（遗传学专业论文）epsps基因用于芸薹族植物分子进化初探.pdf

e p s p s 基因用于芸薹族植物 分子进化的初探 专业：遗传学 研究生：邓运涛指导教师：李旭锋 不同基因由于其进化速率不同，而适用于不同分类等级的系统发育研 究。目前用于科和科以上分类群研究的两个最主要基因为时绿体基因而吐和核 基因1 8 sr d n a 。与它们相比，核编码蛋白基因的进化速率分别快4 5 倍和 1 2 1 5 倍。批舫f 等基因的进化较快，适合于科内系统发育研究。核糖体 d n ai t s 序列进化速率更快，只能用于属间和种间分类群的研究。e p s p 合 成酶是莽草酸途径的一个关键酶，其成熟蛋白在进化中极为保守。高等植物成 熟的e p s p 合成酶的氨基酸序列之间具有很高的同源性，但e p s p 合成酶的叶 绿体运输肽的氨基酸序列同源性极差，各植物间仅2 3 左右的同源性。目前用 e p s p s 基因编码区的d n a 序列来研究物种的进化关系尚未见报道。同源对比 分析已有的植物e p s p s 基因序列，我们找到了该基因中一段极为保守的序列并 设计了一条寡核苷酸引物，采用3 r a c e 法，从植物蜀杂9 号油菜，白菜型油 菜总r n a 中成功的扩增出了e p s p s 基因3 端编码区( 包含外显子8 、7 、 6 、5 、4 的全部序列及外显子3 的部分序列) ，分别长1 0 9 7 b p ，1 1 0 9 b p 。核 苷酸同源分析表明，这两段序列与诸葛菜( o r y c h o p h r a g m u sv i o l a c e u s ) ，拟 南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) ，欧洲油菜( b r a s s i c a c e a en a p u s ) 的同源序列的 同源性都大于9 0 。我们对这些序列与已发表的相应序列( 合计3 个科，1 5 个 序列) 用n j 法和最简约性分析，结果表明：由两种方法构建的进化树是一致 的，同一科的序列形成一组；在十字花科组的分之图中，来自于拟南芥属的j 列与来自于芸薹属的序列又各自形成亚组：来自于诸葛菜属的序列分布在芸猫 属的分之图中，揭示出诸葛菜属与芸薹属有着极其近的亲源关系。此结果与植 物经典分类相一致，说明e p s p s 基因3 端编码区序列是一个很好的分子进化模 型，适合于构建高等植物科之间、属之间的进化关系图。用e p s p s 基因全长编 码区的d n a 序列构建的n j 图，最简约树与用其3 端编码区d n a 序列构建的 树形图相同，表明完全可以用e p s p s 基因3 端编码区d n a 序列代替基因全长编 码序列作进化分析。分别对十字花科、茄科、禾本科序列的碱基变异情况分 析，结果表明，e p s p s 基因在十字花科和茄科中的进化速率不一样，对于总的 碱基替换率，茄科高于十字花科。 关键词：e p s p s ，分子进化，序列分析，n e i g h b o r j o i n i n g 方法 4 t h em o l e c u l a re v o l u t i o nr e s e a r c ho f g e n e e p s p s inb r a s s i c a c e a e p l a n t m a j o r ：g e n e t i c s g r a d u a t es t u d e n t ：d e n gy u n t a ot u t o r ：l ix u f e n g d i f f e r e n tg e n e sa r eu s e dt ot h er e s e a r c h o f p h y l e s i sb e c a u s e o f t h e i r d i f f e r e n te v o l u t i o n a r yr a t e t od a t e ，t w om a i ng e n e st h a ta p p l yt ot h er e s e a r c ho f f a m i l y a n dt h ec l a s s e sa b o v ef a m i l ya r er b c la n d18 sr d n a c o m p a r a t i v e l y , t h e e v o l u t i o n a r yr a t eo f p r o t e i n sc o d e db y t h en u c l e a rg e n e si sf o u ro rf i v et i m e sa sf a s t a st h er a t eo f t h et w of o r m e r s t h er a t eo fn d hfi sf a s ta n ds u i tt ot h ep h y l e s i s r e s e a r c hi nf a m i l y t h ee v o l u t i o n a r yr a t eo f r i b o s o m ed n ai sm o r ef a s ta n do n l y s u i tt ot h ep h y l e s i sb e t w e e ng e n u sa n ds p e c i e s t h ee p s ps y n t h a s ei san e c e s s a r y e n z y m e o f t h es h i k i m a t ep a t h w a ya n di ti sv e r yc o n s e r v a t i v e t h ea m i n oa c i d s e q u e n c e s o fe p s p s y n t h a s eb e t w e e nh i g hp l a n t sh a v ev e r yh i g hi d e n t i t y , b u tt h e i d e n t i t yo f t r a n s p o r tp e p t i d eo f e p s p i sa sl o wa s2 3 b e t w e e np l a n t s a t p r e s e n t ， n o b o d y h a v er e p o r t e dt h ep h y l e s i sr e s e a r c ht h r o u g hd n a s e q u e n c eo f e p s r a n o l i g o - n u c l e o t i d ep r i m e r w a s d e s i g n e da c c o r d i n g t oac o n s e r v a t i v ef r a g m e n to ft h i s g e n eo f p l a n t s i ng e n e b a n k t w o3 - e n d c o d i n gs e q u e n c e s o f t h i sg e n e ( i n c l u d i n gc o m p l e t es e q u e n c e so f e x o n8 , 7 ，6 ，5 ，4a n dp a r t i a ls e q u e n c e so f e x o n3 ) ， o n e ，1 0 9 7 b p ，a n d t h eo t h e r1 1 0 9 b p ，w e r e s u c c e s s f u l l yi s o l a t e df r o m b r a s s i c a e a e 印w a n db r a s s i c a e a ec a m p e s t r i s t h ed n a s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w s t h a tt h et w o f r a g m e n t sa r em o r e t h a n9 0 i d e n t i c a lt oo r y c h o p h r a g m u s v i o l a c e u s , a r a b i d o p s i s t h a b a n aa n db r a s s i c a c e a en a p u s t h ea n a l y s i so f t h e s et w os e q u e n c e sa n dr e p o r t e d s e q u e n c e s ( t h r e ef a m i l i e s ，1 5s e q u e n c e si nt o t a l ) b yn jm e t h o da n dt h es i m p l e s t 5 p r i n c i p l es h o w s ，t h ee v o l u t i o n a r yt r e e se s t a b l i s h e db y t h e s et w om e t h o d sa r e c o n s i s t e n ta n dt h es e q u e n c e so f t h es a m ef a m i l yc o n s t i t u t eo n eg r o u p t h e s e q u e n c e so f t h a l i a n aa n d t h es e q u e n c e so f b r a s s i c a c e a ee a c hm a k e su pa s u b g r o u pi ni t 。t h es e q u e n c e so f v i o l a c e u sd i s t r i b u t ei nb r a s s i c a c e a e s u b g r o u p a n dt h i sp h e n o m e n as h o w st h a tt h er e l a t i o n s h i pi sv e r yn e a r t h er e s u l ta c c o r d st o t h ec l a s s i c a la n a l y s i sa n dt h e3 - e n dc o d i n gs e q u e n c ei sa g o o d m o d e lo fm o l e c u l a r e v o l u t i o na n di ss u i tt ob eu s e dt oe s t a b l i s ht h ee v o l u t i o nr e l a t i o nm a pb e t w e e n f a m i l ya n dg e n u s i np l a n t s t h en j m a p a n d s i m p l e s tp r i n c i p l em a p b a s e do n3 e n d c o d i n gs e q u e n c e sa r ei d e n t i c a lt ot h et w om a p s b a s e do dt h ec o m p l e t ec o d i n g s e q u e n c e s t h i s s h o w st h a t3 e n dc o d i n g s e q u e n c e so f e p s pc a r l _ r e p l a c e t h e c o m p l e t ec o d i n gs e q u e n c e s t oa n a l y z et h em o l e c u l a r e v o l u t i o n a n a l y s i so f t h e v a r i a t i o no f b a s e so f e p s p so f b r a s s i c a c e a e ，s o l a n a c e a ea n d p o a c e a ei n d i c a t et h a t t h ee v o l u t i o n a r yr a t e so fe p s p sa r ed i f f e r e n tb e t w e e nb r a s s i c a c e a ea n ds o l a n a c e a e a n dt h er a t ei ns o l a n a c e a ei sh i g h e rt h a nt h er a t ei nb r a s s i c a c e a ea c c o r d i n gt ot h e t o t a ls u b s t i t u t i o nr a t eo f b a s e s k e yw o e d s ：e p s p s ，m o l e c u l a re v o l u t i o n ， s e q u e n c ea n a l y s i s ，n e i g h b o r j o i n i n gm e t h o d 6 前言 最初，植物系统发育研究主要是基于形态性状，但不同生物常常由于相 同的生态环境造成平行演化，从而形成同塑性状：加上被子植物化石的缺乏， 给形态性状的分析带来极大困难。因此不同分类学家对性状的评价不同，导致 各分类系统在某些分类群的范围和相对等级上存在一些较大的分歧。近年来迅 速增加的d n a 序列为系统发育研究提供了较为客观的证据不同基因由于其 进化速率不同，而适于不同分类等级的系统发育研究。目前用于科和科以上分 类群研究的两个最主要基因为叶绿体基因r b c l i l 】和核基因1 8 sr d n a 【2 j 。这两 个基因都非常保守。与它们相比，核编码蛋白基因的进化速率分别快4 5 倍 和1 2 1 5 倍。砌j 】等基因的进化较快，适于科内系统发育研究。核糖体 d n ai t s 序列进化速率更快，只能用于属间和种间分类群的研究。还有一些小 的基因家族，如光敏色素基因n 【4 】，对确定分类群的根则极为有用。由于不同 基因的进化历史不同，因此不能武断地用一两种基因的进化树来反映物种的进 化关系，而应用尽量多的基因来进行系统发育研究。 e p s p 合成酶是莽草酸途径的关键酶。莽草酸途径的产物芳香族氨基酸 包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，莽草酸途径只存在原核生物、酵母、丝状真 菌、顶配位寄生虫、植物和藻类质体中【5 ，6 ，该途径不存在于脊椎动物中，这 就意味着这些动物必须从其食物中获得必需的分枝酸衍生物，该途径的中间产 物不能满足营养缺陷性个体的需求 7 1 。草甘膦( g l y p h o s a t e ) 是一种广谱的抗 菌、除草剂，其作用的机理为它竞争抑匍j e p s p s 酶的活性 8 1 。植物对高剂量草 甘膦的耐性可能有三种机制，其一是表达过量的e p s p s 酶【9 叫o 】，另一种方式 是某些氨基酸突变产生有耐性的e p s p s 酶，还有一种便是植物自身含有能够分 解草甘膦的基因，但此种机制还未见在植物中报道。据报道，且n a p u s 的 e p s p s 基因含有7 个内含子、8 个外显子。已有数据表明，植物e p s p s 基因其 编码区非常保守，除转运肽同源性较低外，成熟蛋白同源性非常高，科之间的 氨基酸同源性一般在7 3 以上。我们用p c r 的方法从蜀杂9 号油菜和白菜型油 菜总r n a 中扩增e p s p s 基因3 端编码区并与已发表的其它植物同源序列兆剐 分析，尝试探讨它的进化式样及其植物系统发育研究的可行性。 第一部分蜀杂9 号油菜、白菜型 油菜e p s p s 基因3 端编码序列的克隆 1 材料与方法 1 1材料与试剂 摘取在自然条件下生长的蜀杂9 号油菜、白菜型油菜新长出的嫩叶片，然 后将其在液氮中迅速冷冻保存。上述2 种植物的种子及大肠杆菌j m1 0 9 由本 实验室保存。t a k a r ae xt a qd n a 聚合酶及t a 克隆载体p m d l 8 - tv e c t o r 试剂 盒和3 r a c e 试剂盒均购自t a k a r a 宝生物工程( 大连) 有限公司。柱式胶回 收试剂盒及植物叶r n a ( 小量) 提取试剂盒购于上海华舜生物工程有限公 司。p c r 反应引物由t a k a r a 宝生物工程( 大连) 有限公司合成。 1 2方法 1 2 1 蜀杂9 号油菜、白菜型油菜幼叶总r n a 的提取 称取幼叶0 1 克。液氮冷冻条件下将组织捣碎成粉末。待液氮自然 挥发后，加入5 0 0 p i t c p 液，用移液器抽打5 次以上悬浮样品。移 入1 5 m l 离心管，立即用带针头的一次性5 m l 注射器抽打裂解物 5 一l o 次。离心3 分钟，将上清移入另外一个离心管中。 加入2 5 0 p 1 7 5 乙醇。彻底混匀后，全部移入吸附柱中。离- l , 3 0 秒。倒掉收集管中的液体。将吸附柱移入同一个收集管中。 加入5 0 0 1 _ l i r p 液，离, l , 3 0 秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入 同一个收集管中。 加入5 0 0 1 w 3 液，静置1 分钟后，离t m 5 秒。 将吸附柱移入一个干净的收集管中，加入5 0 0 1 w 3 液，离心1 5 秒。 倒掉收集管中的液体，再将吸附柱移入同一个收集管中。离心1 分 钟。 将吸附柱放入另外一个干净的1 5 m l 离心管中。在吸附膜中央加入 5 0 9 l 纯水，室温静置1 分钟后，离心1 分钟。将1 5 m l 离心管 ( r n a ) 贮存于一7 0 。 1 2 2 总r n a 质量检测 取l u l 总r n a 稀释后，用紫外分光光度计在2 6 0 n m 、2 3 0 n m 和2 8 0 h m 处 测紫外吸收值( o d ) 判断总r n a 的纯度和含量。耿5 u l 总r n a 于1 o 琼脂糖凝胶中( e b 浓度为：0 5 u m l ，下同) 电泳( 6 0v ，1 小时) ，判断总 r n a 是否降解。 1 2 33 - r a c ep c r 反应( 原理图请见图1 - 1 ) 5 。：。塑銎塑星瞥m w - a a w 姒圳惮a a a 从 ( 2 ) 1 s t s 吩n de d n a 豫镧雕删位点 m ， p c r 反应l 3 s l t e s a d a p t o rp f l r r m r ( 含有泐矗i 、伽i 8 a 吁hls i 协) - - - - - - - 一 醐化l 黜洲 与= 墨翌譬盔蒌嚣嚣互互蚕互墨岛 克蠹于适邕啡l o 二。一 图卜13 r a g e 法的原理 根据已发表的其它物种的e p s p s 基因最为保守的核苷酸序列设计并合成j 下 向引物( f o r w a r dp r i m e r ) ：5 - g g t t g t t g g t c t t a a g c a g c t t g 一3 。 3 r a c e ( r a p i d a m p l i f i c a t i o no f c d n a e n d s ) 试剂盒含有反向引物( r e v e r s e p r i m e r ) ： 5 - c t g t c t a a g g a c c g g a t c c 一3 ，反转录引物： 5 o l i g od t c t g t c t a a g g a c c g g a t c c 一3 。 1 2 3 1 反转录反应 按下列组成在反应管中调制反应液，反应总体积为1 5 9 l 。 1 0 r n ap c rb u f f e r 1 5 1 d m g c l 2 ( 2 5 m m ) 3 “l d n t pm i x t u r e f 各1 0 m m ) 1 5r a l a m vr e v e r s et r a n s c r i p t a s ex l ( 5 u i _ * 1 ) 1 山 r n a s ei n h i b i t o r ( 4 0 u 9 1 ) 0 5 山 o l i g od t 一3 s i t e sa d a p t o rp r i m e r ( 2 。5 m m ) 1 l 1 1 实验样品1 p l r n a s ef r e ed h 2 0 5 5 b t l 按以下条件进行r t 反应 3 0 1 0 m i n 5 0 3 0 m i n 9 5 5 m i n 5 5 m i n 1 2 3 2p c r 反应 按下列组成在反应管中调制反应液，反应总体积为5 0 “l 。 1 0 e x 乃口b u f f e r ( m g ”f r e e ) 5 d 1 d n t pm i x t u r e ( 各2 5 m m ) 4 p 1 m g c l ：( 2 5 m m )3 p 1 t a k a r ae xt a q ( s u 1 ) 0 3 m 1 0 上游p c r p r i m e r ( 2 0 1 a m 、0 5 1 _ t l 3 s i t e sa d a p t o rp r i m e r ( 2 0 i _ t m ) o 5 a l 反转录产物l u l 灭菌水3 5 7l l l 各管中再加入3 0 “l 矿物油放入美国m jr e s e a r c h 公司p t c 一1 5 0 2 5 型p c r 仪 中低速离心混合 按以下条件进行p c r 反应 9 4 1 5 m i n 9 4 3 0 8 e c 5 5 。c 3 0 s e c j3 0 c y c l e s 7 2 i m i n 7 2 5 m i n 4 2 h o u r s 1 2 3 3 检测 反应结束后，取5 p l 反应液，用1 琼脂糖凝胶电泳检钡j p c r 产物 然后一2 0 冷冻保存反应产物，备以后分析用。 1 2 4p o r 产物的克隆 获得的p c r 产物经电泳后用上海生工的柱式胶回收试剂盒纯化，再按照 p m d l 8 - tv e c t o r 试剂盒的使用说明书进行p c r 产物与克隆载体的连接反应： p m d 18 - tv e c t o r 0 6 斗l ， 柱式胶回收的p c r 产物2 4l a l d h 2 0 2b t l s o l u t i o ni 5 u l 1 6 c 保温1h 。全量1 0u 1 转化1 0 0p 1j m l 0 9 感受态细胞。 1 2 5 其它d n a 操作方法 质粒d n a 的转化、制备参照文献 i l l 方法进行。 1 2 6d n a 序列测定和分析 在含有x g a l 、i p t g 、a m p 的l 琼脂平板培养基上培养，挑选白色菌落 培养再提取质粒检查t a 克隆载体中是否含有外源插入片段。将含有符合预期 要求插入片段的菌落进行穿刺培养，将培养物送至宝生物工程( 大连) 有限公 司进行测序。测得的序列通过i n t e m e t 分别与g e n b a n k d d b j e m b l 等国际基 因序列数据库进行蛋白质序列预测及同源性分析，并将该序列在 g e n b a n k d d b j e m b l 中注册。 2 结果 2 1总r n a 的提取 将提取的总r n a 在1 1 的琼脂糖凝胶中电泳，其结果见图1 2 。 1 8 s 和2 8 s r r n a 在真核生物中占总r n a 的9 0 以上，因此呈特征条带。图中1 8 s 和2 8 s 特征谱 带清晰，无拖尾，亮度比接近1 ：2 ，说明 r n a 是完整的，没有被降解。取l u lr n a 溶 液，稀释到3 m l ，用7 5 6 分光光度计在波长为 2 8 0 n m 、2 3 0 n m 和2 6 0 n m 下测其o d 值( 见表 图1 2 蜀茎! 曼油墨 1 - 1 ) ，钡4 得两者o d 2 6 0 m o d 2 8 0 n 。2 0 ， 1 、2 ，白菜型油菜幼 叶总r n a ( 从左到右)o d 2 6 0 n i r - ，o d 2 3 0 。1 8 说明r n a 样品较纯； 无d n a 、蛋白质以及小分子的污染。 表卜1 蜀杂9 号、甘蓝、白菜型油菜幼叶总r n a 在不同波长下的0 d 值 2 2 蜀杂9 号油菜、白菜型油菜e p s p s 基因3 端的克隆与扩增 以所抽提的蜀杂9 号油菜、白菜型油菜的总r n a 进行r t p c r ，结合 3 r a c e 技术克隆出一条约为1 1k b p 的片段，而不加模板的负对照无扩增带 ( 图1 3 ) 。电泳回收后，将该片段克隆到p m d1 8 - tv e c t o r 中，转化大肠杆 菌j m1 0 9 ，然后经x g a l 平板筛选白色菌落。利用快速碱法提取白色菌落中 的质粒，凝胶电泳筛选具有插入片段的重组质粒确定获得含有蜀杂9 号油菜、 白菜型油菜e p s p s 基因3 端片段的重组质粒。 图1 33 r a c e p c r 产物1 琼脂糖凝胶电泳图 1 分子量标记d l 2 ，0 0 0 ； 2 蜀杂9 号油菜3 r a c e p c r 产物 3 白菜型油菜3 r a c e p c r 产物 4 负对照 2 3 蜀杂9 号油莱、白菜型油莱e p s p s 基因3 端的核苷酸序列特征 将克隆到的约1 1k b p 的3 端的c d n a 片段进行测序( 见图1 4 、 1 5 ) 。其中蜀杂9 号油菜3 端片段长为1 0 9 7b p ，含p o l y ( a ) t a i l ，终止密 码子t a a 位于第9 2 6 位核苷酸，编码区长9 2 8 b p ，编码3 0 8 个氨基酸：白菜 型油菜3 端片段序列长为1 1 0 9 b p ，含p o l y ( a ) t m l 和真核生物m r n a 降解信 号t 丌a t ( 位于第9 9 8 位核苷酸) ，终止密码子t a a 位于第9 2 8 位核苷酸， 编码区长9 3 0 b p ，编码3 0 8 个氨基酸。 三一 g g t t g 1 1 g g t c t t a a g c a g c t t g g t g c t g a t g t t g 从t g t a c t c t t g g t a c t a a c t g t c c t c c t g t t c g t g t c a a i g c t a a t g g 7 f g g c c g c c c g g t g g a a a g g l g a a g c t t t c t g g a t c a a t c a g t a g t c a a t a c t t g a c t g c a c q g c t c a t g g c a g c t c c c t t a g c t c t t g g a g a c g y l g a g a t l _ g a g a t c a t t g a 州t t g a t t t c t g t t c c a t a t g t t g a a t g c a t t g a a g t t g a l g g a a c g 兀t t g g t g t t a g t g c c g a g c a t a g t g a c a g t t g g g a t c g t l t c t t t g t c a a g g g c g g t c a g a g a t a c a a g t c g c c t g g t a a t g c t t a c g t a g a a g g t g a t g c t t c t a g t g c t a g t t a t t t c t t g g c t g g t g c l g c c a t t a c t g g t g a a a c c g t c a c t g t t g a a g g t t g t g g 从c 从c c a g c c t g c a g g g a g a t g t g a a g t t c g r r g a g g t t c t t g a g a a a a t g g g a t g t a a a g t g t c a t g g a c a g a g 从c a g t g t g a c t g t g a c t g g a c c a t c t a g a g a t g c t t t t g g a a t g a g a c a c t t g c g t g c t g t t g a t g t c a a c a t g a a c a m a t g c c t g a t g t a g c c a t g a c t c t t g c c g t t g t a g c t c t c t t t g c a g a t g g c c c a a c c a c c a t t a g a g a t g t g g c t a g c t g g a g a g t a a a g g a g a c a g a 从g g a t g a t t g c c a t t t g c a c a g a g c t t a g g a a g c t t g g a g c t a c a g t g g 从g a g g g t t c a g a t t a t t g t g t g a t 从c t c c a c c a g c a a a g c t g a a a c c g g c g g a g a t t g a c a c a t a t g a t g a c c a t a g a a t g g c 从t g g c a t t c t c c c t t g c a g c t t g t g c t g a t g t t c c a g t g a c c a t c a 从g a t c c t g g t t g t a c c a g g a a g a c t t t c c c t g a c t a c t t c c a a g t c c ”g a a a g t a t c a c 从a g c a c t 从a 从a a c c c l v r t t t t t t t a c c a c t g c a c t a 从a a g a c c t t a a a g c c c a t t t g t c t t t t c t l v r t t g a t c c a a t t g a g a t c a g t t t c c t c t g t t g t c a c c g t a a g a t t a c g a a 从c a a a g a g t a t t 从g a t t g c t t g c t t g t a c c a a a a m a a a a g g a a _ a a a a a a a a a a a a 图卜4 蜀杂9 号3 端序列 ( 加粗代表终止密码子t a a ) g g t t g t t g g t c t t 从g c a g c t t g g t g c t g a t g t t g 从t g t a c t c t c g g c a c t 从c t g t c c t c c t g t t c g t g t c 从t g c t a a t g g t g g c c t t c c c g g t g g a a a g g t g a a g c t t t c t g g a t c a a t c a g t a g t c a a t a c 订g a c t g c c t t g c t c a t g g c a g c t c c t t t a g c t c t t g g a g a c g t g g a g a t t g a g a t c a t t g a t a 从c t g a t t t c t g t t c c a t a t g t t g a a a t g a c a t t g 从g t t g a t g g 从c g t t t t g g t g t t a g t g c c g a g c a t a g t g a t a g c t g g g a t c g t t t c t t t g t c 从g g g c g g t c a g 从g t a c a a g t c g c c t g g t 从t g c t t a t g t a g a a g g t g a t g c t t c t a g t g c t a g c t a c t t c t t g g c t g g t g c t g c t a t t a c c g g t g a 从c c g t c a c t g t t g a a g g t t g t g g a a c a c t a g c c t c c a g g g a g a t g t g a a a t t c g c a g a g g t a c t t g a g a a a a t g g g a t g t a a a g t g t c a t g g a c a g a g 从c a g t g t g a c t g t g a c t g g a c c a t c t a g a g a t g c t t t t g g 从 t g a g a c a c c t t g c g t g c t g g t t g a t g t c 从c a t 6 从t a a a a t g c c c g a t g t a g c c a t g a c t c t t g c c g t t g t t g c t c t c t t t g c c g a t g g t c c a a c c a c c a t c a g a g a t g t g g c t a g c t g g a g a g t t a a g g a g a c a g a a a g g a t g a t a g c c a t c t g c a c a g a g c t t c g a a a g c t t g g a g c t a c a g t g g a a g a g g g t t c a g a t t a c t g t g t g a t a a c t c c a c c a g c a a a g g t g a a a c c g g c g g a g a t t g a t a c a t a t g a t g a t c a t a g a a t g g c g a t g g c g t t c t c g c t t g c a g c a t g t g c t g a t g t t c c 粥t c a c c a t c a a g g a t c c t g g c t g c a c c a g a a 酶a c t t t c c c t g a c t a c t t t c a a g t c c t t g a a 配t a t c a c a a a g c a c _ t _ a a a a a g a t c a t t t c c t t t g a a t c c a a a t g t g a g a a t g t g t t t c t t t c t c t c t c t g t t g c c a c t g t a a c a t t t a t t a g a a g a a c a a 配t g t g t g t g t t t a a g a g t g t g t t t g c t t g t a a t g a a c t g a g t g a g a t g c a a t c g t t g a a t c a g t t t t g g g c c t t a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 图1 - 5 白菜型油菜3 端序列 ( 加粗代表终止密码子t a a 下划线代表真核生物m r n a 降解信号肼t ) 4 2 4 蜀杂9 号、白菜型油莱e p s p s 基因3 端核苷酸及推导蛋白序列同源分析 将蜀杂9 号油菜、白菜型油菜e p s p s 基因3 端核苷酸序列及其推导蛋白 序列同g e n e b a n k 已登录的其它e p s p s 基因的核苷酸序列、氨基酸序列进行 了比较( 见图1 6 、表1 2 ) 。结果表明：这2 个片段无论是核苷酸序列还 是推导蛋白序列都与其它植物的相应序列有非常高的同源性。核苷酸同源分 析发现这些物种的e p s p s 的m r n a 的同源性仅限于编码区段，而3 端非翻 译区则差别很大，说明了3 非翻译区具有物种特异性。 m 6 1 9 0 4 m 2 1 0 8 4 m 2 1 0 7 1 n m 1 3 0 0 9 3 x 0 6 6 1 3 a y 0 4 0 0 6 5 a f 3 6 0 2 2 4 删1 0 3 7 8 0 x 5 1 4 7 5 a f 4 4 0 3 8 9 a f 4 1 3 0 8 2 a b 0 1 6 7 6 8 x 6 3 3 7 4 m 6 1 9 0 4 m 2 1 0 8 4 m 2 1 0 7 l n m 1 3 0 0 9 3 x 0 6 6 1 3 a y 0 4 0 0 6 5 a f 3 6 0 2 2 4 n m 1 0 3 7 8 0 x 5 1 4 7 5 v d g l k q l g a e v i ) c f l g t n c p p v r i v s k g g l p g g k v k l s g s i s s q y l t a l l h a a p l a l g d v6 0 v d g l k q l g a e v d c f l g t k c p p v r i v s k g g l p g g k v k l s g s i s s q y l t a l l m 从p l a l g d v6 0 v d g l k q l g a e v d c s l g t n c p p v r i v s k g g l p g g k v k l s g s i s s o y l t a l i x a a p l l g d v6 0 v v g l k q l g a d v e c t l g t n c p p v r v n a n g g l p g g k v k l s g s i s s o y l t a l 埔s a p l a l g d v6 0 v v g l k o l g a d v e c t l g t n c p p v r v n a n g g l p g g k v k l s g s i s s q y l t a l l m s a p l a l g d v6 0 v v g l k q l g a d v e c t l g t n c p p v r v n a n g g l p g g k v k l s g s i s s q y l t a l l m a a p l a l g d v6 0 v v g l k q l g a d v e c t l g t n c p p v r v n a n g 6 l p g g k v k l s g s i s s o y l t a l l m a a p l a l g d v6 0 v v g l k q l g a d v e c t l g t n c p p v r v n a n g g l p g g k v k l s g s i s s q y l t a l l m m p l a l g d v6 0 v v g l k o l g d v e c t l g t n c p p v r v n a n g g l p g g k v k l s g s i s s 。y l t a l 删从p l a l g d v6 0 v v g l k o l g a d v e c t l g t n c p p v r v n a n g g l p g g k v k l s g s i s s o y l t a l 删从p l a l g d v6 0 w g l k q l g a d v e c t l g t n c p p v r v n a n g g l p g g k v k l s g s i s s o y l t a l l 雠a p l a l g d v6 0 v v g l e q l g a d v e c t l g t n c p p v r v n a n g g l p g g k v e 乙s g s i s s q y l t a l 嘣a a p l a l g d v6 。 v v g l k q l g a d v d c f l g t