（遗传学专业论文）酿酒酵母极性外排途径相关基因的筛选与鉴定.pdf

摘要 摘要 i i i ii i ri i ii i iii i ii iiil y 17 2 6 2 6 8 极性外排途径是真核细胞将胞内合成的重要物质靶向运输到细胞膜上( 或外) 的 重要途径，其与真核生物细胞的生长、通信和极性建立等重要生命活动的关系十分密 切。寻找极性外排途径相关新基因并揭示它们的新功能对该途径的深入研究具有重要 意义。早期n o v i c k 实验曾经报道了一个筛选酿酒酵母温度敏感型分泌缺陷突变体的方 法，并且发现t 2 3 个极性外排途径相关的s e c 基因。但是，他当时所设定的条件只能 筛选出那些3 7 c 分泌严重受阻，密度梯度离心后明显沉入下层的突变体细胞，而忽视 了分泌受阻不明显仍留在上层的突变体细胞。筛选n o v i c k 实验密度梯度离心后的上层 细胞中被忽略的分泌缺陷突变体为发现新的极性外排途径相关基因提供了可行性。本 实验正是以密度梯度离心后的上层突变体( n o v i c k 实验弃掉的细胞) 为研究对象，成 功地筛选出了在n o v i c k 实验中未曾涉及过的温度敏感型分泌缺陷突变体，并且获得了 一系列可能与极性外排途径相关的新基因。目前取得的主要成果及结论如下： 1 、温度敏感型分泌缺陷酵母突变体的筛选及其分泌缺陷特性的鉴定。利用e m s 诱变、两次密度梯度离心、限制性温度条件筛选等技术手段成功筛选出了5 6 0 余个新 的温度敏感型分泌缺陷突变体。选取其中3 0 个突变体进行热激( 3 7 处理1 2h ) 前 后胞内和胞外的i n v e r t a s e 及b g l 2 p 含量比较，发现所有突变体的这两种酶都无法正常 分泌到胞外去，证明我们筛选的突变体外排途径确实受阻，而3 7 c 培养1h 后电镜观 察突变体细胞，未见胞内分泌小泡的积累。 2 、基因组文库挽救及挽救片段分析。对3 0 个分泌缺陷突变体进行基因组文库挽 救，获得了一批能够挽救这些突变体的基因组d n a 片段，并查明了它们所在的染色 体位置、长度范围及所包含的基因类别。 3 、功能基因验证。从基因组d n a 挽救片段上分别克隆出单个候选基因，将克 隆的候选基因与组成型表达载体p r s 3 1 5 连接后去挽救对应的温度敏感型分泌缺陷突 变体，以查明d n a 挽救片段中发挥挽救作用的具体基因，排除其它基因的干扰。目 前为止已验证了l c b 2 ，c d c l 4 ，t e l 2 三个基因的挽救功能。 4 、t e l 2 基因的突变位点鉴定及其翻译产物的生物信息学分析。采用高保真p c r 技术从突变体基因组中克隆t e l 2 基因全序列，检测到两个突变位点p 3 6 7 一l ， s 5 4 5 一f 。应用生物信息学比较分析t e l 2 基因突变前后翻译产物的差异和联系，推 测t e l 2 蛋白结构功能域在氨基酸2 4 6 4 3 4 范围内。首次揭示了端粒长度调控基因 髓z 2 在极性外排途径中的重要作用。 关键词：酿酒酵母，极性外排途径，温度敏感型，基因组文库挽救，t e l 2 a b s t r a c t a b s t r a c t p o l a r i z e de x o c y t o s i sp a t h w a yi sa ni m p o r t a n tm e m b r a n et r a f f i ce v e n tt h a tm e d i a t e s t h es e c r e t i o no fi n t r a c e l l u l a rp r o t e i nc o n t e n t ss u c ha sh o r m o n e sa n dn e u r o t r a n s m i t t e r sa s w e l la st h ei n c o r p o r a t i o no fm e m b r a n ep r o t e i n sa n dl i p i d st os p e c i f i cd o m a i n so ft h e p l a s m am e m b r a n e a saf u n d a m e n t a lc e l lb i o l o g i c a lp r o c e s s ，e x o c y t o s i si sc r u c i a lf o rc e l l g r o w t h ，c e l l - c e l lc o m m u n i c a t i o n ，a n d c e l l p o l a r i t ye s t a b l i s h m e n t t o f i n dn e wg e n e s r e l a t e dt ot h ep a t h w a ya n dr e v e a lt h e i rn e wf u n c t i o n sh a sg r e a ts i g n i f i c a n c ef o rf u r t h e r s t u d yo fp o l a r i z e de x o c y t o s i sp a t h w a y e a r l yi nn o v i c ke x p e r i m e n t ，h ed e s c r i b e da t e c h n i q u ef o rt h ee n r i c h m e n to ft e m p e r a t u r e s e n s i t i v es e c r e t o r ym u t a n t sa n ds u c c e e d e dt o f i n d2 3m a jo rs e cg e n e si n v o l v e di np o l a r i z e de x o c y t o s i sp a t h w a yi ns a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e h o w e v e r , t h es c r e e n i n gc o n d i t i o n sn o v i c ks e ti nh i se x p e r i m e n tc o u l do n l y s c r e e no u td e n s ec e l l sw h o s es e c r e t i o nw a ss e r i o u s l yb l o c k e da n dc e l ld e n s i t ys i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e da t3 7 0 ci nt h eb o t t o mf r a c t i o no ft h ed e n s i t yg r a d i e n t ，b u tc o u l dn o ts e l e c tt h o s e w h o s es e c r e t i o nw a sn o tb l o c k e ds os e r i o u s l ya n dc e l l sm i g h ts t i l ls t a yi nt h et o pf r a c t i o n a f t e rt h ed e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n t oe x a m i n ew h e t h e rt h e r ea r es t i l la n ym u t a n t s w h o s es e c r e t i o nw a sc o n d i t i o n a l l yb l o c k e da m o n gt h ec e l l ss t a y i n gi nt h et o pf r a c t i o na f t e r d e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o nb r i n g saf e a s i b l es c h e m eo ff i n d i n gn e ws e c r e t i o n r e l a t e d g e n e s d u r i n gt h ee x p e r i m e n t ，o n l yt h em u t a g e n l z e dc e l l sw i t h i nt o pf r a c t i o ni nt h ed e n s i t y g r a d i e n tw e r ef o c u s e d ，w h i c hw e r et o t a l l yd i s c a r d e di nn o v i c k se x p e r i m e n t f o r t u n a t e l y , w eo b t a i n e dal o to fn e wm u t a n t sw h o s ee x o c y t o s i sp a t h w a yw a sc o n d i t i o n a l l yb l o c k e do r h i n d e r e da n ds c r e e n e do u tm a n yc a n d i d a t eg e n e st h a ts h o u l db ei n v o l v e di nt h ee x o c y t o s i s p a t h w a y t h em a i nr e s u l t sa n dc o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w i n g ： 1 t h e s c r e e n i n go fy e a s tt e m p e r a t u r e s e n s i t i v es e c r e t o r y m u t a n t sa n dt h e i d e n t i f i c a t i o no ft h e i rs e c r e t i o nc h a r a c t e r s a b o u t5 6 0t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v es e c r e t o r y m u t a n t sw e r es c r e e n e do u tb yt h et e c h n o l o g yo fe m sm u t a t i o n ，t w od e n s i t yg r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o na n dt e m p e r a t u r e r e s t r i c t e dc o n d i t i o n a ls c r e e n 3 0o ft h e s em u t a n t sw e r e s e l e c t e dt oc o m p a r et h ei n t e r n a la n de x t e r n a lc o n t e n t so fi n v e r t a s ea n db g l 2 pb e f o r ea n d a f t e rh o ts h o c k e d ( a t3 7 0 cf o r1 - 2 ”，t h er e s u l t ss h o w e dt h es e c r e t i o no ft h et w oe n z y m e s w e r eb l o c k e di na l lm u t a n t s ，i tp r o v e dt h ep o l a r i z e de x o c y t o s i sp a t h w a yo ft h em u t a n t sw e s c r e e n e do u tw e r ei n d e e db l o c k e d ，h o w e v e rn oa c c u m u l a t i o no fp o s t g o l g is e c r e t o r y v e s i c l e sw e r eo b s e r v e du n d e re l e c t r o nm i c r o s c o p yi nt h e s em u t a n tc e l l sa t37 0 cf o r2h 2 y e a s tg e n o m i cl i b r a r yr e s c u ea n da n a l y s i so fr e s c u ef r a g m e n t s 3 0s e c r e t o r ym u t a n t s i i w e r er e s c u e dw i t hay e a s tg e n o m i cl i b r a r y m a n yr e s c u ef r a g m e n t sw a so b t a i n e d t h e c h r o m o s o m a lp o s i t i o n ，l e n g t hr a n g ea n dt h eg e n e sw i t h i ne a c h r e s c u ef r a g m e n tw e r e c o n f i r m e d 3 d e t e c t i o no ft h er e a le x e r t i n gf u n c t i o ng e n e i no r d e rt oa ，s c e r t a i nw h i c hg e n e i st h e r e a le x e r t i n gf u n c t i o ng e n ew i t h i nt h er e s c u e dd n af r a g m e n t sa n dr e m o v eo t h e rg e n e s i n t e d r e n c e ，e a c hc a n d i d a t eg e n ew a ss e p a r a t e l yc l o n e da n dl i g a t e di n t oe x p r e s s i o n v e c t o r p r s 315t or e s c u ei t sc o r r e s p o n d i n gy e a s tt e m p e r a t u r e s e n s i t i v em u t a n t s of a r , t h e r e s c u e 矗m c t i o no fs o m es i n g l eg e n e si n c l u d i n gl c b 2 ，t e l 2a n dc d c l 4w e r ed e t e c t e da n d c o n f i r m e d 。 4 i d e m i f i c a t i o no ft h et e l 2g e n em u t a t i o ns i t e sa n db i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i so f i t s t r a n s l a t i o np r o d u c t s t h em u t a n tg e n ew a sc l o n e df r o mm u t a n tc e l lg e n o m eb yu s i n ga h i g l l f i d e l i t yp c ra m p l i f i c a t i o nt e c h n o l o g ya n ds e q u e n c e d ，t h es e q u e n c e dr e s u l t s w e r e b l a s t e dw i t hn o r m a ls e q u e n c et oi d e n t i f ym u t a t i o ns i t e s ，t w om u t a t i o ns i t e sw e r ef o u n d ， o n ew a sp 3 6 7 一l ，a l l dt h eo t h e rw a ss 5 4 5 _ f t h ed i f f e r e n c ea n dc o n n e c t i o nb e t w e e n t r a n s l a t i o np r o d u c t so ft e l 2a n dt r a n s l a t i o np r o d u c t so fm u t a t e dt e l 2 w e r ea n a l y z e da n d c o m p a r e db yb i o i n f o r m a t i c st o o l s t h e i rs t r u c t u r a l f u n c t i o n a ld o m a i n r e l a t e dt oe x o c y t o s l s w a ss u p p o s e dt ob ew i t h i nt h er e g i o no fr e s i d u e s2 4 6 4 3 4 t h i si st h ef i r s tt i m e t or e v e a l t h er e l a t i o no ft e l 2w i t hp o l a r i z e de x o c y t o s i sp a t h w a y ，t h o u g hi th a sl o n gb e e nk n o w n a s at e l o m e r el e n 啦m a i n t a i n i n gg e n e k e y w o r d s ：s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ，p o l a r i z e de x o c y t o s i s p a t h w a y , t e m p e r a t u r e s e n s i t i v e ，g e n o m i cl i b r a r yr e s c u e ，t e l 2 i i i 缩略语 e m s i n v e r t a s e b g l 2 p r e r t g n v s n a r e s t s n a r e s n s f g d p g t p g d i s m g f p s d s d t t s g d o d 咖 r a s g e f r a s g e f n g r i p 缩略语 甲基磺酸乙酯( e t h y lm e t b a n e s u l f o n a t ) 蔗糖代谢酶( s u c r o s e - m e t a b o l i z i n ge n z y m e ) 内切一p - 1 ，3 - 葡聚糖酶( e n d o p 一1 ，3 一g l u c a n a s e ) 粗面内质网( r o u g he n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ) 反区高尔基体网结构( t r a n s g o l g in e t w o r k ) 分泌小泡上的可溶性n 己基顺丁烯二酰亚胺一敏感融合蛋白接受子 ( v e s c i l e - - s o l u b l en e t h y l m a l e i m i d e - s e n s i t i v ef u s i o na t t a c h m e n tp r o t e i n r e c e p t o r s ) 靶膜上的可溶性n 己基顺丁烯二酰亚胺敏感融合蛋白接受子 ( t a r g e t - s o l u b l en - - e t h y l m a l e i m i d e - s e n s i t i v ef u s i o na t t a c h m e n tp r o t e i n r e c e p t o r s ) n 乙基顺丁烯酰亚胺敏感融合蛋白( n e t h y l m a l e i m i d e s e n s i t i v e f u s i o np r o t e i n ) 二磷酸鸟苷( g u a n o s i n e5 - d i p h o s p h a t e ) 三磷酸鸟苷( g u a n o s i n e5 - d i p h o s p h a t e ) g d p 解离抑制因子( g d p d i s s o c i a t i o ni n h i b i t o r ) s e c l m u n c l8 蛋白( s e c l m u n c l8p r o t e i n ) 绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ) 十二烷基磺酸钠( s o d i u md o d e c y ls u l f o n a t e ) 二硫苏糖醇( d i t h i o t h r e i t 0 1 ) 酵母基因组数据库( s a c c h a r o m y c e sg e n o m ed a t a b a s e ) 在6 0 0 n m 波长处的光密度( o p t i c a ld e n s i t y ) 类似于r a s 蛋白的小g t p a s e s 的鸟苷酸交换因子( g u a n i n en u c l e o t i d e e x c h a n g ef a c t o rf o rr a s l i k es m a l lg t p a s e s ) 类似于r a s 蛋白的小g t p a s e s 的鸟苷酸交换因子n 端模序( g u a n i n e n u c l e o t i d ee x c h a n g ef a c t o rf o rr a s - l i k eg t p a s e s ；n t e r m i n a lm o t i f ) g o l g i n - 9 7 ，r a n b p 2 a l p h a , i m h lpa n dp 2 30 g o l g i n - 2 4 5 v i i 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 引言 酿酒酵母( 以下简称酵母) 不仅是与人们生活密切相关的经济微生物，而且更是 生命科学研究的重要模式生物，在现代生命科学研究中具有举足轻重的地位。事实上， 真核细胞很多生命活动机制的揭示如细胞周期调控、基因组的结构与功能、外排作用 机理、基因表达调控等都是源自于对酵母的研究。 自从1 9 9 6 年酵母基因组全序列正式公布并发现其中存在约60 0 0 个可能基因以 来，完成酵母60 0 0 个可能基因的功能注释便成了广大遗传学工作者努力追求的一个 重要目标。在此进程中，各种大规模分析技术如大规模直系同源( g o ) 分析乜3 1 、 大规模质谱分析、大规模遗传互作分析1 、大规模表型分析坤1 、大规模蛋白质缺失 分析盯1 、大规模蛋白质互作分析聃1 等的成功应用，明显加快了酵母新基因功能注释的 速度，目前已有约8 0 的酵母基因拥有不同程度的功能注释。尽管如此，酵母功能基 因组的研究仍然面临着十分艰巨的任务，还有诸如如何对那些在酵母基因组数据库 ( s g d ) 旧1 中至今几乎无任何注释的数量高达12 5 3 的新基因( 或o r f ) 的功能进行 更有效的实验筛选和挖掘，如何对那些由大规模分析所得到的但在深度和广度方面往 往存在不足i 训的功能注释进行更加严格的实验检验等重要问题亟待解决。以往的研 究表明叫驯，在新基因的筛选与功能注释方面，以细胞生命活动中各种途径( p a t h w a y ) 为目标的诱变筛选不失为一种行之有效的方法，探讨这些基因与各种p a t h w a y 的关系 有助于揭示它们所承担功能。 本课题正是这种以全p a t h w a y 为目标的新基因诱变筛选与功能揭示的一次重要 尝试。课题以酵母极性外排途径上新基因的发现和功能注释为主线，综合运用经典的 人工诱变、条件筛选和现代的基因组文库挽救( r e s c u e ) 等技术手段，筛选和鉴别出 该p a t h w a y 上尚未发现的新基因并力图阐明它们的功能。 1 2 极性外排途径概述 极性外排途径是真核细胞将胞内合成的重要物质靶向运输到细胞膜上( 或外) 的 重要途径，其与真核生物细胞的生长、通信和极性建立等重要生命活动的关系十分密 切o 胞内合成、加工和分选好的膜蛋白、激素、脂质及神经递质等关系细胞生长和通 讯的物质皆需通过该途径靶向运输到细胞膜的特定部位进行融合与分泌1 。该途径一 直是酵母研究领域里的研究热点，其中一些主要事件和分子机制己得到阐明。 第1 章绪论 1 2 1 细胞分泌过程简介 真核细胞将在粗面内质网上合成而又非内质网组成部分的蛋白和脂类等物质通 过小泡运输的方式经过高尔基体的进一步加工和分选运送到细胞内相应结构、细胞质 膜以及细胞外的过程称为细胞的分泌。细胞分泌活动是非常重要的生命现象，主要沿 着粗面内质网一高尔基体一细胞质膜的途径进行。 1 2 1 1 内质网 内质网是细胞质分子中以双层分子层为基础形成的囊状，泡状和管状结构。根据 内质网膜上有没有附着核糖体，将内质网分为滑面型内质网( s e r ) 和粗面型内质网 ( r e r ) 两种。核糖体合成的蛋白质与粗面内质网外表面结合后进入内质网腔，在内 质网内进行正确折叠和糖基化修饰。之后，从内质网形成的小泡携带新合成并经糖基 化的蛋白到达顺面高尔基体。 1 2 1 2 高尔基体 高尔基体是一些聚集的扁的小囊和小泡，主要特征是具有极性，分泌细胞的顺面 ( 又称形成面) 朝向内质网，而反面( 又称成熟面) 朝向质膜。高尔基体由各个区室 组成，由顺面到反面分别命名为顺区、中区、反区、反区高尔基体网结构( t r a n s g o l g i n e t w o r k ，t g n ) 。高尔基体是内质网合成产物和细胞分泌物的加工和包装场所。部分 膜结构从内质网上脱离后，形成转运泡，通过膜融合，蛋白质进入高尔基体的顺面， 并在高尔基体中进一步加工后通过小泡转运到反面高尔基体，经浓缩并经出芽形成分 泌小泡，从而不断向细胞膜产生和派送运输泡或分泌泡引。 1 2 1 3 高尔基体一细胞膜 高尔基体出芽产生的分泌小泡到达膜上特定区域并与之融合，并将分泌物质释放 到胞外，此过程可分为三个阶段：第一阶段由微管、肌动蛋白等细胞骨架系统将高尔 基体内分选和包装好的分泌泡靶向传送到细胞膜的特定部位附近【1 6 ，17 】；第二阶段由 e x o c y s t ( s e c 3 p ，s e c 5 p ，s e c 6 p ，s e c 8 p ，s e c l o p ，s e c l 5 p ，e x 0 7 0 p 和e x 0 8 4 p 等8 个蛋白组成的复合体) 、r a bg t p a s e s 及长卷曲蛋白( 1 0 n gc o i l e d c o i lp r o t e i n s ) 等牵引 因子将分泌泡牵引到特定的膜结构域( d o m a i n ) 【1 8 】；第三阶段由位于分泌泡和细胞膜 上的整合蛋白( v s n a r e s 与t - s n a r e s ，s o l u b l en e t h y l m a l e i m i d e s e n s i t i v ef u s i o n a t t a c h m e n tp r o t e i nr e c e p t o r s ) 相互作用导致分泌泡与细胞膜的融合【1 9 , 2 0 。 第1 章绪论 1 2 2 外排途径两种类型 1 2 2 1 组成型外排途径( c o n s t jr u tjv ee x o c y t o s ；sp a t h w a y ) 这种分泌途径中运输小泡持续不断地从高尔基体运送到细胞质膜，并立即进行 膜的融合，将分泌小泡中的蛋白质释放到细胞外，此过程不需要任何信号的触发，它 存在于所有类型的细胞中。组成型分泌途径除了给细胞外提供酶、生长因子和细胞外 基质成分外，也为细胞质膜提供膜整合蛋白和膜脂。组成型分泌小泡通常称为运输泡 ( t r a n s p o r tv e s i c l e s ) ，是由高尔基体反面网络对组成型分泌蛋白的识别分选后形成的。 1 2 2 2 调节型外排途径( r e g uia t e de x o c y t o s isp a t h w a y ) 调节型分泌小泡通过出芽离开反面高尔基网络并聚集在细胞质膜附近，当细胞受 到细胞外信号刺激时，就会与细胞质膜融合将内含物释放到胞外。可调节型分泌泡在 激素、神经递质或其它物质的作用下向细胞外分泌，常常是通过c a 2 + 浓度的增加而 启动分泌。此过程多见于某些特化的细胞，如内分泌细胞。调节型途径中形成的小泡 称为分泌泡( s e c r e t o r yv e s i c l e s ) 。其蛋白分选信号存在于蛋白本身，由高尔基体t g n 上特殊的受体选择性地包装为运输小泡。 1 2 3 参与极性外排途径的蛋白及其分子机制 1 2 3 1 膜泡形成机制 运输蛋白质的膜泡并不是裸露的，而是外面包围有蛋白质衣被，因此称为有被小 泡。衣被能够选择性的将特定蛋白聚集在一起，形成运输小泡，并且决定着运输小泡 的外部特征。根据衣被蛋白种类的不同，可将膜泡分为网格蛋白衣被小泡，c o p i 衣 被小泡和c o pi i 衣被小泡。这些衣被小泡分别在细胞内不同部位形成，并按固定的 路线运输蛋白。 1 2 3 1 1 从内质网到高尔基体的物质运输( c o pi l 衣被小泡) c o p i i 小泡是由b a r l o w e 等从酿酒酵母中分离出h ，其主要负责内质网到高尔基 体的顺向物质运输心2 2 引。c o p i i 衣被小泡包被蛋白由s e c 2 3 s e c 2 4 复合体、s e c l 3 s e c 3 1 复合体和s e c l 6 蛋白组成乜钔。此外，c o p i i 包被蛋白之间还有一种小的g t p 结合蛋 白称为s a r l 蛋白，作为分子开关调节膜泡包被的装配与去装配。c o pi i 衣被膜泡形 成时，首先在r e r 膜上的s e c l 2 蛋白的催化作用下，s a r l 上的结合g d p 交换为g t p ， 然后s a r l 与膜受体结合，引起s e c 2 3 和s e c 2 4 蛋白在胞质侧结合成复合体，形成紧 紧包围着膜的一层衣被，s e c l 3 和s e c 3 l 蛋白也形成复合体，成为覆盖在外围的一层 衣被。同时，细胞质中一种纤维素蛋白s e c l 6 结合在r e r 胞质面上，与上述两个复合 体相互作用，组装成一个包围膜泡的框架结构心胡。c o pi i 衣被膜泡的外衣蛋白的解聚 第l 章绪论 过程，是由s a r l 结合的g t p 水解引起的，g t p 的水解引起外衣蛋白的去组装，形成 无衣膜泡。 1 2 3 1 2 内质网逃逸蛋白的回收及转运( c o pi 衣被小泡) c o pi 小泡是由o r c i 等以重组人促红素( c h o ) 细胞为实验材料，研究水泡性 口炎病毒g 蛋白在高尔基体上的转运时发现的引。c o pi 衣被小泡负责回收、转运 内质网逃逸蛋白返回内质网比7 1 。c o pi 有被小泡由7 种蛋白亚基0 【、p 、b 、小6 、 2 0h o u r s ( y e a s t ，i nv i v o ) 10h o u r s ( e s c h e r i c h i ac o l i ，i nv i v o ) i n s t a b i l i t yi n d e x ： t h ei n s t a b i l i t yi n d e x ( i i ) i sc o m p u t e dt ob e3 7 0 8 ( 3 7 4 1 ) 1 1 1 i sc l a s s i f i e st h e p r o t e i na ss t a b l e a l i p h a t i ci n d e x ：10 2 8 5 ( 1 0 3 4 2 ) g r a n da v e r a g eo fh y d r o p a t h i c i t y ( g r a v y ) ：- o 15 6 ( - 0 14 3 ) 5 3 3 疏水性分析 组成蛋白质的2 0 种氨基酸各自带有不同极性的侧链基团。氨基酸侧链的疏水性 以及各氨基酸的疏水性减去甘氨酸疏水性之值来表示n 们。疏水性氨基酸在蛋白质内 部，由于其疏水的相互作用，在保持蛋白质三级结构的形成和稳定中起着重要作用。 本节采用p r o t s c a l e 程序分析。高正值的氨基酸具有更大的疏水性，低负值的氨基酸 则具有更大的亲水性。如图所示，突变后，在3 6 7 位和5 4 5 位两个突变位点处，疏水 3 0 第5 章t e l 2 基因突变位点的鉴定及生物信息学分析 性都略有增强。 p r o * g $ o a l o u t p u tr - rs e q u e n o e 图5 2 蛋白疏水性分析结果 e t 正常蛋白疏水性分析：b 突变蛋白疏水性分析 5 3 4 亚细胞定位 p s o r t i is e r v e r 分析蛋白的亚细胞定位结果如表5 1 所示，这些值代表了可能的 蛋白表达定位概率。预测结果表明正常蛋白和突变蛋白定位于细胞质的可能性最高。 正常蛋白定位于细胞质中的可能性为7 8 3 ，定位于细胞核中的可能性为1 7 4 ，定 位于溶酶体4 3 ；而突变体定位于细胞质中的可能性为6 9 6 ，定位于细胞核中的 可能性为1 7 4 ，其它各有4 3 定位于细胞骨架，溶酶体和线粒体。 第5 章t e l 2 基因突变位点的鉴定及生物信息学分析 表5 1 蛋白的亚细胞定位结果 正常蛋白r e s u l t so f t h ek - n n p r e d i c t i o n k = 9 2 3 7 8 3 ：c y t o p l a s m i c 1 7 4 ：n u c l e a r 4 3 ：p e r o x i s o m a l p r e d i c t i o nf o rq u e r yi sc y t ( k = 2 3 ) 突变蛋白r e s u l t so f t h ek - n n p r e d i c t i o n k = 9 2 3 6 9 6 ：c y t o p l a s m i c 1 7 4 ：n u c l e a r 4 3 ：e y t o s k e l e t a l 4 3 ：p e r o x i s o m a l 4 3 ：m i t o c h o n d r i a i p r e d i c t i o nf o rq u e r yi sc y t ( k = 2 3 、 5 3 5 结构功能域分析 结构功能域是在蛋白质三级结构中介于二级和三级之间的能明显区分但又相对 独立的折叠单元口钔，是蛋白功能、结构和进化单元。每个结构域自身独立存在或折叠 的三维结构，通常由5 0 3 0 0 个氨基酸残基组成。结构功能域分析对于蛋白质结构的 分类和预测有着重要作用。 用s m a r t 软件分析正常蛋白质序列，结果显示在氨基酸4 3 3 5 4 6 范围内，有 一个端粒调控结构域( 图5 3 ) 。该结构域的功能主要是维持端粒的长度，参与亚端粒 区域的基因沉默，通过结合于末端着丝粒的d n a 重复区发挥作用盯明。该结构域的功能 己被实验所证实，与t e l 2 基因的已知功能相符。 匿卜一 m l i e 卿b 。e g i ne n ：d 。e - v a 1 嘴 ；p f a m ：t e l o m e r e r e g - 24 3 3 5 4 61 9 0 e - 0 6 图5 3t e l 2 正常蛋白结构域分析 3 2 第5 章t e l 2 基因突变位点的鉴定及生物信息学分析 然而，用s m a r t 软件分析突变蛋白序列，结果除了显示端粒调控结构域，还列 出了很多可能的结构域( 图5 4 ) 。这些预测的结构域，有的e 期望值( e v a l u e ) 与 设定的阈值相比不是很显著，有的与其它的注释资源有重叠。e 期望值表示仅仅因为 随机性造成获得这一比对结果的可能次数。这个数值越接近零，发生这一事件的可能 性越小。从搜索角度看，e 值越小，比对结果越显著。阈值是指为搜索设定的一个期 望值。如果联配的统计显著性( e 值) 小于阈值，则该比对将被检出。换句话说，比 较低的阀值将使搜索的匹配要求更严格，结果报告中随机产生的匹配序列减少。 n a m e u t g b r o m o f h 2 p f a m ：h y d r o l a s e _ 2 p a m h 3 p o l x c p f a m ：p r l o p f a m ：p o c - e 10 f b o g 旧 p f a m ：日5 6 m u t 8 d c a l p a i n i i i p f a m ：l r g 日 d e d p f a m ：s c 0 1 s e n c c i t r a t e 一埽- i i g 8 e y b 3 _ 4 p l n c c l h p f a m ：0 r a b p t s p n l o n b e 1 i i ie l l de - v a l l l e r e a $ 0 1 1 26 92 2 6 e + 0 3t h r e s h o l d 3 114 42 11e + 0 3t h r e s h o l d 4 73 9 74 0 5 e + 0 3t h r e s h o l d 5 112 97 5 0 e + 0 0t h r e s h o l d 6 82 5 624 7 e + 0 3t h r e s h o l d 6 915 5g 2 7 e + 0 2t h r e s h o l d 7 93 9 21 0 5 e * 0 3t h r e s h o l d 0 42 8 776 0 e + 0 0t h r e s h o l d 8 614 75 2 0 e - 0 1t h r e s h o l d 8 913 11 8 7 e * 0 3t h r e s h o l d 10 22 6 96 3 2 e + 0 4t h r e s h o l d 10 e4 4 64 6 0 e * 0 0t h r e s h o l d 14 55 141 4 3 e + 0 3t h r e s h o l d 16 02 5 22 8 2 e + 0 3 t h r e s h o l d 16 62 8 89 2 0 e + 0 0 t h r e s h o l d 18 52 5 27 0 6 e + 0 2 t h r e s h o l d 18 53 3 84 4 0 e + 0 0 t h r e s h o l d 19 02 5 724 6 e + 0 8t h r e s h o l d 19 32 4 42 7 7 e + 0 3t h r e s h o l d 19 43 154 2 6 e + 0 4t h r e s h o l d 2 0 1 2 9 233 7e + 0 3t h r e s h o l d 2 0 4 3 2 81 2 7 e + 0 5t h r e s h o l d 2 0 6 2 2 58 o o e + 0 0t h r e s h o l d 2 0 93 8 61 7 5 e * 0 3t h r e s h o l d 2 133 5 42 4 2 e + 0 3t h r e s h o l d 2 134 4 32 2 5 e + 0 3t h r e s h o l d m a 32 1 3 u m e2 1 7 m g t e n 2 2 2 p f a m ：m e m o2 3 1 a r m2 3 4 o a l r1 2 3 7 p f a m ：d u f 2 0 13 2 3 7 、啊82 4 2 r a s g e f2 4 6 r a s o e f n2 5 3 g r i p 2 5 6 a l b u m i n2 5 7 b 4 12 8 0 p 亿m ：o u f 6 4 42 6 2 p f a m ：f - a c t i nc a pa2 6 2 r g 82 7 3 m i f 4 g2 7 7 p f a m ：d u f 2 5 2 6 2 7 7 r p o l 4 c2 9 3 p 亿m ：r n a 口o ld e l t a3 15 p f a m ：n u c l e o p l a s m i n3 2 1 l d l a 3 9 4 b a g3 9