许多体外培养的细胞系，如h e l a , h e k - 2 9 3 ， c o s 7 c a d 细胞，m y ox 定位在细胞丝足的顶端，承担着丝足间的运动，促进丝足的 形成和稳定。i m m u n o b l o t t i n g 实验结果显示，m y ox 在脑内显示出动态的发育模式：在 小鼠的大脑组织，m y ox 在出生后的5 天至1 5 天表达量达到高峰，而在成年期表达量 很低。神经系统许多发育事件发生在出生后的早期，包括突起的生长和突触的形成，m y o x 与丝足的密切关联，表明了m y ox 可能参与调节细胞骨架系统迸一步影响神经突起的 发育。 本实验采用体外培养的新生大鼠海马神经元作为模型来研究m y ox 对神经元轴突 和树突生长的调控作用。体外培养( d a yi ng i t r o , d i v ) 5 天的原代神经元，抗m y ox 抗体免疫荧光染色显示内源m y ox 在神经细胞的胞体、轴突和树突中都有表达，分别与 轴突标志蛋白t a u 1 和树突标志蛋白m a p 2 共定位。利用构建的鼠m y ox - s i r n a 表达 载体电转染分离的海马神经元，培养7 2 小时后，免疫荧光染色，共聚焦显微镜下观察， 表达s c r a m b l e - s i r n a 的神经元形成一个长的轴突和3 - - 5 个树突，呈现典型的锥体神经 元形态，表达m y o 测w 的神经元则表现为几个树突样分枝，未见典型的轴突表型。 磷酸钙转染法将m y ox - s i r n a 转染于体外培养4 8 小时的海马神经元( d i v 2 ，s t a g e 3 ) ， 继续培养4 8 小时后，免疫染色结果表明，神经树突减少，神经轴突未见明显差异。进 一步，用m y o 舶圾m 电转染海马神经元，体外培养5 天后，用轴突特异抗体a n t i t a u 1 免疫染色，发现在表达m y oz 叮，尼榭的神经元中，有许多神经元不再具有一个很长的 轴突样的突起，在所有突起中没有显示出可标记的t a u - 1 阳性染色，这类神经元占所有 表达m y oz 百i r n a 神经元的9 0 5 ，表明这些神经元极性特征已经丧失。综上所述，减 低内源的m y ox 的表达影响了神经元轴突的正常生长发育，甚至干扰了神经元的极性， 说明m y ox 是神经元的生长发育必需的调控因子。 关键词：肌球蛋白x ( m y ox ) ；神经细胞生长；神经元极性 a b s t r a c t d u r i n gt h ed e v e l o p m e n to fn e r v o u ss y s t e m ，a x o n so fn e w b o r nn e u r o nu n d e r g o ac e r t a i n d i s t a n c et ot h e i ra p p r o p r i a t et a r g e t s ，f o r ms y n a p t i cc o n t a c t sa n dt h e ne s t a b l i s ht h ep r e c i s e s o p h i s t i c a t e dn e t w o r ko ft h en e r v o u ss y s t e m n e u r o n sc o r r e c tm i g r a t i o na n dt h ea x o ng r o w t h d i r e c t i o n sp r e c i s eg u i d a n c ea r ef u n d a m e n t a lt od e v e l o p m e n to fb r a i nc i r c u i t r y h o w e v e r ，t h e a b n o r m a la x o nw i l lc a u s et h em a n yk i n d so fn e r v o u ss y s t e md i s e a s e s ，s u c ha sc o n g e n i t a l m e n t a lh a n d i c a p ，e p i l e p s y ，a n ds oo n t h e r e f o r e ，i ti sm o r es i g n i f i c a n tt or e s e a r c ht h e m o l e c u l a rm e c h a n i s mo fa x o ng r o w t hf o rn e r v o u ss y s t e md i s e a s e st r e a t m e n t m y o s i nx ( m y ox ) ，av e r t e b r a t e - s p e c i f i cm e m b e ro fm y o s i ns u p e r - f a m i l y , w a s d i s c o v e r e di ni n n e re a rb yp c ri n19 9 4 m y 0x ，a na c t i n - b a s e dm o t o rp r o t e i n ，w a sd e t e c t e d i nm o s tt i s s u e s ，s u c ha sk i d n e y , l i v e r , b r a i n , a n ds oo n m y 0xl o c a l i z e sa tt h et i p so f f i l o p o d i a , c a l lu n d e r g of o r w a r da n dr e a w a r dm o v e m e n tw i t h i nf i l o p o d i a , a n dp r o m o t e f i l o p o d i af o r m a t i o na n ds t a b i l i z a t i o n i th a sb e e nr e p o r t e dt h a tm y oxe x h i b i t sd r a m a t i c d e v e l o p m e n t a lr e g u l a t i o ni nb r a i n i nm o u s ec e r e b r u m ，f u l l - l e n g t hm y 0xe x h i b i tap e a ko f e x p r e s s i o nb e t w e e np o s t n a t a ld a y s5 - 15 ，w i t hm u c h l o w e re x p r e s s i o nl e v e l si nt h ea d u l t i nt h i ss t u d y , t h ec u l t u r e dn e w b o r nh i p p o c a m p a ln e u r o n sw a su s e da sam o d e lt os t u d y t h er o l e st h a tm y 0xp l a yi nr e g u l a t i n gt h eo u t g r o w t ho fa x o n sa n dd e n d r i t e s w h e nt h e c u l t u r e dh i p p o c a m p a ln e u r o n sw a si m m u n o l a b e l e df o rt h ea x o n a lm a r k e rt a u lo rd e n d r i t e m a r k e rm a p 2a t5d a y s nv i t r o ，m y 0xw a se x p r e s s e di nt h ea x o n , d e n d r i t ea n ds o m a , c o 1 0 c a l i z e dw i t ht a uli nt h ea x o na n dw i t hm a p 2i nt h ed e n d r i t e s ，r e s p e c t i v e l y d i s s o c i a t e d h i p p o c a m p a ln e u r o n sw e r et r a n s f e c t e dw i t hm y ox - s i r n ae x p r e s s i o n a lv e c t o r , a f t e r7 2h t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h el e n g t ho fa x o n sw a ss i g n i f i c a n t l ys h o r t e rt h a nt h a ti nt h ec o n t r o l n e u r o n s h o w e v e r , t r a n s f e c t i o nc u l t u r e dn e u r o na td i v2w i t he i t h e rs c r a m b l e - s i r n ao rm y o x - s i r n a ，a n dd e t e c t e dn e u r o n a lm o r p h o l o g ya f t e rt r a n s f e c t i o n2d a y s a l t h o u g ht h el e n g t ho f a x o n sw a sn o ts i g n i f i c a n t l yc h a n g e d ，t h en u m b e ro fn e u r i t e so nm y ox - s i r n an e u r o n sw a s l e s st h a nt h a to ns c r a m b l e - s i r n an e u r o n i na d d i t i o n , m o s tn e u r o n se x p r e s s i n gm y o x - s i r n an ol o n g e rp o s s e s s e das i n g l el o n ga x o n - l i k en e u r i t e ，r e s u l t i n gi nal o s so ft h e c h a r a c t e r i s t i cn e u r o n a lp o l a r i t y , e v e ni nt h e9 0 5 c e l l sd i dn o td i s p l a yd e t e c t a b l e t a ul l a b e l i n gi na n y n e u r i t e so fn e u r o ne x p r e s s i n gm y ox - s i r n a s o ，r e d u c t i o no fe n d o g e o u sm y 0 xc a nc a u s ea x o ng r o w t hd e f e c ti nh i p p o c a m p a ln e u r o n s ，h i n d e rt h ee s t a b l i s h m e n to f n e u r o n a lp o l a r i t y i ns u l n l n a r y ，m y 0xp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nr e g u l a t i n gt h eo u t g r o w t ho f a x o n sa n dd e n d t e s k e yw o r d s ：m y o s i nx ( m y 0x ) ；n e u r o n a lg r o w t h ；n e u r o n a lp o l a r i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：矬日期：丝墨堑：三 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：逊 指导教师签名： f i 期：趔五：罗e l 期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 1 引言 人类的大脑是由数以亿计的神经元构成的网络结构，人类的感知觉、学习与记忆以 及睡眠等都是以相关的神经环路作为基础所引起的。神经环路的形成包括神经元的产生 与迁移以及神经元树突和轴突的发育。每个神经元通过突触按照一定的方式相互连接， 彼此调节，从而控制从呼吸、心跳到感觉、认知各个层次的生理活动。 1 1 神经元极性的建立 成熟的神经元具有高度极化的结构和功能特征，通常从胞体发出一个长长的轴突和 多个树突，胞体和树突负责接受外界传入的信息，轴突负责将接收的信息传递给下一个 神经元或效应器，所以神经元极性的建立是突触信息传递的基础【l 】。 在过去的2 0 年中，b a n k e r 等人建立的原代神经元体外培养体系被广泛的应用于神 经元极性发育的研究。体外培养的神经元在没有外界环境信号的条件下，仍然能够极化 形成轴突和树突，继而形成突触连接，并具有轴突和树突的特征性分子。对体外培养的 海马神经元进行观察，可发现神经突起的发育需要经过以下几个阶段( 图1 1 ) 【l j ：接 种2 ，- - 4 h 后细胞开始贴附在基质上，形成板状伪足( s t a g e1 ) ；1 2 - - - 2 4 h 后细胞完成贴 壁，并且神经元胞体周围长出三四个微小的突起( s t a g e2 ) ，叫做神经突，一旦神经突 生长到大约2 0 p m 的长度时，即停止了纯粹的延长，但是继续维持短距离的伸展和收缩， 其中有些细胞发生再聚合现象。在2 4 小时内，神经元显现出从非极化状态到极化状态 的过渡，其中一个未成熟的神经突迅速的伸延形成以后的轴突，而其它的神经突保持相 对静止，很少进行生长活动，这样就形成了具有一个轴突和几个较短神经突的神经元 ( s t a g e3 ) 。几天之后，剩余的几个神经突开始生长，但其生长速率远较轴突的慢，最 后获得了树突的形态特征( s t a g e4 ) 。在神经元轴突和树突随后的发育过程中，神经元 形成突触连接，自发的生物电活动通过神经元网络进行传播( s t a g e5 ) 。这样，一个未 成熟的神经元发育成了具有一个长长的的轴突和众多树突的高度极化的成熟的神经元。 神经元极性的确立似乎是是处于s t a g e2 的神经元的从众多微小突起中随机选择一个进 而快速生长形成轴突，完成s t a g e2 到s t a g e3 的转变。然而，最近有研究表明，神经 元极性是在双极阶段确定的，即最初形成的两个神经突中的一个将发育为轴突，但是轴 突的延长是在形成多个神经突之后开始的。 大脑皮层锥体神经元是体内研究神经元极性的重要模型。通过t i m e l a p s 技术发现 开始迁移的皮层锥体神经元在以单极形态进行迁移之前首先要经历一个瞬时的多极阶 段即从胞体辐射发出多个神经突起，当迁移进入中间区时，神经元呈双极形态，即具有 一个朝向皮层板的引导突和一个朝向脑室带的尾突，之后尾突迅速发育成神经元的轴 突。然而近期，a n t h o n ypb a r n e s 等人的研究结果表明，不论是体外培养的胚胎期海马 东北师范大学硕士学位论文 神经元还是体内发育的皮层锥体神经元都是在双极阶段确定极性轴和轴突命运 2 1 。 s t a g e1 l a m e l l i p o d l a s t a g e 3 匹叵圃 s t a g e 4 d e n d r i t ef o r m a t i o n s t a g e 5 f u r t h e rm a t u r a t i o n d e n d r i t e ( m u l t i p l e ld e n d r i t e ( m u l t i p l e ) 图1 1 神经元极性发育的阶段。 1 2 神经元轴突的诱向生长 在脊椎动物胚胎发育早期，外胚层的细胞决定成为神经元前体，随后神经元前体细 胞群开始分裂增生，少数细胞在最终分裂后可能已经位于紧靠它们在神经系统的最终位 置，但大部分细胞要经过一段距离的迁移才能到达它们的最终目的地【3 1 。一个未成熟的 神经元一旦迁移到它在神经系统的最终位置，就必须向相邻神经元伸出轴突和树突分 支，并与其它神经元的突起建立起合适的突触连接。一般来说，神经元在完成迁移之后 才生长出轴突和树突，但是也有的神经细胞在迁移途中同时进行分化【”】。 在神经元的发育过程中，神经元轴突向着一定方向长出，沿着一定路径延伸，最后 到达靶部位并形成正确的连接。这是复杂的神经系统发育中十分重要的事件。轴突的生 长具有严格的方向性，这有赖于轴突末端的具有运动能力和高度敏感性的结构生长 锥的活动，这个过程是受环境中一系列信号分子调控的【”】。 神经元发育或再生时，其突起末端膨大成扇形，称生长锥。生长锥包括三个结构域： 丝足、板足和中央区。丝足是生长锥的最远端部分，中心有平行的肌动蛋白细丝束。丝 足是一个非常活跃的结构，不断地前伸或后缩，也可以自生长锥向两侧伸展。生长锥的 外周部是板足，它的主要感觉成分是分支的丝状足，这个部位也是高度能动的。中央区 内富含细胞器，如线粒体、内质网、溶酶体等，此部位是微管终止的部位，具有调节神 经突起的组装及延伸的作用【3 5 】。生长锥是所有轴、树突分支活跃生长的尖端。生长锥的 功能与神经突起的生长、轴突特殊途径的选择、靶细胞的识别和突触的形成有关【6 】。 轴突生长的延伸过程需要肌动蛋白骨架和微管系统的协同作用。轴突生长的驱动始 于轴突生长锥中肌动蛋白不断地聚集和解聚。生长锥是神经轴突的构建装配部位，对轴 2 兰 东北师范大学硕士学位论文 突生长的导向性有重要作用。生长锥形态发生改变之前，肌动蛋白骨架不断的发生着聚 集和解聚的改变使丝足和板足不断的伸缩，探测局部环境，寻求合适的表面定向扩张， 然后其它部位借助板足向前运动，待生长锥巩固后丝足和板足又开始重新探测，整个运 动呈波纹式来回伸缩。这种行为的分子基础是生长锥内微管和微丝的变化【7 j 。板足和丝 足的伸出和回缩，以及生长锥锥体的前进，似有两个过程介导：肌动蛋白丝的多聚化 和解体；由肌球蛋白介导的肌动蛋白丝从生长锥前缘移开。这两个过程都可利用a t p 水解的能量来产生动力，并为肌动蛋白的结合蛋白所调节【8 】。 神经突起的延长不但是由于它的细胞骨架的延伸，随着生长锥朝向它的靶区伸长， 整个细胞体积的增大需要不断地增加新的胞浆膜。应用荧光脂质的实验发现膜性脂质不 断流向生长锥。在胞体及沿着生长中轴突的全长可见新的脂质潜入胞浆膜p q 3 - 5 。 1 3 影响神经突起生长的因素 神经元极性的确立是脑内的神经元整合和传送信息的先决条件。有研究表明，神经 元的极性可能与细胞骨架的选择运输和重排有关。细胞骨架是有极性的结构，例如，微 管的正端朝向轴突，负端朝向胞体。神经细胞内不同的酶、受体和细胞器分别由细胞骨 架运送到神经元的不同部位【6 】。在轴突形成过程中，神经元细胞骨架发生了重排。最初， 所有的神经突都是一样的。在形态学的极化出现之前细胞骨架开始发生动态变化，在一 个神经突的生长锥上肌动蛋白骨架变得非常活跃，驱动蛋白的头部区优先的定位在这个 突起中，微管也在这个神经突中稳定化、极化【9 】。在发育早期，中心体存在于将要发育 成轴突的基底部，可能会促进微管骨架的早期极化【9 1 0 1 。微管相关蛋白是微管结构和功 能必需的组分，在微管蛋白装配成微管后结合于其表面，有促进和调节微管的装配并起 稳定的作用。其中t a u 蛋白仅在神经元发现，它主要定位于轴突，呈短杆状在微管间形 成短的横桥，促进微管蛋白聚合。m a p 2 仅分布在成熟神经元的树突内，可以构成微管间 的横桥，也可横连神经丝和微管【6 】。c d c 4 2 、s a d 激酶、e n a v a s p 家族的蛋白在神经元极 性的确定过程中起到关键的调控作用【9 , 3 6 - 3 8 】。然而，有关神经发育过程中其各组成部分 如何发育，以确保神经元的极性，神经元内在因素和外环境如何影响神经元的极性等问 题，目前还不是很清赳6 。 神经元的轴突和树突长出之后必须建立正确的功能性的连接才能发挥其信号传导 的功能，这时神经元需要经历广泛的形态学变化。在这些事件中，细胞外信号起着至关 重要的作用，它通过激活细胞表面的受体来控制调节细胞骨架的信号通路。能够调节细 胞骨架变化的信号分子主要包括以下几类：细胞黏附分子( 如钙连蛋白、神经细胞黏附 因子n c a m 和l l 等) ，细胞外基质( 如层黏蛋白、纤黏蛋白等) ，信号素( 如s e m a p h o r i n s ) ， 导向因子( 如n e t r i n s ) ，e p h 相关受体酪氨酸激酶配体，神经营养因子等【3 刮1 1 ，这些信 号分子是由神经突起延伸途径周围的组织或靶组织的细胞合成，释放到细胞外或附着于 细胞膜上，与生长锥表面的特异受体分子相互作用，导向受体可以通过其信号传导通路 的下游作用元件调节r h og t p a s e s 的活性，进而引起细胞骨架蛋白系统的重组介导生长 3 东北师范大学硕士学位论文 锥的生长【7 , 1 2 】。 e n a v a s p 是肌动蛋白结合蛋白，存在于肌动蛋白应力纤维、丝足和片状伪足的边缘， 它能够与成帽蛋白( a c t i nc a p p i n gp r o t e i n s ，a c p ) 竞争肌动蛋白结合位点，使肌动 蛋白单体继续聚合到微丝的末端，从而使丝足延长，它也能够抑制或减弱肌动蛋白丝的 分支。因此，可以推测出e n a v a s p 在细胞内的特异分布可能调控了细胞骨架和细胞形 状变化相关的肌动蛋白丝的延伸【1 3 1 。导向因子n e t r i n - 1 与受体d c c 胞外第五个f n 功 能域结合，继而引发下游胞内p 3 区二聚化，传递吸引性信号介导轴突朝向n e t r i n 高 浓度区域生长【1 4 1 。n e t r i n - i 诱导的丝足形成依赖于e n a v a s p 的功能，而且与e n a v a s p 的p k a 调控位点的磷酸化直接相关【1 5 1 。v a s p 和d c c 从胞体到丝足顶端的运输都是依靠 m y ox 这个马达蛋白，沿着肌动蛋白细丝滑行，把v a s p 和d c c 运输到丝足的顶端【1 3 , 1 4 。 由此可以推测，m y ox 在神经突的生长和导向中起着一定的作用。 1 4m y ox 及在神经系统中的研究现状 m y ox 是肌球蛋白家族中的一个成员，是在1 9 9 4 年通过p c r 技术在内耳中发现的， 基因定位于小鼠第1 5 号染色体人的第5 号染色体上。m y ox 是脊椎动物所特有的一种肌 球蛋白，其在大部分组织中都有表达，但表达量有所不刚1 6 1 。全长m y ox 的分子量约为 2 4 0 k d a ，分子结构可分为三个部分：头部区、颈部区和尾部区。m y ox 头部区是马达结 构域，可结合肌动蛋白、靠水解a t p 产生动力从而沿着肌动蛋白丝移动。颈部区由三个 i qm o t i f s 组成，每一个i qm o t i f s 都提供了钙蛋白或类钙蛋白的结合位点。尾部区开始 于一个卷曲螺旋，这意味着m y ox 可以在此部位形成二聚体。卷曲螺旋的后面是三个p e s t ( p r o l i n e 一，g l u t a m a t e 一，s e r i n e a n dt h r e o n i n e r i c h ) r e g i o n s ，提供溶蛋白性裂解 位点，可以在此位点把头部区和尾部区分离。m y ox 尾部区是m y o 家族中独有的结构， 包括三个血小板一白细胞一蛋白激酶c 底物同源区( p l e c k s t r i nh o m o l o g y ，p h ) 、m y t h 4 ( m y o s i nt a i lh o m o l o g y4 ，m y t h 4 ) 和f e r m ( b a n d 4 1 e z r i n r a d i x i n m o e s i n ，f e r m ) 结 构域。p h 区通常是磷酯酰肌醇的结合位点，如磷酯酰肌醇二磷酸( p i p 2 ) 和磷酯酰肌醇 三磷酸( p i p 3 ) 。m y t h 4 区能够结合微管，可以通过此部位把微丝和微管连接起来。f e r m 结构域含有细胞骨架蛋白的结合位点，可以与磷酸酪氨酸、整合素、e n a - v a s p 、d c c 等 结合【1 锄4 】。 a p a r n ab b o h i l 等人的研究结果显示，m y ox 作为动力蛋白在丝足的形成过程中在 起作用，在h e l a 细胞中用m y oz f 删低内源性m y ox 的表达能够导致丝足的减少， 而在c o s - 7 细胞中过表达m y ox 可以大大的促进丝足的形成【2 1 1 。m y ox 通过f e r m 结构域 与整合素的胞质结构域相结合，在丝足形成过程中起到运输整合素和稳定细胞粘附结构 的作用【l 引。酵母双杂交、p u l l - d o w n 和免疫共沉淀分析表明，m y ox 通过f e r m 结构域与 n e t r i n 一1 的受体d c c 胞内段p 3 结构域相结合，d c c 具有与n e t r i n - 1 直接结合的活性，继而 引发下游胞内p 3 区二聚化，传递吸引性信号介导轴突朝 句n e t r i n 高浓度区域生长【1 4 】。 h i r o s h it o k u o 等人通过免疫沉淀作用和免疫细胞化学技术发现，m y ox 可以通过尾部 4 东北师范大学硕士学位论文 区与v a s p 蛋白结合，且两者共定位在哺乳动物细胞的丝足的尖端。h i r o s h it o k u o 等人 的实验结果还显示了丝足尖端v a s p 的数量与m y ox 的数量是呈正比的，而m y ox 的数量 与丝足的长度是呈正相关的，因此，m y ox 沿着肌动蛋白微丝滑行，把v a s p 带到丝足的 末端，v a s p 阻止肌动蛋白成帽蛋白与微丝结合，从而使肌动蛋白单体可以继续聚合到微 丝的末端，使丝足延长【l 引。 研究结果显示m y ox 在神经系统中有较高的表达。 g y ox 蒯刃全长约有9 2k b 。 s o u s a 等人通过序列分析、n o r t h e r nb l o t 、p c r 和免疫印迹等实验手段已经证明，脑中 还存在一种短的约6 0k b 的l g y ox 刎删，其表达的蛋白是缺少头部结构域的m y ox ， 分子量约1 6 0 - 1 7 0k d a 。由于这种形式的m y ox 缺少头部结构域，因此它不能行使分子 马达的功能。s o u s a 等人发现两种形式的m y ox 在大脑和小脑中都有表达，但表达量存 在着差别。全长型的m y ox 在大脑中从出生后第5 天到第1 5 天都有较高的表达，而在小 脑中从出生后第5 天开始表达后表达量持续增长。无头型m y ox 在大脑中的表达与全长 型一致，而在小脑中在出生后第5 天获得最高的表达量，之后表达量持续减少，在第1 0 天几乎没有表达。因此他们推测无头型m y ox 在神经细胞中可能起到抑制或在空间上限 制全长型m y ox 的活性。s o u s a 等人还发现m y ox 主要存在于神经元丝足的顶端和膜的 边缘，过表达m y ox 在丝足的顶端和板足的前缘有明显的积累，而无头型m y ox 没有 定位在丝足的顶端，而是弥散的分布在神经突和细胞体内【2 5 1 。最近关于m y ox 在神经系 统中的发育调控有一个特别有意思的报道，周围神经受损后大约有2 0 个基因的表达将会 增加7 倍或是更多，m y ox 就是其中之一。发育中小鼠的背根神经节的n o r t h e r nb l o t s 结果显示全长的m y ox 的转录物在出生后第3 天表达，在成年期下降至较低的水平。然 而，在背根神经节损伤后7 天，其神经元激活再生时，m y ox 转录物将会显著上调【2 6 】。 这些结果表明m y ox 可能在神经系统的发育和再生中起着非常重要的作用。然而，到目 前为止，m y ox 在神经系统中的功能尚不明确，有待深入的研究。 1 5 立题依据 神经细胞轴突生长导向的研究是神经科学领域的热点，生长锥板足和丝足的延伸和 导向，是神经网络形成和建立的基础。已有的研究结果显示m y 0x 在神经系统中高表 达，并且在一些细胞系( 如c o s 7 ，h e l ac e l l ) 中得到证据m y 0x 可以促进丝足的形 成和生长，本实验综合前人的研究结果，以原代神经元为实验材料研究m y 0x 对神经 元突起生长的作用。相比于体外培养的细胞系，原代神经元能提供更准确的生物学信息。 因此，原代神经元转染是模拟体内情况研究基因功能的很好的方法。 5 东北师范大学硕士学位论文 2 材料和方法 2 1 实验材料 新生w i s t a r 大鼠( p 0 - 2 ) 购于吉林大学基础实验动物中心 2 2 主要试剂 多聚赖氨酸( s i g m a ) ，d m e m f 1 2 培养基( c a t n o 1 1 3 2 0 0 3 3 ：g i b c o ) ，胎牛血清 ( g i b c o ) ，l 一谷氨酰氨，胰酶，7 5 乙醇，蒸馏水，台盼蓝，无水乙醇，b 一2 7s u p p l e m e n t ( c a t n o 1 7 5 0 4 0 4 4 ：g i b c o ) ，n e u r o b a s a lm e d i u m ( c a t n o 2 1 1 0 3 0 4 9 ；g i b c 0 ) ，鼠 源t a u l 抗体( c a t n o m a b 3 4 2 0 ：m i l l p o r e ) ，鼠源m a p 2 抗体( c a t n o m 1 4 0 6 ：s i g m a ) ，兔 源m y ox 抗体由美国佐治亚医学院熊文成老师馈赠，a l e x af l u o r4 8 8 偶联羊抗兔抗体和 a l e x af l u o r5 4 6 偶联羊抗鼠抗体购于i n v i t r o g e n 公司，罗丹明- 鬼笔环肽购于s i g m a 公 司。 2 3 仪器 解剖镊，解剖剪，1 2 孔培养板，圆形盖玻片( 由1 8 咖，厚度1m m ) ，1 0 0 唧培养 盘，实体解剖镜( s f c - 1 1 ，m o t i c ) ，b d 细胞滤网( 4 0 1 u nr e f 3 5 2 3 4 0 ) ，细胞计数板，1 5 m 1 离心管，5 0m 1 离心管，刻度吸管( 5m 1 ，1 0m 1 ) ，巴斯德吸管，微量移液器( 1m 1 ， 2 0 0 肛i ，l o i - t 1 ) ，恒温水浴锅，常温低速离心机，3 7 细胞培养箱( s n 4 3 8 0 1 - 3 1 4 0 ， t h e r m o f o r m a ) ，电转仪( a m a x a ) ，正置荧光显微镜( e c l i p st e 2 0 0 0 一u ，n i k o n ) ，倒置荧 光显微镜( 8 0 i ，n i k o n ) ，激光共聚焦显微镜( f v l 0 0 0 ，o l y m p u s ) 。 2 4 构建鼠的m y ox - - s 腧懈表达载体 按照试剂盒b l o c k - i t t mp o li im i rr n a ie x p r e s s i o nv e c t o rk i tw i t he m g f p 的说明书进行，由本实验室郭宇光构建保存。序列为：t o ps t r a n do l i g o 序列： 5 - t g c t g t t aa t a t c t t g g a t c a g c t g c g t t t t g g c c a c t g a c t g a c g c a g c t g a c a a g a t a t t a a 一3 ；b o t t o ms t r a n do l i g o 序列：57 - c c t g t r aa n 气t c t r g t c a g c t g c g t c a g t c a g t g g c c a a a a c g c a g c t g a t c c a a g a t 发r f a a c 3 7 。 2 5 质粒的扩增与提取 用q i a g e n 公司的无内毒素的质粒提取试剂盒e n d o f r e ep l a s m i dm e g ak i t 抽提质粒 6 东北师范大学硕士学位论文 s c r a r a b es i e n a 和m y ox - s i e n a ，步骤严格按照说明书进行。从5 0 0 m l 菌液中提取制 备质粒，用1 0 0 3 0 0l x lt e 溶解抽提的质粒d n a 。用分光光度计测量在2 6 0 n m 和2 8 0 n i i l 紫外吸收值。a 2 6 0 2 8 0n m 应为1 7 1 9 ，浓度大于l p p 1 。测定公式：o da 2 6 0x5 0 稀释倍数( 4 0 0 ) - - - 浓度( i t e d r n l ) 。 2 6 新生大鼠大脑海马神经元的原代分离和培养 2 6 1 准备： ( 1 ) 配制h b s s 缓冲液： k c l0 4g k h 2 p 0 4 0 0 6g n a c l8 0g n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 0 1 2g h e p e s2 3 8 3g g l u c o s elg h 2 0 9 0 0r n l 用n a o h 调p h 至7 3 ，定容至1l ，高压灭菌备用。 ( 2 ) 盖玻片处理：用3 冰醋酸浸泡玻片3 0 分钟后冲洗，9 5 酒精棉擦拭玻片，再用蒸 馏水冲洗，之后浸泡在7 5 的乙醇中备用。 ( 3 ) 包被盖玻片：在超净台中取出盖玻片，过火焰后放入到1 2 孔细胞培养板中，将多聚 赖氨酸配制成l m g m l 的储存液，使用时用无菌水稀释至1 0 9 0 m l 作为包被液，取l m l 包被液加入到含盖玻片的培养板中，室温放置过夜，然后移去多聚赖氨酸，无菌水洗3 次。处理好的培养板可放置于4 c 冰箱中，待用。 ( 4 ) 实验前，将解剖用具浸泡于7 5 乙醇中1 小时，取出后放于超净台中吹干。 ( 5 ) 所用培养基于3 7 ( 2 水浴锅中预热。 2 6 2 海马神经元的分离1 2 7 】： ( 1 ) 处死新生大鼠，于7 5 乙醇中消毒后，置于含有预冷的h b s s 的培养盘中，用解剖 剪打开大鼠颅骨，用解剖镊快速取出大脑，放入另一含h b s s 的培养盘中。 ( 2 ) 在实体解剖镜下，分离大脑的海马组织，剥离海马组织的脑膜。用移液器将海马移 入1 5 m l 离心管中，用解剖剪快速剪碎组织。 ( 3 ) 取一个无菌的5 0i n l 离心管，加入合适体积的终浓度为0 1 2 5 的胰酶消化液，将剪 碎的组织转入消化液中，一般4 - 5 海马5 血消化液。3 7 ( 2 水浴锅中孵育3 0 分钟。 “) 加入1 2i i l l 含1 0 胎牛血清的d m e m f 1 2 培养基，终止消化。 ( 5 ) 室温下静止5 分钟，用移液器将消化液中团状粘性物移出，加入到另一装有1 0 m l 含1 0 胎牛血清的d m e i v i f 1 2 培养基的5 0m l 离心管中。 ( 6 ) 用吸管轻轻地吹打组织，吹散成单个细胞悬液，注意动作尽量轻柔，不要产生气泡。 ( 7 ) 取一新的5 0i n l 离心管固定于离心管架上，将细胞滤网放于其上，吸取细胞悬液过 7 东北师范大学硕士学位论文 滤，以获得单个的神经细胞。 ( 8 ) 取3 0 9 l 细胞悬液，加入等体积的o 8 台盼蓝染色，用细胞计数板计数。 ( 9 ) 接种细胞于多聚赖氨酸包被的培养板中，接种密度为l 1 5 1 0 5 细胞孔。 ( 1 0 ) 将培养板置于3 7 c 、5 c 0 2 培养箱中培养，8 小时后更换为培养神经元的培养基： 含2 b 2 7s u p p l e m e n t 和2 m ml - 谷氨酰氨的n e u r o b a s f lm e d i u m 。 2 7 电转染法转染海马神经元 2 7 1 电转液的配制 ( 1 ) s o l u t i o ni ： a r p n a 2 0 2g m g c l 2 6 h 2 0 1 2g h 2 0 1 0 m l 用0 2 2 u r n 的滤器过滤，8 0 9 1 分装，一2 0 储存。 ( 2 ) s o l u t i o ni i ： k h 2 p 0 4 6 9 n a h c 0 3 0 6g 葡萄糖 o 2g h 2 0 3 0 0m l 用n a o h 调p h 值7 4 至终体积为5 0 0i n l ，用o 2 2 岬的滤器过滤，4l n l 分装，一 2 0 c 储存。使用前，将8 0 山s o l u t i o ni 和4m ls o l u t i o ni i 混和制成电转液，该溶液应为 新鲜配制，4 条件下，至多可保存一个月。 2 7 2 准备 ( 1 ) 将清洗干净经7 5 的乙醇浸泡的盖玻片过火焰，放入1 2 孔板中，每孔加入1 0p 9 m l 的多聚赖氨酸l m l ，包被过夜，无菌水洗三次。 ( 2 ) 每孔加入7 0 0md m e m _ f 1 2 完全培养基( 含1 0 胎牛血清) ，置于3 7 、5 c o 。培养 箱中预热。 ( 3 ) 另取两个无菌的1 5i n l 离心管，每管加入5 0 0 山含1 0 0 5 胎牛血清的d m e m f 1 2 培养 基，置于3 7 、5 c 0 2 培养箱中预热。 2 7 3 电转神经元 ( 1 ) 以1 0 0 0r p m 离心5 分钟，收集新鲜分离的神经元。 ( 2 ) 弃掉上清液，小心的吸净残余的培养基，用2 0 0m 电转液重悬细胞，并分到两个1 5 m l 离心管中，每管1 0 0 山，分别加入2 阳质粒s c r a m b l es i r n a 或m y ox - m r n a ，混匀。 ( 3 ) 将两管细胞一质粒一电转液转移到两个电转杯中，选择电转程序0 - 0 0 3 或g - 0 1 3 ，把 电转杯插入电转仪中，电转。 8 东北师范大学硕士学位论文 ( 4 ) 电转结束后，立刻拿出电转杯，用塑料吸管吸出细胞一电转液，转移到含有5 0 0m 预热过的d m e m f 1 2 完全培养基的两个1 5 m l 离心管中，混匀。每次吸出1 0 0p l 细胞 悬液加入到含有7 0 0 山预热的d m e m f 1 2 完全培养基的孔中。 ( 5 ) 将培养板置于3 7 、5 c 0 2 培养箱中培养，4 小时后，更换为神经元的培养基( 每 孔8 0 0u 1 ) ：含2 b 2 7s u p p l e m e n t 和2 m ml - 谷氨酰氨的n e u r o b a s a lm e d i u m 。 ( 6 ) 逐日观察神经元生长情况，7 2 小时后，免疫荧光染色。 2 8 磷酸钙法转染成熟海马神经元 海马神经元培养4 8 小时后，进行磷酸钙转染【2 8 2 9 1 。 ( 1 ) 2 x h b s 的配制： 5 0 m mh e p e s ( m w 2 3 8 3 ，1 1 9 1 5 9 l ) ，2 8 0 m mn a c l ( m w 5 8 5 ，1 6 3 8 9 l ) ，1 5 m m n a 2 h p 0 4 ( m w l 4 1