（遗传学专业论文）采采蝇组织特异性基因的克隆、分子鉴定及功能表达.pdf

中文摘要 第一章采采蝇中肠特异表达的基因克隆与分子鉴定 采采蝇( g l o s s i n i d a em o r s i t a n sm o r s i t a n s ) 多见于中非及东非，是非洲锥虫 ( t r y p a n o s o m e ) 的介体，主要传播嗜睡病( 人) 和非洲锥虫病( 牲畜) ，从而严重 危害了人民的身体健康并阻碍了农业的发展。f 在整个发育时期，其仅能以吸血为 、 生。研究表明，昆虫肠道中有许多与食物蛋白的消化有关的酶。在包括采采蝇在 内的很多昆虫中这些酶还被证明与病原体在昆虫体内的定居和发育有关。i 本篇论文克隆和分析了两个来源于采采蝇中肠( m i d g u t ) 的、编码丝氨酸蛋 白酶( s e r i n ep r o t e a s e ) 的基因：g l o s s i n a 丝氨酸蛋白酶一1 ( g s p l ) 和g l o s s i n a 丝 ， 氨酸蛋白酶2 ( g s p 2 ) 。这两个基因的蛋白产物的5 末端均含有疏水性的信号 肽序列，故而它们编码的都是蛋白前体。g s p l 编码的成熟蛋白含有2 4 5 个氨 基酸残基，分子量为2 6k d a 。g s p 2 编码的成熟蛋白含有2 2 8 个氨基酸，分子 量为2 4k d a 。研究还证明，正如所有丝氨酸蛋白酶所显示的，由这两个基因编 码的多肽序列含有a s p h i s s e r 催化中心，该中心周围分布着若干保守的氨基酸 残基。另外：这两个蛋白亦拥有由6 个半胱氨酸组成的3 个二硫键，这在无脊 椎动物丝氨酸蛋白酶中也是很典型的。根据其底物特异性，g s p l 基因编码的 蛋白为胰凝乳蛋白酶f c h y m o t r y p s i n ) ，而g s p 2 基因编码的蛋白具有胰蛋白酶 ( t r y p s i n ) 的活性。采采蝇基因组分析发现，这两个基因均只有l 一2 个拷贝。在整 个食物消化过程中，g s p l 和g s p 2m r n a 表达水平并无明显变化，即使是在 刚羽化的采采蝇中肠中，亦能检测出高水平的m r n a 表达。但是，在采采蝇喂 血之后，肠腔( 1 u m e n ) 中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性却有所提高，肠细胞 中这两种酶的活性还有明显增高。因此，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶表达的调控 发生在转录后水平上。研究还表明，g s p l 和g s p 2 基因的编码序列、喂血后 的表达状况均与厩螫蝇( s t o m o x y sc a l c i t r a n s ) 中的丝氨酸蛋白酶颇为相似。 除此以外，我们还克隆和分子鉴定了采采蝇中肠的其它三个基因：组织蛋 白酶b ( c a t h e p s i nb ) 基因( g m c a 回、锌金属蛋白酶( z i n c m e t a l l o p r o t e i n a s e ) 基因( g m z ；n p ) 和锌羧肽酶( z i n c c a r b o x y p e p t i d a s e ) 基因( g m z c p ) 。g m c a t b 编码一个含有3 4 0 个氨基酸的蛋白，分子量为3 8 ，2k d a 。g m z m p 金长为8 5 4b p ， 编码的蛋白含2 5 4 个氨基酸，分子量为2 9k d a 。g m z c p 全长为1 3 1 9b p ，编码 的蛋白由3 5 4 个氨基酸组成，分子量为4 0k d a 。所有这三个基因n 末端均含有 信号肽序列。结构分析表明g m c a t b 和g m z m p 是以酶原的形式被表达出来的， 经过蛋白翻译后加工，它们才具有活性。值得一提的是许多锌羧肽酶序列所拥 有的激活位点并不能在g m z c p 中发现。实验结果证实，g m c a t b 的转录是组 成型的 ， 而 g m z m p 和 g m z c p则不然 。 在 刚羽化的成虫中，g m z m p 的m r n a 水平很低，g m z c p 的m r n a 表达则检测 不到。喂血几个小时后，这两个基因的转录均被诱导，并且在整个消化过程中 保持较高水平。另外，我们还发现g m c a t b 和g m z c p 对于免疫刺激较敏感。 在感染了锥虫的采采蝇中，它们的表达水平都比未感染的采采蝇高。、 。 羌键词：昆虫，采采蝇，丝氨酸蛋白酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，组织蛋白 酶曼_ 一箨金属蛋白酶，锌羧肽酶，中肠，锥虫，免疫刺激 一7 第二章采采蝇脂肪体特异表达的几丁质酶基因克隆及其功能表达 科学工作者已经克隆了在昆虫幼虫蜕皮过程中起作用的几丁质酶( c h i t i n a s e ) 。 然而，只在昆虫脂肪体f f a tb o d y ) 内表达的几丁质酶却未见报道。本文克隆及 分子鉴定了一个独特的几丁质酶基因g c f f ，。g 劬打，只在采采蝇脂肪体内特 异表达，全长为1 5 5 1b p ，编码的蛋白由4 6 0 个氨基酸组成，分子量为5 lk d a 。 f 7 研究还表明g c h # i 含有信号肽序列，故o c h i t l 可能被分泌到血淋巴 ( h e m o l y m p h ) 中去。通过o c h i t l 与其他昆虫几丁质酶序列的比较，我们发现 有两个催化氨基酸残基a s p l5 0 和g l u 在所有序列中均很保守。进一步研究 证实g c h i t l 中还富含有丝氨酸一苏氨酸结构域和半胱氨酸结构域，这在许多几 丁质酶的c 味端也都很普遍。s o u t h e r n 杂交表明在gm m o r s i t a n s 基因组中， g c h i t l 是单拷贝基因。n o r t h e r n 杂交证实g c h i t l 只在采采蝇成虫的脂肪体中 表达，但是在其幼虫及蛹中却不表达。g c h i t l 蛋白活性在喂血2 4 小时后达到 最高水平，而在刚羽化的或饥饿的成虫中，却很难检测得到。d r o s o p h i l a 表达 系统被用来表达g c h i t l 。表达的重组蛋白( r e c g c h i t l ) 经纯化后，进一步分 析了其依赖于p h 值的活性状况，并测试了其对抑制剂阿洛氨菌素( a l l o s a r n i d i n ) 的敏感程度。分析与测试结果表明r e c g c h i t l 不仅具有几丁质酶的生物活性， 而且还具有较宽的p h 范围。当p h 在7 5 8 5 时，r e c g c h i t l 均有活性。阿洛 氨菌素浓度大于o 1 肛m 时，r e c g c h i t l 的活性就被抑制。w e s t e m 印迹指出 g c h i t l 蛋白仅在脂肪体和乳腺体中有表达。有趣的是，虽然于转录水平上在幼 虫及蛹中检测不到c h i t l 的表达，g c h i t l 蛋白却在幼虫及蛹中存在。g c h i t i 的 表达还在喂血2 4 小时后有所提高。 关键词：昆虫，采采蝇，脂肪体，几丁质酶，幼虫，蛹 “”；j 纵。；，j 锄粤扫。、 a b s t r a c t c h a p t e ro n e ：i d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f g e n e st h a t a r ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di nt h em i d g u tt i s s u e so fg ，扎 m o r s i t a n si nr e s p o n s et ob l o o df e e d i n g i n s e c tg u te n z y m e sa r ei n v o l v e di nd i g e s t i o no fd i e t a r yp r o t e i n s a d d i t i o n a l l y , t h e s e e n z y m e sh a v eb e e ni m p l i c a t e di nt h ep r o c e s so fp a t h o g e ne s t a b l i s h m e n ti ns e v e r a l i n s e c t si n c l u d i n gt h et s e t s ef l y ( d i p t e r a ：g l o s s i n i d a e ) ，w h i c hi st h ev e c t o rf o r a f r i c a nt r y p a n o s o m e s b o t ht h em a l ea n df e m a l et s e t s ec a r lt r a n s m i tt r y p a n o s o m e s a n db o t ha r es t r i c tb l o o df e e d e r st h r o u g h o u ta l ls t a g e so f t h e i rd e v e l o p m e n t i nt h i st h e s i s ，w ed e s c r i b et h ec h a r a c t e r i z a t i o no ft w op u t a t i v e s e r l n e p r o t e a s e e n c o d i n gg e n e s ，g l o s s i n as e r i n ep r o t e a s e 1 ( g s p l ) a n dg l o s s i n as e r i n e p r o t e a s e - 2 ( g s p 2 ) f r o mg u tt i s s u e b o t hp u t a t i v ee d n ap r o d u c t sr e p r e s e mp r e p r o p e p t i d e sw i t hh y d r o p h o b i cs i g n a lp e p t i d es e q u e n c e sa s s o c i a t e dw i t ht h e i r5 - e n d t e r m i n u s t h eg s p lc d n ae n c o d e sap u t a t i v em a t u r ep r o t e i no f2 4 5a m i n oa c i d s w i t ham o l e c u l a rm a s so f 2 6k d a ，w h i l et h ep r e d i c t e ds i z eo ft h e2 2 8a m i n oa c i d s m a t u r ep e p t i d ee n c o d e db yg s p 2e d n ai s2 4k d a b o t hd e d u c e dp e p t i d e sc o n t a i n t h ea s p h i s s e rc a t a l y t i cm a da n dt h ec o n s e r v e dr e s i d u e ss u r r o u n d i n gi t ，w h i c ha r e c h a r a c t e r i s t i co fs e r i n ep r o t e a s e s i na d d i t i o n ，b o t hp r o t e i n sh a v et h es i xc o n s e r v e d c y s t e i n er e s i d u e st of o r mt h et h e e - c y s t e i n eb o n d st y p i c a l l yp m s e mi ni n v e r t e b r a t e s e r i n ep r o t e a s e s b a s e do nt h ep r e s e n c eo fs u b s t r a t es p e c i f i cr e s i d u e s ，t h eg s p lg e n e e n c o d e sac h y m o t r y p s i n - l i k ep r o t e a s cw h i l eg s p 2g e n ee n c o d e sf o rap r o t e i nw i t h t r y p s i n - l i k ea c t i v i t y b o t hp r o t e i n sa r ee n c o d e db yf e wl o c ii nt s e t s eg e n o m e b e i n g p r e s e u ti no n eo rt w oc o p i e so n l y t h em r n ae x p r e s s i o nl e v e l sf o rt h eg e n e sd on o t v a r ye x t e n s i v e l yt h r o u g h o u tt h ed i g e s t i v ec y c l e ，a n dh i g hl e v e l so fm r n a s c a l lb e r e a d i l yd e t e c t e di nt h eg u tt i s s u eo fn e w l ye m e r g e df l i e s t h el e v e l so ft r y p s i na n d c h y m o t r y p s i na c t i v i t i e s i nt h eg u tl u m e ni n c r e a s ef o l l o w i n gb l o o df e e d i n ga n d c h a n g es i g n i f i c a n t l yi nt h eg u tc e l l st h r o u g h o u tt h ed i g e s t i o nc y c l e h e n c e ，t h e r e g u l a t i o n o f e x p r e s s i o n f o r t r y p s i na n dc h y m o t r y p s i n o c c u r s a tt h e p o s t t r a n s c r i p t i o n a ll e v e l i nt s e t s e b o t ht h ec o d i n gs e q u e n c e sa n dp a t t e r n so f e x p r e s s i o no fg s p la n dg s p 2g e n e sa r es i m i l a rt ot h es e r i n ep r o t e a s e st h a th a v e b e e nr e p o r t e df r o mt h eb l o o df e e d i n gi n s e c ts t o m o x y sc a l c i t r a n s w ea l s od e s c r i b et h em o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o no fo t h e rt h r e eg u tg e n e s ：c a t h e p s i n b ( g m c a t b ) ，z i n c m e t a l l o p r o t e a s e ( g m z m p ) a n dz i n c - c a r b o x y p e p t i d a s e ( g m z c p ) t h ec d n af o rg m c a t be n c o d e sap r o t e i nf o r3 4 0a m i n 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z a t i o na n dc l o n i n go fa n o v e lc h i t i n a s eg e n e ( g c h i t l ) t h a ti se x p r e s s e ds p e c i f i c a l l yi nt h ef a tb o d yo fa d u l t t s e t s ef l i e s ，gm m o r s i t a n s t h eg c h i t le d n ai s15 5lb pi nl e n g t ha n dh a sa4 6 0 a m i n oa c i d so p e nr e a d i n gf r a m ef o rc o d i n ga5 1k d ap r o t e i n t h eg c h i t le d n ah a s s i g n a lp e p t i d es e q u e n c e ，i n d i c a t i n gt h a ti tm i g h tb es e c r e t e di n t ot h eh e m o l y m p h a l i g n m e n tw i t ho t h e ri n s e c tc h i t i n a s es e q u e n c e ss h o w st h ea c t i v es i t ec e n t e r e do n t h et w oc a t a l y t i cr e s i d u e sa s p l5 0a n dg l u mi sc o n s e r v e di n a l la l i g n e ds e q u e n c e s g c h i t1a l s oh a st h es e r i n e t h r e o n i n e - - r i c hd o m a i na n dc y s t e i n e - r i c hd o m a i nf o u n di n t h ec t e r m i n u so fm a n yc h i t i n a s e s s o u t h e r nb l o tr e s u l t ss u g g e s tt h a tg c h i t lm a y e x i s ta sas i n g l ec o p yg e n ei nt h egm m o r s i t a n sg e n o m e n o r t h e mb l o tr e s u l t s i n d i c a t eg c h i t lg e n ei se x p r e s s e di nt h ea d u l tt s e t s ef l i e s ，b u tn o ti nl a r v aa n dp u p a g c h i t li sa t i s s u e s p e c i f i cg e n e ，o n l ye x p r e s s e di nt h ef a tb o d yt i s s u e c h i t i n a s e a c t i v i t yr e a c h e si t sh i g h e s tl e v e l2 4h o u r sa f t e rb l o o df e e d i n gi nt h ef a tb o d y , b u ti s b a r e l yd e t e c t a b l ei nt e n e r a lf l i e sa n ds t a r v e df l i e s g c h n le d n aw a sa l s oe x p r e s s e d u s i n gd r o s o p h i l a e x p r e s s i o ns y s t e m a f t e rp u r i f i c a t i o n ，p h d e p e n d e n ta c t i v i t y p r o f i l e s a n da l l o s a m i d i ni n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o nc u r v e sf o rr e c g c h i t lw e r e d e t e r m i n e d r e s u l t ss h o wr e c g c h i t lh a dac h i t i n a s ea c t i v i 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p f u li nm yr e s e a r c h ：d r q i u y i n gc h e n ，p o s t g r a d u a t es t u d e n ts o n gl i ， d r x i a o a ic h e n ，d r l e y l aa k r n a n ，g r a d u a t es t u d e n t sr g t ar i oa n d p a t r i c i as t r i c k l e r ，d r z h e n g r o n gh a oa n dr e s e a r c ha s s o c i a t ei r e n e k u s u m b a t h e r ew e r eo t h e r sw h om a d em yw o r kp o s s i b l ei na d d i t i o nt ot h ea k s o y l a bm e m b e r s 1w o u l dl i k et oe x p r e s sm ys i n c e r eg r a t e f u l n e s st om y a d v i s o r sp r o f s c c t a na n dd a l e n gs h e no f f u d a nu n i v e r s i t y 1w o u l d a l s oe x p r e s sm y s p e c i a lt h i n k st op r o c h a n g b e nl io ff u d a nu n i v e r s i y i tw a st h e mw h og a v em et h i sv a l u a b l eo p p o r t u n i t yt ov i s i tt h e p r e s t i g i o u sy a l eu n i v e r s i t ya n do b t a i nb e n e f i c i a lp h d t r a i n i n g a l lo f t h e mh a v eb e e ng i v i n gm ea l le x a m p l ef o rh o wt ob 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