（机械制造及其自动化专业论文）转基因微注射系统的研究与开发.pdf

摘要 摘要 显微注射法是进行基因转移的重要手段。转基因显微注射的注射操作过去主 要由手工完成，手工操作依赖操作人员自身的素质，注射成功率很低。目前市场 上的自动微注射控制器基本为国外产品所垄断，价格比较昂贵。国内对微注射控 制器的研究和开发工作开展很少。 微操作系统是多学科理论成果相结合的高科技产物，它融微流体动力学、自 动化控制理论与应用、计算机科学与应用以及精密机械加工、显微生物操作技术 为一体，其特点是基于计算机图像实现、人工参与的闭环操作控制，对系统整体 的安装精度、运动精度和定位精度均有很高的要求。微操作系统的特性对注射作 业提出了相当苛刻的要求。正常细胞的外源基因容受量为皮升级。外源基因注入 的太少，达不到表达效果；太多，又容易将细胞胀破。注射剂量不一致又会导致 胚胎注射后发育不同步。 基于上述原因，本文以用于生物工程微操作的超微量注射系统为研究目标， 目的在于为我国的生物工程的发展提供强有力的工具。本文对微注射物质的动力 学特性进行理论研究，建立了微注射量与注射压力、时间及微注射针尖端的参数 的关系模型，并依此推导出了微注射量与其影响参数的关系公式。并在理论研究 的基础上，根据超微量注射操作的要求，进行了液压电控式微注射系统的设计。 包括结构设计，液路及电路部分的设计，以及硬件的选择，并进行了控制算法的 研究。最后，对压力和注射量进行了实际测量，验证了微注射量与压力，时间及 微注射针尖端几何参数的关系。 关键词微注射；显微操作；理论模型 a b s t r a c t a b s t r a c t t h e m i c r o i n j e c t i o nm e t h o di so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tm e a n si ng e n e t r a n s f e r i nt h ep a s tt h eo p e r a t i o no fm i c r o i n j e c t i o ni sc o m p l e t e db ym a n u a l ，w h i c hd 印e n do n t h e q u a l i t yo fo p e r a t o r s ot h es u c c e s sr a t ei sv e r yl o w n o wt h ea u t om i c r o i n j e c t i o n i n m a r k e ti sm o n o p o l i z e db yf o r e i g np r o d u c t sb a s e l y , t h er e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n tf o r m i e r o i n j e c t i o ni nd o m e s t i ci sv e r yf e w m i c r o m a n i p u l a t i o ns y s t e m i st h eh i g h t e c h n o l o g yp r o d u c to f t h e o r i e s c o m b i n a t i o no fm u l t i s u b j e c t s i ti n c l u d e sm i c r o f l u i d i c sd y n a m i c s ，t h e o r i e sa n d a p p l i c a t i o n so fa u t o m a t i o nc o n t r o l ，c o m p u t e rs c i e n c ea n da p p l i c a t i o n ，p r e c i s i o n m a c h i n i n gt e c h n o l o g i e sa n dm i c r o m a n i p u l a t i o nt e c h n o l o g i e s i ti sb a s e do n c o m p u t e ri m a g e s r e a l i z a t i o na n dc l o s e d l o o pc o n t r o lo p e r a t i o n , a n dh a sh i g h r e q u e s t st ot h ei n s t a l l a t i o np r e c i s i o n ，m o v e m e n tp r e c i s i o na n d o r i e n t a t i o np r e c i s i o no f s y s t e m a l s o ，i th a sh i g hr e q u e s t s t ot h ei n j e c t i o np r o c e s s i ft h ei n j e c t i o ni st o ol i t t l e ， t h ea f f e c t i o nw i l ln o tb ep r o p e r ；i ft o om u c h ，t h ec e l lw i l lb eb u r s t i fn o ti d e n t i c a l ，t h e e m b r y o sg r o w t hw i l ln o ts y n c h r o n o u s b a s e do nt h e s er e a s o n sm e n t i o n e da b o v e ，ic o m p l e t e dt h ed e v e l o p m e n to f e l e c t r i c a lc o n t r o lm i c r o i n j e c t i o ns y s t e mw i t hg a sn i t r o g e na si n j e c t i o np r e s s u r e m e d i u m ，a c c o r d i n gt ot h em i c r o i n j e c t i o np r o c e s so p e r a t i o n t h ep a p e r f i r s ta n a l y z et h e o v e r a l ld e s i g na b o u tm i c r o i n j e c t o r , a n dt h e nr e s e a r c ht h em e t h o dt od e v e l o p m e n tt h e a c c u r a c yo f t h ep r e s s u r ed a t aa c q u i s i t i o ns y s t e m ，a n dt h a nd ot h eh a r d w a r ed e s i g n 、 s o f t w a r ep r o g r a m m i n ga n dd ot h ed e b u g g i n g t h ew h o l es y s t e mo fm i c r o i n j e c t i o ni s c o n s t i t u t e db yp r e s s u r ed r i v i n ga n dh a r d w a r ec o n t r o l l i n g t h ep a r to fp n e u m a t i c s u p p l i e st h ei n j e c tp r e s s u r e ，b a l a n c ep r e s s u r e ，c l e a np r e s s u r ea n dn e g a t i v ep r e s s u r ef o r s u c k i n ga c t i o n t h ep a r t o fh a r d w a r ec o n t r o l l e ri sc o n s t i t u t e db yp i e z o r e s i s t i v e p r e s s u r e s e n s o r ,m i c r o c o n t r o l l e r , m a n m a c h i n ei n t e r a c t i o n i n t e r f a c e ， s e r i a l c o m m u n i c a t i o na n dp o w e rs u p p l y t h ew h o l es y s t e mi sc o n t r o l l e rb ym i c r o c o n t r o l l e r , a n dd o e st h ec o n t r o ld i r e c t i v et h r o u g ht h ek e yt oc o m p l e t et h ea c t i o no fi n j e c t i o n ， s u c k i n g ，c l e a n i n ga n dc o m p e n s a t i o n k e yw o r dm i c r o i n j e c t i o n ；m i c r o m a n i p u l a t i o n ；t h e o r e t i cm o d e l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：玉班l 日期：丝陋 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：孑丛枣 导师签名： 肄妣吼蛐 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 引言 多年以来，杂交选择一直是改良家畜遗传性状的主要途径。随着现代生物技 术的发展，传统的杂交选择法的各种缺陷日益明显，而现代分子育种技术却显示 出越来越强大的生命力，逐渐成为动物育种的趋势和主流。通过运用将d n a 导 入细胞的技术，结合从一种细胞中分离出细胞核移植到另一种去核细胞中的核移 植方法，科学家们可以把单个有功能的基因或基因簇插入到高等生物的染色体中 去，并在其中表达。 2 0 世纪8 0 年代，经过科学家们的不懈努力，这种运用受精卵基因导入技术 对动物进行基因工作改造的想法终于变成了现实。像许多新兴学科一样，人们创 造出了一套术语以方便交流，例如，转入了外源基因以后的动物称为转基因动物 ( t r a n s g e n i c a n i m a l ) ，其导入的基因称为转入基因( t r a n s g e n e ) ，而整个技术则称为转 基因技术( t r a n s g e n i e t e e h n o l o g y 或t r a n s g e n e s i s ) ，等等。 运用相关转基因技术对多细胞动物进行遗传改造，这些年的进展非常迅速。 目前，转基因技术已经发展成为一种研究很多基础问题的有力手段，例如研究哺 乳动物的基因表达和发育、人类疾病的动物模型系统的建立，在动物乳汁中生产 重要的医用蛋白等等。1 9 8 3 年，美国华盛顿大学和宾夕法尼亚大学的学者利用 显微操作技术，把大鼠的生一长激素基因与小鼠一段管开关的基因组成重组体， 把这个重组体注射到小氧的受精卵里，再把受精卵移植到雌鼠体内，生下来的小 鼠的生长速度比普通小鼠的平均生长速度快5 0 ；1 9 8 9 年，北京农业大学陈永 福院士应用显微注射技术，将o m t u p g h 基因导入猪的受精卵，得到我国的第 一批转基因猪；1 9 9 7 年克隆羊“多利”及克隆猴的出现，使得生物技术成为当 今世界自然科学中最为活跃的领域【l 】。 按基因导入方式来分，建立转基因动物主要方法有显微注射法、逆转录病毒 感染法、胚胎干细胞法与精子载体法。其中显微注射法是目前使用最为广泛，其 实验周期相对比较短，整合效率可达3 0 ，并且还可直接用不含有原核载体d n a 片段的外源基因进行转移而得到纯系动物。 基于上述事实，以及细胞内直接操作的优点，使得微注射成为体外单个细胞 实验的首选技术，也使之成为产生遗传变异动物的一个理想技术。 对单个细胞的微注射实验涉及到细胞的培养、洗涤、消毒技术，基因表达水 平的检测技术，以及注射的操作技术等，其中注射的操作过去是由人工来完成的， 操作的设备主要是微注射针管。后来随着计算机的普及，二十世纪8 0 年代后期 机器人技术的成熟，以及传感技术、计算机视觉和图像处理技术的日臻完善，出 现了在更高技术层次上构架的微注射设备，形成了一整套以机器代替人工，以自 动代替手动的转基因微注射系统。 这样的系统通常由高倍放大显微镜、左右微操作臂、作业工作台，以及左右 两个末端执行嚣等部分组成。有些系统还在显微镜上接c c d 摄像头，阻便将显 微图像的信息传送到监视器上插放出来，如图1 1 所示【：i 。 囤i - 1 转基因微注射系统 f i g l im i c r o i n j e c t o rs y s t a ni ng c r i et r a n s f e r 1 2 转基因显微注射技术概述 基凼工程技术是生物技术中的核心要素。基因转移是指借助基凼工程技术将 确定的外源基因导入生物个体的染色体上的过程。基因转移技术克服了物种间的 生殖隔离，实现了物种之间遗传物质的交换和重组，广泛应用丁生命科研各个领 域。 基因转移方法町分为显微注射法、反转景病毒载体法、胚胎干细胞载体法、 精子载体法、电脉冲法、逆转录病毒载体法。 其中显微注射法是进行基因转移的重要手段，其利用微细的玻璃针头将外柬 的d n a 直接注射到受精卵原核内，在动物细胞的基因转化、核转植以及细胞器 的移植力面应用最多。其优点有：转移效率高，整合率可达3 0 ；被转移基凼长 度长，可达1 0 0 k b ；可用于不同类型的细胞：可连续向细胞注射多种样品；基因 导入不经嵌台体途径，实验周期短。不足之处有：需要非常精细的操作技术和精 密设备：微注射会对细胞带来一定损伤；导入e l 的基因量难于控制，表选效率比 较低；整合位置不易克隆，会导致宿主d n a 突变，甚至造成严重，e 理缺陷”。 甘前，显微注射法中定量注劓常用包被法、被动注射法、直接压力洼这i 种 方挂。 在包被法中，将针尖( 密闭针) 浸到即将导入到细胞的溶液中。微注射针刺 八细胞，样品在细胞质中溶解。这种方法既快又简单，但对实际导入到细胞中样 品的量难以控制。 第1 帝绪论 被动注射法中，针中充满注射溶液。溶液的填充是依赖虹吸作用，即将针管 末端插入溶液中使其针头充满溶液，也可将针头置于一定体积样品，将针的开放 端由于虹吸作用而充满。将针刺入细胞中，样品被动地流入细胞中，这种方法避 免了包被针尖方法所遇到的许多问题，包括由于针尖干燥使样品变性。另一个优 点是导入到细胞中的物质的浓度是已知的，但控制注射的量极为困难。这是由于 时间、位置以及导入样品进入细胞的速度无法精确控制。 直接压力法应用最为广泛，这种方法有恒定流动显微注射方法、脉冲流动注 射方法这两种不同方式。 恒定流动显微注射方法将相对恒定量的物质导入到生长于玻璃或塑料底物 上的培养细胞中。注射物质的量取决于针尖停留在细胞质内的时间。这种方法不 允许重复注射，其变异率低于1 0 ，且受注射时3 5 个细胞滑脱因素影响。该方 法所需注射物质较多，因此对于十分宝贵的样品是不合适的。 脉冲流动注射方法是目前最为广泛使用的方法。其具体操作步骤如下： ( 1 ) 从后面用注射液加载注射针； ( 2 ) 用抗压管将持针器与压力控制装置相连接，这能准确控制排出气体量 以及控制喷射压力的时机和时间； ( 3 ) 将针安装到持针器； ( 4 ) 测定针的正确平衡压力，防止样品从针内流出或倒流； ，一( 5 ) 测定释放到介质中的气泡直径大小以校正脉冲的压力和持续时间，从 而使注射针到细胞的量具有可重复性【2 1 。 1 3 转基因显微注射系统组成及研究现状 1 3 1 细胞微注射系统的研究现状 细胞工程中的显微作业形式很多。如细胞的切割、分离、融合，细胞内器 官( 核、染色体、基因) 的转移、重组、拉伸、固定，细胞壁挤孔，细胞群体的操 纵等，其操作尺度都是在微米或纳米级。由于细胞工程技术的研究对象是具有“生 命”的动植物的细胞，每一个实验环节的失败都会导致生命的死亡，前功尽弃， 造成人力、物力、时间的巨大浪费。 目前生物工程界用于转基因注射的显微注射系统基本上被o l y m p u s 、n i k o n 、 l e i e a 、o p t o n 、b i 0 2 r a d 等公司垄断。这些显微操作系统一般由三大部分组成： ( 1 ) 显微成像系统包括生物倒置显微镜，c c d 摄像头、监控器等设备， 负责细胞转基因微注射操作中显微图像的成像及图像数据采集、显示等。 ( 2 ) 左右微动操作系统包括左右微操作臂及术端执行器等设备。左右微 操作臂分别与左右末端执行器相连，末端执行器通常有微吸管、微注射针、切割 刀、微电极等。 北京in 大学i 学预 n 论女 ( 3 ) 作业操作平台系统作业操作平台系统为一具有两个自由度的承物台， 在马达的驱动下可在平面方向作精确移动，将目标物送垒显微镜视野n 图1 - 2 即为显微操作系统的示意图j 。 妒霸 黔 魄 图1 - 2 显微操作系统全图 f i g l - 2 t h e t o t a lg r a p h o f m i c r o m a n i p u l a t i o ns y s t c 【t 1 目前常规的方法是将被操作的生物置于显微镜下，操作人员通过显微镜目 视被操作物，然后手动操作特定的工具柬运动末端工具，寅现注射的操作。但是 存在很多不足，比如动作精度高，对手动操作的要球很严格：操作人员璺经过长 时期的培训，成本很高等等。 近几年来，各国投入大量资金进行微操作机器人系统的研究，已相续研制 出一牡各具特点的用于生物工程的微操作机器人系统。美国明尼苏达大学的s u n y n 和b r a d l e yjn e l s o n 提出了胚胎生殖核的半自动化注射系统，该系统利用视 觉伺服技术搜寻、捕捉细胞，细胞捕捉器利用m e m s 技术制造。加拿大m c g i l ! 大学八十午代成功地研制出用卜细胞操作的遥控式微机器人系统，日本也研制出 用于细胞操作( 细胞切割、细胞转移、基因注射等) 的取指微操作机器人样机， 1 9 9 5 年日本a i s t 机器人机械技术研究所开发出双指微操作机器人手，由压电陶 瓷驱动，可以实现微米级的精确定位。g r a c e 等人研制出可作眼视网膜手术的遥 控微型机器人，即在眼球运动的条件下，进行切除弹性网膜或个体病理细胞的手 术。法国对昆虫及各种卵细胞进行显微手术或操作的微操作机器人系统研制方 面也取得阶段性成果，已初步研制出实验样机。 相对国外，国内研究起步较晚，但也取得了。些成果。南开大学研制出我 国第一台面向生物医学工程的微操作机器人系统，目前已进入产业化进程。该系 统在显微视觉的引导下，利用汁算机控制多自由度操作器、捕捉器及自动化调焦 系统实现人员通过显微视觉系统观察被操作生物体( 细胞、染色体等) ，寻找 试验台。 北京航窄航天大学机器人研究所正研制的用于细胞操作的微操作机器人系 藩 镕i 章镕m 统包括倒置生物显微镜、粗动平台、左操作手、右操作手、摄像头、图像处理单 位、控制系统、人机交互接口等，该系统具有视觉反馈的性能，能在摄像头下完 成全局视觉闭环反馈，且采用压电陶瓷启动和较新颖的柔性铰链机构，可对活体 细胞和基因进行自动或半自动显微操作。该系统已进行了数次小白鼠受精卵基因 注射实验，并获得成功“。 哈尔滨工业大学研制出操作精度达到纳米级的高精度微动机器人，并已投 入产业应用，该机器人可以应用于分子生物学基因操作能够对细胞和染色体进 行“手术”。 13 2 国外的显微注射仪的研究现状 目前在细胞药物定量注射方面丰要有两类注射器，第一类是手动旋纽式微 注射器( m a n u a lm i c r o i n j e 甜o r ) ，具有结构简单、成本低、操作方便的特点。生产 该类注射器有美国的s u a e r 公司和同本的n i k o n 公司及德国的l e i c a 公司等图 l - 3 a ) 为美国s u t 【e r 公司制造的手动旋纽式注射器，靠手旋动微分头的旋钮实现注 射量的调节，这样的注射量级是无法满足细胞注射皮升级注射量精度，主要操作 过程靠手动调节和显微观察进行，操作精度由操作者的技自来保证，无法安现注 射量的精确控制。 另类注射器被称作编程微注射器但r o g r a m m a b l em i c r o i n j e c t o r ) ，用于按照 预先确定的时删和压力，可以自动地注射或从细胞、卵和细胞组分中抽取少量液 体。图i 一3 b ) 为美国m d i 公司制造的用于转基因实验的徽注射器，采用容积气泵， 由相应的密封舱提供正负压力，正压用于高压注射，负压用于吸住细胞或从尖端 冲灌微管。注射压、保持压和负压都通过控制钮独立调节，并在面板上显示。由 于注射玻璃微针针尖的内径尺寸在微米级，针尖处毛细阻力较大，因此注射压， 保持压和负压要根据注射玻璃微针针尖的内径尺寸确定。 鹦 图1 3a 1 手动旋纽式注射器f 美国s u t t e r 公司 f i g i - 3 a 1m i c r o i n j e c t o r o f m a n u a lk n o b ( m a d eb y s u a e r , u s ) 图1 - 3 b ) 美国m d i 公司制造的自动注射仪 f i g l - 3 b ) a u t o - i n j e c t i o ni n s t r u m e n t ( m a d e b y m d i ，u s ) 这些公司生产的微注射器基本上采用压力驱动。利用高压惰性或不活泼气 体作能源，通过管道入口与出口之问的压力差推进管道中流体运动。压力驱动微 北京丁业大学t 学硕七学位论文 注射中存在许多有待解决的问题，容积式气泵压力控制的延迟性及气体的压缩性 实际上无法精确保证压力、施加时间的控制精度，同时还存在着结构复杂、体积 大、成本高等缺点【1 2 】。 为提高注射效率和注射成功率，国内外许多科研机构和大学都开展了微注 射技术的研究，主要利用计算机图像采集和处理技术、微机电技术，在细胞的观 测、定位、寻找、接近、瞄准方面开展自动化控制研究，但对注射器技术研究方 面进展不大。其中k y o s e o kc h u n 和g e nh a s h i g u c h i 等人开发d n a 注射系 统时，采用在玻璃或硅的基体上刻蚀出可吸持批量细胞的呈阵列状排列的微孔， 利用与之对应的注射针阵列对细胞进行批注射，是一种基于概率注射的系统，在 成功率和生产率上无法保证。 1 3 3 国内的显微注射仪研究现状 1 9 9 6 年之前我国微注射量控制器的研究和开发为一片空白。2 0 0 4 年广东工 业大学研制了一种气压电控式超微量注射仪，整个系统内有压力传感器和放大电 路。可以通过注射压力和注射时间调定注射剂量，弥补了液压手控式微注射仪在 注射时不能精确定量的不足，消除了人为因素所造成的注射剂量不一致，解决了 因注射剂量不一致而导致胚胎注射后发育不同步的矛盾。但是该系统功能非常简 单，为半自动微注射控制器，如果注射参数设定不合适，需要退出整个操作，重 新设定。 南京理工大学利用微流体数字化技术研制了数字化量可控微注射仪，该微 注射仪主要采用改变容积的原理，依靠压电陶瓷的微位移来改变容积，从而实现 微流量注射。但是注射器内部压力增加时，玻璃微针的密封圈处及多处螺纹连接 都会产生泄露。如何解决移动部件的密封问题成了很大难点。 用于细胞基因转移的显微注射实验涉及到细胞的培养、洗涤、消毒技术、基 因表达水平的检测技术，以及注射的操作技术。由于细胞工程技术的研究对象是 具有“生命”的动植物的细胞，每一个实验环节的失败都会导致生命的死亡，前 功尽弃，造成人力、物力、时间的巨大浪费。就目前来说，实验动植物的净化技 术，细胞的培养、洗涤、消毒技术，基因的表达水平的监测技术等自动化程度都 己很高，所以显微操作技术和手段的提高是实验成败的关键。 1 4 转基因微注射器的研究意义及发展现状 1 4 1转基因微注射器的研究意义 对活细胞的显微操作起始于2 0 世纪前半叶，首先应用于电生理的研究。在 4 0 年代后期，建立了细胞内记录的可靠方法。在以后不到十年间，使用类似的 技术直接将生物物质转送到细胞内。起初微注射的目的是向培养的受体细胞中转 移哺乳动物的细胞核和染色体。随着物质的提纯和设备的改进，已经能够向细胞 6 第1 鼋绪论 内转移不同来源的大分子溶液，比如病毒r n a 、纯化的蛋白质和病毒d n a 。人 们采用同样的方法，利用微注射把d n a 转移到受精卵中，很快就有人报道克隆 基因在鼠体细胞中得到了表达。不久人们把重组基因稳定地引入到鼠生殖细胞系 【7 】。从此以来，微注射成为转基因动物研究的常规方法，广泛地应用于活细胞的 研究中，如基因表达、信号转导或细胞骨架研究等。 过去注射操作主要由人工完成，操作的设备为手动微注射器，手动微注射器 具有机构简单、成本低等特点。在人工操作过程中微量注射是操作员最为头疼问 题。因为正常细胞的外源基因容受量为皮升级。外源基因注入太少，达不到表达 效果；太多，又容易将细胞涨破。同时注射剂量不一致会导致胚胎注射后发育不 同步【8 j 。所以人工操作强烈依赖于操作人员自身的各种因素，受情绪、疲劳等和 周围环境的影响；操作精度由操作者的技能来保证，无法实现注射量的精确控制； 目前能够从事这种精密操作的实验人员，至少要经过两三年的严格培训，成本很 高；而且手动微注射成功率只有百分之一5 1 。 这就决定了这项技术只能由少数人掌握，一定程度上制约了生物工程、细胞 工程的科研发展。广大从事生物工程、细胞工程的科研人员迫切希望能改进原有 的手动微注射控制设备，采用先进的微注射量控制技术，以机械代替人工，以自 动化代替手动，使微注射控制技术能够简单化、自动化，进而推动转基因工程的 发展。 1 4 2 转基因自动微注射器的研究现状 目前在细胞药物定量注射方面主要有两类注射仪，第一类是手动旋钮式微注 射仪，具有机构简单、成本低、操作方便的特点。生产该类注射仪有美国的s u t t e r 公司和日本的n i k o n 公司及德国的l e i c a 公司等。这种手动旋钮式注射仪靠手旋 动微分头的旋钮实现注射量的调节，这样的注射量级是无法满足细胞注射皮升级 注射量精度，主要操作过程靠手动调节和显微观察进行，操作精度由操作者的技 能来保证。无法实现注射量的精确控制。 另一类注射仪被称作自动注射仪，用于按照预先确定的时间和压力，可以自 动地注射或从细胞、卵和细胞组分中抽取少量液体。目前市场上最常见的就是由 气驱动的自动注射仪。图1 4 为美国m d i 公司制造的用于转基因实验的微注射 仪，采用容积气泵，由相应的密封舱提供正负压力，正压用于高压注射，负压用 于吸住细胞或从尖端冲灌微管。注射压、保持压和负压都通过控制钮独立调节， 并在面板上显示。由于注射玻璃微针针尖的内径尺寸在微米级，针尖处毛细阻力 较大，因此注射压，保持压和负压要根据注射玻璃微针针尖的内径尺寸确定。 7 图1 4 美国m d i 制造自动注射仅 f i g l - 4 a u t o - i n j e c t i o a i n s t r u m e n t m a d e b y m d i ，u s 对于微操作机器人系统的自动微注射装置来说，要求被注射液体( 包括外源 基因、蛋白质、染料、石蜡等) 的控制量都精确到纳升甚至皮升级。而且针对不 同的操作对象，毛细玻璃或针管内的压力要求也随着变化。即使利用上述的编程 为注射仪，如何自动精密控制注射量及内部压力仍是生物研究工作者十分头疼的 问题之一。 细胞注射时微注射玻璃针的临界喷射压力决定了系统的内部压力而微注射 玻璃针的制造要经过拉制和磨制两个工艺过程，针尖的直径较难控制，每根针尖 的直径的若别会使i 临界喷射压力有所不同。注射不叫的药物时，注射玻璃针是不 允许重复使用的，因此不同批次注射时都需要靠旋钮调整压力。另外容积式气泵 压力控制的延迟性及气体的压缩性实际上无法精确保证压力、施加叫问的控制精 度，同时还存在着结构复杂、体积小、成本高、成功率低等缺点。由于日前尚无 成熟的定量微注射方法，目前围内大多数用户仍然在使用前面所述的两类仪器， 但对定量注射方法的研究一直在进行。 为提高注射效率及注射成功率，国内外计多研究机构和大学都开展了微注射 技术的研究，主要利用计算机图像采集和处理技术、微机电技术，在细胞观测、 定位、爿找、接近、瞄准方面开展自动化控制研究，但在注射仪技术研究方面进 展不大。 广东工业大学研制了一种气压电控式超微量注射仪，整个系统内有压力传惑 器和放大电路。可咀通过对注射气压和注射时间的精确调定注射剂量，弥补了液 压手控式微注射仪在注射时不能精确定量的不足消除了人为因素所造成的注射 剂量不一致，解决r 因注射剂量不一致而导致1 王胎注射后发育不同步的矛盾a 但 在试验过程中，微注射针端部非常狭长，气体本身存在一定的压缩性，导致在试 验结果与理论推导问存在一定的出入。 南京理工大学利用微流体数字化技术研制r 数字化量可控微注射仪，该微注 射仪主要采用改变容积的原理，依靠压电陶瓷的微位移来改变容积，从而实现微 流量注射。但是注射器内部压力增加时，玻璃微针的密封圈处及多处螺纹连接都 会产生泄露。这样以来，如何解决移动部件的密封问题成了很大难点。 第1 章绪论 1 5 本文主要研究内容 本文的主要研究内容包括以下三个方面： ( 1 ) 对微注射物质的动力学特性进行理论研究，建立了微注射量与注射压 力、时间及微注射针尖端的参数的关系模型，并依此推导出了微注射量与其影响 参数的关系公式。 ( 2 ) 在理论研究的基础上，根据超微量注射操作的要求，进行了液压电控 式微注射系统的设计。包括结构设计，电路部分的设计，以及硬件的选择，并进 行了控制算法的研究。 ( 3 ) 对压力和注射量进行了实际测量，验证了微注射量与压力，时间及微 注射针尖端几何参数的关系。 9 第2 章转幕因微汴射系统的硬件设计 第2 章微注射过程的动力学特性研究 2 1 注射量的理论模型的建立 首先，根据理论依据，对注射量建立数学模型进行推导。图2 - 1 为注射针端 部模型。 图2 1 注射针尖端部分的理论模型 f i 9 2 1t h et h e o r e t i c a lm o d e lo fm i c r o i n j e c t o rn e e d l e p o i n t 先假设d n a 流体在微针管内的流动是一维不可压缩的稳态流动( 或充分发 展的流动) ，由哈根泊谡叶( h a r g e n - - p o i s e u i l l e ) 方程可得，由注射针两端的 压力差引起的体积流率为： 幻z c r 4 口= o 一 1 8 1 a 但1 ) 该方程适用于管内流体为牛顿流体，它表明了管道层流动中体积流量与导致 流动的压力差和重力的关系。式中，r 代表针管半径，“为内部溶液动力粘性系 数，ap 为注射针两端的压力差【4 3 1 。 将哈根一泊谡叶方程引入微注射量模型的推导，由于注射针为头大尾小的锥 形，管径并非是常数，所以将原方程中的r 用变量r 代替，将ap 压力梯度用d p d l 来代替。并且根据d p d l - - t a n q ) ( d p d r ) ，改写为： 兀 玎r 4t a n 啐d p g2 _ 了印2 i ，亍佗一2 11 8 此8 此办一 将上式积分，可得 因为针尖端径远远小于针头的端径，即 ，则 9 2 ；3 弭x t a n q o a p 2 警 f 3 两端积分，得出流量方程： q ：垫挲竺坐) 。 8 + m 为微针前端倾角。因为微针端部非常细长，所以倾角很小，可视为不变量。 因为实际注射中，基因液的扩敞效应很小，所以也可以视为恒值。所以影响流 量的因素包括两端的压力差6 9 、注射时间t 和针管端部内径r l 。从式中可以看 出，ap 、t 和流量o 都成线性关系，而半径n 和流量q 成三次方关系i i 是采 用压力注射时影响流量变化的关键因素。 2 2 细胞注射微针的研制 2 21 拉针器实验祥机的发展现状 近年来，随着生物t 程技术的发展细胞操作及微量液体检测的应用越来越 广泛。细胞操作主要包括细胞桉移植、细胞内药物注射，细胞核内d n a 注射、 胚胎注射及细胞单个分离。细胞微操作的主要： 具是玻璃微针，对普通细胞注射 要求针尖内孔直径在o5u m 一5un l ，细胞顾内单精于注射中针尖内孔苴径在4 u m 5um ，细胞核移植及细胞单个分离耍求将玻璃微针针尖磨制或锻烧成指定的 形状用于吸持或勾墩细胞。由于微操作的成功率仅在1 0 左右，而上l 因为要避免 注射物质和注射生物体的交叉感染。一般玻璃微针不会重复使片i 。随着生物工程 技术存我围的快速发展，各个科研院所需要做大量的常规性细胞注射操作，因此 我国每年消耗的玻璃微针数最十分巨大。拉针器结构如图2 2 所示8 。 图2 - 2 拉针器的爵个组成部分 f i 9 2 2 t h ec o m p o n e n tp a r t s o f g i a s s m i c r o e l e c t r o d ep u l l e r 第2 辛转基因微注射系统的硬件设计 玻璃微针的生产在微操作配套设备上进行，目前我国的微操作设备全部依赖 进口，外商一般以主设备微操作器与微拉针器、磨针器、锻针器等配套设备进行 捆绑式销售。世界上较著名的制造商有美国的s u r e r 公司和日本的n i k o n 公司和 日本成茂公司。表2 1 中是细胞工程仪器系统的组成及国外售价。配售专用拉针 所需的毛细玻璃管单只售价近7 元人民币，由于国外所售微拉针器在拉制微针时 是根据该配售毛细玻璃管材料及规格制定的工艺参数，拉伸工艺参数制作成数个 模式固化到机器的控制芯片中，当我国用户试图利用该拉针器以国产毛细玻璃管 为原材料拉制微针时，制造的针尖尺寸及柔韧度达不到微注射的基本要求，只能 购买进口毛细玻璃管。其所耗费用极高，因此微拉针器等配套设备的国产化是一 个非常紧迫性的课题。 在微量化学分析仪器、微流量传感器和微供给系统中，由于分析液体的微量， 要求承载液体的管道的内径在1 0 1 0 0 um 之间。在金属材料上用去除金属的方法 很难得到，目前5 0l am 以内的微管道几乎全部是在硅上光刻而成，硅微加工技 术制作的微管道一般呈矩形，流动阻力比圆截面微管尺寸大，需用阳极键合等技 术进行封装，相对成本较高。 表2 1 细胞仪器系统的组成及国外报价 t a b 2 - 1t h ec o m p o s i n gp a r t so fc e l l u l a ri n s t r u m e n ts y s t e ma n dt h e i rq u o t e dp r i c ea ta b r o a d 罐蚪b 日英产品售价 辟j名弦 产地( 塑吁)簸摊 ( 万元人民l f ；， l 徽擞像瓣fi 奉佗壤( 麓t 一稠箨e 1 3踱lj , t 簟幼j 2 控针仅il 奉成淡( 1 ，n 一3 0 )唾4 叔f t 0 1 b ) , 胡 3 拙舒仪 戈围m r r t e r ( r - 8 0 ) 5 。2 烈细 童纠 4 锻针仅 l i 奉成，盍( n f - 9 0 0 ) 6 。8 5 般l 包玩轴街讶筘 5 破墒二e - q 谤ll 奉城茂1 6 - 1 0 0 ) 0 。1 4 2 0 0 驰鑫 内径在1 0 0 址m 的圆截面玻璃微管道具有流动阻力小及管壁光滑的优点，而 用于液体微量检测的微管道内径一般小于5 0um ，并且要求有较好的强度，所以 两端应与外界有宏观尺度的连接口以保证液体能顺利导入【2 3 1 。 2 2 2 微针用材料的选择 一般地，微注射针是用玻璃毛细管拉制，并由四部分组成，分别是针尖、针 径( 逐渐变细的部分) 、肩部和针柄，如图2 3 所示。 根据细胞操作的特点，对细胞注射用微针的材料提出了以下几点要求： 北京t 业人学工学硕1 j 学位论文 ( 1 ) 一定的化学稳定性：在细胞注射时，由于细胞培养皿中的培养基溶液 要具有细胞正常的生存环境，因此可能会具有一定的酸性或碱性，且微针中的样 品溶液也可能具有一定的酸性或碱性。因此，对细胞注射用微针材料就有特殊的 要求，即要具有较强的化学稳定性，能够抵抗一定的酸、碱性。 ( 2 ) 较好的工艺温度特性：细胞微注射对微针的直径提出了较高的要求， 一般在几个微米左右，如此小的直径一般只能采用拉制的方法，而拉制时要涉及 到加热温度的问题，因此，这种材料要适于采用拉制的方法，且工艺温度一定要 恰当，不能太高，否则很难加工。 ( 3 ) 一定的机械强度：首先微针需要与注射器联接。另外，微注射时，微 针需要扎入细胞核内，细胞本身具有一定的韧性，因此，对微针就提出了一定的 机械强度要求。 ( 4 ) 一定的清洁度：微针由于内径很小，能够达到几个微米，如果稍微有 杂质就容易堵死微针内径，因此对材料的清洁度有很高的要求。 ( 5 ) 良好的磨削加工性能：由于微针在细胞注射时要磨成不同的角度，因 此要求材料具有良好的磨削性能。 符合上述要求的有4 种材料，一般预制成圆截面中空的薄壁毛细玻璃管，便 于制各、洁净，适合于拉制玻璃微针。苏达玻璃融解温度较低( 1 0 0 5 c ) ，制作出 的针易弯曲，不易用于注射细胞膜较坚硬的细胞。硼硅酸盐玻璃较硬( 融解温度 1 2 5 2 ( 3 ) ，最易于制备针尖，拉出的针尖内径较大，它在刺穿相对坚实的细胞表 面时不易弯曲，本实验中我们就用了牛的卵细胞作为实验细胞。铝硅酸盐和二氧 化硅玻璃用于制造更加坚硬的注射针，拉制时需用蓝焰或激光加热【2 4 1 。 针灸斜角徽针内径 图2 3 微注射用玻璃微针的外形图 f i 9 2 3t h eo u t s i d ev i e wo fm i c r o i n j e c t i o ng l a s sn e e d l e 2 2 3 微注射针的拉制 ( 1 ) 确定拉制材料 用于拉制的毛细管要求有较好的强度，并且在拉细到微米级尺寸后要有足够 的韧性。经过选择，我们选定用碰硅酸盐玻璃毛细管。玻璃毛细管的规格为外径 1 6 m m 、内径1 o m m 。碰硅酸盐玻璃的成分如下所示： s i o ，7 4 8 1 4 第2 章转基目微a 射系统的硬件设计 a 1 2 0 3 一一一- - 3 5 b 2 0 3 - 一- 1 4 5 n a 2 0 一一一一- 45 k 2 0 一一0 5 其软化温度为7 7 0 1 0 。 ( 2 ) 微注射针的拉制试验 未加热曲在活动卡头上加力，在拉制过程中，力的大小和拉伸速度变化梯度 成正比，但又不能在未加热时产生静拉断现象。经试验加力大小应大约在1 3 0 0 n 左右较合适。将调压电雎超过1 0 伏特时，加热温度过高致使微玻璃针针尖部分 的柔韧性降低，在进行细胞注射时针尖部分极易断裂。因此调压器电压调至1 0 伏以下，毛细管一旦加热到熔融状态便自动开始拉伸，其状态逐渐变细，毛细管 抵抗拉力逐渐减小，由于拉力不变，这样拉忡速度会愈来愈快，晶后拉断。在拉 制过程中，要保证加热丝在玻璃毛细管被拉断的瞬间及时地切断电源。微针拉制 后如图2 - 4 所示。 硼硅酸盐玻璃毛细管的规格有多种，另二种玻璃毛细管规格为外径1 2 r r a n 、 10 r a m 内径o8 m m 、o6 m m ，相应的拉制实验电已完成，其他材料的玻璃毛细管 的拉针实验已开始进行，由于本文篇幅限制，在此不再叙述。 隔 圈2 4 微针的拉制过程 f l 醇- 4 t h e p u l t m gp r o c + c + s o f m i c r o i n j e c t i o nn e e d l e 拉制后的微钳，有些针尖是处于不通的状态，因此，需要采用磨制的手段才 可以使其通畅。磨制出斜角的微针更有利于扎入细胞内。对某些黏度较大的样品 ( 如大d n a 或r n a 分子，或大分子蛋白质及亚细胞碎片) ，采用磨制斜角的方 法可以在不增大针颈部的截面积( 即增大针尖直径) 情况下增大微针弯曲部位出 口腔的面积，从而更有利于注射。 2 3 注射微针的临界喷射特性研究 23i 注射微针喷射特性研究的意义 在生物工程中，细胞注射是必不可少的操作规程，细胞注射主要包括细胞核 北京t 业大学1 = 学硕t - 学位论文 i i 移植、细胞内药物注射，细胞核内d n a 注射、胚胎注射及细胞单个分离。对细 胞注射要求针尖内孔直径在0 5 1 a m 5 a m ，这样才能保证针尖可以刺入细胞核并 进行药物注射。并且，注射物质的数量级在皮升级。目前，随着微操作技术和微 量注射技术的发展，细胞注射已成为现代细胞学与分子生物学领域对于各种过程 和结构研究的重要方法。由于注射量和注射玻璃针尖部内径的微小，整个细胞注 射系统属于微流体范畴。细胞注射微玻璃针的临界喷射特性研究为实现细胞定量 注射、提高注射效率、提高注射成功率提供了基础数据。 细胞注射微针的临界喷射状态是指注射药液在压力的作用下逐渐接近针尖， 当压力达到一定数值时，药液从针尖临界射出的状态。注射压力在临界喷射状态 附近上下的微小