（遗传学专业论文）人类ap3b2_v2和rabl4基因的克隆及初步功能研究.pdf

论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名：酗日期：幽：鱼：2 论文使用授权声明 ， 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 一一善l 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅，学校可以公布论文的全部或部分内 i 。 。 一 。 。 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者彝：隧新虢丝& 期：埤堕蔓 人类a p 3 8 2 _ v 2 和r a b l 4 基因的克隆和初步功能研究 摘要 人类基因a p 3 8 2 的一新的剪接体a p 3 8 2v 2 ，从人类胎脑e d n a 文库的大 规模序列分析中分离出来。a p 3 8 2e d n a 全长为1 1 7 1 b p 。序列分析表明a p 3 8 2v 2 缺少了存在于a p 3 8 2 _ v l 中的2 2 个外显子，导致产生一种不同的蛋白。此蛋白 有1 4 5 个氨基酸( 称为a p 3 8 2 _ v 2 ) ，而a p 3 8 2 含有 个氨基酸，它们有_ v l 1 0 8 2 c 端相同的1 4 5 个氨基酸。r t - p c r 分析显示人类基因a p 3 8 2v 2 在若干成人组 织中表达。a p 3 8 2 _ v 2 在脑和睾丸中的表达量比较高，相比较之下，a p 3 8 2v 2 在 肾、胰腺、脾、胸腺、前列腺、卵巢和小肠中呈低水平的表达。 r a b 蛋白组成小分子g t p 结合蛋白最大的家族。第一个发现的r a b 蛋白是酵 母中的s e c 4 p 和y p t l p 。在人类基因组中至少有6 0 种r a b 基因。r a b 蛋白在生 物体中高度保守，约由2 0 0 个氨基酸组成，由保守的g 结构域和高度可变的c 端 组成。而c 端涉及亚细胞的定位。象其他调节型g t p 酶一样，r a b 蛋白在两种 不同的构象问变化，即g t p 结合状态和g d p 结合状态。g t p 结合状态是处于活 性状态，因为这种形式能够和下游效应蛋白相互作用。在g t p 结合状态下，r a b g t p a s e s 能够募集特定的效应蛋白到膜上。通过这些效应蛋白，r a bg t p a s e s 可 以调节囊泡的形成，肌动蛋白和微管蛋白依赖性的小泡的运动以及膜的融合。 r a b l 4 ，r a s 致癌基因家族r a b 类蛋白4 ，我们称为黜墟l 4v l 。r a b l 4v l 的一新的剪接体，r a b l 4v 2 ，从从人类胎脑e d n a 文库的大规模序列分析中分 离出来。r a b l 4v 2e d n a 全长为1 0 2 1 b p ，而r a b l 4v le d n a 全长为1 2 6 7 b p 。 序列分析显示r a b l 4v l 和r a b l 4v 2 都有7 个外显子，其中6 个是相同的， 这导致产生不同的蛋白。r a b l 4v 2 含1 8 5 个氨基酸，而r a b l 4v l 含1 4 5 个氨 基酸，它们有共同的c 端1 4 5 个氨基酸。生物信息学分析表明r a b l 4v l 蛋白 中r a b 结构域不完整，而r a b l 4v 2 蛋白中的完整。r t - p c r 分析显示r a b i av 2 在所有成人组织中都表达，而r a b l 4v l 在胎盘、肝、肾、胰腺和脾中有明显 表达。 关键词：a p 3 8 2 基因，可变剪接，表达类型，r a b i a ，r a b 结构域，生物信息 学分析，克隆，r t - p c r 人类a p 3 8 2 _ v 2 和r a b l 4 基因的克隆莆l 初步功能研究 a b s t r a c t an o v e ls p l i c ev a r i a n to f h u m a na p 3 8 2 ，n a m e da p 3 8 2v 2 w a si s o l a t e dt h r o u g h t h e l a r g e s c a l es e q u e n c i n ga n a l y s i so fah u m a nf e t a lb r a i nc d n al i b r a r y t h e a p 3 8 2v 2c d n ai s1 1 7 1 b pi nl e n g t h s e q u e n c ea n a l y s i sr e v e a l e da p 3 8 2v 2m i s s e d 2 2e x o n st h a te x i s t e di na p 3 8 2y 1 1 e a d i n gt oad i f f e r e n tp u t a t i v ep r o t e i n t i 圮 d e d u c e dp r o t e i n sw e r e1 4 5a m i n oa c i d sr d e s i g n a t e d 嬲a p 3 8 2v 2 ) a n d1 0 8 2a m i n o a c i d sf a p 3 8 2y 1 ) i nl e n g t l , , s h a r i n gt h ec - t e r m i n a l1 4 5a m i n oa c i d s r t - p c r a n a l y s i ss h o w e dt h a th u m a n a p 3 8 2v 2w e r ee x p r e s s e di ns e v e r a lh u m a na d u l tt i s s u e s a n a l y z e d 1 1 1 ee x p r e s s i o nl e v e l so f a p 3 8 2v 2w e r er e l a t i v e l yh i g hi nb r a i na n dt c s t i s i nc o n t r a s t , l o wl e v e l so fe x p r e s s i o nw e r ed e t e c t e di nk i d n e y , p a n c r e a s s p l e e n , t h y m u s ，p r o s t a t e ，o v a r ya n ds m a l li n t e s t i n e r a bp r o t e i n se l e a r i yc o n s t i m t et h el a r g e s tf a m i l yo fs m a l lg t p a s e s t h ef i r s tr a b p r o t e i n st ob ei d e n t i f i e d 。s e c 4 pa n dy p t l p w e r ef o u n di ny e a s t t h e r er r ea tl e a s t6 0 r a bg e n e si nt h eh u m a ng e n o m e ，a n dan u m b e ro fr a bg t p a s e sa r ec o n s e r v e df r o m y e a s tt oh u m a n s i ti sc o m p o s e d0 f2 0 0a m i n oa c i d sa p p r o x i m a t e l y i ng e n e r a l r a b g t p a s e sd i f f e rm o s ti nt h e i rc a r b o x y lt e r m i n i w h i c hh a v eb e e ni m p l i c a t e di n s u b c e l l u l a rt a r g e t i n g ，w h e r e a sr e g i o n si n v o l v e di ng n a r t i n e - n u c l e o t i d eb i n d i n ga r e m o s tc o n s e r v e d l i k eo t h e rr e g u l a t o r yg t p a s e s ，t h er a bp r o t e i n ss w i t c hb e t w e e nt w o d i s t i n c tc o n f o r m a t i o n s o n eg t p b o u n da n dt h eo t h e rg d p b o u n d 1 1 1 eg t p b o u n d c o n f o r m a t i o ni sg e n e r a l l yr e g a r d e d 弱a c t i v e a st h i si st h ef o r mt h a ti n t e r a c t s 砸m d o w n s t r e a me f f e c t o rp r o t e i n s i nt h eg t p b o u n df o r m t h er a bg t p a s e sr e c r u i t s p e c i f i cs e t so fe f f e c t o rp r o t e i n so n t om e m b r a n e s t h r o u g ht h e i re f f e c t o r s ，r a b g t p a s c sr e g u l a t ev e s i c l e sf o r m a t i o n , a c t i n - a n dt u b u l i n - d e p e n d e n tv e s i c l em o v e m e n t , a n dm e m b r a n ef u s i o n r a b l 4 r a bm e m b e ro fr a so n e o g e n ef a m i l y 1 i k e4 i sd e s i g n a t e da s r a b l 4v 1 an o v e ls p l i c ev a r i a n to fh u m a nr a b l 4v 1 n a m e dr a b l 4v 2 w a s i s o l a t e dt h r o u g ht h el a r g e s c a l es e q u e n c i n ga n a l y s i so fah u m a nf e t a lb r a i nc d n a l i b r a r y t h e 队b l 4v 2e d n ai s1 0 2 l b di nl e n g t h , a n dt h er a b l 4v lc d n ai s 1 2 6 t o p s e q u e n c ea n a l y s i sr e v e a l e dr a b l 4v la n dr a b l 4v 2b o t hh a v e7e x o n s o fw h i c h6e x o n sa r et h es a m e 1 e a d i n gt od i f f e r e n tp r o t e i n s t h ep r o t e i n sw e r e18 5 a m i n oa c i d s ( d e s i g n s t e da sr a b l 4v 2 ) a n d1 4 5a m i n oa c i d s ( r a b l 4)，_vl i nl e n g t h s h a r i n gt h ec - t e r m i n a l1 4 5a m i n oa c i d s b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i ss h o w e dr a b l 4v l h a dp a r to fr a bd o m a i n , a n dr a b l 4v 2h a dt h ew h o l er a bd o m a i n r 1 二p c r a n a l y s i ss h o w e dt h a th u m a nr a b l 4v 2w e r ee x p r e s s e di na l lh u m a na d u l tt i s s u e s a n a l y z e d t h el o we x p r e s s i o nl e v e l so fr a b l 4v lw e r ed e t e c t e di np l a c e n t a , i i v e r , k i d n e y , p a n c r e a sa n ds p l e e n k e yw o r d ：h u m a na p 3 8 2 ，a l t e r n a t i v es p l i c i n g ；e x p r e s s i o np a r e m ，r a b l 4 ，r a bd o m a i n , b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s ，c l o n i n g ，r t - p c r 2 人类a p 3 8 2 _ v 2 和r a b i a 基因的克隆和初步功能研究 第一部分a p z b 2 _ 1 1 2 基因的克隆与功能研究 第一章前言 一衔接蛋白a p 的定义 信号衔接蛋白( a d a p t o r p r o t e i n ) 是指具有蛋白质与蛋白质或者蛋白质与脂类 相互作用的结构域，但不具备酶活性的一类蛋白质，它们或表达在细胞膜上或存 在于细胞内，在决定细胞信号转导通路的激活与关闭、信号通路的时空整合等生 物学过程中起重要的作用。 1 衔接蛋白是一种在披网格蛋白小泡形成中起中介 作用的蛋白质( 图1 ) 。 图1 衔接蛋白与膜受 体细胞质结构域中的信号序列相互作用 广义上的衔接蛋白分子是指所有既无酶活性又无转录活性但却含有保守结 构域或酪氨酸脯氨酸基序的蛋白分子，包括：狭义的衔接蛋白( a d a p t o r ) 和衔 接蛋白( 1 i n k e r ) 、支架蛋白( s c a f f o l d ) 、船坞蛋白( d o c k ) 。而在狭义上，真 正的衔接蛋白( b o n af i d ea d a p t e r s ) 主要系指用作两种信号分子桥梁的含有组 件结构域的蛋白分子；而支架蛋白既含有组件结构域，也含有酪氨酸脯氨酸基 序，因而可同时与两个或更多的互补蛋白分子伴侣相结合 2 3 。由于在功能上， 狭义的衔接蛋白与支架蛋白以及衔接蛋白、船坞蛋白几乎是一致的，已有不少作 人类a p 3 8 2v 2 和r a b l 4 基因的克隆和初步功能研究 船坞蛋白e 3 l 。 二衔接蛋白分子的基本特性 根据衔接蛋白在细胞的定位，可将之分为胞浆内衔接蛋白( c y t o p l a s m i c a d a p t e r s ) 和跨膜衔接蛋白( t r a n s m e m b r a n ea d a p t o r s ) 。前者如肉瘤样衔接蛋 白( s l a p ，s r c l i k ea d a p t e rp r o t e i n ) ，生长因子受体结合蛋白一2 ( g r b 2 ，g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r b o u n dp r o t e i n - 2 ) ，g r b 2 一相关衔接蛋白s h c 下游 ( g a d s ，g r b 2 一r e l a t e da d a p t e rd o w n s t r e a mo fs h c ) ；后者如富含糖腊微域相关 的磷酸蛋白c s k 一结合蛋白( p a g c b p ，p h o s p h o p r o t e i na s s o c i a t e d w i t h g 删s c s k b i n d i n gp r o t e i n ，g e m s ：g l y c o l i p i d e n r i c h e di n i c r o d o m a i n s ) ，活 化t 细胞衔接蛋白( l a t 。l i n k e rf o r a c t i v a t e dtc e l l s ) 。跨膜衔接蛋白通常 存在于脂筏之中( 1 i p i dr a f t s ) ，后者是细胞膜中富含糖鞘脂的微结构域。它由 独特的胆固醇鞘脂类脂微结构域构成，通过浓集或释出信号蛋白分子，为t 细 胞功能提供一种调节机制 4 。存在于脂筏中的衔接蛋白分子在经过t 细胞活化 过程中所发挥的磷酸化作用后又重新定位于5 0 l o o m m 的微结构域内，提示这些 衔接蛋白分子分隔存在于独特的脂筏中，其功能在于功能性调节t 细胞信号转导 5 。胞浆内衔接蛋白与跨膜衔接蛋白的结构各具特色，其相互作用的蛋白分子 类别也不尽相同( 表1 ，2 ) 6 。 表1胞浆衔接蛋白结构特点 衔接蛋白分子结构分子量( k d )相关分子 衔接蛋白分子结构分子篮( k d )相关分子 衔接蛋白分子的保守结构域是与功能密切相关的。s h 2 结构域是磷酸酪氨酸 结合组件，它通常识别p yxxv 基序( p y 代表磷酸酪氨酸，x 代表任何疏水氨基 酸) ；s h 3 结构域与含脯氨酸肽相互作用，通常形成r k xx p xx p ( i 类) 或 4 人类a p 3 8 2 _ v 2 和r a b l 4 基因的克隆和初步功能研究 pxx p x r k ( i i 类) 基序；p t b 结构域识别n p x y 序列，其中酪氨酸勿需磷 酸化；p h 结构域与p t b 享有同样的序列，除了结合磷脂酰肌醇( p t p s ) 外并发 挥膜触发器作用；唧结构域和p d z 结构域未能在抗原受体信号途径中的衔接蛋 白分子中发现，删结构域通常识别富含脯氨酸的配体，而p d z 通常识别c 末端 基序 7 。 除了上述的结合规则之外，s h 2 、s h 3 、p t b 结构域并不局限于上述的结合规 则。比如，s a p 的s h 2 结构域，在x 一连锁的淋巴细胞增殖综合征的突变基因的 产物，不再具有结合磷酸和非磷酸t 1 yxxy 1 基序。有趣的是，若在结合基 序发生y f 突变，则大多都能维持s a p 的结合能力 8 。s h 3 结构域并不限于p xx p 核、因为s l a p 一1 3 0 f y b ，f y n 以及l c k 可以识别s k a p 5 5 衔接蛋白的p k xx y xx y 基序。一级蛋白序列并非蛋白结构域结合特异性所需的指标，更关 键的是结合结构域与其靶分子之间实际的分子接触 9 。 相互作用的相关分子伴侣可以是不同的衔接蛋白分子之间，也可以是t 细胞 受体的组成链部分，还可以是细胞内非受体型蛋白酪氨酸酶和磷脂酶、小g 蛋白 酶或其它具有酶活性和转导活性的信号传递分子如s t a t 、j a k 等。当t 细胞受体 与其配体启动结合后，将诱导受体的聚簇并活化p t k s 、l c k 、f y n 以及z a p 一7 0 ， 这些酶的底物包括衔接蛋白，如l a t 、s l p - 7 6 和p a g c p b 等。这些衔接蛋白分子 磷酸化后，即可募集其它含有s h 2 结构域的蛋白分子参与到信号转导复合体 ( s i g n a l i n gc o m p l e x e s ) ，l a t 和s l a p 被认为在连接p t k 活性与下游反应之闯 起重要作用。磷酸化的l a t 募集p l c r l 和g r b 2 s o s 复合物到胞浆膜，导致钙动 员以及r a s m a p k 活性；s l a p 通过衔接蛋白g a d s 间接地与l a t 连接。磷酸化的s l p 7 6 可以结合v a v ，后者是r a cg t p 酶的g e f 。而p a g c b p 则可通过募集p t k c s k 下 调t 细胞信号转导 1 0 。 衔接蛋白分子含有诸如s h 2 ，s h 3 结构域等保守结构域以及磷酸酪氨酸结合 结构域( p t b ，p h o s p h o t y r o s i n eb i n d i n gd o m a i n ) 、色氨酸色氨酸( w w ) ，石蝇 同源区( p h ，p l e e ks t r i nh o m o l o g y ) ，突触后密集盘巨大z o l 结构域( p d z , p o s t s y n a p t i cd e n s i t yd i s kl a r g e7 _ o ld o m a i n ) 以其特有的结构与相互作用分子伴侣 ( i n t e r a c t i n gp a r t n e r ) 结合，即介导蛋白一蛋白的相互作用，从而形成多蛋白信 号分子复合体或称信号转导体( s i n g a l o s o m e ) 。 1 1 衔接蛋白分子的保守结构域 以及存在其上的结合基序( b i n d i n g m o t i f s ) 与其互补的蛋白分子伴侣相互作用包 括衔接蛋白作为细胞内非受体酪氨酸蛋白激酶的底物，其它蛋白分子与衔接蛋白 分子在结构上互补性结合而产生相互作用。比如：s h 2 和p t b 结构域可与靶蛋 白分子的磷酸酪氨酸残基相结合；s h 3 和w w 结构域可以识别与结合互补蛋白 分子伴侣中富含脯氨酸基序；而p h 结构域则与磷脂酶结合；p d z 结构域与某些 人类a p 3 8 2 v 2 和r a b l 4 基因的克隆和初步功能研究 分子伴侣中富含脯氨酸基序；而p h 结构域则与磷脂酶结合；p d z 结构域与某些 含有c 末端保守的疏水残基的短序列蛋白分子相结合。除了这些保守结构域之 外，大多数衔接蛋白分子本身也含有脯氨酸和酪氨酸基序，后者又分别与互补蛋 白分子伴侣中的s h 3 和s h 2 组件结构域( m o d u l a rd o m a i n ) 结合并与其相互作 用。 1 2 三衔接蛋白分子的分类 网格蛋白包被小泡外被的内层有衔接蛋白组成，衔接蛋白介导两种不同蛋白 组分的连接，在内表面衔接蛋白与膜受体尾端结合，而受体在膜泡腔面与特异性 分子( 配体) 结合：在外表面( 胞质基质面) 衔接蛋白与网格蛋白分子结合，将 网格蛋白骨架固定在膜泡表面。两种不同类型的衔接蛋白负责不同的包被膜泡， 它们的来源不同。在质膜包被窝和特征性的内吞膜泡中存在a p 2 衔接蛋白。这些 膜泡也包含另一种衔接蛋白，即a p l 8 0 ，它控制着膜泡的大小。a p l 接头但百存 在于高尔基体膜泡包被窝，且成为运往内吞体膜泡的定位识别特征。每个a p 都 是异源四聚体，单个亚基称为衔接蛋白单体。衔接蛋白中的1 3 亚基与网格蛋白结 合而a 或y 亚基则与形成膜泡的膜的相互作用有关；也就是说，它们负责在网格 蛋白衣被组装之后将整个a p 复合物装配在合适的膜上。 目前已知有三种衔接蛋白：a p l 、a p 2 和a p 3 ( 图2 ) a p l ：衔接蛋白a p i 参与反面高尔基体的披网格蛋白小泡的出芽。由于m 6 p 受体蛋白既存在于反面高尔基体又存在于细胞质膜，所有这种受体既能同a p i 作用又能与a p 2 相互作用。 a p 2 ：衔接蛋白a p 2 是由a 衔接蛋白( q 链) 和1 3 衔接蛋白( 1 3 链) 良 种接头但白组成的异二聚体。参与反面高尔基体网络的披网格蛋白小泡的组装。 a p 3 ：最近在酵母和鼠的研究中又鉴定了一种衔接蛋白，a p 3 ，具有a p 3 突 变的酵母，反面高尔基体的某些蛋白就不能被运输到液泡、溶酶体。 6 耋竺! 里! ：丝型墨垒璺坚兰里盟塞堕塑塑垄塑丝婴窒 图2 哺乳动物和酵母中的衔接蛋白( a p ) 同源物及它们分子量1 - 1 3 3 这三种不同类型的衔接蛋白，可分别结合不同类型的受体，形成不同性 质的转运小泡，如a p i 参与高尔基体要内体的运输、a p 2 参与质膜口内体的运输、 a p 3 参与高尔基馓j 溶酶体的运输( 图3 ) 。 1 4 1 ( a ) 酵母中 ( b ) 哺乳动物细胞中 人类a p 3 8 2v 2 和r a b l 4 基因的壳隆和初步功能研究 图3 在酵母和哺乳动物细胞中a p - 3 依赖性运输 四衔接蛋白的结构与功能 4 1t 细胞活化的跨膜衔接蛋白 最近发现了一组t c r 相关的跨膜衔接蛋白，包括t 细胞活化的连接分子 ( 1 i n k e rf o ra c t i v a t i o no ftc e l l s ，l a t ) 、s h p 2 相互作用跨膜衔接蛋白 ( s h p 2 i n t e r a c t i n g w a n s m e m b r a n e a d a p t o r p r o t e i n , s i t ) 和t 细胞受体相互作用分 子( tc e l lr e c e p t o ri n t e r a c t i n gm o l e c u l e ，t r i m ) 。这些分子的共同特点是胞外区很 短( 和1 8 个氨基酸) ；胞质区较长并包含多个与免疫受体酪氨酸活化模块( i 吖心订) 特征不同的酪氨酸残基，它们被磷酸化后能结合具有s h 2 域的细胞内信号转导 分子，使这些分子与细胞膜相关，并进一步传递信号。 1 5 l a t 是一种表达于t 细胞、n k 细胞、肥大细胞和血小板的3 6 k d 单链蛋白 质。它的胞外区、跨膜区和胞质区分别4 ，2 1 、2 0 8 个氨基酸残基。l a t 的胞质 区部分含有l o 个酪氨酸残基，其中至少6 个可与具有s h 2 域的细胞内信号分子 g r b 2 或p l cy 结合而传递信号。此次l a t 并不直接与t 细胞抗原受体( t c r ) 相 连，t c r 被交联激活后，l a t 很快被z a p - 7 0 s y k 或s r c 家族p t k 酪氨酸磷酸化， 并快速接近t c r ，形成以t c r 为中心的多分子活化族( s u p r a m o l e c u l a r a c t i v a t i o n c l u s t e r ，s m a c ) 。s m a c 可募集大量多种协同刺激分子，对t c r 信号传递和t 细胞 活化至关重要。s m a c 中l a t 的磷酸酪氨酸可为许多含s h 2 域的信号分子( 如g r b 2 、 g r a p 、g a d s 、p l cy 、原癌基因c - c b l 产物( c b l ) 、p 1 3 k 的调控亚单位p 8 5 、s l p 一7 6 等) 提供停泊位点，使他们能进一步传递信号。 1 7 t r i m 是二硫键连接的同二聚体，特异性表达于t 细胞和n k 细胞，可与t c r 共沉淀、共调节和共帽化( c o c a p s ) ，可能是t c r 复合体中的未知部分。在胚胎 发育早期( 人类妊娠1 4 1 7 周) 即可检出高水平t r i mm r n a 。t r i m 单体的胞外区、 跨膜区和胞质部分分别有8 、1 9 和1 5 9 个氨基酸残基。t r i m 的胞质区有8 个酪 氨酸残基，其中一个是g r b 2 的潜在结合点，一个可与p 1 3 kp 8 5 亚基相互作用。 t c r 活化时，t r i m 可结合s r c 家族p t k 并被磷酸化而激活，活化t r i m 可结合g r b 2 、 p 1 3 k 的p 8 5 亚基而传递信号，还与4 3k d 和9 5k d 的未知肷相关。t r i m 和p 1 3 k 相互作用的序列尚不知，但它们可激活蛋白激酶b ( p k b a k t ) - b a d 途径诱导抗 凋亡信号、调节肌动蛋白细胞骨架和或参与t c r 的表达和内化。t r i m 基因位于 染色体3 q 1 3 ，约1 6 的基因成分与类风湿性关节炎有关。 1 8 ，1 9 s i t 是特异性表达于淋巴细胞的、二硫键连接的同二聚体。s i t 的前导序列 有2 2 个氨基酸，成熟单体s i t 的细胞外区、跨膜区和胞质部分分别有1 8 、2 0 和 1 3 6 个氨基酸残基。s i t 胞外区有2 0k d 分子量的糖基，提示可能有细胞外配体 8 人类a p 3 8 2v 2 和r a b l 4 基因的克隆和初步功能研究 通过糖基调节s i t 的功能。s i t 的胞质区有5 个酪氨酸残基：2 个结合g r b 2 ：2 个结合s r c 家族p t k ；另一个是i t i m ( 序列为y a s v ) ，被s r c 家族p t k 或s y k 激 酶酪氨酸磷酸化后可抑制t c r 相关的n f a t 活化。 2 0 3 在j u r k a t 细胞中过度表达后，s i t 通过位于p l cy 激活上游的机制阻止t c r 介导的n f a t 的活化，提示s i t 可能是t 细胞活化的一个负调节成分。然而，现 在仍不知哪一个效应分子被s i t 影响，s i t 的哪一部分介导它的功能。s i t 的i t i m 可与s h p 2 ( s h 2 一c o n t a i n i n gp r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e2 ) 相互作用，后 者可使磷酸酪氨酸脱磷酸从而抑制t c r 介导的、与磷酸酪氨酸相关的信号传递， 最终抑制n f a t 活化。然而，点突变s i ti t i m 上的t y r 为p h e 后，虽然s i t 过 度表达，t c r 介导的n f a t 活性仍被下调。另有报道，点突变i t i m 中的t y r 后， s i t 虽仍与s h p 2 结合，但负调节能力显著下降。除s h p 2 外，s i t 还可通过n 端 和c 端y x n 序列与c r b 2 相互作用。 4 2b 淋巴细胞信号转导相关衔接蛋白b a m 3 2 3 2k db 淋巴细胞接头分子( b a r n 3 2 ) 是一新发现的蛋白质，主要在淋巴系 统的细胞中表达。 2 1 b a r n 3 2 基因序列的分析显示，该蛋白质分子具有两个结 合域( s h 2 结合域和p h 结合域) ，没有具有酶活性的功能片段，因此是一种衔 接蛋白。b 细胞抗原受体( bc e l l a n t i g e n l e c a i 3 t o l r , b c r ) 激活可导致b a m 3 2 重新 从细胞浆分布到细胞膜上，这一过程需要p d 激酶的活性。 2 1 研究证明，b a m 3 2 与p i ( 3 ，4 ，5 ) p 3 和p i ( 3 ，4 ) p 2 有很强的亲和力，而p d k 激酶催化产生的 p i ( 3 ，4 ，5 ) p 3 在趋化b a m 3 2 到细胞膜上发挥了关键的作用。 在b a m 3 2 基因敲除的小鼠，b c r 诱导的b 细胞增殖明显降低，对i i 型t 非依赖性抗原的免疫应答出现明显的缺陷。进一步分析发现，在b a m 3 2 确失的 b 细胞，b c r 诱导的h p k l ，m e k k l 、j n k 和e r k 的激活明显降低。 2 2 ，2 3 这些结果提示，b a n d 2 可分流b c r 信号到不同的通路，是调控b c r 信号转导 通路中的关键蛋白质分子之一。 2 4 4 3 衔接蛋白c i n 8 5 c 8 5 中有多个结构域，与它相互作用的蛋白质有许多，如：c i n 8 5 的s h 3 结构域可同十几种蛋白质的p x x x p r 序列或者p x ( p ，a ) ) o 汛序列或者p ) o ( p 序列相互作用，这些蛋白质中有c b ( c a s i t a sb 1 i n e a g el y m p h o m a p r o t o o n c o g c n e ，e 3 泛素连接酶家族) 、凋亡调节蛋白a i p y a l i x ( a l g 2 - i n t e r a c t i n g p r o t e i nl o ra l g 2 - i n t e r a c t i n gp r o t e i n ) ( ，a l g 2 - a p o p t o s i s l i n k e dg e n e2 ，凋亡相关 蛋白) 、d a b 2 ( d i s a b l e d 2 ，内吞相关衔接蛋白) ；c i n 8 5 的脯氨酸富集区可以结 合p i 3 激酶的p 8 5 调节亚单位衔接蛋白( 如g r b 2 、c r k 和p 1 3 0 c a s ) 以及内吞 相关蛋白e n d o p h i l i n a le n d o p h i l i n a 3 ；其c o i l e d c o i l 结构域负责蛋白质的二聚化。 9 人类a p 3 8 2 _ v 2 和r a b l 4 基因的克隆和初步功能研究 另有研究发现c i n 8 5 可以结合黏着斑激酶( f o c a la d h e s i o nk i n a s e ，f a k ) 。存在这 么多与c i n 8 5 相互作用的蛋白质也提示了该衔接蛋白质功能的多样性。根据已 有的研究，c i n 8 5 的功能可以归纳为促受体酪氨酸激酶( r t k ) 的内吞与降解、 影响局部黏附( f o c a la d h e s i o n ) 三个方面。 1 1 0 人类a p 3 8 2 _ v 2 和r a b l 4 基因的克隆和初步功能研究 第二章材料和方法 1 菌株、质粒 1 1 大肠杆菌菌株 d h 5 a 菌株：基因型s u p e 4 4 a ，l a c u l 6 9 ，( q 0 8 0 1 a e z a m l 5 ) ，h s dr 1 7 ，r e c a l ， e n d a l ，g y r a 9 6 ，t h i 1 ，r e l a l ，本实验室保存 b l 2 1 ( d e 3 ) 菌株：基因型f - o m p t , h s d s ( r 8 一m b 一) g a ld e m ( d e 3 ) ，本实验室 保存 2 实验材料 m u l t i p l et l 路u ee d n a p a n e li & i i ，美国c l o n t e e h 公司产品 p v d f 膜( h y b o n d - p ) ，美国a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 h y b o n d - n 膜，美国a m c r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 3 主要试剂、酶类 v - g e n e 日常型质粒d n a 快速制备试剂盒，v - g e n e 公司产品 v - g e n ep c r 清洁试剂盒，v - g e n e 公司产品 v - g e n ed n a 凝胶回收试剂盒，v - g e n e 公司产品 o m e g a 无内毒素质粒d n a 中量抽提试剂盒，美国o m e g a 公司产品 q i a g e nm i d i 质粒抽提试剂盒，德国q i a g e n 公司产品 t 4d n a 连接酶，英国b i o l a b s 公司产品 d n a 分子量标准d g l 2 0 0 0 ，北京鼎国生物公司产品 低分子量蛋白标准，中科院上海生物化学研究所 预染蛋白标准p 7 7 0 8 v ，英国b i o l a b s 公司产品 各种限制性内切酶，英国b i o l a b s 公司产品 p 如d n a 聚合酶，上海生工生物工程公司产品 t a q 酶，复旦大学遗传学国家重点实验室产品 细菌d n a 提取液，复旦大学遗传学国家重点实验室产品 d n t p s ，上海生工生物工程公司产品 p r o m e g ar e v e r s et r a n s c f i p t i 0 1 1s y s t e m ，美国p r o m e g a 公司产品 引物由上海赛百盛公司和上海生工公司合成 1 p t g ，美国p r o m e g a 公司产品 氯化钙，美国a m r e 班7 , o 公司产品 。 i r i s 碱，分析纯，美国b o e h r i n g e rm a n n h e i m 公司产品 乙二胺四乙酸( e d t a ) ，分析纯，安徽合肥工业大学化学试剂厂 氨苄青霉素，上海四药股份有限公司 n ，n ，n ，n - 四甲基乙二胺( 砥m e d ) ，美国f l u k a 公司产品 n ，n - 亚甲双丙烯酰胺，美国b b i 公司产品 人类a p 3 8 2 _ v 2 和r a b l 4 基因的克隆和初步功能研究 丙烯酰胺，美国b b i 公司产品 过硫酸胺，美国s i g m a 公司产品 考马斯亮蓝r 2 5 0 g 2 5 0 ，美国a m i 汪s c o 公司产品 十二烷基磺酸钠( s d s ) ，美国s e r v a 公司产品 d m e m ，g i b c o 公司产品 n e w b o r nc a l f s e n l m ，h y c l o n e 公司产品 h a n k sb a l a n c e ds a l ts o l u t i o n ，g i b c o 公司产品 胰酶干粉，g i b c o 公司产品 a g a r o s e ，美国p r o m e g a 公司产品 1 1 u z o l ，g i b c o 公司产品 d m s o ，美国s i g m a 公司产品 p r o t e a s ei n h i b i t o rc o c k t a i l1 曲l e t s ，美国r o c h e 公司产品 n p 4 0 ，上海生工公司产品 4 常用试剂配制： 2 0 s d s ：在9 0 m l 水中溶解2 0 9s d s ，加热至6 8 c 助溶，加水定容至1 0 0 m l 后高压灭菌。 o 7 5 m o l l 柠檬酸钠( p h7 o ) ：在干烤过的试剂瓶中秤取4 4 1 3 9 柠檬酸三钠， 加m i m - q 水1 6 0 m l 溶解后，加n a o h 调节至p n7 0 ，在干烤过的量筒中定 容至2 0 0 m l 后高压灭菌。 无r n a 酶的o 5 m o l le d t a ( p h8 o ) 溶液：取新领的e d t a ，用干烤过的 烧杯和药匙称取1 4 6 1 9 ，溶于8 0 m lm i l l i q 水中，完全溶解后用干烤过的量 筒定容至1 0 0 m l 。 无r n a 酶的2 m o l ln a a c ( p r i4 o ) ：在干烤过的试剂瓶中秤取n a a c 3 h 2 0 5 4 2 2 9 ，加m i l l i - q 水1 5 0 m l 溶解，以冰醋酸调节至p h4 0 ，于干烤过的量筒 中定容至2 0 0 m l ，高压灭菌。 水饱和酚：商品苯酚加热融化后倒入圆底烧瓶中开始蒸馏，弃1 8 0 前镏份， 收集1 8 2 c 镏份( 每瓶约3 0 0 m 1 ) ，加m i l l i q 水饱和，充分摇匀后4 c 静置 分相，根据有机相体积加o 1 8 羟基喹啉，颠倒摇匀后4 静置分层。 氯仿异戊醇( 4 9 ：1 ) ：取干烤过的量筒量取4 9 0 m l 氯仿及1 0 m l 异戊醇，倒 入干烤过的试剂瓶中充分摇匀备用。 l m o l lt r i s - h c i ( p h7 5 ) ：于干烤过的试剂瓶中秤取t r i s2 4 2 2 9 ，加1 6 0 m l m i l l i q 水溶解，加浓盐酸调至p h7 5 ，于干烤过的量筒中定容至2 0 0 m l ，高 压灭菌。 1 0 s d s ：在千烤过的试剂瓶中秤取2 0 9 十二烷基肌氨酸钠，加m i l l i q 水 1 2 人类a p 3 8 2 - v 2 和r a b l 4 基因的克隆和初步功能研究 1 8 0 m l ，6 5 溶解混匀，加m i l h - q 水定溶至2 0 ( 0 1 ，倒入试剂瓶中混匀备用。 o 5 me d t a ( p h8 o ) ：二水乙二胺四乙酸二钠1 8 6 1 9 ，加d d h 2 08 0 m l ，磁力 搅拌器上剧烈搅拌，用n a o h 调节至p hg 0 ，然后定容至1 0 0 m l ，灭菌。 3 m o l l 卜i a a c ( p u5 6 ) ：无水乙酸钠4 9 2 9 ，加1 4 0 m l 重蒸水，加热使溶解， 再用冰乙酸( 约3 0 m 1 ) 调节p n 至5 6 ，加重蒸水定容至2 0 0 m l