（遗传学专业论文）类黄酮促进拟南芥生长素极性运输的研究.pdf

塑望查兰堡主堂垡堡塞 一 摘要 硝酸根是影响1 贝| j 根发生的重要因素，一方面，硝酸根对于侧根发生必不可少， 而硝酸根浓度过高则又抑制了侧根的发生。在浓度相对较低的条件下( 5 0m m ) 硝酸根只影响侧根生长，而对主根没有明显影响；随着浓度的提高，硝酸根对主 根的延伸也起到了明显的抑制作用。同时，较高浓度的硝酸根还降低了生长素的 敏感度。 生长素极性运输( p o l a r a u x i n t f a l l s p o n ，p = 舡) 对侧根发生和根尖向地性起着 重要的调节作用，添加外源生长素极性运输抑制剂不仅抑制了侧根发生，同时还 便根尖丧失了向地性。类黄酮物质由于分子结构上同r 玎抑制剂n p ：a 十分相似， 长久以来被人们认为内源的生长素极性运输抑制剂。但我们在实验中发现，类黄 酮对根系发生的抑制是与高n 相联系的。对于向地性，类黄酮中的一种 q u e r c e t i n 不但不抑制，反而促进向地性诱导超向地性。 我们在最适合侧根发生的硝酸根浓度( o 2h l m ) 条件下，通过转移实验来 研究类黄酮对于侧根发生的影响。在我们的体系中，q u e r c e t i n ( q ) 对主根和侧根 的延伸都有一定的抑制作用。原基统计结果表明，q 对侧根原基发生的影响和 n p a 有着根本的不同：q 不影响侧根原基的发生，而只影响原基的延伸，使侧 根发生比正常延迟一步。n p a 则不同，它既抑制原基的发生，还影响到原基的 延伸。测量拟南芥下胚轴长度结果表明，q 促进了下胚轴的延伸，这一表型与生 长素极性运输增强相联系。 d r j ? j g 店报告株系染色和c 】i a a 测薰拟南芥茎 段的生长素运输能力结果表明q 不但不抑制反而促进了生长素运输。 在向地性方面，我们发现q 能够增强拟南芥的向地性诱导超向地性。一 方面q 促进了下胚轴的向光生长，另一方面，促进了根尖的向地性，在8 0 。培养 时，q 诱导根尖钻入培养基中。在旋转培养时，经过q 处理的根尖比对照提前达 到9 0 。药物学实验结果表明，q 诱导超向地性来自于末端特异性结构，同时细胞 内的c a ”和c a m p 等二级信使也参与了这一过程，并且生长素极性运输也是发生 超向地性所不可缺少的条件。所有的这些结果表明，q u e r c e t i n 在植物中不是直接 作为生长素极性运输抑制剂存在的，而更多的是在信号转导水平上进行调节，从 而影响到生长素极性运输。 浙江大学硕士学位论文 关键词：拟南芥生长素极性运输突变体硝酸根侧根原基向地性超向地性 类黄酮槲皮素信号转导 塑坚查兰堡圭堂壁兰兰一 a b s t r a c t n i t r a t er e g u l a t e sl rd e v e l o p m e n t o no n eh a n d ，n j t r a t ei sn e c e s s a r i l y f o rl r d e v e l o p m e m ，o nm e o t h e rh a l l d ，1 1 i g hl e v e lo fn i t r a t ei i l l l i b i t e sl r 黟o w t l l w h e n t h e c o n c e n t r a t i q ni sb w ( 5 0m m ) 的硝酸根显著 抑制主根的生长，在相对较低的浓度下( 5 0m m ) ，硝酸根对侧根发育也起着重 要的调节作用。一方面，硝酸根严重抑制了侧根的发生，在我们的体系中浓度高 于l om m 的硝酸根存在下，培养8d 时很少有侧根发生。另一方面，硝酸根又 是侧根发生所必需，我们曾经用1 m mn h 4 c l 来代替硝酸钾作为n 源，经过1 2d 的培养，侧根形成受到严重抑制，并且整个苗生长都偏小。表明硝酸根对侧根发 ，的影响不仅仅体现在作为n 源，而更是作为调节信号参与发育的调控。 生长素在根系发育方面起到了至关重要的作用，添加外源生长素能够显著改 变根的发育：主根变短，侧根数日显著增多。我们发现，在使用0 0 5umn a a 时，在低浓度硝酸根的培养条件下，能够明显表现出生长素的作用，而在较高浓 度硝酸根 5 0m m ) 的培养条件下，生长素的调节作用被大大减弱。表明在高浓 度硝酸根的条件下生长素敏感度( a u ) ( i ns e n s i t i v 时) 有所降低。 通过d 霞p g 船报告株系能够反映在不同硝酸根浓度的培养条件下，生长素 在植物体内的分布情况。在高n 的培养条件下，生长素在根尖得积累要比低n 高表现出抑制生长素从根尖往上运输( b a s i p e t a l 乜a 1 1 s p o r t ) 的分布特点。同时 高n 处理的拟南芥在根尖伸长区的内皮层和形成层这些极性运输所经过的区域 出现了生长素积累，表明商浓度硝酸根使生长素极性运输在这些区域受到延滞。 5 结论 硝酸根作为必需的n 源，对拟南芥根系统发育有着重要的影响。在较低浓 度下( 7 0m m ) ，硝 酸根显著抑制主根的延伸。对于侧根的发育，一方面硝酸根对于侧根发生不可缺 少，但硝酸根同时也是侧根延伸的抑制信号。同时高浓度的硝酸根也使得拟南芥 对外源生长素的敏感度降低ad 只j j ? g ，s 报告株系结果表明，较高浓度的硝酸根 还延滞了生长素的极性运输。 浙江大学颂士学位论文 第三章类黄酮对侧根发育影响研究 1 前言 类黄酮是一大类植物次生代谢产物，在植物体内有着广泛的分布。其基本的 c 骨架经过基团修饰后形成各种类黄酮物质。植物中类黄酮合成途径目前已经有 了比较清楚的了解，已经发现了好几个调控类黄酮合成的基因，其中包括查尔酮 合成酶基因( c h a l c o n es y n t l l 酗e ，c h s ) 。c h s 是类黄酮合成通路中的第一个关键 酶，调控着下游其他类黄酮的合成。其产物柚皮素( n 撕n g e n i n ) 是其他黄酮的 前体，经过一些基团的修饰，从而合成4 ，5 ，7 三羟黄酮醇( k a e m p f e r o i ) 、槲皮素 ( q u e r c e t i n ) 等类黄酮( 图3 5 ) 。 类黄酮在植物体内分布广泛，m u p h y 等发现在拟南芥中发现类黄酮的分布 具有组织特异性，4 ，5 ，7 三羟黄酮醇、槲皮素和柚皮素等类黄酮主要积累在下胚 轴上端、根茎交界和根尖远端伸长区，而通过放射性同位素标记生长素测量结果 显示这些区域也是生长素富集区( m u p h ye f 甜，2 0 0 0 ) 。早在1 9 8 8 年j a c o b s 等就 发现许多类黄酮物质如槲皮素、4 ，5 ，7 三羟黄酮醇等具有特异性竞争结合n p a ( 1 一n 氨甲酰苯甲酸萘酯，一种生长素极性运输抑制剂) 受体的活性，并在许 多组织中影响到生长素的运输( j a c o b se f 口，1 9 8 8 ) 。而且，从分子结构上来看， 类黄酮基本骨架类似于n p a ( 图3 1 ) ，这些结果让人推测类黄酮是一种植物内源 的生长素极性运输抑制剂( b r o w n ，e r 口，2 0 0 1 ；m u p h yp f 甜，2 0 0 0 ；j a c o b sa n d r u b e 以1 9 8 8 ) 。 通过遗传学手段在拟南芥中筛选得到一系列类黄酮合成突变体。其中f ( f ，口，印甜鲫，f 胁彳) 最为引入注目。丁w 编码查尔酮合成酶( c h s ) ，它是类黄 酮合成途径中的第一个关键酶，该基因失活导致下游类黄酮合成不能进行 ( b u r b l l l i s 甜越，1 9 9 6 ) 。删突变体和野生型相比具有明显特征，首先缺乏茎顶端 生长优势，其次，次生根( 包括侧根和不定根) 数目增多，而且发生时期提前。 使用同位素标记i a a 对觯生长素运输能力进行测量发现，r f 4 突变体的b 踮e d e t a l 生长素运输能力明显提高，并且该表型能够被c h s 产物柚皮素所恢复。另外， 在培养拟南芥时添加类黄酮合成前体柚皮素，生长受到了抑制( b r o w n 吖口，。 塑垩查兰堡主堂些堡兰 2 0 0 1 ) 。这些结果为类黄酮是内源生长素运输抑制剂提供了进一步的证据。 c o o h 8 b 撇 c o o h hl g 鲥b n f j g 3 ls t n d 瑚屯0 fn p a ，d p c a n d q u e m e 岫 虽然上述结果非常具有说服力，但这些实验有一个共同的特点。就是这些实 验材料都是在高n 培养基上培养( m s 培养基) ，而这点与自然界生长情况有所 不同。在实验中我们发现类黄酮与硝酸根之间似乎存在着协同作用的关系。本实 验以低n 为培养条件，来研究类黄酮物质同生长素运输的关系和对侧根发生的 影响。 2 材料和方法 2 1 试剂和材料 槲皮素( s i g m a ) 、木黄酮( s i g m a ) 溶于二甲亚砜，柚皮素( s i g m a ) 溶于乙醇， 以上试剂母液浓度均为1 0 0m m ，过滤灭菌，使用时根据所需浓度稀释到培养基 中。n p a 购于t o k y ok a s e ik o g y oc o l t d 公司，溶解于乙醇，母液浓度为1 0m m ， 【h c 】i a a ( 9 of n c 0 1 ) ，d p b a ，d a s m p i 购于s i 舯a 公司。 d 足j ? j g c 心由j a n em u r f e n 博士( u n i v e 娼i t yo f m i s s o u 哦c o l u m b i a ) 惠赠。“突 变体来自n a s c 。 2 2 嗡 浙江大学硕士学位论文 2 2 种子萌发、处理和培养条件 种子萌发培养条件同第二章2 3 部分。 2 3 根长和下胚轴长度测量 方法同第二章2 5 部分。 2 4 侧根原基统计 发苗四天后，转移至处理培养基垂直培养四天。将整个拟南芥小苗转移到 2 5 戊二醛固定液中固定4h ，0 2m m 磷酸缓冲液清洗两次，显微镜下统计侧根 原基数目和所处的时期。为了提高检测效率和易于辨认原基所处时期，我们使用 了线粒体荧光染料d a s m p i ( 2 一( 4 - d i m e 也y la m i n o s t y d r l ) 一1 - m e t h y lp y r i d i n i 啪 i o d i d e ) ，3 0 0pm 染色2 分钟，然宿在荧光显微镜下以4 5 0 4 9 0n m 激发波长进行 检测。 d a s m p i 荧光染料：5 0 肛咖l ，1 0 t r i t o n ) ( - 1 0 0 。 戊二醛固定液：2 5 戊二醛，o 2m m 磷酸缓冲液( p h7 o ) 。 2 sg u s 染色和固定 方法同第二节2 6 部分。 2 6 类黄酮染色 方法参见p e e r “口f ( 2 0 0 1 ) 。取无类黄酮物质处理的拟南芥苗。在d p b a ( d i p h e n y l b o r i ca c i d 2 - a i i l i i l o e 出y le s t e r ) 染色液( 组分如下) 中染色l o 分钟后， 十荧光倒置显微镜下观察染色结果。 d p b a 染色液：o 2 5 d p b a ，o 0 0 5 强t o nx - 1 0 0 。 2 7 生长素测定 方法参见m u p h y 甜甜( 2 0 0 0 ) ，b r o w n 甜口f ( 2 0 0 1 ) 。 2 7 1 样品的制备 发苗条件同第二节。1 0l lm 发苗培养发苗，见光4 d 后，转移各处理培养基 处理培养2 d 。为了让茎不要贴在培养基上，培养角度可以倾斜至6 0 。剪刀除 2 3 、 浙江大学硕士学位论文 去小苗的子叶，用lul 微量进样器滴加o 2 u lo 0 5n m 【1 4 c 】i a a ( 4 5 0n c “ul ) 于茎顶端，让生长素通过茎往下运输。4 小时后剪取茎顶端2m m 、根苗交界处2 m m ，和根尖2 舢，分别放置于液闪杯中，液闪法进行测量各区段放射性同位 素的强度，用来标定生长素含量。每份样品取自2 5 棵苗，重复3 次。 2 7 2 同位素测量 用液闪法进行测量。 闪烁液配方：称取0 1 5 克p p 0 ( 2 ，5 一二苯基恶唑) 和o 0 0 3 克p o p o p 1 ，4 双( 5 苯基恶唑) 苯 溶于3 0 札二甲苯，再加入2 0m l 乙三醇甲醚，混匀。 在样品中加入5m l 闪烁液，黑暗中振荡萃取过夜后，于l k b w a l l a c1 2 1 9 r a c k b e t a 液闪仪上进行测定【1 4 c 1 a a 计数。 ， 3 结果 3 1 类黄酮染色结果 与m u p h y 等结果相似，在我们的实验中，类黄酮在根中分布区域主要在主 根顶端( 根苗交界处) 、根尖远端延伸区( 图3 2b ，d ) 。同时我们还发现，在整条 根中，形成层区域都有类黄酮积累，在荧光显微镜下形成两条很明显的条带( 图 3 2c ) 。在皮层细胞中，类黄酮积累也有组织特异性，主要积累在细胞膜表面， 特别是在细胞的顶端和侧向有很明显的积累( 图3 2a ) 。这些结果表明，在拟南 芥根中，类黄酮积累具有组织特异性，并且其积累区域和生长素极性运输调控的 关键区域有所重叠。 3 2 类黄酮对侧根生长的影响 为了研究类黄酮对拟南芥侧根发生的影响，在实验中我们使用了活性最高的 两种类黄酮( q u e r c e t i n 和g e n e s t i n ) 以及类黄酮前体( n a 血g e l l i n ) 。转移后8 天 统计主根长度，侧根长度及数目。在主根方面，类黄酮物质显著抑制生长( p 0 o i ) ( 图3 3a ) 。对于侧根，类黄酮物质不仅能减少每棵苗侧根的数目( 图3 3c ) ， 而且也降低了侧根相对长度( 单位主根的侧根长度) ( 图3 3b ) 。这些结果表明， 在添加外源类黄酮物质时，主根生长和侧根发生延长都受到抑制。 浙江大学颁i ：学位论史 同时我们还比较了生长素极性运输抑制剂n p a 以及d p c ( 一种离子通道抑制 剂，结构和n p a 、黄酮很相似，图3 1 ) 和q u e r c e t i n 对拟南芥根发育的影响。主 根方面，这三种药品都抑制主根生长( p 0 0 1 ) ( 图3 4 a ) 。在侧根方面，q 和 d p c 表现出了类似的抑制作用，但相对于n p a ，抑制作用要轻。n p a 在1 0um 时完全抑制住了侧根的发生，经过8d 的处理，侧根的数目为o ( 图3 4b 、c ) 。 这些结果暗示了虽然类黄酮物质具有抑制侧根发生的作用，但这种抑制作用可能 并不是来自对生长素运输的直接抑制，而更有可能是由于结构上的相似，而同 n p a 在某些功能上的重复。我们甚至将q 的使用浓度提高到1 0 0um ，但始终没 有达到n p a 在1 0u m 时的抑制效果。 3 3 类黄酮对侧根原基发生的影响 为了更确切都知道类黄酮物质对侧根发生的影响，我们在显微镜下统计了侧 根原基的数目，并和n p a 、d p c 作了比较( 表3 1 ) 。在这个实验中，我们使用 了两种培养方法：实验a 中，我们先在l ou m 低n 培养基上发苗，4 d 后再转 移到o 2 m m 适n 培养基上进行各种处理；实验b 中，则是直接在o 2 m m 适n 培养基上发苗并处理。这两种培养方式不同点在于实验a 允许在处理前就有侧 根原基形成( 并不延伸出来) ，而实验b 则是在侧根原基形成之前就进行处理。 在n p a 处理下，实验a 中仅有3 个停留在早期的原基，而在实验b 中，原基数 目为o ，表明n p a 既抑制侧根原基的发生，又抑制原基延伸。在d p c 处理下， 实验a 中，有大量的原基长出，而处于发育各个时期的原基数目几乎没有；在 实验b 中，侧根原基几乎为o 。可以认为，d p c 的对侧根发生的作用主要是在 原基发生阶段，而对于原基的延伸没有抑制作用。q 的处理在实验a 中对各个 时期的侧根原基影响不大，而在b 中，无论是2 5u m 还是1 0 0 p m 都没有侧根 生长出来，但在2 5um 的处理下，侧根原基总数目接近对照，而1 0 0 pm 的处 理大大减少了侧根原基数目( 仅1 7 个) 。这些结果表明，类黄酮物质q 对侧根 原基发育后期的延伸起着抑制作用，而高浓度的q 还影响到原基的发生。这些 结果表明，和生长素极性运输抑制剂不同，q 和d p c 只能影响到侧根发生过程 中的某个阶段，而生长素极性运输对于侧根发生整个过程都是至关重要的，因此， q 对于侧根发生的影响可能不是通过影响n 盯来实现的。 塑坚查兰堡圭兰垡堡兰 t a b k3 1 e m c t s 仰l r ，sp r i m o r d i u m n m 耳t i o na n de m e r g e n c e i nt h ee x p e r i m e n t s ，t h e c o c e n t 阳t i o n so f d p c ，n p aa r e1 5uma n d1 0 mr e s p e c t i v e i y ，a n d o f qi s2 5 um a n d 1 0 0umw i t ht h ei n d i c a t i o n so fq 2 5a n dq 1 0 0 i ne x p e r i m e n ta ，l r sp r i m o r d i u m s w e r e c o u n t e d4d a y st r a n s f e w h i l ei ne x p e r j m e n tb ，c o u n t e d8d a y sa f t c rd i n c t i yt 忡a t m e n t t h e v a l u e sa r ef r o ml os e e d i i n g s e x d e r i m e n ta c k n p a q 2 5 d p c e x d e r i m e n tb c k n 队 d p c q 2 5 q 1 0 0 1 03 36 2lo 82 91 02o 82 5 00 o 1 1 82 3 11 4 3 4 类黄酮合成突变体的侧根发生 我们使用了几种类黄酮合成突变体，在我们的培养体系中来观察其侧根系统 发生情况，试图为类黄酮在侧根发生过程中所起的作用提供参考。在这个实验中， 我们使用了f f 4 、酊、硝和，7 等4 个突变体，它们所突变的基因在类黄酮合成 路径中各自所处的位置如图3 5 所示。 在我们的实验体系中，“系列突变体的主根和侧根生长并未得到促进，相反， 无论在主根还是侧根方面，突变体都表现弱于野生型，特别是鲋突变体( 图3 6 ) 。 当补充外源类黄酮q ( 2 5um ) 时，突变体和野生型的主根和侧根的生长都受到 了抑制，这一点和类黄酮抑制根系生长是一致的。 ，突变体是类黄酮合成缺陷个体，它们分别在不同步骤中阻止了类黄酮合成 的进行。在我们的实验中出现了抑制生长的现象，可能是由于以下几个方面的原 因：l 、我们培养条件是低n ，对于侧根发生是最适浓度，但对于整个植株生长 却是不良环境，类黄酮合成是植物的一种抗逆反应。其合成受阻就会降低对逆境 ，钉加 钉0 犯 ”o ：2 体 0 o d o 浙江大学硕士学位论文 的反应能力，所以受到影响比较大；2 、这些突变体都是在类黄酮合成的某个阶 段阻止了反应的进行，这样就必然造成上步反应产物的过多积累。由于类黄酮 合成过程的许多中间代谢物都是苯酚类物质，这些物质的过多积累会导致生长受 到影响。 ( a ) ( b ) ( c ) 7 6 毯5 巡4 骤3 + h2 1 0 倒 业 喏 重 墨 罂 型o 1 鞲 o 6 垂i 器3 孽； o c kq 2 5 c k q 2 5g 2 5n a r 2 5 c k q 2 5 f i 9 3 3t h e i n n u e c e o f n a v o n o i d s 仰 脚i 画哆出m o t g m w 伍q i q u e r c e t i n ，g g e n e s 咖n a r ：聃r i n g 蛐j 2 5m n s 也e n c 姐蛔如nj 32 5um 浙江丈学硕士学位论文 ( a ) ( b ) ( c ) 7 6 暑5 受； 娶2 + h 1 0 0 6 刨 出0 5 墅o 4 髫 窨o 3 甭o 2 诺n 1 0 7 旺6 籁5 蓁； 嚣2 鞲l o c kn p a qd p c 上 c k qn p ad p c c k qn p ad p c f i g 3 4c 岫p a r j s o n0 f t h e 岫n 呦c 鹤0 fq n p a 矗n dd p co n 瑚ts y s t e m 山岫e x p e r i m e t ， t h ec o n c e n t r a t j o n s o fq n i aa n d d p c i s 2 5 ，1 0 u ma n d l 5 m l - 铭p e c t i v e l y 3 5 傩5 7 ：g 晒染色结果 我们使用了珊5 j ? g l 召株系来反应在类黄酮处理下，根尖生长素积累水平是 否发生变化，结果如图3 7 所示。在n p a 的处理下，根尖g u s 表达发生明显变 化，比对照染色更深，而且集中在根尖的底部，反应了生长素往外运输受阻( 图 浙江大学硕士学位论文 3 7a b ) 。在1 5umd p c 处理下。根尖g u s 染色也有所加深，表现出了生长素 运输受到抑制，佩没有n p a 抑制作用强烈( 图3 7d ) 。但在较高浓度d p c ( 7 5 um ) 的处理2 天，根尖染色区域明显减少，且较对照淡( 图3 7 e ) ，经过8 天 高浓度d p c 的处理，根尖就检测不到g u s 的表达。表明高浓度d p c 严重抑制 了生长素往根尖的运输。在q u e r c e t i n 的处理下，g u s 表达主要集中在柱细胞及 其起始点，这点和对照情况一致，也和根尖生长素分布吻合。但和对照所不同的 是，在q 的处理下，g u s 染色在根尖远侧端还出现了两条深深的蓝色条带( 图 3 7c ) ，而这两个条带在对照中很短，且染色浅( 图3 ，7a ) 。从g u s 染色结果 来看，2 5um 的q 的处理似乎并没有影响到生长素的运输。 4 - c o 啪a r y l - c o a + m a l o n y l 一c o a c h s ( 删) n 撕n g e n i nc h a l c 6 n e c m ( 硝) n a r i n g e n i n f 3 h ( 彻 d i h y 出0 王( i 锄p f e r 0 1 只! ：里堡pd i l l y d r o q u e r c e t i n 矾。埘上+ 茴一墨吼试k 娴 ft d f r ( ，f 3 ) ik m p f e r o l 曼! 兰地孕q u e r c e t i n d f r ( 疆j ) 1 e u c 叩e l a r g o m d i l ll e u c o c v 姐i d i i l 、_ 锄m o c v a n i n s t 。 f i g 3 5s c h e m 叠t i cd i a g 妊mo f t h e 玎8 v o n o i db i o s y n t h e t i cp a l h w a y 3 6 生长索测量结果 通过放射性同位素计数结果，显示出在不同处理下。拟南芥生长素运输能力 的差异( 图3 8 ) 。在结果中，我们将放射性计数转换为相对运输能力，以对照的 计数表示相对运输为1 ，其他处理都以对照为基础，转换为相对运输。 结果表明，在n p a 和d p c 的处理下，生长素运输大大的降低，面在d p c 处理下的生长素运输能力更低( 仅o 1 7 ) 。和前人结果不同，在我们的体系中， 浙江大学硕士学位论文 经过类黄酮q 的处理，拟南芥的生长素运输能力反而有所提高，达到1 1 l 。表 明类黄酮在拟南芥中并没有抑制生长素的运输。 f a 、 ( b ) ( c ) 名： 耄： 誊； o o 6 受0 5 掣o 4 羹o 3 + ho 2 苷o 1 o t t 壬一 壬】 一 广_。i1 t 陷广- _ 阿一i 口c k j q 2 5 口c k 。q 2 5 骑一曲一曲恤一警 t t 一4t t 一5t t 一6t t 一7 s 一0 f i g 3 6l r sd e v e l o p m e n to f 打m u t a n t s 塑垩查兰堡主兰壁堡兰 脚3 2 聊w 蚰枷s i “- j - g ：撇n 枷- l 6 帽o f n 钾帽前血h 曲e 啪to f m 赫最甲霸k m r = l p m n g 3 7 d 詹受：g 脬墨蝴硝n g 虹曩m ；_ e 卸1 蛔撇咖帕- 6 叫j n 埘拭而睇面r o 毗 ( a ) 舭g 脬娃p 嘴啪h - n t 咖m o l 旧舭g 哪唧啷j 帅h 曩n ，l a 0 0 h 脚岫删瑚i ( c ) 艄孙g 嬲唧嘲蛔h q m m 嘶( 2 sp 旧蛔吲 r o o l ( d ) 鹏嚣g 删慨p 嘲嫡佃h d p c ( 1 5p 呻蛔缸d m o l 、蹦等佣譬 旺p r 粥i o 畸妯眦t 巧p m ) 打鞠t 酣咖l o 担1 _ a 、b 、c 、d 、e s _ m p _ 嚣w e m t m 衄d 如r 8 凼帕呐j k 抽e t 嘲t 耐f o r 2 蛔b = 3 sp m 3 1 塑兰盔兰堡! 兰些笙苎一 r 一 _ 一一口 d p cn p a f i g 3 8d i f 托r e n ta u x i nt 糟n s p o na b i l n yo fq ，d p c ，a n dn 1 at n a t e ds e e d l i n 驴 t h ec o c e n t r a t i o n so fe a c ht 仲鱼t m e n t s 母n2 5pm ，1 5pm ，a n d1 0umf o rq ，d p c ，a n d n p a n s p e c t i v e l y j 3 6 类黄酮对下胚轴延伸的影响 下胚轴延伸是由于下胚轴细胞伸长的结果，生长素极性运输在这一过程中起 着重要作用( j e n s e n 甜口f ，1 9 9 8 ；c o l l e n 引耐，2 0 0 0 ：g e n d r e a u 酊口f 1 9 9 7 ) 。下胚 轴长度在一定程度上反映了下胚轴内生长素的运输，因此，我们测量了在各种处 理中拟南芥苗下胚轴的长度，为反映植物体内生长素运输提供伪面的证据。 在野生型中，1 0 “m n p a 的处理显著降低下胚轴长度( o 3c m ) ( p 3 0 0 0 ，图4 2a ，图4 3 ) 。并且如果是转移苗，将 从转移时的根尖处开始钻：如果是直接培养，则从根苗交界处开始钻。表明在接 触q 后不久就开始了这一特有的反应。但在对照和其他没有q 处理的培养基上， 由于培养基具有一定的硬度( 含有l 的琼脂) 。8 0 。的培养时，拟南芥的主根都 4 0 浙江人学坝l ：学位论义 沿着培养基袁面往下延伸，而不会钻入培养基中( 图4 2b ) 。 ab f i g 4 2d i a g r a mi n d i c a 廿n gh y p e r g 糟v i t m p j s mu n d e rt h et n a t m e to f q u e r c e t i n a ：2 5um q t r e a t e d b ：c o n t r o lc u l t u 忡 为了再清楚根尖钻入培养基这一现象的的本质，我们又进行了各种培养，结 果如表5 1 所示。经过2 5umq u e r c e n i n 的处理下，在绝对9 0 0 培养时，根尖并不钻 入培养基中，说明这一现象并非由于趋化性导致。由于添加q 的培养基呈现黄褐 色，为了分辨根尖避光性是否可以导致根尖进入培养基，我们在对照培养皿背面 贴上张黑纸，并进行转移后8 0 。培养，结果根尖并不钻进培养基。表明该行为 也并非根尖避光性所致( 表4 1 ) 。 接下来的实验更有意思，我们先将转移到2 5pm 的q 上的苗9 0 0 垂直培养2d ， 再进行8 0 d 培养。结果出乎意料的是，郎使延长培养至3d ，也没有一棵苗根尖进 入培养基。表明q 诱导根尖进入培养基是种特异的、与重力感受信号有关的信 号转导事件。同时我们还在转移后，将苗平放2h 。再进行8 0 0 、9 0 。和1 0 0 。培养， 结果这些苗的根尖都很快的钻进了培养基，但1 0 0 。培养的苗在一段时间后又重新 钻出培养基，沿培养基表明进行延伸。表明了在转移最初2h 内的侧向重力感受 是诱导根尖钻入培养基的必须条件。 我们还实验了其他两类黄酮是否也具有诱导根尖进入培养基的特性，结果是 台定的。我们在各种浓度的木黄酮g 和类黄酮前体n a r 的培养条件下，也没有诱 导拟南芥根尖进入培养基。表明诱导根尖进入培养基是q 所特有的性质。 4 l 浙江大学硕| 学位论义 t 曲i e 4 1 t b ee f 珏c to f d j f 髓r e n tc u l t u r ec o n d i t i o n s w i t h t h e t r e a t m e n t o f q u e r c e t i n 转移后培养条件根尖钻入培养基与否 c k8 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 4 9 0 02 d 后8 0 0 平放2 h 后8 0 0 平故2 h 后9 0 0 平放2 h 后1 0 0 0 c k8 0 0 背面黑色 g2 58 0 0 n a r2 58 0 0 否 是 否 否 否 是 是 先进入后钻出 否 否 否 3 3q 加快拟南芥根尖向地性反应 我们还比较了q 对拟南芥根尖向地性的影响。在旋转9 0 。后每一小时统计根 尖旋转角度，结果如图4 4 所示。在2 5 韭m 的q 的处理下，拟南芥根尖弯曲速度 显得要比对照快。通常在c k 处理下，需要7h 才能达到9 0 0 ( n = 5 0 ) ，而在q 的处 理下，只需要6h 就完成了旋转过程( n = 5 0 ) 。并且在接下来的培养中，保持在 9 0 。，不会弯曲过头( 图4 4 ) 。表明类黄酮物质q 只会影响向地性反应的速度，而 并不会影响到其精确性。 1 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 g 3 0 2 0 1 0 0 234567 t i m e ( h ) f i g 4 4q u e k e t i n 曩c c e k n t e d 伯eg 憎v i t yr p o n s t 3 4q 引起超向地性与生长素有关 内源生长素非对称分布是根尖向地性反应的基础。为了研究生长素在超向蝇 (om西c田aj暑罂jo 赣江大学硕士学位论文 性反应中的作用，我们将苗转移到同时含有q 以及n 1 ) a 、d p c 和n a a 的培养基上， 观察这些物质对q 引起的超向地性的影响。 f i “ 那略噜憎v n m p h mo f 山谢蒯b p 幽： 州h i k - m y i 嘣h 6 鸣w h 啪山e m t 6 阳蛆缸h 协岫_ 蛐u 呐 f 皤帖爿啪嚣伽唧嗍i 蛐硼d e r 山e 嘲细咖to f q u e 删n a ：g u s 嘲h i n g j 皿出e 啪t 一辩珊h 蚤 b ：g 峭嘲i m 咚0 f i 矗t h e 2 s m q 啦n 洲n t 憎倒酬血噻 结果如表4 t 2 所示，较低浓度下m ) a ( 1um l 和d p c ( 5l im ) 延迟了超向地性的 发生。而较高浓度时n p a ( i oum ) 和的d p c ( 1 5 i lm ) 则完全阻止了q 引起根 浙江大学硕士学位论文 尖的超向地性反应。同时，添加外源生长素n a a 对超向地性发生没有影响，并 且n a a 不能恢复n p a 以及d p c 对超向地性的抑制。这些结果表明，生长素极性运 输对于超向地性是十分重要的，这种重要性体现在内源生长素浓度梯度的建立， 而不是生长素本身。 在添加另外种药品氨茶碱( a m i n o p h y l l i n e ) 时，则能促进q 所引起的 超向地性反应。在转移后第一天时，所有的根尖全部钻入了培养基，而单独氨茶 碱本身不能引起超向地性反应。氨茶碱是茶碱与乙二胺复合物，可抑制磷酸二酯 酶，减慢c 舢v i p 的水解速度，增加c a m p 的浓度。添加氨茶碱促进q 的作用，表明 较高水平的环腺苷酸有助于超向地性的发生。 使用生长素反应和生长素极性运输突变体也证实q 引起的超向地性反应与生长 素有关( 表4 2 ) 。向地性缺陷的生长素内向和外向运输突变体口船一7 和孵2 一， 一 对q 引起的超向地性反应也有缺陷。而生长素抗性突变体骶r j j 、戤r 2 一，、蕊乃一、 鲥r 4 、戤r 6 一对超向地性也几乎没有反应。3 强j 纠d 对超向地性反应也有缺陷， 而允掀n 6 一，杂合体只是反应有所延迟。，阴j j 突变体提高了生长素极性运输， 其根尖能在q 的处理下钻进培养基，而另外几种生长素极性运输突变体p 加j ，、 p f n 4 4 和极性运输条件突变体f 护3 。j d 儿鱼一样能对q 的处理也有不同程度的反应 ( 表4 2 ) 。 4 啪基因负责生长素的内向运输，那么q 的处理对一u 的表达是否有影 响? 我们使用了4 叫，j ? g 吣报告株系来检测在q 的处理下4 暇，基因的表达情 况，结果如图4 4 所示。和对照相比，在2 5umq u e r c e t i n 的处理下，a 嗽，j j g l 塔 的表达并没有发生明显的变化，表明q 引起超向地性反应并不是通过改变爿l 玢0 基因的表达来实现的。 ， 3 5 超向地性的药物学研究 类黄酮物质q u e r c e t i n 在医学上有诸多作用，如过氧化物酶抑制剂和蛋白激酶 抑制剂等( c 】i f r 甜以，1 9 9 2 ；g r u b b 盯以，1 9 9 3 ；甄v 毯t a v a 甜“；s c h l l l t z8 ，讲， 】9 9 9 ) 。为了验证类黄酮引起超向地性反应是否与这些活性有关，我们试验了若 干种其他过氧化物酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂和蛋白激酶抑制剂，试图发现q 诱发超向地性的活性来源。 堑翌查兰堡：! 兰堡堡壅 t h b i e4 2r o o t sr e s p o n s et oh y p e r g r a v i t m p i s mu n d e rt h et 阳a t m 佃to f q u 。r t i n d 忸v sa f k rl r a n s f e r f e d t r e a t m e n t l d2 d7 d e x d e m e n ta ( 4 ) c k 0oo q 4 89 09 0 - d p c000 n p a0oo n a a4 7 9 09 0 q + d p c 000 q 喇p _ ooo q + n a a + d p c 000 q 十n a a + n p a o ojo a0o0 a + q 9 09 09 0 q + d p c 5 01 29 0 q + n p a l 9 2 49 0 e x p e r i m e n tb ( b ) d ，7o31 5 铅门- j 1 21 22 1 “r ，j003 “r 2 ，o0o “r 3 j000 “r 4 ! oo2 a x 凡切c ，乒3 05 19 0 3 5 s ：p i d 3 03 03 0 n i i4 s9 0 d 抽j j o4 s7 5 口加4 ，42 27 89 0 f f ，j 0 j3 45 69 0 a ：f 叫r - d a y - o l dw 玎dt y p ea 阳删出印- 蟊s 黯棚l n g sa 糟t l n s f e r r e dt o 拍c hp j a t e sc o n b i n e d r 曜u l a t o 喵t h ep l 丑t 鹤a 糟p l a c e da t8 0 口，叠n dm em o b 蛐t e r e di n t om e m u ma nc o u n t e d1 ，2 a n d7 血y sa n e rt 憎n s f e lt b ev a h a 件f h m3 0s e e d h 驴t h e 旺p e r i m e 哦i sn p e a t e dt h 犯e t i m e s d p ca n dn p ac o n c e n t 憎o n sa 忡1 5 矗n d1 0 弘mr 鹳p e c t i v e i yu n i e 鹊i m c a t e d b ：e a c hm u t a n b 叠mt r a n s f e r r e dt op i a t 船c o n t a i n i n g2 5umq u e r t i nf o rf u r t h e rc u n u r e r o o tt i p se n t e r e di n t om e d i u ma r ec o u n 删l ，2a n d7d a y s 且i t e rt r a n s f e lt h ev a l u e s 且r e f r o m3 0s e e d i i n g s t h ee x p e r i m e ti sr e p e a t e dt h r 种t i m 鹋 4 5 浙江大学硕士学位论文 t h b i e4 3 ：i n n u e n c eo fs o m ei n h i b i t o r so nh y p e r g r a v “r o p i s m 药品英文名称 超向地性 抑制超向地性 过氧化物酶抑制剂 3 氨基l ，2 ，4 三唑 4 氨基苯酚 甲巯咪唑 半胱胺 - 二硫苏糖醇 谷胱甘肽 蛋白磷酸酶抑制剂 斑蝥素 环胞霉素a 氧化酚砷 矾酸钠 氧苯砷 蛋白激酶抑制剂 t y 呐o s t i na 4 7 t y r p h o s t i na l 术黄酮 柚皮素 离子通道抑制，开放剂 d i d s 9 羧酸蒽 四乙胺 四氮基吡啶 格列本脲 呋塞米 米诺地尔 n p p b 瑞格列奈 g d 3 d p c 维拉帕米 阿米洛利 p e m x j d 船ei n h i b i t o r s 3 一a m i n o - 1 。2 ，4 - t r i a z o l e 4 一a m i n o d h e n o l m e t h i n a o o l e 2 m e r c 印t o e n l y l m i n e d i t h i o t l l r e i t o i g l u t a t h i o n e p r o t e i np h o s p h a t a s ei n h i b i t o r s c t h a r i d i n c y c i o s p o r i na p h e n y l 盯s i n eo x i d e s o d i u mo n h o v a n d a t e p a o j p m t e i nl i n a s ei h i b i t o 鸭 t y r p h o s t i na 4 7 t y r p h o s t i na l g e n i s t e i n n 盯i n g e n i n 无 无 无 无 无 无 无 无 无 无 无 有 无 无 无 i o nc h a n n e ii n h - b i t o r 咖p e n e r s 4 ，4 d i i s o t h i o - c y o s t i l b e n e - 2 ，2 -无 d i s u i f o n i ck d 9 a c 无 t e a + 无 4 - a p 无 g i t b e n c i a m i d e 无 f u r o s e m i d e 无 m i n o x i d i ls u i f a t e 无 5 一n i 仃o - 2 ，3 一p h e n y l p r o p y l 无 锄i n o b e n 2 0 i ca c i d 他p 唱l i n i d e无 g a d o l i n i 啪无 d i p h e n y l 帅i n e 2 c a r b “y l i c i d无 v e r 印i l无 a m i i o r i d e 无 否 否 否 是 否 否 其他类o t h e r s 腺苷二磷酸a t p 无 ， 是 些一曼竺些塑垒 垂 至 否 否否否否否否是 是是是是否 浙江大学硕士学位论文 我们试验的6 种过氧化物酶抑制剂和4 种蛋白磷酸化酶抑制剂都不能引起拟 南芥根尖的超向地性反应，在干扰q 引起超向地性方面，只有环胞霉素a ( 1 “m ) 能抑制根尖钻入培养基( 表4 - 3 ) 。表明q u e r c e 廿n