（微生物学专业论文）乳酸菌的高密度培养及酸奶冻干发酵剂的研究.pdf

华中农业大学硕士学位论文 摘要 随着我国发酵乳制品工业的迅猛发展，积极研究并大力开发高效浓缩型酸奶冻 干发酵剂，对推动我国酸奶发酵剂的生产水平，提高国产发酵剂的竞争力，具有重 要的意义。本文对优良乳酸菌发酵菌种进行了分离选育以及优化搭配；研究了乳酸 菌的增殖培养、细胞分离浓缩、真空冷冻干燥等工艺技术；优化筛选出了高效的乳 酸菌增菌培养基及冻干保护剂；制备出高效的酸奶冻干发酵剂，并对其在乳中的发 酵活力以及贮藏稳定性进行了检测。 从国外优质商品化发酵剂中分离出2 株嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l l u s ) 和2 株嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) ，通过对菌种在乳中的发酵性能及其混 合搭配比例的研究，筛选出发酵性能较优的1 株嗜热链球菌一s 8 0 0 和1 株嗜酸乳杆 菌一l 6 2 1 ，并确定了二者在乳中混合发酵的最佳接种比例为2 ：l 。 对l 6 2 1 和$ 8 0 0 的增菌培养基的氮源、碳源、果蔬汁以及其他营养因子进行了 单因素筛选和正交优化实验，经过研究确定了两菌的增菌培养基配方，l 6 2 1 的增菌 培养基为：o 5 乳糖、3 蛋白胨、3 0 胡萝卜汁、3 0 平菇汁、1 牛肉膏、1 酵母粉、0 3 磷酸氢二钾、1m i 几吐温8 0 ，在此配方条件下，l 6 2 1 经3 7 静置 培养1 8h 后菌数达到3 7 2 x 1 0 9 c f u m l ：$ 8 0 0 的增菌培养基配方为：0 5 乳糖、3 大豆蛋白胨、3 0 番茄汁、3 0 平菇汁、l 牛肉膏、l 酵母粉、0 5 磷酸氢二 钾、0 3 乙酸钠，在此配方条件下，$ 8 0 0 经3 7 静置培养1 8h 后菌数达到1 0 4 x 1 0 9 c f u m l 。 利用全自动发酵罐对乳酸菌的培养分别进行了温度、p h 以及补料的优化实验， 实验结果表明，l 6 2 1 的最佳生长温度为3 7 ，最佳恒定生长p h 值为5 5 ，以3 的速度流加1 0 乳糖和2 0 酵母膏的混合补料，经过1 2h 培养，最高菌数达到 6 2 1 x 1 0 9c f u m l ；$ 8 0 0 的最佳生长温度为4 2 ，最佳恒定生长p h 值为6 0 ，以3 的速度流加1 0 乳糖和2 0 酵母膏的混合补料，经过1 2h 培养，最高菌数达到 3 2 9 x1 0 9c f u m l 。 通过研究不同离心时间和离心转数对乳酸菌离心收得率的影响，确定了离心收 集菌体的最佳离心条件，l 6 2 1 的最佳离心条件为：6 0 0 0r m i n 离心1 0m i n ，离心收 得率为9 5 8 ；$ 8 0 0 的最佳离心条件为：6 0 0 0 r m i n 离心2 0m i n ，离心收得率为9 3 5 。 研究了样品的冻干厚度和以脱脂乳为基础保护剂的浓度对乳酸菌冻干存活率 的影响，确定了其最佳的样品冻干厚度为o 5c m ( 对应样品体积为2m e ) ，脱脂乳的 最适浓度为1 0 ；通过对不同保护因子的单因素筛选，选择了海藻糖和甘氨酸作为 复合冻干保护剂的成分，经过正交优化，确定了复合冻干保护剂的组成为：1 0 脱 脂乳，3 海藻糖和2 甘氨酸。当样品冻干厚度为0 5c m ( 对应样品体积为2m l ) ， 经过此复合保护剂的冻干保护，l 6 2 1 的冻干存活率为7 7 o l ，冻干菌粉的活菌数 华中农业大学硕士学位论文 为2 3 1 x 1 0 1 0c f u g ；$ 8 0 0 的冻干存活率为8 3 6 7 ，冻干茵粉的活菌数为1 2 6 x 1 0 1 0 c f u g 。 冻干发酵剂在常压4 下保藏3 个月中，其活茵数以及发酵活力都无明显变化， 表现出比较稳定的贮藏性能。球菌杆菌冻干菌粉按质量比4 ：1 ( 菌数比约2 ：1 ) 的量 发酵脱脂乳，在4 2 下经过4 小时2 0 分钟能凝乳，凝乳时p h 为4 8 左右，凝乳 酸度约为8 0 。t ，而且感官风味俱佳，具有酸奶直投式发酵剂的开发潜力。 关键词：乳酸菌；优化培养；冻干保护剂；冻干发酵剂 h 华中农业大学硕士学位论文 a bs t r a c t w i t ht h er a p i d l yd e v e l o p m e n to ff e r m e n t e dd a i r yp r o d u c ti n d u s t r y , i t ss i g n i f i c a n t f o rp r o m o t i n gt h ei n d u s t r i a lo fl a c t i ca c i db a c t e r i a s ( l a b ) f r e e z e d r y i n gs t a r t e r sa n d e n h a n c i n gt h ec o m p e t e n c eo fo u rn a t i o n a ls t a r t e r s i nt h i sp a p e r , t h en i c e rs t r a i n sw a s i s o l a t e da n do p t i m u mc o l l o c a t i o n ；t h et e c h m c a lc o n d i t i o n so fi t se n r i c h m e n tc u l t u r e s ， c o n c e n t r a t e di s o l a t i o na n df r e e z e d r y i n gw e r es t u d i e d ；t h ee n r i c h m e n tm e d i u m sa n d c r y o p r o t e c t a n t sw e r es c r e e n e d ，i no r d e rt op r o d u c et h el a bf r e e z e d r y i n gs t a r t e r s ，a tl a s t t h ec l a b b e r i n gc h a r a c t e r i s t i c sa n ds t o r es t a b i l i t yw e r ee x a m i n e do ft h es t a r t e r s c l a b b e r i n gc h a r a c t e r i s t i c so fs t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l l u s $ 8 0 0a n dl a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u sl 6 21 ，w h i c hi s o l a t e df r o mt h ec o m m e r c i a ll a bs t a r t e r sa b r o a d ，w e r e s t u d i e d 2 ：li st h eo p t i m u mp r o p o r t i o no ft h o s et w os t r a i n sf o rm i x e df e r m e n t e di nm i l k c o m p o s i t i o n so ft h eo p t i m u me n r i c h m e n tm e d i u m sf o rl 6 21w a s ：0 5 l a c t o s e 3 p e p t o n e ，3 0 c a r r o tj u i c e ，3 0 m u s h r o o mj u i c e ，1 b e e fe x t r a c t ，1 y e a s te x t r a c t ， 0 3 k 2 h p 0 4 1m i i ，t w e e n 8 0 r n l ec e l ld e n s i t yo fl 6 2 1c o u l dr e a c h3 7 2 x i o y c f u m l i nt h i sm e d i u mo n3 7 ，w i t h i nt h e18h t h ec o m p o s i t i o n so ft h eo p t i m u me n r i c h m e n t m e d i u m sf o r $ 8 0 0w a s ：0 5 l a c t o s e ，3 b e a np e p t o n e ，3 0 t o m a t oj u i c e ，3 0 m u s h r o o mj u i c e ，1 b e e fe x t r a c t ，1 y e a s te x t r a c t ，0 5 k 2 h p 0 4 ，0 3 n a a c t h e c e l ld e n s i t yo f $ 8 0 0c o u l dr e a c h1 0 4 x 1 0 9c f u m li nt h i sm e d i u mo n3 7 a f t e r l 8h ： e x p e r i m e n tr e s u l t sb yt h ea u t o m a t i cf e r m e n t e rd e m o n s t r a t e dt h a t ：t h eo p t i m a l t e m p e r a t u r eo fl 6 2 1w a s3 7 ，t h eo p t i m a lp hw a s5 5 ，i nt h o s eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h e c e l ld e n s i t yo fl 6 2 1c o u l dr e a c h6 2 1 x 1 0 9c f u m lw i t h i nt h e1 2hb ya d d i n gf e e d i n ga s 1 0 l a c t o s ea n d2 0 y e a s te x t r a c t t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n d p ho f $ 8 0 0w a s3 7 a n d5 5 i nt h i so p t i m a lc o n d i t i o n ，t h ec e l ld e n s i t yo f $ 8 0 0c o u l dr e a c h3 2 9 x 1 0 9c f u m l w i t h i nt h e1 2h o u rb ym d i n g f e e d i n ga s1 0 l a c t o s ea n d2 0 y e a s te x t r a c t t h eo p t i m u mc e n t r i f u g a lf o r c ea n dt i m ew e r e6 0 0 0r m i na n dl o m i n ，t h eh a r v e s t r a t ew a s9 5 8 ；f o r $ 8 0 0 ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r e6 0 0 0r m i na n d1 0m i n 。a n dt h e h a r v e s tr a t ew a s9 3 5 t h eo p t i m a lt h i c k n e s so ff r e e z e d r ys p e c i m e nw a s0 5c m ( t h ec o r r e s p o n d i n gv o l u m e w a s2m l ) t h ec o n c e n t r a t i o no fs k i mm i l kw a s1 0 t h ef i n a lo p t i m u mc r y o p r o t e c t a n t w a sd e t e r m i n e da s1 0 s k i mm i l k , 3 f u c o s ea n d2 g l y c i nu s i n go r t h o g o n a l e x p e r i m e n t w h e nt h et h i c k n e s so ff r e e z e - d r ys p e c i m e nw a s0 5 c m , w i t ht h ep r o t e c t i o n o fo p t i m u mc r y o p r o t e c t a n t ，t h el i v a b i l i t ya b o u tf r e e z e d r y i n go fl 6 2 1w a s7 7 0 1 。$ 8 0 0 w a s8 3 6 7 ：t h ec e l ld e n s i t yo ft h ef r e e z e - d r y i n gp r o d u c t i o nw a s2 3 1 x 1 0 1 0c f u ga n d 1 2 6 x 1 0 c f u g ，r e s p e c t i v e l y t h ef r e e z e d r y i n gs t a r t e r sw a ss t a b i l i z a t i o no nt h ec e l ld e n s i t yo fl i v eb a c t e r i aa n d i i i 华中农业人学硕上学位论文 c l a b b e r i n gc h a r a c t e r i s t i c s a f t e rc o n s e r v i n g3m o n t h si n4 w h e nf e r m e n t i n gt h em i l k w i t ht h es t a r t e r , t h em i l kc o u l dc l a b b e ra f t e r4h o u r sa n d2 0r a i n si n4 2 t h ep ho ft h e y o h o u r tw a sa b o u t4 8 ，t h ea c i d i t yw a sa b o u t8 0o t ，t h ec l a b b e r i n gc h a r a c t e r i s t i c sw a s f i n e r k e y w o r d s ：s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l l u s ；l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ：o p t i m u mc u l t u r e ； c r y o p r o t e c t a n t ：f r e e z e - d r y i n gs t a r t e r i v 华中农业大学硕士学位论文 缩略词( a b b r e v i a t i o n ) v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 衫 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究蚴：呷吻毡 帆m 年歹日 学位论文使用授权书 撇黼挠叩哆姆锄签必群 签名日期：硼为年6 月阳签名日期：才潞年5 月2 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学硕士学位论文 - _ 。一 l 刖吾 自从2 0 世纪初俄国诺贝尔生理学和医学奖获得者梅契尼科夫提出“酸奶长寿 说”以来，酸奶以其独特的口感风味和有利健康的益生作用，受到人们的热情追捧 和喜好，乳制品产业也在世界范围内得到迅速发展。同时，也极大的引发了科学工 作者们对酸奶制作的研究热情，从最初的开始使用天然的混合菌株制备酸奶等乳制 品，到筛选出性状优良的发酵菌种制备纯菌种液体发酵剂，再发展到现在易于保藏 和运输的高效冻干直投式发酵剂( d i r e c tv a ts e t ，d v s ) 的出现，标志着酸奶发酵剂研 究的三个时代的更替。同时为了迎合不同人们的喜好，酸奶也从最初的简单风味的 制作，开始向不同口感、不同风味、不同营养作用等方向发展。 发酵剂中的性状优异的乳酸菌菌种是制备高品质酸奶的关键，保加利亚乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u ) 和嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l l u s ) 是发酵剂中的常 用菌种。随着对酸奶益生作用的越来越重视和对乳酸菌菌种研究的深入，嗜酸乳杆 菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 和双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i a ) 也越来越多的应用在酸奶发 酵剂中。在酸奶发酵剂的研究水平上，由于欧洲国家在2 0 世纪初就开始了研究， 至今已经取得非常瞩目的成功，浓缩发酵剂已实现了专业化、商品化生产，并成功 的应用于发酵乳制品的生产以及保健型乳酸菌制剂的研制，越来越多的发酵乳生产 厂家开始使用浓缩型冻干发酵剂，其中也包括国内大多数大规模的乳制品公司；而 我国由于起步较晚，研究水平还与西方国家有一定的差距，但随着国内乳制品市场 需求量逐年增长，许多科研部门和高校实验室都开始加紧对乳品发酵剂的研究和生 产，并取得了一定的进展。 1 1 酸奶发酵剂的概述 1 1 1 酸奶的发展史 酸奶的历史古老而悠久，人类制作发酵乳的历史可以追溯到数千年以前。埃及 的古书中有文字记载，早在五六千年以前，就有种叫l e b e n 的酸性乳饮料：8 世纪 的土耳其人在其游牧生活中，就开始制作酸奶，其名为y o g h u r t ，现代英语中“酸 奶”( y o g h o u r t ) 一词便是由此演变而来；后来酸奶的制作方法由土耳其传到了保加利 亚后，酸奶受到了保加利亚人们的喜爱，经过他们的长期的探索，研制出一套比较 完善的酸奶制作工艺，酸奶开始在保加利亚及其周边的巴尔干半岛地区广泛传播； 2 0 世纪初期，俄国著名科学家诺贝尔生理及医学奖获得者梅契尼柯夫发现了巴尔干 半岛的居民大多都很长寿，经过他一番科学的调查研究，发现长寿的秘诀是正是常 饮酸奶的缘故，他发现酸奶中有一种能有效消灭大肠内的腐败细菌的杆菌，将它命 名为“保加利亚乳酸杆菌”，之后他提出了“酸奶长寿说”( 郭本恒，2 0 0 3 ) ，带动了 酸奶的工业化大生产，酸奶从此开始风靡欧洲各国，成为大众营养保健食品。 华中农业大学硕七学位论文 我国乳制品的制作历史也非常悠久，我国晋朝就有乳酪；北魏贾思勰的齐民 要术中记载了酸奶的制作方法；唐代文成公主进藏时，已有酸奶的记载；宋朝更 是设立了“牛羊司乳酪院”，专管乳品加工；1 9 1 1 年，上海可的牛奶公司( 上海乳制 品二厂的前身) 开始生产酸奶，是我国第一家机械化生产酸奶的厂家( 郭本恒， 2 0 0 3 ) ；但直到上个世纪末，酸奶才在国内开始火速普及，市场需求量逐年递增， 酸奶产业在国内开始蓬勃发展。 1 1 2 酸奶发酵剂的发展历史及现状 伴随着酸奶制作技术的发展，酸奶发酵剂的制备方法也得到了相应的发展与 提高。酸奶发酵剂的历史经历了经验性发酵剂和选择性发酵剂两个阶段，其过程如 图1 ( 张兰威，2 0 0 2 ) 所示： 公元前2 0 0 0 年 1 8 7 3 年 1 9 6 3 年 二十世纪七十年代 图1 1 发酵剂发展历史 f i g 1 1t h eh i s t o r yo fs t a r t e rc u l t u r e 经验性发酵剂是指取少量经自然发酵而成的酸乳或其它乳酸菌发酵制品作为 发酵剂，接种于加热处理过的乳或其它食品原料中而制成的发酵制品，被誉为“天 然发酵剂”。其特点是：发酵剂中微生物区系复杂，除乳酸菌之外，还包含酵母菌 等其它微生物。这一时期，人们通过经验选择的方法，将发酵性能优良的发酵剂世 代相传，除用于制作酸奶之外，还用来发酵生产干酪、酸制奶油、乳酒等产品，但 发酵条件不易控制，发酵性能稳定性较差。 1 8 7 3 年，l i s t e r 最先从酸乳中分离并研究了乳酸链球菌，将分离制得的纯乳酸 菌作为发酵剂生产酸乳制品，从而引起了人们广泛的兴趣，从此开始了选择性发酵 剂的研究和应用( 谭欢，2 0 0 5 ) 。选择性发酵剂是指用经分离纯化后的纯乳酸菌种 制成的发酵剂，并可根据原料的不同，选择最适宜的产酸、产香菌种。这种发酵剂 的特点是：菌种纯正；发酵性能较为稳定；发酵条件易于控制；发酵产物除乳酸之 外，还有一定量的风味物质及维生素和抗菌物质等。 2 华中农业大学硕士学位论文 最初的选择性发酵剂虽然在菌种选育方面有了新的突破，但是发酵剂的制备需 要经过多级的扩大培养，生产工序复杂、生产周期较长，菌种在生产过程中易出现 变异、退化以及污染，而且也不适于长时间保藏和运输。于是西方发达国家在2 0 世纪六、七十年代开始研究浓缩型的乳酸菌发酵剂，并取得了突破性的进展，实现 了发酵剂的商品化生产，并涌现出一批知名的实力强劲的发酵剂制造商，如丹麦的 科汉森公司和法国的罗地亚公司等。最初研制成的是冷冻浓缩乳酸菌发酵剂，即将 乳酸菌通过浓缩培养、离心收集等手段制成高浓度菌体的浓缩型菌悬液，添加抗冻 保护剂后在低于7 0 c 的低温条件下速冻，再置于低温下深冻保藏而成。伴随真空冷 冻干燥技术的日益成熟，在九十年代初，又相继开发出了浓缩型的真空冻干发酵剂， 即将冻结后的浓缩菌悬液通过添加冻干保护剂，在真空低温的条件下将水分升华干 燥，制成干燥粉末状的固体发酵剂，也叫直投式发酵剂( d i r e c tv a ts e t d v s ) 。这 种发酵剂具有较多优点：菌种活力强，浓度高，菌数能高达1 0 1 0 - 1 2 c f u g ；发酵性能 稳定；生产工艺易于控制，生长周期较短；保藏方便，在4 常压保藏1 年以上仍 然具有很强的活力；体积较小，运输方便等等( 乔东发，1 9 9 8 ) 。因此随着直投式 发酵剂的出现，酸奶产业得到了进一步的加速发展。 我国虽然制作酸奶的历史悠久，但是乳品工业的发展起步较晚，在酸奶的制作 工艺特别是酸奶发酵剂的研究水平上远落后于西方国家。直到上个世纪末期，国内 大部分酸奶生产厂家使用的酸奶发酵剂仍然是最传统的继代型发酵剂，生产过程一 般需要经过过菌种活化、母发酵剂、中间发酵剂、生产发酵剂等工艺过程。在发酵 剂制备过程中，菌种经过多级扩大培养，极易退化和污染。这将直接导致酸奶及乳 酸菌饮料产品质量不稳和生产效率低下，阻碍了我国酸奶及乳酸菌饮料产业的发 展；直到上个世纪九十年代中期，些有眼光的大规模的乳品生产企业才开始引进 国外先进的浓缩型直投式发酵剂进行生产，虽然其发酵性能较高，产品品质稳定， 促进了国内酸奶生产企业的快速发展，但是进口发酵剂的高成本逐渐成为影响乳品 企业特别是中小型企业进一步发展难以跨过的门槛。因此，积极研制并开发出品质 优良、价格低廉的具有我国自主产权的浓缩型发酵剂势在必行。 1 1 3 酸奶发酵剂的种类及特点 根据酸奶发酵剂的发展进程及其制作工艺，可以将酸奶发酵剂分为三种：天然 型发酵剂、传统继代型发酵剂以及高效浓缩型发酵剂( 谭欢，2 0 0 5 ) 。 1 1 3 1 天然型酸奶发酵剂 天然型酸奶发酵剂是利用原料乳中的微生物自然发酵而成的液体发酵产物，即 将自然发酵形成的酸奶作为发酵剂。早在公元前2 0 0 年左右土耳其人就开始使用此 种发酵剂。其优点是菌种复杂，易形成多种风味物质，使产品具有独特风味。但是 由于存在太多不确定因素，发酵产物性质不易控制，而且其中的腐败细菌也会降低 产品的贮藏稳定性。 华中农业大学硕士学位论文 1 1 3 2 传统继代型酸奶发酵剂 传统继代型发酵剂又称为普通发酵剂。当l i s t e r 分离出乳链球菌和梅切尼科夫 分离出保加利亚乳杆菌后，人们开始研究酸奶中的不同微生物，并将其纯化出来的 乳酸茵作为发酵剂应用于酸奶的制作。传统继代型发酵剂的特点是：菌种纯正；发 酵性能较为稳定；发酵条件易于控制；可通过改变菌种来控制不同风味和口感等。 这种发酵剂在2 0 世纪八十年代以前一直作为酸奶制作的重要发酵剂在世界范围内 广泛应用，我国直到本世纪初仍有部分中小型乳品企业采用此种发酵剂制作酸奶。 但此种发酵剂制各需要经过多级扩大培养，生产工序多、周期长、菌种易退化和污 染的缺点随着- y l * i j 品产业集约化、规模化的发展逐渐体现出来，越来越不适应现在 大规模酸奶发酵生产的要求。 1 1 3 3 高效浓缩型酸奶发酵剂 高效浓缩型酸奶发酵剂指不需要经过菌种活化、母发酵剂、中间发酵剂、生产 发酵剂的逐级扩大培养过程而直接可以应用于生产的一类新型发酵剂。其主要优点 是：活菌含量高；保藏期长；发酵性能稳定；易于运输等等。酸奶生产企业可以向 发酵剂生产厂家购买直接作为生产发酵剂使用，在酸奶生产过程中省略了发酵剂的 制备工序，减少了菌种车间的投资和空间，还能防止菌种的退化和污染的风险，使 得酸奶制作工业的劳动生产率和产品质量大大提高。 高效浓缩型酸奶发酵剂根据制备工艺的不同，又可以分为高效浓缩型冷藏发酵 剂和高效浓缩型干燥发酵剂( 黄良昌等，2 0 0 1 ) 。 ( 1 ) 高效浓缩型冷藏发酵剂 高效浓缩型冷藏发酵剂是指将乳酸菌经过液体增值培养，浓缩分离后，与冷冻 保护介质混合，放入低温下冷冻保藏，制备成发酵剂。其主要影响因素有：冷冻保 护介质、冻结速度和冻结温度。 冷冻保护介质的主要作用是防止乳酸菌在冷的过程中胞内冰晶的形成而造成 细胞损伤和死亡。张建国等( 张建国，2 0 0 3 ) 研究表明：甘油、蛋白胨、蔗糖、谷 氨酸钠、酵母酶解粉和v c 的保护作用较好，可使发酵剂在冻藏期间仍能保持较高 浓度活菌数。 根据冷冻的温度不同，可以分为冷冻( - 2 0 ) 、低温冷冻( 4 0 一8 0 ) 和 超低温液氮冷冻( 1 9 6 ) ，其中，超低温液氮冷冻效果最好。有研究报道，对浓 缩型冷藏发酵剂在2 0 和4 0 的不同温度下进行试验，结果表明，冷藏3 个月以 后，2 0 和舶的活菌数无显著差异( 吕加平，1 9 9 7 ) 。 冻结速度可分为快速冻结和慢速冻结。3 0m i n 内甚至更短时问内完全冻结为快 速冻结。快速冻结对菌体细胞损害较慢速冻结要大，降低了细胞存活率，这是由于 快速冻结时，水分没有足够时问渗出，形成的胞内冰晶会损伤细胞。 4 华中农业大学硕士学位论文 冷藏发酵剂在发酵活力、应用效果及保藏时间上都取得了显著的成效，但是在 实际应用情况上，其维持冷冻的费用较高，运输需要配制专用的冷藏车，超低温液 氮冷冻更需要昂贵的液氮设备，都影响了其推广和应用。 ( 2 ) 高效浓缩型干燥发酵剂 高效浓缩型干燥发酵剂是指乳酸菌种经液体增殖培养、浓缩分离后，与保护介 质混溶再经一定方式进行干燥，制成干燥的菌粉发酵剂。 在制备干燥发酵剂过程中，采用的干燥工艺有：真空低温干燥法、喷雾干燥法 和真空冷冻干燥法( 简称：冻干法) 。其中，真空低温干燥法和喷雾干燥法制备的 浓缩型发酵剂，由于干燥过程对菌体的损伤比较严重，一般活菌含量相对偏低；而 冻干法制备的浓缩型发酵剂，不仅活菌含量高，而且保藏和运输方便，机械化程度 高，便于工业化批量生产。利用冻干法制备的发酵剂自从上世纪八十年代开始使用， 受到了乳制品生产厂家的一致好评，并开始在乳制品行业广泛的应用，是当今浓缩 型发酵剂的主要生产方法，也是当今乳品行业应用最为普遍的发酵剂。我国自从九 十年代开始由少数大型乳制品企业引进直投式冻干发酵剂以来，冻干发酵剂在国内 乳制品行业的应用也迅速普及开来。 1 2 酸奶发酵剂的微生物学 1 2 1 乳制品发酵菌种的主要种类 用于发酵乳生产的菌种难以计数，这是因为世界上几乎各地都有自己独特的发 酵乳制品，其发酵的菌种差异非常大，很难以精确统计。目前工业化生产应用较多 的菌种大约有几十种，如表1 1 所示。表中乳酒假丝酵母和胞壁克鲁维酵母属于酵 母菌，其他菌种均可归为乳酸菌，也就是说，乳制品行业的生产菌种绝大部分为乳 酸菌。 乳酸菌不是一个分类学上的名称，是一群能从可发酵性碳水化合物产生大量乳 酸的革兰阳性细菌的通称。基本特性是革兰氏阳性、不形成芽孢、不形成色素、不 能产生含铁的卟啉化合物、过氧化氢酶阴性、兼性厌氧；不能还原硝酸盐；无运动 性或很少；分解蛋白质但不产腐败物质，脂肪分解能力较弱；乳酸是发酵的最重要 的终产物。乳酸菌生长的营养要求复杂，一般需要氨基酸类化合物、维生素以及其 他类的生长因子，不能利用复杂的碳水化合物。但它具备大部分微生物所没有的乳 糖分解能力。 乳酸菌在广义上划分，可以分为嗜温乳酸菌和嗜热乳酸菌。嗜热乳酸菌由于比 嗜温乳酸菌具有更强的产酸量和耐酸性，作为发酵菌株主要用于酸奶生产( t u r n e r a n dm a r t l e y ，1 9 8 3 ) 。嗜热乳酸菌有保加利亚乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s ) 、嗜热 链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l l u s ) 、瑞士乳杆菌( l a c h e l u e t i x u s ) 、嗜酸乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 、双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i a ) 及其他一些乳杆菌。 5 华中农业大学硕十学位论文 表1 1 用于乳制品生产的一些常用菌种 t a b l e l 1s o m eb a c t e r i a su s i n gi nt h em a n u f a c t u r eo fd a i r yp r o d u c t s 1 2 2 乳酸菌在发酵乳中的作用 在发酵乳制品过程中，乳酸菌作为发酵剂主要有三个重要的功能：产酸( 产生 乳酸，赋予酸奶爽口的酸味) 、产香( 产生风味物质，使酸奶具有独特香味) 、形成 特有的组织结构( 凝固酪蛋白，分泌胞外多糖，形成酸奶细腻的组织结构) 。 ( 1 ) 乳酸菌在乳中的生长 酸奶生产常用的菌种是嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，两菌的生长具有共生 性。在生产过程中杆菌分解乳中蛋白成小肽和氨基酸促进球菌生长，球菌则在生长 过程中通过丙酮酸代谢产生甲酸和c 0 2 而促进杆菌快速生长。由于菌株在乳中的相 互促进共同生长，乳酸产生的比单一的菌要快，在酸度达到一定时期，球菌不能继 续生长而发生抗生现象，杆菌对酸不敏感而可以继续生长。这种共生和拮抗对酸奶 中菌的生长和酸奶质量非常重要。据赵瑞香等人的研究，在嗜热链球菌和嗜酸乳杆 菌之间，也存在这种共生发酵的现象( 赵瑞香，2 0 0 5 ) 。 6 华中农业大学硕士学位论文 ( 2 ) 乳酸菌在乳中的产酸 嗜热性乳酸菌可分解乳中的乳糖成为葡萄糖和半乳糖，半乳糖不能被转化而被 积累，葡萄糖则被分解产生大量的乳酸。其中，保加利亚乳杆菌产生的乳酸量为1 7 一1 8 ，嗜热链球菌产生的乳酸量为0 6 一o 8 。乳酸在酸奶类发酵乳制品中 的作用是非常重要的，不仅促使酸奶形成凝块，同时还赋予了酸奶爽口的酸味。研 究表明，嗜热链球菌产生l 乳酸，保加利亚乳杆菌产生d ( ) 乳酸。酸奶中通常含 有4 5 一6 0 的k + ) 和4 0 一5 5 的d ( ) 一乳酸，b l u m e n t h a l 和h e l b l i n g 认为i 和d ( o 乳酸比例为1 ：1 时是优质酸奶( e m 德莱森，1 9 9 1 ) 。嗜温性发酵剂的产算量 远低于嗜热菌。 ( 3 ) 乳酸菌在乳中的产香 酸奶的风味来源于乳酸和羰基化合物。在乳糖的代谢过程中，有少量的乙酸 ( o 0 3 - - 0 。0 5k g m 3 ) 、乙醇( o 0 1 一o 0 4k m 3 ) 生成，但因乙醇风味阈值高而对酸 奶风味无影响。天然酸奶的风味与羰基化合物，特别是乙醛、2 一羟基丁酮、丁二酮 等，这些物质取决于乳酸菌在生长过程中产生的各种代谢酶，包括乙醛脱氢酶、乙 醇脱氢酶、脱氧核糖醛缩酶等，其含量因菌种不同而又差异，不同乳酸菌产物这些 物质的能力存在明显差别。因此，要获得良好的风味必须对发酵菌株进行适当的选 择。 乙醛是酸奶风味的重要成分，它主要是乳杆菌形成的，其代谢过程的前驱物是 乳酸菌水解蛋白产生的苏氨酸( m a r s h a l l ，1 9 8 4 ) 。酸奶中乙醛的含量约为1 0m g k g ， 而一般认为乙醛最佳风味值为2 0 4 0m g k g 。乳酸菌还能利用在糖代谢过程中生成 的丙酮酸作为前驱物产生微量的丁二酮，酸奶中的丁二酮含量为0 8 一1 5m g k g 。 ( 4 ) 乳酸菌对酸奶特有组织结构的形成 乳酸菌对酸奶特有组织结构的形成起着重要的作用，首先乳酸菌的代谢过程产 生的大量乳酸使得酪蛋白中的胶体磷酸钙转变成可溶性的磷酸钙，促使酸奶凝固。 其次，乳酸菌还能产生胞外粘多糖等粘性物质，使酸奶粘度增加，形成酸奶制品特 有的粘稠细腻的组织结构。各种乳酸菌产生的粘多糖的种类和粘度不同，有人认为 它是由半乳糖和其他糖苷构成的( 李全阳，2 0 0 5 ) 。 1 3 影响高效冻干发酵剂的制备的主要因素 冻干发酵剂即采用真空冷冻干燥法制备的发酵剂，其基本原理是：将菌体与保 护介质混匀，在其共熔点以下预冻，然后在低于三相点压力的高度真空状态下，使 菌体中的冰晶升华，达到干燥的目的。影响高效冻干发酵剂的制备的主要因素有： 菌种和菌种的特性、乳酸菌液体培养的菌体浓度及其活性、菌体的浓缩分离条件、 冻干工艺以及冻干保护剂的使用以及发酵剂包装和保藏条件等。 7 华中农业大学硕上学位论文 1 3 1 优良菌种的选育 筛选出具有优良性状的乳酸菌菌种是制备高效冻干发酵剂的基础，用于冻干发 酵剂的的菌种应该具有优良的发酵产酸产香性质、较弱的后酸化性质、较强的抗冷 冻干燥特性等基本特性。 具备优良的发酵产酸产香性质，才能使发酵出来的酸奶具有优质的口感、风味 以及形态等感官性能，这是作为发酵剂菌种的首要条件；其次要延长酸奶的保存期， 就要求发酵菌种具有较弱的后酸化的性质，使得酸奶发酵完成后在常压低温下保存 较长时间不会过酸而影响酸奶的品质，一般发酵完成后的酸奶在4 7 条件下贮藏 3 周，滴定酸度增加幅度应该在6 1 0o t 范围内为宣。在制备发酵剂的过程中，菌 种必须经过真空低温的冷冻干燥，因此，要求菌种具备较强的抗冻抗干燥的性能， 才能保证冻干的发酵剂具有足够的活菌数。 1 3 2 菌种的增殖培养 获得乳酸菌高浓度生长的培养菌液是制备浓缩型发酵剂的前提。要使乳酸菌能 高浓度的生长，配制合适的增殖培养基和控制培养条件是最关键的两个因素。 1 3 2 1 增殖培养基的选择 要培养出高浓度的乳酸菌，所生长的增殖培养基应该具有如下特点：适合菌 体生长，繁殖速度快，在较短时间内可以得到大量活性细胞；菌体与培养基易于 分离；缓冲能力强，能降低乳酸对菌体的抑制作用；成本低廉，原材料容易获 取。乳是乳酸菌良好的天然培养基，但菌体生长后凝乳，很难分离得到菌体。在乳 酸菌经典培养基中菌体生长情况较好，也易分离，但是成本较高。酸度控制型培养 基是基于乳酸菌生长到一定阶段产生大量乳酸和其盐类物质而产生抑制作用这一 原理发展起来的，分为内控型和外控型两种( r k t h u n e l l ，1 9 8 4 ) ，内控型是在培养 基中加入一定量的缓冲盐，在菌体一定的生长期内缓冲p h 的变化，在一定程度上 缓解乳酸对菌体的抑制。有报道乳和乳清基质培养基经过改良也用于增菌培养基， 有人在研究肽化甜乳清培养基对l a 的促进作用时发现，茵体在2 5 、和5 的低 固形物组分中生长的效果优于7 5 的高固形物组分，s l w r i g h t 的研究确定了以乳 清和脱脂乳为基质的p h 控制型生长发酵剂培养基的最佳配方( s l w r i g h t ，1 9 9 2 ) ； 美国有专利报道了应用超滤浓缩乳作为发酵剂培养基，其较高的缓冲能力可使菌数 高达2 5 x1 0 9c f u m l 。c p c h a m p a g n e 等比较了保加利亚乳杆菌在乳清、酶解乳清和 牛乳中生长情况，结果表明：酶解乳清效果优于乳清；而牛乳和牛乳、乳清混合两 组效果相差不大( c h a m p a g n e ，1 9 9 1 ) 。张兰威将5 的经过6 0r a i n 水解的酶解乳 清和4 的脱脂乳等量混合制备成增菌培养基基质，再通过添加其他增殖因子进行 培养，效果比较显著( 张兰威，2 0 0 2 ) 。 8 华中农业大学硕士学位论文 近年来的研究发现，乳酸菌在天然的植物汁液中也能较好的生长，由于天然的 植物汁液来源广，价格低，受到了研究者们的关注。万红兵等人对乳酸菌在麦芽汁 中的生长情况研究发现，乳酸菌能在麦芽汁中进行正常的生长代谢，在以麦芽汁为 基质添加其他营养物质通过优化试验，在3 7 培养1 6h 后能使嗜热链球菌菌数达 到2 4 2 x 1 0 9 c f u m l ，保加利亚乳杆菌菌数达到4 8 1 x 1 0 9 e f u m l ( 万红兵等，2 0 0 6 ) 。 山丽杰等人利用菊芋汁为基质优化出复合增菌培养基，使得保加利亚乳杆菌经过培 养菌数达到1 5 0 x 1 0 9 c f u m l ( 山丽杰，2 0 0 4 ) 。此外，胡萝卜汁、番茄汁、黄豆汁、 香菇汁、猕猴桃汁、茶叶汁等等植物汁液作为促生长物质用于乳酸菌增菌培养的研 究时有报道。 表1 2 乳酸菌的增菌物质 t a b l e1 2s o m es t i m u l a t e dg r o w t hf a c t o r so fl a c t i cb a c t e r i a 9 华中农业人学硕十学位论文 在乳酸菌的增菌培养基研究中，许多基质和增菌因子都是产生高菌数的关键， 表2 总结了国内外研究报道较为有效的一些乳酸菌增菌物质。 1 3 2 2 培养条件的控制 乳酸菌在生长过程中会产生大量的乳酸，使p h 值下降到菌体耐酸的极限，此 时即使有充足的营养，菌体细胞的进一步生长也会受到抑制( r k t h u n e u ， 1 9 8 4 ) 。要想获得浓缩培养的乳酸菌培养液，仅提供足够的营养物质还不行，还必 须在培养的过程中，通过补充营养物质、排除代谢产物、调节p h 等措置，尽量减 少和降低代谢产物乳酸对菌体生长的抑制作用，额外补充营养物质，延长菌体的快 速生长期。目前国内外在解除乳酸对乳酸菌生长抑制的方法一般有以下几种： ( 1 ) 缓冲盐法 向乳酸菌培养基中添加缓冲盐进行培养，能在一定范围内调节培养液的酸度， 达到促进乳酸菌生长的效果。但由于缓冲盐的缓冲能力有限，虽然能在一定范围内 促进菌体生长，但是要想达到很高的菌数比较难。 ( 2 ) 化学中和法 在乳酸菌的培养过程中向培养液中添加n a o h 、n a 2 c 0 3 或n h 3 h 2 0 等碱类物 质，不断中和乳酸菌产生的乳酸，解除乳酸的抑制作用。此法常用于自控型发酵罐 自动控制培养，在控制添加碱液同时，通常还能补充营养物质，不仅能持续的中和 乳酸，保持恒定p h ，还能补充充足的营养，促进菌体大量繁殖，但是随着不断被 中和的乳酸盐的积累达到一定水平，过高的盐浓度依然会抑制菌体的生长。 ( 3 ) 膜渗析法 也称膜过滤法，原理是在向培养基中添加新鲜培养液的同时，利用合适膜孔径 的膜过滤掉培养基中的乳酸和乳酸盐，促进乳酸菌连续的大量繁殖。 在上述培养方法中，膜渗析法是目前国内外最先进的方法，而且培养效果也最 为好，有报道用此法培养的乳酸菌菌体浓度能高达1 0 1 1c f u m l ( t a k a h i r os ，1 9 9 6 ) ， 但该法对膜材料和操作技术要求较高，而且设备投资大，在工业上的应用并不十分 广泛。而化学中和法和缓冲盐法由于其方法材料要求不高，研究及应用相对较为普 遍。在化学中和法研究方面，国外有研究报道认为n h 3 h 2 0 作为中和碱液的效果最 好( g i u i l a n ds h ，1 9 8 5 ) ，国内的史媛英等的研究也证明了n h 3 h 2 0 作为中和碱 液效果比较好( 史媛英，1 9 9 9 ) 。在缓冲盐法研究领域中，美国和意大利处于领先 水平，但其缓冲盐配方属于专利保密。t i n e k e h 等人曾用2 0 一2 9 的超滤浓缩奶 和脱脂奶作为培养液，利用高浓度的蛋白和磷酸盐达到缓冲效果( t i n e k e h ，1 9 9 9 ) 。 高松柏等人曾在5 脱脂乳水解液培养基中和1 2 脱脂乳培养基中分别加入缓冲 盐进行培养，使乳酸菌活菌数分别提高了3 倍和6 倍( 高松柏，1 9 9 1 ) 。冯友军等 应用1 0 柠檬酸钠、5 乙酸钠和2 丙酮酸钠按一定比例组合而成的缓冲体系使 保加利亚乳杆菌培养的最终浓度从2 2 2 x 1 0 8c f u m l 提高到1 3 2 x 1