（遗传学专业论文）草鱼生长激素基因在酵母菌中的表达研究.pdf

四川大学硕士学位论文 致谢 本论文是在导师刘世贵教授的悉心指导下完成的。在我攻读硕士学位的三 年中，刘先生付出了巨大的心血和关怀， 使我得以 顺利完成学业. 刘先生严谨 的治学态度和深厚的学术造诣使我收益非浅， 对于我以后从事的工作产生深远 的影响。我将铭记导师的谆谆教诲，在未来的人生旅途中不断进取.谨此论文 完成之际， 我向辛勤培养我的导师表示最诚挚的 谢意。 我将会在以后的工作中， 更加勤奋努力，以 优异的成绩回报恩师和社会。同时， 师母柏老师在生活上给 了我无微不至的关怀，让我独自 在外求学的日 子中倍感温暖。在此，也向柏老 师表示最衷心的感谢。 同时，我也要向张义正教授、杨志荣教授、龙章富博士、高平博士、伍梅 博士和葛绍荣老师表示诚挚的谢意。在我攻读硕士学位期间，各位老师给了我 热情的指导和帮助，使我在科研过程中得到启迪和进步。 在四川大学生命科学院攻读硕士学位的三年中，我有幸工作和生活在一个 力求上进、勤奋工作、互相帮助、 共同进步的集体中 草原生物防治工程国 家专业实验室。本实验室的老师和李尚伟博士、刘增然博士、殷中琼博士、张 仁怀博士以 及刘燕萍、 江德洪、 潘为高、 陶勇、 刘燕飞、李凤、 孟亚 鹏、 谭俊 杰等同学在我的工作和学习中给予我许多帮助和支持，在此一并致谢。 特别要感谢我的父母、男友和所有关心支持我的朋友，是他们的宽容和关 爱让我有了克服一 切困难的勇气，是他们的鼓励和支持才使我顺利完成学业。 在此， 我要向他们表示我最诚挚的谢意和最深切的祝福。. 一雪 爪 四川大学硕士学位论文 草鱼生长激素基因在酵母菌中的表达研究 遗传学专业 现代遗传和生物工程方向 研究生:殷雪 指导教师:刘世贵教授 本研究首先用d n a 重组技术将已克隆的草鱼生长激素( c g h 基因c d n a 编码 区片断定向 插入p g e x - 4 t - 1 质粒， 转化大肠杆菌t o p i o f ， 用菌落p c r 和质粒 p c r 方法筛选阳性克隆;以b a m h i 和e c o r i 酶切鉴定重组质粒.以i p t g 诱导 融合蛋白 表达， 并作r t - p c r 及s d s - p a g e 分析。 从聚丙稀酞胺制备凝胶中回收 正确表达的融合蛋白，以此免疫小鼠制备高免血清。 得到高效表达草鱼g h的 重组质粒 p g c g h , r t - p c r分析确证重组质粒在大肠杆菌中 能正 确转录; s d s - p a g e分析证明诱导重组质粒菌株表达了融合蛋白，分子量约为5 0 k d , 与预期的2 6 k d的g s t 带和2 3 . 6 k d 的 草鱼生长激素基因编码蛋白 质构成的融 合蛋白大小一致，以此免疫小鼠，制备得到滴度为1 : 1 2 8 0 0 的鼠高 免血清. 在此基础上，完成了草鱼g h酵母表达菌株的构建与表达研究。 设计合成 了一对草鱼生长激素基因的特异性引物， 上游引物加入e c o r i 酶切位点: 下游 引物加入n o t i 酶切位点，采用 d n a聚合酶进行扩增，获得了草鱼生长激素 基因表达片断。将该片断插入含有甲醉启动子及带有酵母相应信号肤的 p p i c 9 k表达载体中，成功构建了p p i c 9 k - c g h酵母高效表达载体。 选择 p p i c 9 k作为 草 鱼生 长 激素 基因 的 表 达 载 体国 内 还 未 见 报 道. 将已 连 接 有 草 鱼 生长激素基因c g h的 表达载体p p i c 9 k - c g h经电 击转化导入毕 赤巴 斯 德酵 母， 经m d和mm培养基及g 4 1 8 抗性筛选和纯化， 获得了高效表达草鱼生长 激素的重组毕赤巴斯德酵母基因工程菌株。 通过对所有筛选到的阳 性菌株菌落 p c r分析， 证实了外源草鱼生长激素基因己经整合到了酵母菌中， 并选出了4 株高拷贝的重组毕赤巴 斯德醉母基因工程菌株， 对其培养液采用饱和硫酸氨沉 淀纯化后，作s d s - p a g e分析，得到了分子量为2 3 . 6 k d 的蛋白带，与预期的 四川大学硕士 学位论文 分子量相近。 结果表明， 草鱼生长激素基因得到了高效的胞外分泌表达。以免 疫小鼠得到的鼠高免血清为一抗作w e s t e rn印迹分析，证实了所产的胞外蛋白 的特异性。 本研究 将克隆 到的 草 鱼生 长激 素 基因c g h首 次 采用p p i c 9 k 表 达 载体构 建了重组表达质粒， 获得高拷贝的重组毕赤巴 斯德酵母基因工程菌株， 实现了 c g h的高效表达.以原核表达产物为抗原，制备的鼠抗高免血清为一抗， w e s t e m 检测证实了毕赤巴 斯德酵母基因工程菌株表达产物的特异性。 本研究 为进一步开展草鱼生长激素的应用和生物活性检测分析， 以及研制新型调节鱼 类生长的基因制剂的应用奠定了坚实的基础。 关键词: 草鱼生长 激素基因 高免血清毕赤巴斯德醉母高效 表达we s t e rn 印迹 四川大学硕上 学位论文 e x p r e s s i o n s t u d y o f g r a s s c a r p g r o w t h h o r m o n e ge n e i n p i c h i a p a s t o r i s ma j o r : g e n e t i c s gr a d u a t e s t u d e n t : yi n xu et u t o r : l i u s h i g u i g r a s s c a r p g r o w t h h o r m o n e ( c g h ) g e n e w a s c o r r e c t l y i n s e r t e d i n t o p g e x - 4 t - 1 p l a s m i d i n o r d e r t o c o n s t r u c t t h e e x p r e s s i o n p l a s m i d p g c g h . t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d w a s t r a n s f o r m e d i n t o e . c o l i t o p 1 0 f c o m p e t e n t c e l l s , t h e p o s i t i v e c l o n e w a s s c r e e n e d b y c o l o n y p c r a n d p l a s m i d p c r a n d t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d w a s i d e n t i f i e d b y b a m h i a n d e c o r i d i g e s t i o n . f u s i o n p r o t e i n e x p r e s s i o n w a s i n d u c e d b y i p t g a n d e x p r e s s i o n s i t u a t i o n w a s a s s a y e d b y r t - p c r a n d s d s - p a g e . t h e f u s i o n p r o t e i n w a s r e c o v e r e d f r o m p o l y a c r y l a m i d g e l a n d u s e d t o i m m u n i z e t h e r a b b i t . t h e r e s u l t o f r t - p c r s h o w e d t h a t t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d c o u l d b e t r a n s c r i p t e d c o r r e c t l y i n t o p l o f .a n e w p r o t e i n b a n d w a s f o u n d i n s d s - p a g e w i t h m o l e c u l a r m a s s o f a b o u t 5 0 k d a w h i c h i s c o n s i s t e d o f a 2 3 . 6 k d a p r o t e i n d e d u c e d f r o m t h e c g h g e n e s e q u e n c e a n d g s t ( 2 6 k d a ) . t h e t i t e r o f r a t a n t i - c g h s e r u m f r o m i m m u n i z e d r a t w a s 1 : 1 2 8 , 0 0 0 . a n e w p a i r o f p r i m e r s o f c g h g e n e w a s d e s i g n e d w h i c h c o n t a i n e d a e c o r i s i t e i n s e n s e p r i m e r a n d a n o t i s i t e i n a n t i s e n s e p r i m e r , a n d a n e w c g h g e n e f r a g m e n t w a s o b t a i n e d b y a m p l i f i c a t i o n w h i c h d i d n t c o n t a i n s i g n a l p e p t i d e a n d i n t r o n . t h e n e w f r a g m e n t w a s i n s e r t e d i n t o p p i c 9 k p l a s m i d w h i c h c o n t a i n m e t h a n o l p r o m o t e r a n d y e a s t s i g n a l p e p t i d e t o 四川大学硕士 学位论文 c o n s t r u c t e x p r e s s i o n p l a s m i d p p i c 9 k一c g h , a n d t h e p l a s m i d w a s t r a n s f o r m e d i n t o p i c h i a p a s t o r i s b y e l e c t r o p o r a t i o n . f o u r h i g h c o p y p o s i t i v e c l o n e s w e r e s c r e e n e d a n d p u r i f i e d b y c u l t u r i n g o n m d p l a t e ， m m p l a t e a n d y p d - g 4 1 8 p l a t a n d c u l t u r e o f t h e f o u r c l o n e s w a s p u r i f i e d b y s a t u r a t i o n a m m o n i u m s u l f a t e f o l l o w e d b y s d s - p a g e a s s a y , a n d a b a n d o f a b o u t 2 3 . 6 k d w a s f o u n d w h i c h s h o w e d t h a t c g h g e n e w a s e x p r e s s e d a n d s e c r e t e d t o t h e s o l u t i o n m e d i u m e f f i c i e n t l y . a l s o t h e s p e c i a l i t y o f s c r e t e d p r o t e i n w a s c o n f o r m e d b y w e s t e r n - b l o t a n a l y s i s w i t h r a t a n t i - c g h se ru m. c g h g e n e w a s i n s e r t e d i n t o p p i c 9 k p l a s m i d a n d o v e r e x p r e s s i o n p i c h i a p a s t o r i s y e a s t s t r a i n s w a s c o n s t r u c t e d w h i c h r e a l i z e d e f f i c i e n t e x p r e s s i o n o f c g h g e n e i n y e a s t . a l s o t h e r a t a n t i - c g h s e r u m w a s o b t a i n e d b y i m m u n i z i n g r a t w i t h c g h p r o k a r y o t i c e x p r e s s i n g p r o d u c t , a n d s p e c i a l i t y o f s c r e t e d p r o t e i n w a s c o n f o r m e d b y t h e s e r u m . t h i s s t u d y s e t s a f o u n d a t i o n f o r f u r t h e r r e s e a r c h a n d a p p l i c a t i o n o f r e c o m b i n a n t g h i n g r a s s c a r p . k e y w o r d s : g r a s s c a r p , g r o w t h h o r m o n e g e n e ， p i c h i a p a s t o r i s y e a s t , e x p res si o n 四川大学硕士学位论文 前言 鱼类养殖己有至少2 5 0 0 年的历史，鱼体富含的蛋白 质是人类重要的动物 蛋白 源之一。 我国是世界水产大国， 淡水养殖鱼类年产2 0 0 0 多万吨， 占肉类消 费品总量的 1 / 3 ，居世界第一。草鱼是我国重要的淡水鱼类养殖品系，也是生 长最快的淡水鱼类之一。四川是一个农业大省，水资源丰富，草鱼也是本省的 主要水产养殖品种，能够提供优质的蛋白质。随着现代人口数量的增加，土地 的减少， 水环境的污染， 粗放型自 然放养鱼类已 不能满足人类的需求。 集约化、 工厂式养殖的出现，要求更合理、更有效的饵料，旨 在促进鱼类生长、 缩短养 殖周期。当前在养殖业中 用过的很多激素制品如孕酮、性激素及其它化学合成 分子类似物 ( 如喳乙醇)虽然可促进鱼类增长;但这些分子在鱼体内累积，通 过食物链富集后将对人类的健康构成严重威胁。我国已发生多起因滥用人工合 成的促长剂而导致人畜中毒的事件，水产品中药残量严重超标不仅降低水产品 质量，出口 受阻， 经济效益降 低， 人食 用后更损害人体健康。因 此， 为 保障 水 产业的可持续健康发展和提高经济效益，生产更多的绿色有机食品， 保证食品 和健康安全，目前巫需研制安全高效的新型鱼用生长促进剂，以 取代现在使用 的化学合成促长剂。 生长激素 ( g r o w t h h o r m o n e , g h ) 是 包括 鱼类在内的 所有脊椎动物脑下垂 体分泌的一种单链多肤激素， 由于其具有促进机体生长发育， 加速蛋白 合成以 及 脂类降解的生理功能口o n a ld s o n e t a l . , 1 9 7 9 ) ， 使得它在鱼类水产养殖业中具有 重大的作用，因而得到越来越广泛的重视。如何更好地发挥鱼类内源生长激素 的生理作用或将外源生长激素 ( 或基因)引 入鱼体，以 促进生长、 提高 抗性， 己 成为当前鱼类生长激素应用于水产养殖研究的 重大课题。鱼类g h研究不仅 具 有重要的理论意义，而且具有重大的应用价值。 人类对脊椎动物生长激素的认识始于上世纪3 0 年代。5 0 年代之后，开始 对低等脊椎动物 ( 鱼类) 生长激素进行研究。 起初一般都是从切除的 垂体组织 中分离纯化生长激素，随着基因重组技术的进展，陆续有一些鱼类的生长激素 四川大学硕士学位论文 c d n a序列和基因 全序列被报道，有些已 在工程菌或动物细胞中高效表达， 并出 现了许多通过在 d n a水平上改变结构基因编码顺序、改换新的启动子或重组 载体途径，以期提高生长激素表达产物的生物学活性、贮存稳定性及产率的方 法。 哺乳类和鱼类垂体来源的天然生长激素( g h ) 对鱼类都具有明显的促生长 作用( a g e l l o n e t a l . , 1 9 8 8 ; m c l e a n e t a l ., 1 9 9 3 ) 。 人 类己 利用 基因 工 程技术 合成了 哺 乳类和鱼类的重组g h ( r g h ) ， 并证明r g h具有天然g h促进鱼类生长的 活性 ( d u a n e t a l ., 1 9 9 1 ; m c le a n e t a l ., 1 9 9 3 ; c h e n , 1 9 9 3 ) 。 研究 表 明， 多 肤 和 蛋白 质能 被鱼类消化道完整吸收而进入血液并保持活性( c h e n , 1 9 9 3 ) 。 因而g h的大量生 产并作为鱼类生长促进剂已 成为可能。 给鱼体注射天然的猪、牛、羊、鸡、鱼的生长激素或利用基因工程菌产生 的生长激素， 鱼体 表现出 快 速的 生 长 效 应 ( c l a r k e t a l ., 1 9 9 7 ， 许克 圣 等 ， 1 9 9 1 ) 0 人的生长激素能够促进鱼的生长，但它对鱼生长激素受体的结合活力要比鱼本 身生长激素 低1 5 0 倍。 而 鱼生长 激素 对哺 乳 动 物的 生 长 激素受 体 无 任何活 性 ( 孙 逊等， 1 9 9 9 ) 。外源生长激素在鱼体内2 4 小时 便会分解9 0 % , 4 天内 全部消失， 不会在鱼体中累积( 肖 东 等, 1 9 9 9 ) 。 这一结果提示，重组g h蛋白的 应用可能以 本 动物来源的为好。早期的研究发现， 将动物的脑垂体匀浆后，加入饵料中， 投 喂给鱼，鱼体生长加快，似乎鱼体的 肠道能 够吸收具有生物活性的生长激素， 经研究证实，鱼体的后肠上皮细胞， 通过泡饮作用， 可以吸收完整的大分子蛋白， 具 有免疫学 活性和 i mo，性的 生 长 激素 可以 进入 鱼 体血 液中， 从 而 促 进 鱼体 生长( m c l e a n ， 1 9 9 0 ) , m c l e a n 等( 1 9 9 0 ) 把重组牛的生长 激素作为 饵料添加剂， 经口 饲喂 促进了 大 马哈鱼的生长，当同时添加抗酸剂和可增强细胞渗透性的 物质时，大马哈鱼的 生长更快。d e g a n i 等( 1 9 8 5 ) 把天然牛的生长激素与饵料混合， 投喂美洲鳗鲡 ( a n g u i l la r o s t r a t a ) , 2 u g / g 饵 料与l o u g / g 饵 料都促 进了 鳗鲡的 生 长， 但高 浓 度的 生长激素促生长效应更为显著。 鱼类生长激素到达鱼体后肠，以 活性构象进入 血液， 作用于肝脏的靶受体从而 促进鱼类生长 ( 肖 东等， 1 9 9 8 ) 。 生长激亲在 鱼类 之间 具有很高的保守性， 不同 种鱼的g h都可促进某一种鱼类的生 长， 一 种外 源生长激素也可以对多种鱼类起作用。 另外， f u 等( 1 9 9 8 ) 对快速生长的 鱼体生化组 成分析发现，生长 激v 4 t i # i 四川大学硕士学位论文 类生长主要是更多动用体内脂肪作为能源物质而使更多的氨基酸用于蛋白 质合 成。解剖鱼体，观察内脏组织，分析内脏指数，都与正常鱼体无差异。可见生 长激素促进鱼体生长并未对鱼体内 脏造成损害，是一种安全的生长促进剂。 因而，开展基因工程重组鱼g h的生产及其在水产养殖中的应用，这将对 改变我国鱼类养殖的落后面貌，培育出生长快、抗性强的优质养殖鱼类或快速 生长的转基因鱼新品种， 缩短商品 鱼养殖周期， 提高鱼产量，为人们提供更多 的优质鱼类蛋白 做出有益的贡献。 本研究选择毕赤巴斯德酵母表达草鱼生长激素基因有如下显著的优点: 一 是能在以甲 醇为碳源的培养基上快速生长; 拥有一个很强的可被诱导的甲 醉利 用途径，可以 在以甲醇为唯一碳源的培养基中得到诱导表达;其表达产物量很 高，这种方法的表达量大，便于大规模发酵生产。另外一个重要的优点是外源 基因不是存在于自主复制的表达载体中，而是和表达载体一起整合到了酵母染 色体上，随染色体一起复制和遗传，不会发生外源基因的丢失现象。 将已 连接 有草鱼生长激素基因c g h 的表达载体p p i c 9 k - c g h 经电 击转化导入毕赤巴 斯 德酵母， 经m d和m m培养基及g 4 1 8 抗性筛选和纯化， 获得了高效表达草鱼 生长激素的重组转化的毕赤巴斯德酵母基因工程菌株。 通过p c r分析， 选出了 高拷贝的菌株。采用 s d s - p a g e凝胶电泳、w e s t e rn印迹等技术对基因工程菌 及所表达蛋白 进行鉴定研究。为进一步研制开发成为安全、高 效的新型调节鱼 类生长的生物制剂奠定坚实的基础。 四川大学硕士学位论文 第一章草鱼生长激素基因的原核表达及抗体制备 摘要: 本研究用d n a 重组技术将己 克隆到的草 鱼生长激素 ( c g h ) 基因c d n a片 段定向插入原核表达载体p g e x - 4 t - 1 ， 转化大肠杆菌t o p i o f ， 经菌落p c r 和 质粒p c r 初步筛选出重组子，以b a m h i 和e c o r i 酶切作进一步鉴定后， 将得到 的重组质粒命名为p g c g h 。 以i p t g 诱导融合蛋白 表达， 并作r t - p c r 及s d s - p a g e 分析表达情况，r t - p c r实验确证 p g c g h在大肠杆菌中能正确转录， s d s - p a g e 分析结果显示， 重组质粒诱导表达的融合蛋白 分子量约为5 0 k d ， 与预期大小一 致。从聚丙稀酞胺制备凝胶中回收融合蛋白，以此为抗原免疫小鼠制备高免血 清，制备得到滴度为1 : 1 2 8 0 0 鼠 高免血清。 关键词:草鱼生长激素基因，原核表达，s d s - p a g e ，抗体 1引言 生长激素 ( g r o w t h h o r m o n e , g h ) 是 包 括 鱼类在内 的 所 有 脊 推动 物 脑 下 垂 体分泌的一种单链多肤激素，有促进鱼体蛋白 质合成、加速脂肪代谢、提高饵 料转化效率和增强鱼体高盐环境适应能力等功能，对鱼体的生长发育和机体代 谢起着重要的 调节作用( d o n a l d s o n e t a l ., 1 9 7 9 ) ， 在鱼类水产养殖业上具 有重大 的作用，因而得到人们越来越普遍的重视。为了弄清鱼体内g h水平与鱼体生 长的关系， 以及研究外源g h基因在受体鱼体内的表达部位、 表达效率和表达调 控等问题， 首先必须建立鱼类g h灵敏、 特异的 微量检测技术。 此外， 在进行鱼类 g h分离纯化中， 很重要的一点就是鉴定所获得的g h制品是否具有生物活性， 同样也需要建立鱼类g h灵敏、 特异的生物活性检测技术。 因此， 建立鱼类g h 生物活性和特异的定量免疫分析技术引起各国学者的广泛关注与重视. 陈松林 等( 1 9 9 5 ) 根据激素一 受体特异结合的原理， 结合e l i s a和r r a的优点， 应用 鱼 类肝细胞膜受体制剂和纯化的鱼类g h及其抗体，首次成功建立了一套检测鱼 类g h生 物活 性的 酶 联 免 疫吸 附 受体 测 定 法( e l i s a re c e p to r a s s a y , e l i s a r a ) . 该法是建立在g h先与受体相结合， 然后再与其特异抗体结合的基础上. 这 种酶 标受体法主要用于检测鱼类g h制备物的生物活性，具有快速、准确的 特点。 因此如何得到具有活性的特异性一抗便显得十分重要。 四 川大学 硕士学位论文 本研究首次选用了 融合表达载体 p g e x - 4 t - 1 构建高效表达的原核表达质 粒，对其在大肠杆菌中的表达进行研究，得到了具有正确表达的融合蛋白，以 此免疫小鼠，制备了抗草鱼g h的鼠抗高免血清。为进行鱼类g h生物活性和 特异的定量免疫分析及生物学功能研究奠定了基础。 2材料方法 2 . 1材料 2 . 1 . 1 质粒和宿主菌 p g e x - 4 t - 1 : 购自p h a r m a c i a 公司， 其物理图 谱见图1 . 1 草鱼生长激素c d n a 正向 插入v r 1 0 2 0 的 重组的 质粒v r g h由 本实验构建并保存 大肠杆菌t o p 1 0 f由本室保存 2 . 1 . 2试验动物 6 周龄b a l b / c 健康小鼠， 1 0 只， 体重2 0 g 左右， 购自 四川大学华西试验动物中 心 2 . 1 . 3主要试p 1 异丙 基 一 p - d 一 硫 代 半 乳 糖 昔 ( i p t g ) , 购自 p ro m e g a 公 司 ， 丙烯酞胺、 n ,n 亚甲 双丙烯酞胺， 购自b o r h r i n g e r m a n n h e i m公司， n ,n ,n ,n ， 一 四甲 基乙 二 胺( t e m e d ) , 购自t a k a r a 公司， 各种工具酶购自t a k a r a 公司， d e p c购自f l u k a 公司， 胶回收试剂盒购自m b i 公司， 质粒抽提试剂盒:购自 华舜公司， 寡核昔酸引物:p 1 : 5 一 c g g g a t c c t c t a c c c t g a g c g a a a t g b a mhi p 2 : 5 - c g皿 立 生卫翌g c c a t c t a c a g g g t g c a e c o r i t i ta n o n e t u b e r t - p c r k i t : 购自b o e h r i n g e r m a n n h e i m ( b m i ) 公司， 总r n a提取试剂盒:购自 上海华舜生物工程公司， 四川大学硕士学位论文 3 3 5 5 一四甲基联苯胺 ( t mb ) :购自 华美生物工程有限公司， s p a - h r p : 购自华美生物工程有限公司; 2 . 1 . 4 培养基 l b : 胰蛋白 陈 l o g / l ， 酵母抽提物 5 g / l , n a c l l o g / l ， 用1 n n a o h 调节p h 至 7 . 5 . l m :胰蛋白陈 1 0 g / l ,酵母抽提物 5 g / l , n a c l 5 g / l , m g s o , 7 h ,o 2 . 4 g / l ,琼 脂 1 8 g / l ，用1 n n a o h 调节p h 至7 . 0 . s o b : 胰蛋白陈 2 0 g / l ，酵母抽提物 5 g / l , n a c l 0 . 5 8 g / l , k c 1 0 . 3 8 g / l , m g s o , . 7 h , o 0 . 2 5 g / l , m g c 1 z . 6 h , 0 0 . 2 0 g / l ，用1 n n a o h 调节p h 至7 . 0 0 s o c : s o b + 2 0 m m o l / l葡萄塘 2 . 1 . 5 e l i s a 所需溶液: p b s : n a , h p o , . 1 2 h , o 2 . 9 g , k h , p o , 0 . 2 g , 8 . o g n a c l , k c 1 0 . 2 g 再加水至mo w , p h 7 . 0 包被液:0 . 0 2 m o l / l 碳酸缓冲液 ( c b s ) , p h 9 . 6 洗液:含0 . 1 % t w e e n - 2 0 的0 . l m o l / l p b s 缓冲液，p h 7 . 2 稀释液:含0 . 1 %b s a 的0 . l m o l / l p b s 缓冲液， p h 7 . 2 封闭液:含0 . 1 %b s a 的o . i m o l / l p b s 缓冲液， p h 7 . 2 底物液: 含 0 . l m g / m l 3 3 5 5 一四甲 基联苯胺 ( t m b )的 磷酸盐一 柠棣酸缓冲 液( p h 5 .4 ) ， 用前加5 p 1 3 0 % h , o ,/ 1 o m l 2 . 2方法 2 . 2 . 1原核表达质粒的构建 2 . 2 . 1 . 1重组质粒 v r g h 的小批童提取 参照z h a n g y i z h e n g 方法 进行。 将l k 平 板 上 含 有重 组 质粒的 菌 落 接种于 2 m l l k( 含5 0 e t g / l 1 k a n a m y c i n 的l b 培养 基) ， 3 7 0 c 振摇过夜。 将 培养 菌液 转 移到e p 管中， 1 2 , 0 0 0 r m p 离 心l 分 钟， 去 上 清， 加 入1 0 0 4 1 溶 液1 ( 1 4 6 葡 萄 糖， 2 . 5 m m o l / l t r i s - h c 1 , p h 8 . 0 , 5 0 m m o l / l e d t a ) ， 悬 浮 菌 体， 室 温 放 置5 分 钟 ; 加入2 0 0 v i 溶液1 1 ( 0 . 2 m o l / l n a o h , 1 4 6 s d s ) ， 翻转混合， 冰浴5 分 钟: 加 四川大学硕士学位论文 入1 5 0 1 x 1 溶 液i i i ( 3 m o 1 / l k a c , p h 4 . 8 ) ， 翻 转混合， 冰浴1 0 分钟; 1 2 , 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟， 转移上清至新e p 管内， 加入两倍体积的冰无水乙 醇， 混匀， - 2 0 c 放置3 0 分钟;1 2 , 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟， 去上清7 0 %乙醇清洗d n a 沉淀， 适 度干燥后加 入5 0 1x 1 t e r ( 含1 0 h g / m l r n a s e a 的t e 缓 冲液) ， 3 7 0 c 水 浴1 0 分钟: 取5 h l 电 泳 检测， 剩余4 5 1 x 1 加 入4 . 5 g l 3 m o l / l k a c ( p h 4 . 8 ) . 9 0 1 1 1 冰无水乙醉，混匀，- 2 0 0 c放置3 0分钟，离心去上清，7 0 9 6 乙醇洗涤沉淀，千 燥后，溶于 d d h 2 0 ，- 2 0 0 c 保存备用。 2 . 2 . 1 . 2 v r g h / b a m h i +e c o r i 酶切片段回收 将含有草鱼g h的重组质粒v r g h用b a m h i / e c o r i 双酶切后，产物进行 1 .2 %琼脂糖凝胶电泳， 5 v / c m电泳 i 小时后，溟乙锭染色，在紫外灯下切下 含片段 约6 7 0 b p 大小的 凝 胶， 采用m b i 公 司 琼 脂 糖 凝 胶d n a 抽 提 试 剂 盒 回 收 d n a片 段。 称凝胶重 量， 按每l 0 0 m g 加3 0 0 1 1 1 琼 脂糖 溶解缓 冲液， 5 5 0 c 水 浴 1 0 分钟， 每2 - 3 分钟 漩涡 混 合一次; 待 完 全溶 解后， 加 入1 0 川s i l i c a 悬 浮液， 5 5 0 c水浴 1 0 分钟，侮2 - 3 分钟漩涡混合一次，1 2 , 0 0 0 r p m 离心5 秒， 弃上清: 用5 0 0 1x 1 w a s h i n g b u ff e r 重 悬 沉 淀， 1 2 , o o o r p m 离 心5 秒， 弃 上 清; 5 0 0 p l w a s h i n g b u ff e r 沉淀两次后， 室温干燥沉淀1 5 分 钟， 加5 0 闪 d d h , 0 悬浮沉淀， 5 5 0 c水浴 1 0 分钟， 每2 - 3 分钟漩涡混合一次，1 2 , o o o r p m 离心 1 分钟，转移上清于新e p 管中，- 2 0 0 c保存备用。 2 . 2 . 1 . 3载体d n a 的制备 取 p g e x - 4 t - 1 质粒2 0 p 1 ， 加入 1 0 p l i o x k酶切缓冲液， 5 p l b a m h i 酶 ( i o u / a l ) , 5 p 1 e c o r l 酶切 ( iou/pi), 6 0 p l d d h 2 0 , 3 7 0 c 水浴3 小时，电 泳检 查酶切效果，若酶切完全， 加入1 / 1 0 体积3 m o l/ l k a c ( p h 4 . 8 ) , 2 倍体积冰无 水乙醇，- 2 0 0 c 放置3 0 分钟，1 2 , o o o r p m 离心1 0 分钟，7 0 % 乙醇洗涤沉淀，干 燥 后. 溶 于5 0 g l d d h z0 - 2 . 2 . 1 . 4 c g h c d n a 片 段与p g e x - 4 t - 1 载体的连接 取制 备的b a m h i / e c o r l 双 酶切的p g e x - 4 t - 1 质 粒d n a 1 :5 0 稀释， 取 稀 释的载体 1 g i ， 加入回 收的b a m h i / e c o r i 双 酶切的c g h c d n a 片 段2 p 1 , l p l 四川大学硕士学位论文 t 4 d n a连接酶 ( t a k a r a 公司) ， i p l l o x 反 应缓冲液， 5 11 1 d d h 2 0 , 1 6 0 c水浴连 接 1 6小时。 2 . 2 . 1 . 5连接产物的转化 2 . 2 . 1 . 5 . 1 感受态细胞的制 备 参照h i r o a k i 等方法进行，稍作改动。 衫 匕 取e . c o l i t o p i o f 单菌落。接 种于2 m 1 s o b , 3 7 0 c 振摇过夜; 取0 . 5 m 1 过夜培养的菌液接种于5 0 m 1 s o b ,继续 振摇2 小时;冰浴3 0 分钟， 4 , o o o r p m 4 0 c 离心1 0 分钟，去上清， 用l m l 预冷 的t b ( 0 . 2 m o l / l k c l , 0 . 0 5 4 m o l / l m n c l z , 0 . 0 1 5 m o l / l c a c 1 0 . 0 1 2 5 m o l / l k m e s ) 悬浮菌体， 再加入1 4 m 1 t b ， 冰浴1 0 分钟， 4 , o o o r p m 4 0 c 离心1 0 分钟， 去上 清， 4 m 1 t b 悬 浮 细 胞， 加2 8 0 1x 1 二 甲 基 亚 讽( d m s o ) ， 分 装 小 管( 2 0 0 u 1 / 管 ) 后， 液 氮 冻存备用。 2 . 2 . 1 . 5 . 2 质粒d n a 对大肠杆菌的转化 参照z h a n g y iz h e n g 方 法 进 行。自 液 氮 中 取出 感 受 态细 胞， 室 温 解 冻; 取 3 1 x l 连接产物加7 1x 1 d d h 2 0 稀释， 与2 0 0 u 1 感 受态 细 胞混 匀， 冰浴3 0 分 钟， 4 2 0 c 热 冲击 9 0 秒， 冰浴3 分 钟， 加 入8 0 0 1x 1 s o c , 3 7 0 c 缓 慢摇 振1 小 时， 5 ,0 0 0 r p m 离心5 分钟， 去8 0 0 1 x 1 上 清， 用剩 余2 0 0 u 1 上 清 悬浮 细 胞， 涂布于 含5 0 1 x g l m l a m p 的l m培养基，3 7 0 c倒置培养 1 8 小时。 2 . 2 . 1 . 6重组原核表达质粒的筛 选和鉴定 2 . 2 . 1 . 6 . 1菌落p c r 在5 0 u 1 体系中加入5 u l 1 0 x p c r 反应缓冲液， 4 u 3 4 0 m m d n t p ，上、 下游 引 物各l u l ( 1 5 p m o l / l ) , l u l t a q ( 5 u n i t s / u l ) , 3 8 u l d d h , 0 ， 挑取l a 平板上的 菌 落作 为模板. 反应混合物混匀后在上面加一层约2 0 u 1 石蜡油， 进行p c r 扩增。 反应 条件如下: 9 4 预变性4 m i n ，每次 循环9 4 变性4 5 s , 5 6 退火 4 5 s , 7 2 延 伸6 0 s ， 共3 0 个循环;最后在7 2 下再延伸l o m i n 。扩增产物在1 % 琼脂糖凝胶 上电 泳检测，并用g d - 8 0 0 凝胶图 像分析系统照像分析。 2 . 2 . 1 . 6 . 2质粒 p c r 四川大学硕士 学位论文 提取可能的重组质粒。 在2 0 0 u l 的e p 管中 加入s u l 1 0 x p c r 反应缓冲液， 4 u l 4 0 m m d n t p ， 上、 下 游引 物各l u l ( 1 5 p m o u l ) , l u l 模板质粒 ， i u l t a q ( 5 u n it s / u l ) , 补d d h 2 0 至5 0 u l ， 反应混合物混匀后在上面加一层约2 0 u 1 石蜡油，进行p c r 扩 增。 反应条件如下: 9 4 预变性2 m i n ，每次循环9 4 变性4 5 s , 5 6 0c 退火 4 5 s , 7 2 延伸6 0 s ， 共3 0 个循环; 最后在7 2 下再延伸i o m i n 。以p g e x - 4 t - 1 空 载体为模板， 设置为相应的负对照， 扩增产物在 1 9 6 琼脂糖凝胶上电泳检测，并 用g d - 8 0 0 凝胶图像分析系统照像分析。 2 . 2 . 1 . 6 . 3 质粒d n a b a m h i / e c o r i 酶切及电泳观察 按常规反应体系进行质粒d n a 的b a m h l 酶切，e c o r 工 酶切和b a m h i / e c o r i 双酶切。 b a m h i 酶切:2 0 p 1 体系中 加d n a 5 p 1 , l o x k反应缓冲液2 p 1 , b a m h i ( l o p / a d 1 p 1 , d d h 2 01 2 a i : e c o r i 酶 切: 2 0 p 1 体系中 加d n a 5 p 1 , l o x h 反 应 缓冲液2 p l , e c o r i ( 1 0 州 p l ) 1 p 1 , d d h 2 0 1 2 p l ; b a m h i / e c o r i 双酶 切: 2 0 p 1 体系中 加d n a 5 p l , i o x k反 应缓 冲液2 p l , b a m h i ( i o p / p l ) i p l , e c o r i ( 1 0 川 闪 ) i p l , d d h 2 0 l l p l , 3 7 0 c水浴2 小时， 分别 取l o u l 酶切产物在1 . 2 9 6 琼脂糖凝胶上 电 泳检测，电 泳完成后， e b 染色， 紫外光下观察， 并用g d - 8 0 0 凝胶图 像分析 系统照像分析。 2 . 2 . 2 以r t - p c r 检测重组子在诱导条 件下的转录 情况 接种含 重组质 粒的 菌 落和含 有p g e x - 4 t - 1 空 质 粒的菌 落于2 m l l a培养 基， 3 7 0 c振荡培养4 小时至o d 6 0 0 = 0 . 9 ， 加入i p t g至终浓度o . l m m o l/ l ， 继续 培养4 小时取样， 参照总r n a提取试剂盒的使用说明书提取重组子的总r n a . 参照 b o e h r in g e r m a n n h e i m ( b m)公司的使用说明书，用 t i t a n o n e t u b e r t - p c r k i t 以 上述提取的重组子总r n a为 模板进行r t - p c r 扩增， 条 件如下: 5 0 反转录3 0 分钟，然后9 4 预变性2 分钟，以 后每个循环9 4 变性1 分 钟、 5 6 退火3 0 秒、 7 2 延伸1 分钟， 共3 0 个循环， 最后7 2 再延伸1 0 分 钟。以p g e x - 4 t - 1 质粒转化子的总r n a作为， 相应的负对照。以1 % 琼脂糖 电 泳检测， e b 染色， 紫外光下观察， 并用g d - 8 0 0 凝 胶图 像分析系 统照 像分析。 2 . 2 . 3融合蛋白的诱导表达及样品制备 r q / i i 全9堕巡i b l一一一一一一一一 接种含重组质粒的菌落于2 m l 三碳