（遗传学专业论文）自养生物膜氨氧化及其反硝化现象初探.pdf

四j 1 大学硕t 学位论文 第一部分自养生物膜氨氧化及其反硝化现象初探 遗传学专业 研究生李沛霖指导教师高平李大平 从某油田外摊水中富集、分离的自养氨氧化菌经培养、挂膜获得自养氨氧 化生物膜。研究了不同p h 、碱度、含盐量、氨氮浓度、温度及氧分压这些环境 因素对自养生物膜氮氧化能力的影响。发现该自养生物膜受p h 、碱度、氨氮浓 度、碱度、温度及氧分压的影响比较显著，而几乎不受盐度的影响。对该自养 生物膜氨氧化活性检测表明，自养生物膜的最适p h 范围为7 5 7 7 ，在含盐量 为0 - 3 5 的范围内，该自养生物膜表现出一定的耐盐能力，自养生物膜进水 氨氮1 6 0 - 1 7 0 m g l ，碱度1 6 0 0 m g 几一1 7 0 0 m g 几条件下( 碱度与氨氮比约为1 0 ：1 ) ， 氨氧化率超过7 0 ，有痕迹量的亚硝酸盐的生成，氧化的氨氮部分转化为硝酸 盐。自养生物膜在氨氧化过程中存在明显的温度拐点，在3 6 以下，生物膜氮 氧化速率低下，2 4 小时氧化率约5 0 ，产物以亚硝酸簸和硝酸盐为主；而在3 8 以上，生物膜氨氧化速率显著提高，达到9 5 以上，液相产物以硝酸盐为主， 其浓度约占已氧化氨氮7 0 。对生物膜氨氧化过程产生的气体进行气相色谱分 析结果表明，经过生物膜处理后的气体中氮气的含量是9 4 3 6 7 氧气的含量 降低至5 6 3 3 ，而空气中氮气的含量是7 9 3 7 9 ，氧气的含量是2 0 5 9 6 。与 对照气体相比，氮气浓度提高了1 4 9 8 8 ，而氧气浓度降低了1 4 9 6 3 ，说明自 养生物膜发生了有趣的好氧反硝化脱氮现象。该现象的发生可能与膜表面的致 密包裹层限制了氧的传输有关。从自养氨氧化生物膜中富集、筛选、分离获得 7 株细菌。由于整个氨氧化过程都是生物膜上的细菌共同作用和完成的，对这7 株细菌分别进行了初步的生理生化特征检验，并对其中的优势菌2 8 一l 和3 8 1 进行了1 6 5r d n a 的分子鉴定。根据形态和生理生化特征；2 8 2 为硝化球菌属， 2 8 3 鉴定为球杆菌属，2 8 4 为栖热菌属，2 8 - 5 为红色杆菌属，3 8 2 为栖热菌 属。2 8 1 菌与r h o d o c o c c u ss p 的期望值达到了2 e 1 ”一6 e 1 “之间，可以认为2 8 1 一 婴坐盔兰堡! 兰竺丝茎： 为b h o d o c o c c u ss p 菌( 红球菌属) ；3 8 1 菌与b a c i l l u sc e 即u s 的期望值在8 e - , ”_ l e l 。之间，可以认为3 8 - 1 为b a c i l l u sc b t b u s 菌( 蜡样芽胞杆菌) 。本论 文针对高温条件下自养氨氧化微生物和代谢途径的研究，对于缺乏有机碳源的 氨氧废水生物脱氮来说具有一定的理论意义，为开发针对低c n 比氨氮废水的 新型自养脱氮技术奠定了基础。 关键词：生物膜氨氧化好氧反硝化 2 - 阴川大学硕 学位论文 p r e li m i n a r yr e s e a r c ho nt h e a m m o n i a o x i d i z a t i o na n dt h ep h e n o m e n o no f a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o no fc h e m o a u t o t r o p h i c b i o f i l m m a j o r ：g e n e t i c s g r a d u a t es t u d e n t ：l ip e i1i n t u t o r ：6 a op i n g l id a p i n g c h e m o a u t o t r o p h i ca m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i ai s o l a t e df r o mo i lf i e l df o r m e da b i o f i l ma f t e re n r i c h e dc u l t u r e t h ee f f e c t so fs i xk i n d so fe n v i r o n m e n t a lf a c t o r ss u c h 嚣p h a l k a l i n i t y , s a l i n i t y , i n i t i a la m m o n i u mn i t r o g e nc o n c e n t r a t i o n , t e m p e r a t u r ea n d p a r t i a lp r e s s u r e o f o x y g e n o nt h e e h e m o a u t o t r o p h i c b i o f i l m s a b i l i t yo f a m m o n i a - o x i d i z a t i o nw e r es t u d i e d t h ed a t ai n d i c a t e dt h a tt h ea m i n o n i a - o x i d i z a t i o n c h e m o a u t o t r o p h i cb i o f i l mw a sn o t a b l e l yi n f l u e n c e db yp h ，a l k a l i n i t y , a m m o n i u m n i t r o g e nc o n c e n t r a t i o n , t e m p e r a t u r ea n dp a r t i a lp r e s s u r eo fo x y g e n , a n db a r e l y i n f l u e n c e d b ys a l i n i t y 砀ea n a l y s i s o fa m m o n i a - o x i d i z a t i o n a c t i v i t yo f t h e c h e m o a u t o t r o p h i cb i o f i l mi n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m u mp hr a n g ew a s7 5 7 7 i nt h e e n v i r o n m e n tc o n t a i n i n gn a c io fo - 3 5 c o n c e n t r a t i o n t h ea m m o u i a - o x i d i z a t i o n c h e m o a u t o t r o p h i cb i o f i l ms h o w e dc e r t a i ns a l t - r e s i s ta b i l i t y i nt h ee n v i r o n m e n t c o n t a i n i n g i n i t i a la n l t n o n i u m n i t r o g e n o f 1 6 0 1 7 0 m g la n d s a l i n i t y o f 1 6 0 0 - 1 7 0 0 m g l ( t h er a t i oo fs a l i n i t ya n da m m o n i u mn i t r o g e nw a sa p p r o x i m a t e l y 1 0 ：1 ) ，t h ea m m o n i a - o x i d i z a t i o nr a t i ow a so v e r7 0 ，a n dt h e r ew a sb a r e l yn i t r i t e t h e o x i d i z e dn h 4 + - nw a sp a r t i a l l yt r a n s f o r m e di n t on i t r a t e t h e c h e m o a u t o t r o p h i c b i o f i l mh a do b v i o u st u r n i n gp o i n t sd u r i n gt h ea m m o n i a - o x i d i z a t i o n t h ea m m o n i a o x i d i z a t i o nw a sa p p r o x i m a t e l y5 0 a f t e r2 4 hb i o t r e a t m e n ta n dt h ep r o d i l c t so f a m m o n i a - o x i d i z a t i o nw e r em a i n l yn i t r i t ea n dn i t r a t eb e l o w3 6 ，w h i l ea b o v e3 8 ， t h er a t ew a su pt o9 5 ，a n dt h ep r o d u c tw a sm a i n l yn i t r a t e ，t h ec o n c e n t r a t i o no f 3 四川大学硕十学位论文 w h i c hw a s7 0 i nt h eo x i d i z e dn h 4 + - n n er e s u l t so f g a sp r o d u c e di nt h ed e p o s a l o f b i o f i i r aw i t hg ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h ei nt h et r e a t e da i r , t h ec o n c e n t r a t i o no f n i t r o g e nw a s9 4 3 6 7 a n dt h eo x y g e nr e d u c e dt o5 6 3 3 a n dt h ec o n c e n t r a t i o no f n i t r o g e n i nt h ea i rw a s7 9 3 7 9 a n dt h eo x y g e n2 0 5 9 6 c o m p a r e dw i t ht h e c o n t r o l ，t h ec o n c e n t r a t i o no f n i t r o g e nw a si n c r e a s e db y1 4 9 8 8 ，a n dt h a to f o x y g e n w a sr e d u c e db y1 4 9 6 3 ，w h i c hi n d i c a t e dt h ec h e m o a u t o t r o p h i cb i o f i l mh a da l l i n t e r e s t i n ga e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o n t h i sm i g h tb er e l a t e dt ot h ef a c tt h a tt h ec o m p a c t w r a p p i n gl a y e rr e s t r i c t e dt h et r a n s m i s s i o no fo x y g e n 7b a c t e r i aw i t hd i f f e r e n t c o l o n yc h a r a c t e r i s t i c sw e r eg a i n e df r o mt h ec h e m o a n t o t r o p h i cb i o f i l mb ye n r i c h i n g ， f i l t e r i n ga n di s o l a t i n g b e c a u s et i l ee n t i r ea m m o n i a - o x i d i z a t i o np r o c e s sw a sa f f e c t e d b yt h ec o a c to ft h eb a c t e r i ao i l t h eb i o f i l m ，t h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c so ft h e7b a c t e r i aw e r et e s t e da n dw em a d ea1 6 sr d n as e q u e n c e s a n a l y s i so ft h ep r e p o n d e r a n t2 8 一la n d3 8 1 o nt l l eb a s i so ft h e i rm o r p h o l o g i c a l o b s e r v a t i o na n d p h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a ic h a r a c t e r i s t i c s ，t h e2 8 - 2w a s c l a s s i f i e da s n i t r o s o e o c c u s ，2 8 - 3 勰s p h a e r o b a c t e r , 2 8 4 豁t h e r m u s 2 8 5a s r u b r o b a c t e r , 3 8 2a st h e r m u s 2 8 一lc o u l db ec l a s s i f i e d 孙r h o d o c o c c u ss p a n d3 8 1 a sb a c i l l u sc e r e u s n es t u d yo fm i c r o b i o l o g ya n dm e t a b o l i s mo fa m m o n i t a n o x i d a t i o no fc h e m o a u t o t r o p h i ca m m o n i a - o x i d i z a t i o nt o h i i g ht e m p e r a t u r ei so f t h e o r e t i c a ls i g n i f i c a n c ew i t hr e s p e c tt oc h e m o a u t o t r o p h i ca m m o n i a - o x i d i z a t i o na n d i so f p r a c t i c a lv a l u ei nr e a l a t i o nt od e v e l o pn i t r i f i c a t i o n d e n i t r i f i c a t i o nt e c h n o l o g yo f d e p o s a lo fa m m o n i aw a s t e w a t e rl a c ko fo r g a n i cc a r b o na n dp r o v i d e dt h ef o u n d a t i o n f o rd e v e l o p i n gn e wc h e m o a u t o t r o p h i ed e n i t r i f i c a t i o nt e c h n o l o g ya i m i n ga ta m m o n i a w a s t e w a t e rw i t hl o wc nr a t i o k e yw o r d s ：b i o f i l m ；a m m o n i a - o x i d i z a t i o n ；a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o n 4 四川大学硕十学位论文 1 ，引言 众所周知，我国是世界入口大国，也是农业大国，我国以占世界7 的耕地 养育着占世界2 2 的人口，粮食成为我国生死攸关的问题。农业增产的重要手 段之一就是增加化肥施用量。因此化肥工业的发展得到了各级政府的高度重视 和政策扶持，化肥工业在近十年来得到了i i 所未有的快速发展。2 0 0 2 年我国合 成氨生产已达到2 5 0 0 万吨以上，居世界第一。同时我们还清醒认识到，2 0 0 2 年，我国排放废水中，氨氮排放总量已达到1 2 9 万吨，其中工业废水氦氮排放 达到4 2 万吨。尽管缺乏氮肥行业近年来的氨氮排放总量数掘，但1 9 8 5 年的一 项统计数据说明氮肥行业当年排放总量达到2 3 万吨，这已足以使我们认识到合 成氨行业氨氮排放在总排放量中的比重。2 0 0 0 年长江三峡库区和上游地区氨氮 排放总量达到1 1 4 万吨，其中工业排放达到4 8 万吨，占总排放量的4 2 ，而 长江上游排放氨氮达到6 3 万吨。 氨氮超标排放进入自然界的严重后果之一是导致水体的富营养化现象。水 体富营养化对水体生态造成严重影响，尤其是封闭水体的极度富营养化。水体 的富营养化使河流中的细菌和藻类尤其是蓝藻可以大量繁殖，藻类的死亡和腐 烂消耗了水中的溶解氧，致使大量的水生生物因缺氧而死亡。含氮废水还会影 响鱼鳃的氧传递使鱼类致死。富营养化引起蓝藻大量爆发生长。并且有些还会 产生毒素。蓝藻的死亡引起缺氧，又使得一些厌氧菌乘虚而入，并与河流中残 余废物起作用，放出硫化氢之类的臭气。富营养化不仅威胁渔业、旅游业的发 展，而且改变水体中原有的生物种类及生态系统，引起意想不到的环境生态问 题。如美国环境危机中最突出的实例伊利湖的水质恶化和湖泊退化就是富 营养化的“杰作”。在有氧环境中，水中的氨可以转变成为亚硝酸盐，或者继续 转变成为硝酸盐。而饮用水中的硝态氮超过l o m g l 就会造成婴儿的高铁血红蛋 自症。硝酸盐、亚硝酸盐可能转化成为亚硝胺，这是一种致癌、致突变、致畸 物，严重威胁人类健康。此外氨氮还会与氯作用生成氯氨，因而在自来水消毒 时，要增加氯消耗量，加大自来水处理成本。因此从废水中去除氨氮，防止水 体富营养化，消除氮污染对人类的危害是近年柬废水处理研究的重要课题。目 前我国对新建、扩建、改建企业的氨氮废水一级排放标准要求氨氮排放标准要 求氨氮含量控制在1 5 m g l 以下，二级标准要求控制在2 5 m g l 以下；对现有企 婴型盔堂堡! ：兰壁堡苎 业的氨氮废水一级排放标准要求氨氮含量控制在2 5 m g l 以下。二级标准要求控 制在4 0 m g l 以下。 传统的脱氮工艺需经过好氧硝化和厌氧反硝化两个过程。即先在好氧条件 下，自养型硝化细菌将氨氮转化为哑硝酸盐，继而氧化成硝酸盐，然后在厌氧 条件下，由兼性异养菌将硝酸盐还原成亚硝酸盐，最后转变成氮气逸出。 1 9 3 0 年w u h r m a n n 首先发现，在生物滤池的深处，氮的浓度减少，他还通 过试验证明，在生物滤池和曝气池中均可存在硝化作用和反硝化作用，并提出 以微生物细胞内物质作为脱氮菌还原硝酸盐的供氢体的微生物脱氮法。1 9 6 0 年 前后，b r i n g m a n n 提出，利用城市污水的有机物作为反硝化细菌代谢反应所需 的有机碳源。在这两种微生物脱氮法的基础上，1 9 6 0 年以后，微生物脱氮方面 的研究进展很快。1 9 7 0 年后便出现了用以去除b o d 和氮的生物脱氮系统：即去 碳、硝化，反硝化各自分开的三级生物脱氮系统；去碳、硝化同时进行，沉淀 后再进行反硝化的二级生物脱氮系统以及去碳，硝化、反硝化相结合的单级生 物脱氮系统。这三种系统都需在硝化阶段投加碱，在反硝化阶段投加有机物， 这使生物脱氮系统的运行费用较高。为克服这些缺点，2 0 世纪8 0 年代前后， 又产生了将反硝化工艺放置在处理系统最前面的前置反硝化微生物脱氮法，又 称缺氧好氧生物脱氮法( a o 法) ，以及厌氧一缺氧一好氧生物脱氮法( a 2 o 法) 等，这些是目前广泛采用的以传统活性污泥工艺为基础的脱氮工艺。 然而传统的生物脱氮工艺存在着两个主要的不足之处。一是能耗大。氯氮 的氧当量是4 5 7 9 ，即l g 氨氮完全硝化需要氰4 。7 5 9 ，要供氧就要有能耗。对 于前置反硝化生物脱氮系统，因需设置内回流也增加了能耗。其次，在反硝化 过程中，必须由有机物( 有机碳) 提供电子供体，虽然前置反硝化系统可利用 污水中的有机物作为碳源，但若污水的c n 过低，脱氮效果就会受影响。后置 反硝化系统不得不投加甲醇等外加碳源，有机碳投加量需严格控制，过多会影 响出水b o d 5 指标，过少则影响脱氮效果。 据报道，在生物脱氮系统中往往采用载体固定硝化菌，也就是常说的生物膜 技术。能有效的增加系统的硝化菌数量，提高系统的硝化能力。因此，新的载体 不断的涌现，它们共同的特点是：对微生物无毒害，比表面积大，生物容易吸附 等。 生物膜技术实质上是为生物固定化技术，它足将生物细胞固定在载体( 即 6 婴型盔兰婴兰兰丝丝苎 填料) 上，细胞与载体问不发生任何化学反应，并在其上生长繁殖，最后形成 膜状生物絮体。生物膜法与传统的活性污泥法相比，具有以下特征：生物相多 样化：生物量大，设备处理效率高；剩余污泥产量少：运行管理较方便； 无污泥膨胀之虑，且可利用丝状菌的强氧化能力来去除较难降解的物质； 微生物呈固着态，有利于将微生物保持在反应器内和优势菌属的培养。 本试验利用油田外排水中分离的自养氨氧化菌进行了高温氨氧化的研究， 发现游离菌株在好氧条件下存在反硝化现象。在此基础上，对分离的混合培养 物进行了挂膜培养，考察了p h 、碱度、温度等环境因子对自养生物膜氨氧化过 程的影响。在此过程中同样发现自养生物膜具有氨氧化一好氧反硝化现象。 一一 婴坐盔兰竺兰壁垦奎 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 菌源 山东胜利油田的外排水水样。 2 1 2 培养基 2 1 2 1 氨氧化细茵富集筛选培养基 n h c l 1 o g khzpo,079 m g s o , 7 h 2 0 0 5 9 cacl22h扣059 n a c l l o g n a h c 0 3 i g 微量元素溶液 i m l 蒸馏水9 9 9 r a i p h ( 用i nn a o h 或5 n a 2 c o 。或i nh c i 调解，用p h 酸度计测量) 1 2 l 灭菌2 0 - 3 0 m i n 。 微量元素溶液 c u s o , 5 也o c o c l 2 6 h ：0 ( n i 4 ) e m o ，o “4 h z o z n s 吼7 1 ：0 e d t a f e s 仉7 1 1 2 0 m n s 仉h 2 0 蒸馏水 2 1 2 2 人工配制氨氮废水 n i l c i 3 2 0 m g 3 2 0 m g 2 4 0 m g 4 4 0 r a g 1 0 0 0 m g 1 0 0 0 m g 8 7 0 r a g l o o m l 0 6 5 9 8 四川大学珂it - 学位论文 n a h c o ) n a c l k , h p o k h z p o , m g s 0 4 7 u , o m n s 0 _ i h , 0 f e s 0 4 7 h 2 0 h , o 调节p h 到7 6 5 ， 2 0 9 1 0 9 0 7 5 9 0 2 5 9 0 0 3 9 0 0 1 9 0 0 0 1 9 1 0 0 0 n l l 1 2 l 灭菌2 0 m i n 。 2 1 2 3 肉汤培养基( 又称基础培养基，鉴定细菌用) 牛肉膏059 酵母膏059 蛋白胨 1 o g 葡萄糖059 n a c l0 5 9 琼脂 1 5 9 蒸馏水 1 0 0 m 调p h 范围为7 0 - 7 2 ，1 1 2 。c 灭菌3 0 m i n 。 2 1 2 4 马铃薯葡萄糖培养基( 鉴定细菌用) 马铃薯浸汁( 2 0 ) 1 0 0 m l 葡萄糖2 0 9 琼脂1 5 9 自然p h ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 2 1 2 5 氨氧化细菌半固体培养基 在氨氧化细菌培养基( 见培养基2 1 2 ) 中，按w o l n n i a k 洗洋菜 2 i 2 6 厌氧培养基 酪素水解物2 0 9 9 一一 塑型盔兰堡! 兰丝堡苎 n a c i 5 9 巯基醋酸钠 2 9 甲醛次硫酸钠 1 9 琼脂 1 5 9 蒸馏水 1 0 0 0 m l p n 自然。 2 1 2 7 柠檬酸盐培养基 2 1 2 7 1 西蒙斯( s i m m o n s ) 氏柠檬酸盐培养基： n a c l 5 o g m g s o , 7 h z 0 0 2 9 ( n h 4 ) h 。p o , 1 0 9 k 2 h p o , 3 h 2 0 1 0 9 柠檬酸钠 2 0 9 溴百里酚蓝1 水溶液l o m l 水洗洋菜 1 2 9 蒸馏水 9 9 0 m l 以上成分除指示剂外加热溶解，调p h 为7 0 并加入指示剂。分装试管，培 养基量以能摆高低柱斜面为宜。1 2 1 c 蒸汽灭菌1 5 m i n ，并摆成高低柱斜面。 2 1 2 7 2 适用于芽孢菌的柠檬酸盐培养基： n a c l 1 9 m g s 0 7 h z 0 0 2 9 nh4h2po,059 柠檬酸钠 2 9 蒸馏水 1 0 0 0 m l o 0 4 酚红液2 0 m 1 2 1 2 8 酯酶( t w e e n 8 0 ) 培养基 2 1 2 8 1 基础培养基： 蛋白胨 1 0 9 t o 硼j 1 1 大学硕卜学位论文 n a c l 5 9 c a c l 2 2 h z o0 i g 琼脂9 9 蒸馏水1000ml p h 7 4 ，于1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 2 1 2 8 。2 底物： t w e e n 8 0 灭菌于1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 2 1 2 8 3 测定培养基： 冷却基础培养基于4 0 - 5 0 ( 2 ，加入t w e e n 8 0 至终浓度为1 ，倒平板。 2 1 2 9 葡萄糖氧化发酵培养基 2 1 2 9 1 一般细菌葡萄糖氧化发酵培养基 休和利夫森二氏培养基。 2 1 2 9 2 芽胞菌培养基： ( n h 4 ) 2 h p o 。1 0 9 k c l 0 2 9 m g s 0 40 2 9 酵母膏029 琼脂5 o 一6 0 9 葡萄糖log 蒸馏水1000ml 溴甲酚紫( 0 0 4 ) 1 5 m l p h 7 0 - 7 2 ，分装试管，培养基高度约4 - 5 c m ，l1 2 。c 蒸汽灭菌3 0 m i n 。 2 1 2 1 0 产硫化氢培养基 蛋白胨log n a c l 5 9 牛肉膏log 半胱氨酸059 蒸馏水1000ml p h 7 0 - 7 4 分装试管，每管液层高度4 - 5 c m ，1 1 2 灭菌2 0 3 0 r a i n 。另外将普 塑坐查兰堡主兰堡丝茎 通滤纸剪成0 5 - l c m 宽的纸条，长度根据试管与培养基高度而定用5 一1 0 的 醋酸铅将纸条浸透，然后用烘箱烘干，放于培养皿中灭菌备用。 2 1 2 1 1 木糖发酵培养基 2 1 2 1 1 1 一般细菌木糖发酵培养基 休和利夫森二氏培养基 2 1 2 1 1 2 芽胞茵培养基 ( n 也) 瑚e o , k c l u g s o , 7 h z o 酵母膏 琼脂 木糖 蒸馏水 溴甲酚紫( o 0 4 ) 1 0 9 0 2 9 0 2 9 0 2 9 5 0 6 0 9 l o g l o o o m l 1 5 m l p h 7 0 - 7 2 ，分装试管，培养基高度约4 - 5 c m ，1 1 2 ( 2 蒸汽灭菌3 0 m i n 。 2 1 2 ，1 2 甲基红溅定( m r ) 培养基 2 1 2 1 2 1 培养基 蛋白胨 葡萄糖 k 2 h p 仉 蒸馏水 p h 7 0 7 2 ，每管分装4 - 5 r a l ， 2 1 2 1 2 2 试荆 甲基红 9 5 乙醇 蒸馏水 2 1 2 1 3 明胶液化培养基 5 9 5 9 5 9 1 0 0 0 m l 1 1 5 c 灭菌3 0 m i n 。 0 1 9 3 0 0 m l 2 0 0 r a l 四川大学颂f 学位论文 蛋白胨 5 9 明胶 1 0 0 1 5 0 9 蒸馏水 1 0 0 0 m l p h 7 2 7 4 ，分装试管，培养基高度约4 - 5 c m ，间歇灭菌或1 1 5 c 蒸汽灭菌 2 0 m i n 。 2 1 2 1 4v p 测定培养基 2 1 2 1 4 1v p 培养基 蛋白胨 葡萄糖 k 2 t t p 0 蒸馏水 p h 7 0 - 7 2 ，每管分装4 - 5 m l ， 2 1 2 1 4 2 试荆 肌酸 n a o h 2 1 2 1 5 吲哚培养基 2 1 2 1 5 1 吲哚培养基 1 获胨水溶液：调p h 7 2 7 6 2 1 2 1 5 2 试荆 对二甲基氨基苯甲醛 9 5 乙醇 浓h c l 5 9 5 9 5 9 1 0 0 0 m l i1 5 灭菌3 0 m i n 。 0 3 或原粉 4 0 分装1 3 1 4 试管，1 1 5 c 蒸汽灭菌3 0 m i n 。 8 9 7 6 0 m l 1 6 0 m l 2 i 。2 1 6 淀粉水解培养基 2 1 2 1 6 1 培养基：在肉汁胨中加入o 2 可溶性淀粉，分装三角瓶，1 2 l 蒸 汽灭菌2 0 m i n ，倒平扳备用。 2 1 2 1 6 2 试剂：卢哥氏碘液 髑) 1 l 大学碗卜学位论文 2 1 2 1 7 硝酸盐还原培养基 2 1 2 1 7 1 硝酸盐还原培养基： 肉汁胨培养基 1 0 0 0 m l k n 0 3l g p h 7 0 7 6 ，每管分装4 - 5 m l ，1 2 1 蒸汽灭菌1 5 - 2 0 m i n 。 2 1 2 1 7 2 试剂： 1 ) 格黾斯氏试剂( g r i e s s ) a 液：对氨基苯磺酸 稀醋酸( 1 0 左右) b 液：a 一奈胺 蒸馏水 稀醋酸( 1 0 左右) 2 ) 二苯胺试剂： 0 5 9 1 5 0 m l 0 i g 2 0 m l 1 5 0 m i 二苯胺0 5 9 容于i o o m 浓硫酸中，用2 0 m l 蒸馏水稀释。 2 1 3 试剂 2 1 3 11 mn a 0 h 溶液 2 1 3 2i nh c i 溶液 2 1 3 35 s c a c 0 3 溶液 2 1 3 4i a g n 0 ，溶液 称取i g a g n 0 3 ，溶于1 0 0 m l 蒸馏水。 2 1 3 5 水洗洋菜 参照文献制备。 2 1 3 6 革兰氏染色试弃j 2 1 3 6 i 结晶紫的混合液： 甲液：结晶紫 乙醇( 9 5 ) 1 4 2 0 9 2 0 m l 塑业查兰堡兰堡丝苎 乙液：草酸铵 o 8 9 蒸馏水80ral 将甲、乙两液相混。静置4 8 h 后过滤使用。此染液较稳定，在密闭的棕色 瓶中可储存数月。 2 l3 6 2 鲁哥氏碘液： 碘 1 o g 碘化钾 2 0 9 蒸馏水 3 0 0 m l 先用少量( 3 5 m 1 ) 蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片。待碘全溶解后加水稀 释至3 0 0 m l 。 2 1 3 6 3 脱色液 9 5 乙醇 丙酮乙醇溶液： 乙醇( 9 5 )7 0 m l 丙酮 3 0 m l 2 l3 6 4 复袭液： o 5 的番红( s a f r a n i n eo ) 水溶液： 番红2 5 的乙醇溶液 2 0 m l 蒸馏水$oml 混合后过滤。 2 1 3 7 芽孢染色( 孔雀绿染色法) 试荆 2 1 3 7 17 6 孔雀绿饱和水溶液 2 1 3 7 2 齐氏石炭酸复红染凌 a 液：碱性复红 o 3 9 95乙醇loml b 液：石炭酸 5 o g 蒸馏水9 5 r n l 2 1 3 8 奈氏试剂( n h + _ n 定| l 生检酒l 试弃j ) 婴型盔竺婴兰丝堡塞 a 液：碘化钾 1 0 o g 碘化汞 2 0 0 9 蒸馏水1 0 0 m l b 液：氢氧化钾 2 0 o g 蒸馏水1 0 0 m l 先将1 0 o g 碘化汞溶于5 0 m l 蒸馏水中，在此液中加碘化汞颗粒，待完全溶 解后，缓缓加入氢氧化钠，全部溶解后，倒入棕色容量瓶中并补足蒸馏水，然 后再配制好的液体倒入棕色瓶中贮存。 2 1 3 9 二笨胺一硫酸试剂( 硝酸盐定性检测试荆) 二苯胺 0 5 9 浓硫酸1 0 0 m l 蒸馏水2 0 m l 先将二苯胺溶于浓硫酸中，再将此溶液倒入2 0 m l 蒸馏水中。 2 1 3 1 0 氨氮测定一纳氏试剂光度法试剂 2 1 3 1 0 1 无氨水 每升蒸馏水中加入o 1 m l 硫酸( p = 1 8 4 ) ，在全玻璃蕉馏器中重蒸馏，弃 去5 0 m l 初馏液，接取其余馏出液于具塞磨口的玻璃瓶中，密塞保存。 2 1 3 1 0 2 水样预处理试剂及物品 l o ( m ) 硫酸锌溶液： 2 5 氢氧化钠溶液( 贮于聚乙烯瓶中) ： o 3 5 ( m v ) 硫代硫酸钠溶液； 淀粉碘化钾试纸： 称取1 5 9 可溶性淀粉于烧杯中，用少量水调成糊状，加入2 0 0 m l 沸水，搅 拌混匀放冷。加入0 5 碘化钾( k i ) 和o 5 9 碳酸钠( n a 2 c 0 3 ) ，用水稀释至2 5 0 m l 。 将滤纸条浸渍后，取出晾干。装棕色瓶中密封保存。 2 1 3 1 0 3 纳氏试剂 称取1 6 9 氢氧化钠，溶于5 0 m l 水中，充分冷却至室温。另称取7 9 碘化钾 和l o g 碘化汞溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐注入氢氧化钠溶液中，用水 1 6 塑望查兰翌! 兰堡堡苎 稀释至1 0 0 m l ，贮于聚乙烯瓶中，密塞保存。 2 1 3 1 0 4 酒石酸钾钠溶液 称取5 0 9 滔石酸钾钠( k n a c d g 0 6 4 h 2 0 ) 溶于1 0 0 m l 水中，加热煮沸以 除去氨，放冷，定容至1 0 0 m l 。 2 1 3 1 0 5 氨标准棼备溶液 称取3 8 1 9 经过1 0 0 c 干燥过的氯化铵溶于水中。移入1 0 0 0 m l 容量瓶中， 稀释至标线。此溶液每毫升含1 0 0 m g 氮氮。 2 1 3 1 0 6 氨标准使用溶液 移取5 0 0 m l 氮标准贮备溶液于5 0 0 m 容量瓶中。用水稀释至标线。此溶液 每毫升含0 0 1 0 9 氨氮。 2 1 3 1 l 亚硝酸盐氮测定- i , - ( 1 一奈基) 一乙二胺光度法试剂 2 1 3 1 1 1 无亚硝酸盐纯水 于蒸馏水中加入少许高锰酸钾晶体，使呈红色，再加氢氧化钡( 或氢氧化 钙) 使呈碱性。景全玻璃蒸馏器中蒸馏，弃去5 0 m l 初馏液，收集中间约7 0 不含锰的馏出液。 2 1 3 1 1 2 显色荆 于5 0 0 m l 烧杯内，置于2 5 0 m l 水和5 0 m l 磷酸( p = 1 7 0 9 m 1 ) ，加入2 0 0 9 对氨基苯磺酰胺。再将1 0 0 9n ( 1 - 奈基) 乙二胺光度法亚硝酸盐溶于上述溶 液中，转移至5 0 0 m l 容量瓶中，用水稀释至标线，混匀。此溶液贮于棕色瓶中， 保存在2 5 ，至少可稳定一个月。 注意：本试剂有毒性，避免与皮肤接触或吸入体内。 2 1 3 1 1 3 亚硝酸盐氮标准贮备液 称取1 2 3 2 9 亚硝酸钠( n a n 0 2 ) ，溶于1 5 0 m l 蒸馏水中，转移至1 0 0 0 m l 容量瓶中，用水稀释至标线。每毫升含约0 2 5 r a g 亚硝酸盐氮。本溶液贮于棕 色瓶中加入l m l 三氯甲烷，保存在2 5 0 ，至少稳定一个月。 贮备液的标定如下：在3 0 0 m l 具塞锥形瓶中，移入5 0 0 0 m 1 0 0 5 0 m o l l 高 锰酸钾溶液，5 m l 浓硫酸，用5 0 m l 无分度吸管，使下端插入高锰酸钾溶液液面 下，加入5 0 0 0 r n l 亚硝酸钠标准贮备液，轻轻摇匀，嚣于水浴上加热至7 0 一8 0 。按每次1 0 0 0 m l 的量加入足够的草酸钠标准溶液，使红色褪去并过量，记 婴型查兰堡兰兰丝堡苎 录草酸钠标准溶液用量( v 2 ) 。然后用高锰酸钾标准溶液滴定过量簟酸钠至溶 液呈微红色，记录高锰酸钾标准溶液总用量( v i ) 。再以5 0 m l 水代替亚硝酸盐 氮标准贮备液，如上操作，用草酸钠标准溶液标定高锰酸钾溶液的浓度( c ，) 。 按下式计算高锰酸钾标准溶液浓度： q ( t 5 撇) 。芈 按下式计算亚硝酸盐氮标准贮备液的浓度： 亚硝酸盐氮( n 一l ) = 啦丑攀总半型塑 = t 4 0 v , c 一7 0 0 c l 经标定的高锰酸钾标准溶液的浓度( t o o l l ) ； v l 一滂定亚硝酸盐氮标准贮备液时，加入高锰酸钾标准溶液总量( m 1 ) ： v 2 一滴定亚硝酸盐氮标准贮备液时，加入草酸钠标准溶液总量( m lh v 3 一滴定水时，加入高锰酸钾标准溶液总量( m 1 ) ； v 广滴定空白时，加入草酸钠标准溶液总量( m 1 ) ： 7 o o 一亚硝酸盐氮( i 2 n ) 的摩尔质量( g m 0 1 ) ： 5 0 o o 一亚硝酸盐标准贮备液取用量( m 1 ) ； 0 0 5 0 0 一草酸钠标标准溶液浓度( i 2 n a 2 c 2 0 4 ，m o l ，l ) 。 2 1 3 1 1 4 亚硝酸盐氮标准中间液 分取适量亚硝酸盐标准贮备液( 使含1 2 5 m g 亚硝酸盐氮) 置于2 5 0 m 1 容 量瓶中，用水稀释至标线。此溶液每毫升含5 0 0 ug 亚硝酸盐氮。中间液贮于 棕色瓶内，保存在2 - 5 ，可稳定一周。 2 1 3 1 1 5 亚硝酸盐氮标准使用液 取1 0 m l 亚硝酸盐标准中间液，置于5 0 0 m l 容量瓶中，用水稀释至标线。 每毫升含1 o oug 亚硝酸盐氮。此溶液使用时，当天配置。 2 1 3 1 1 6 氢氧化铝悬浮液 四川大学硕士学位论文 溶解1 2 5 9 十二水硫酸铝钾 k a i ( s o , h 1 2 h 2 0 或十二水硫酸铝铵 n i - h a i ( s o d2 1 2 h 2 0 于1 0 0 0 m l 蒸馏水中，加热至6 0 ( 2 ，在不断搅拌下，徐徐加 入5 5 m l 氨水，放最约1 h 后，移入1 0 0 0 m l 量简内，用水反复洗涤沉淀，最后 至洗涤液中不含亚硝酸盐为止。澄清后，把上清液尽量全部倾出，只留稠的悬 浮物，最后加入3 0 0 m l 水，使用前应震荡均匀。 2 1 。3 。1 1 。7 高锰酸钾标准溶液( i s k m n o ，0 0 5 0 m o l l ) 溶解1 6 9 高锰酸钾于1 2 0 0 m l 水中，煮沸0 5 - i h ，使体积减少到1 0 0 0 m l 左 右，放置过夜。用g 一3 号玻璃砂芯滤器过滤后，滤液贮存于棕色试剂瓶中避光 保存，按上述方法标定。 2 1 3 1 1 8 草酸钠标准溶液( 1 2 n a 2 c 2 0 4 ，0 0 5 0 0 m o l l l ) 溶解经1 0 5 c 烘干2 h 的优级纯无水草酸钠3 3 5 0 9 于7 5 0 m l 水中，移入 1 0 0 0 m l 容量瓶中，稀释至标线。 2 1 3 1 2 紫外分光光度法测定硝酸盐氮的试荆 2 1 3 1 2 1 氢氧化铝悬浮液：参见2 l3 1 2 6 2 1 3 1 2 21 0 ( m v ) 硫酸锌溶液 2 1 3 1 2 35 m 0 1 l 氢氧化钠溶液 2 1 3 1 2 4i m 0 1 l 盐酸( 优级纯， 2 1 3 1 2 5 硝酸盐标准贮备液： 称取o 7 2 1 8 9 经过1 0 5 1 1 0 3 2 干燥2 小时的硝酸钾( k n o d 溶于水，移入 1 0 0 0 m l 容量瓶中，稀释至标线，混匀。贮于棕色试剂瓶中，此溶液至少稳定6 个月。每毫升该溶液含o 1 0 0 m g 硝酸盐氮。 2 1 3 1 2 6