（细胞生物学专业论文）利用农杆菌真空渗透在烟草中瞬时表达人酸性成纤维细胞生长因子（hafgf）.pdf

摘要 利用植物生物反应器生产药用蛋白是近年兴起的一种生产蛋白的新技术，它与其他 生物反应器如动物生物反应器、蛋白的原核表达系统等相比有许多优势：a ，安全，可 有效的避免病毒、内毒素对人体的伤害；b ，蛋白能在植物体内正确折叠，本身的糖基 化与动物本身也十分的相似；c ，成本底；d ，操作简单，设备简易： e ，可以大规模 生产。利用农杆菌真空渗透的瞬时表达体系表达药用蛋白与植物的稳定转化相比，表达 周期短、表达量高、无环境安全性问题，有很好的发展前景。 人类酸性成纤维细胞生长因子( a f g f ，f g f 1 ) 是成纤维细胞生长因子超家族成员， 来自于三个胚层的多种细胞都可以表达a f g f 。a f g f 在治疗帕金森综合症、急性脊柱扭 曲性损伤、断指中神经功能重建、脑缺血、肾缺血、心肌梗塞、闭塞性脉管炎、视网膜 缺血、胃溃疡及难愈合性伤口等多种临床应用方面具有巨大潜力。 通过农杆菌真空渗透法在烟草中瞬时表达人酸性成纤维细胞生长因子( 1 1 a f g f ) 基 因，并对影响表达量的几个因素进行了研究。结果表明在真空渗透后4 天，外源基因获 得高水平的表达，烟草i c d 砌h 口6 p 删 硎泐锕( n b ) 的表达量明显低于烟草n h ( 转基 因沉默抑制子h c p 的n b 植株) 。e u s a 结果表明l l a f g f 基因在表达载体 p m 3 9 0 _ h a f g f 依d e l 中得到最高水平的表达，v “e m i i l e 等培养方法的表达量高于 k a p i l a 等培养方法的表达量，叶片有划痕的烟草材料的表达量高于叶片完整的烟草材料 的表达量。 关键词：人酸性成纤维细胞生长因子；g u s ；k d e l ；信号肽：沉默抑制因子h c p r o 真空渗透 a b s t r a c t u s i n gp l 趾tb i o r e a c t o rt op m d u c ep h 甜m a i c i 砸c a lp m t e i n si san o v e ls 觚c e g y ，w h i c hw a s d e v e l o p e di 1 1r e c e n ty e a r s c 叩a r e d 、i t l lo t h c rb i o r e a c t o fs y s t e m s ，s u c h 嬲a i l i m a lb i o r e 虻t o r ， p r o t e j np r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e m ，i th 髂m ea d v 趾t a g e s1 i k es 世y ，p r o p e rf 0 1 d i n ga n d 9 1 y c o s y l a t i o n ，c o s te m c i e n c y ，e a s yo p e r a t i o n ，s 吼p l ee q u i p m e n t t h ea g r 0 _ b a c t e r i u m m e d i a t e dv a c u 砌m l 仃a t i o ns y s t e mh a ss o m ea d d i t i o n a la d v a n t a _ g e s ，s u c ha st 妇es a v i n g ， 1 1 i 曲e x p r e s s i o nl e v e l ，e n v i m m e ms a f 蚵 t h ea c i d i cf i b m b l a s tg r o w t l l 缸t o r ( a f g f ) i sa i li l n p o r t a n tm e m b e ro ff g f i l y ， w h i c hc a i lb ee x p r e s s e db yav a r i e 哆o fc e l l s 丹o ma l l 廿l r e eg e mk 叮e r s a f g fs h o w sg r e a t p o t e n t i a lf o rc l i i l i c a 王叩p h c a t i o n sf o r 也e r a p yo fav a r i e t yo f ( 1 i s e a s e s ，s u c ha sp a r k i n s o n s d i s e 髂e ，s p i i l a lc o r dc o n t u s i o ni 玛u 啦n e l l r a lr e g e n e r a t i o ni nr c i i n p l a 1 1 c a t i o no fb m k e n - o 仃 f - m g e r ，b r a i ni s c h e m i a r e n a li s c h e m i a ，m y o c 砌i a li n f a r c t i o n ，o c c l u s i v ev a s c m a r i t i s ，r e d n a l i s c h e r n j a ，g a s t r i c1 1 1 c e ra n dn o r l h e a l i n gw o u n da n ds oo n w ee x p r e s s e dh m a l la c i d 丘b r o b l a s t 铲o w 山f h c t o fg e n et r a n s i e n n yi nt o b a c c ob y a g m _ b a c t e r i u mm e d i a t e dv a c u 岫i 1 1 n l 廿a t i o na n ds t i l d i e dm ef h c t o r s ，w i l i c h 面- f l u 髓c e dt 1 1 e e x p r e s s i o nl e v e l _ t h ea g r o - b a c t e d 啪m e d i a t e dv a c u u m 脚l 删o ns y s t 锄w a so p t i m i z e d a i l ds n j d i e d 也er e l a t i o n s h i pb e 伽e c nt l l ee x p r e s s i o nl e v e la n d 协ec u l t i v a t i o nt 血，d i 侬：r e n t t o b a c c om a t e r i a l sn b ，n h ( a 慨s g e n i cn bp l a n tw h i c he x p r e s s 也eg e n es i l e n c e 吼l p p t e s s o r g e n e ) t h er e s l i l t si n d i c a t e dm a tm ee x p r e s s i o nl e v e lw a sl l i g h c s t i nt h e4d a y s 啦e r i n n l 仃a t i o na n d 协ee x p r e s s i o nl e v e li i lt l l en hp l 趾t sw a ss u p e r i o rt 0 廿l a ti nt h en bp l a n t s t h ee l i s ar e s m t si n d i c a t e dt h a te x p r e s s i o nl e v e lo fh a f g fg e n ew a s1 1 i g h e s ti nt o b a c c o w l l i c hw a si 曲1 仃a t e d 、v i m 也ep m l 3 9 0 h a f g f k d e lv e c t o r ，t l l ee x p r c s s i o nl e v eo f 山e 、v o u l l dl e a f 、 邯h i 曲e rt h a nt l l a to ft h ei n t a c ti e 吐t h ee x p r e s s i o nl c v e l i nt 1 1 em a t e r i a l s c l l l t i v a t c d 明e n t h l e sm 劬o dw a sh i 曲e r 廿l a l lt h a tp e 面r i l l e db y 1 ek a p i l a sm 劬o d k e yw o r d s ：a c i d i c6 b r o b l a s t 铲o w l hf 缸0 r ，g u s ，k d e l ，s i g n a lp e p t i d e ，s i l e n c i n g s u p p r e s s o rh c p r o ，v a c u mi n f i l 廿a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：羞至塾日期：鲨! 堑堕! 旦 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：槛指导教师签名：兰堕 日 期：砭心细ll j 日 期：呈竺! 鱼塑! 鱼 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 1 1 植物生物反应器研究进展 1 引言 近年来，随着分子生物学的飞速发展，植物遗传转化技术的不断完善，植物基因工 程取得了令人瞩目的成就，尤其是转基因植物作为生物反应器来表达外源蛋白f 包括疫 苗、抗体、药用蛋白) ，即所谓的分子农业( m o l e c i l l a r 加m i n g ) ，己成为植物基因工程 领域内一个研究的热点，具有极大的市场前景和商业价值。目前，已用于生物反应器的 植物有烟草、拟南芥、大豆、小麦、水稻、玉米、油菜、马铃薯、西红柿等。 1 1 1 植物生物反应器的概念及其优点 植物生物反应器，就是利用植物这个系统包括植物细胞、组织器官以及整株植物为 工厂来生产具有商业价值的生物制品包括疫苗、抗体、药用蛋白等。广义上讲，不仅仅 指经基因工程改造的植物细胞、组织器官以及整株植物，也包括天然的植物，例如一些 天然植物的次生代谢产物也具有重要的药用价值【l 。植物生物反应器与其它的生物反 应器相比有许多的优点： 植物是最经济的蛋白质生产系统。种植植物所需要的仅仅是阳光，来自土壤或肥料 的矿质营养、水分，这一点明显优于微生物发酵和动物细胞的培养，因为微生物发酵需 要昂贵的设备投入，而动物细胞的培养需要昂贵的生长培养基，而且要保持无菌的生产 条件。 植物可以大规模种植，而且产物贮藏在种子、果实、块茎中，便于贮运。例如，在 室温条件下经过5 个月储存的水稻种子中s c f v ( s i g l ec h a i nf v ) 的含量和活性没有明显 的损失p 】。在4 条件下，储存1 8 个月的马铃薯仍保留5 0 的有活性的抗体【4 l 。 植物具有完整的真核细胞表达系统。表达产物能进行正确的折叠、装配、糖基化、 磷酸化、酰胺化，从而具有高等动物细胞表达的产物基本一致的免疫原性和生物活性。 植物生物反应器的表达产物具有无毒性、无副作用，无残存d n a 、无潜在致病致 癌性，安全可靠。用动物细胞作为生物反应器，动物本身携带有致病原；用微生物做反 应器，其本身的内毒素很难去除，两者均对人的健康有潜在的威胁。 1 1 2 植物生物反应器取得的进展 目前，在植物生物反应器领域已取得很大成绩，这主要表现在3 个方面，一是利用 植物表达抗体，二是利用植物生产疫苗，三是利用植物生产药用蛋白。 植物抗体( p l a 砸b o d y ) ：抗体( a n 曲o d y ) 是动物体液中的一系列球蛋白，称为免疫球 蛋白( i m m u i l o 四o b i l l i n ，i 曲，它们可介导动物的体液免疫反应。在植物体内表达编码抗 体或抗体片段( 如f a b 片段和f v 片段) ，获得的产物就称为植物抗体【5 j 。植物抗体最大的 优点是使生产抗体更加方便和廉价，尤其在生产单克隆抗体方面，利用植物要比杂交瘤 细胞成本低廉的多。目前，利用转基因植物表达的抗体包括完整的抗体分子、分泌型抗 体i g a 、i g g 、单链可变区片段( s c f v ) 、f a b 片段、双特异性s c f v 片段以及嵌合型抗体等 不同类型的抗体。 口服疫苗f e d i b l ev a c c i n e ) ：传染病严重威胁着人类的生命和健康，一直以来人类获 得免疫预防主要通过疫苗接种，但在发展中国家，昂贵的疫苗造成数百万人尤其是儿童 依然死于传染病。目前利用植物作为生物反应器生产口服疫苗，很大程度的降低了疫苗 的生产成本，并且研究表明植物疫苗确实可以使人和动物产生相应的免疫应答。目前在 植物中表达的疫苗有几十种，包括乙肝病毒表面抗原( h 印a t i t i sbs u 疏c ea i l t i g e n ， h b s a g ) 、诺沃克病毒叫o n 砌kv i m s ) 外壳蛋白、大肠杆菌热不稳定肠毒素b 亚基( lt b ) 、霍乱毒素的a ，b 亚基( c t a ，b ) 、冠状病毒( c o r o n a v i m s ) 的免疫原糖蛋白s 多 肽、狂犬病毒糖蛋白、口蹄疫病毒( r t a n d m o u t hd i s e a s ev i m s ) 抗原、水貂肠炎病毒抗 原、犬细小病毒抗原【“1 3 】。 利用植物生产药用蛋白：植物作为生物反应器除了可以生产抗体疫苗外，还可表达 细胞因子、酶及其它药用蛋白和生物活性肽等。但是利用植物生产上述细胞因子、酶， 药用蛋白和生物活性肽等需要下游纯化，只有它占总可溶性蛋白( t 0 t a ls o l u b l e p r 0 1 c i n ， t s p ) 的1 以上才具有商业开发价值。 1 1 3 植物生物反应器存在的问题 外源蛋白表达水平低：这个问题普遍存在于转基因植物的研究中，对于植物疫苗来 说，表达量必须达到较高水平，才能达到口服免疫的效果，而对于在植物中表达需要纯 化的抗体以及药用蛋白时，只有当其超过总可溶性蛋白的1 ，才具有商业开发价值。 为了进一步提高外源蛋白在植物细胞中的表达水平，人们设计了很多策略：( 1 ) 蛋白质的 靶向定位。外源基因在植物体中转录和翻译， 表达的外源蛋白能否在植物细胞内稳定 存在以及积累量的多少是植物生物反应器中需要考虑的一个重要问题。研究发现，如 果给某些外源基因连接上适当的定位信号序列，使外源蛋白产生后定向运输到细胞内的 特定部位，例如，叶绿体、内质网、液泡等，则可明显提高外源蛋白的稳定性和累积量。 这是因为内质网等特定区域为某些外源蛋白提供了一个相对稳定的内环境，有效防止了 外源蛋白的降解。在高等植物叶绿体表达外源基因是一种可供选择的转基因体系。叶绿 体环形基因在每个植物细胞中可达5 0 0 l0 0 0 个，可显著提高外源基因的拷贝数，从而 使基因表达产物成倍增加，甚至可达总可溶性蛋白的4 7 。s t a u b 等人将人的生长激素 基因导入烟草叶绿体中，其表达量占总可溶性蛋白的7 【1 4 l ；靶向定位在内质网的重组 蛋白的表达水平提高了1 0 1 0 0 倍，s c h o u t e n 等将加了一个内质网滞留信号肽的s c f v 基因转入烟草，其s c f v 的表达量占总可溶性蛋白的1 ，而对照不加信号肽的转基因烟 草的s c f v 的表达量只占总可溶性蛋白的o 0 1 【1 5 1 。( 2 ) 使用植物病毒作为表达载体，可 大大提高外源基因的表达水平。v e r c h 等利用t m v 为载体在植物中表达了大量的 s c f v ( 1 6 】。k u r n a g a i 等利用n 快速大量地生产h b s a g ，s c f v 等重组蛋白【1 。1 。( 3 ) 使 用植物偏爱的密码子，植物中遗传密码子的使用频率与动物、微生物不同。适当地对外 源基因的密码子进行替换能显著提高该基因在植物中的表达水平。( 4 ) 使用增强子序列， 利用组织特异性的启动子，优化先导序列，能够提高外源基因的表达水平。( 5 ) 使用核 基质附着区m a r 序列，可以使外源基因在染色质中形成独立的活跃转录单元不受周围 染色质结构的影响，从而提高外源基因的表达水平。( 6 ) 在拟南芥中生产a r c e l m ，同时 表达种子贮藏蛋白2 s 清蛋白的反义基因，结果使得a r c e l i l l 的表达量占种子总蛋白地4 ，利用这个策略显著提高了目的蛋白的表达量1 1 引。 下游生产成本高：尽管植物生产系统的上游生产成本比其它系统低，但是如果产物 需要提纯，则费用昂贵，因此在上游设计中应注意尽量简化下游的纯化成本。将外源蛋 白多肽与植物油脂蛋白( o i l b o d y ) 形成融合蛋白在植物中表达，利用油脂蛋白的亲脂 性，通过漂浮离心法进行纯化，使之成为一种高效的多肽纯化系统。利用( g v p 做为 融合蛋白，g v g v p 是一种人工合成基因编码的蛋白多聚体，低温时，g v g v p 能够以伸 展的分子形式存在，当升高温度超过转换温度时，这种多聚物就会疏水折叠成动态结构 b 螺旋，进而形成扭曲的纤丝，这一方法已成功运用于胰岛素的纯化u 。另外，有发 展前景的是利用毛状根系统生产外源多肽，即利用转基因植物将目标蛋白从植物根系分 泌到液体培养基中，这一系统已成功地生产g 1 l y s 1 3 单克隆抗体( 预防龋齿) ，产量可达 2 4m g l 。此外，运用植物悬浮细胞培养系统也可减少下游的纯化成本。 安全性问题：目前，转基因产品的安全性仍存在争议。例如在转基因研究中用于筛 选阳性克隆使用的选择标记基因多数为抗生素抗性基因，因此人们就会担心食用这种转 基因作物后也会产生抗生素抗性。另外，在植物抗体的研究中，抗体上都连有多聚糖， 由于动物源的抗体中多为唾液酸，这在植物中是缺乏的，而植物中富含木糖，这在动物 不存在，因此人们怀疑不同的聚糖结构会对植物抗体的免疫原性和致敏性产生影响。同 时，转基因植物具有潜在的破坏生态环境的可能性。 1 1 _ 4 植物生物反应器的未来 尽管转植物生物反应器仍存在一些问题尚待解决，但利用植物表达系统已成功地表 达了多种具有生理活性的外源多肽，而且有些已经进行了人体和动物的试验，其前景是 可观的， 随着人类基因组计划研究的不断深入，会发现有更多医疗价值的蛋白质，因 此植物植物表达系统将会成为最具潜力的生产系统来生产这些多肽。 1 2 农杆菌介导的真空渗透瞬时表达体系 本实验以植物作为反应器，利用农杆菌真空渗透瞬时表达体系，在烟草中建立并优 化该体系，并利用这一表达体系生产人酸性成纤维细胞生长因子。 依赖真空渗透的瞬时表达系统是1 9 9 7 年由k a p i l aj 等人发展完善的。目前利用该 体系已表达了许多重组蛋白。依赖真空渗透的瞬时表达系统与其他表达系统比较有如下 优点： 周期短。传统的稳定转化系统，从转化到长出转基因植株至少需要几个月甚至更长 的的时间，依赖病毒的瞬时表达系统仅仅需要2 4 周，然而农杆菌真空渗透的瞬时表达 系统仅仅需要3 5 天就可以获的目的蛋白，特别省时。 安全性好。由于该系统是在植物完全离体的条件下，完成蛋白的表达的，根本不用 担心基因扩散，病毒扩散对环境带来的影响。 操作简单、所需仪器设备普通、成本底。 1 3 人酸性成纤维细胞生长因子的结构特点、生物活性 1 3 1 成纤维细胞生长因子的主要成员、主要结构。 f g f 又称为肝素亲和生长因子( h 印“nb l i n d i n gg r o w mf 砒o r ，曲g f ) ，是一类通 过与细胞膜特异性受体结合发挥作用、调节细胞生长的肽类分子。目前已知f g f 家族 至少包括2 3 个因子或癌基因的产物，它们在一级的氨基酸序列上有一定的同源性及类 似的生物学功能。在脊椎动物f g f 家族中，其分子量为1 7 3 4k d ，并在结构上都有 1 2 0 个氨基酸残基构成且保守的核心，家族成员阊有3 0 7 0 的序列同源性【2 0 】。大多 数的成纤维细胞生长因子在分子结构上都 含有一个中心结构区，这一中心结构区一 般含有2 8 个高度保守的氨基酸残基，其中 有6 个氨基酸残基完全相同叫。中心区中 1 0 个高度保守的氨基酸残基在与f g f 受体 的相互作用中起重要作用晗引，f g f s 的中 心区形成1 2 个反向平行的s 折叠( 图1 ) ， 这些折叠结构对f g f s 的功能至关重要。 家族成员依末端氨基酸序列的不同，可 分为分泌型蛋白质如：f g f 3 、f g f 4 、f g f 5 、 f g f 6 、f g f 7 、f g f 9 、f g f l 5 等及非分泌型 蛋白质如：f g f l 、f g f 2 等，前者有经典的 信号序列而后者没有，如人f g f 一1 8c d n a 序列全长6 2 1 个核苷酸，n 端的前2 6 个氨基 酸为信号肽：还有一类f g f s 不含有信号肽 序列，但仍可通过某种途径被分泌到胞外。 4 图lf g f 的结构 ( a ) f g f 的一级结构。所有的f g f 都含有 保守的中心区，中心区包含保守的氨基酸 残基和结构组件；( b ) f g f 2 的三级结构。 如f c 匝1 ( a f g f ) 与f g f 2 ( b f g f ) 没有信号肽序列，它们不能通过内质网高尔基体途径分 泌到细胞外，但可通过其它途径被运到细胞外，如在热激情况下通过分子伴侣的帮助或 从损伤的细胞中直接释放。 按等电点的不同，分为碱性成纤维细胞生长因子( b a s i cf i b r o b l a s tf o 、v t l lf a c t o r ， b f g f ) 和酸性成纤维细胞生长因子( a c i df i b m b l a s tg r o 、v 血f h c t o r ，a f g f ) ，a f g f 的等电 点为5 7 ，b f g f 的等电点为9 6 。a f g f 与b f g f 均为分子量1 6k d ，不含糖的肽类，有 约5 6 相同氨基酸排列顺序。 1 3 _ 2 酸性成纤维细胞生长因子的基因和蛋白质结构 酸性成纤维细胞生长因子( a c i d 抽r o b l a s tg r 0 、v mf k t o r ，a f g f ) 是成纤维细胞生长因子 家族成员之一，对中胚层及神经外胚层来源的细胞具有促分裂作用。入的a f g f 基因位 于第4 号染色体上，为单拷贝基因，由两个大的内含子和三个外显予组成。a f g f 主要 分布于脑中，它以自分泌或旁分泌的方式作用于周围细胞，a f g f 蛋白由1 5 4 个氨基酸 残基组成。 三维晶体结构测定表明，8 f g f 由3 组相似的折叠模式组成，每组又包含4 个反平 行的b 折叠，共有1 2 个b 折叠( 氨基酸位点：1 1 1 3 7 ) ，这种结构决定了其功能特异性。 a f g f 功能区主要包括肝素结合区、受体结合区和核转位区。 肝素结合区：肝素是一类糖胺聚糖，可增加a f g f 的稳定性，防止a f g f 被热、极端d h 变性及蛋白酶水解。人们发现a f g f 与肝素结合后活性可增加1 0 1 0 0 倍，赖氨酸等碱性 氨基酸在肝素与肝素结合蛋白的相互作用中起重要作用。肝素结合区是碱性氨基酸的富 集区，这些带正电荷的碱性残基很可能在与带负电荷的肝素结合中发挥作用。a f g f 、肝 素、a f g f 受体( a f g f r ) 胞外域的分子模型表明，a f g f l o 1 2b 折叠可能在a f g f 与肝素 a f g f 胞外域复合体的相互作用中扮演着重要角色 2 3 1 。甘氨酸盒( g 1 p v r g ) 决定了a f g f 与 肝素硫酸盐f g f r 复合体结合的特异性【2 4 1 。 受体结合区：晶体结构分析发现，a f g f 与f g f r 2 的胞外域d 2 作用位点位于三维 结构中的p 1 、p 1 p 2 转角、p 3 p 4 环和p 9 、p 1o p 1 1 环：p 1 2 与d 3 作用的位点位于p 4 p 5 以及n 端的5 9 位氨基酸残基【2 5 1 。 核转位区：n 端第2 1 2 7 位的a s n 1 姐l y s l y s 。p r o l y s l e u 序列对a f g f 的丝裂原活性 十分重要，删去该序列后a f g f 诱导d n a 合成和细胞增生能力丧失，但仍能与a f g f 受体 结合并诱导受体介导的酪氨酸磷酸化和c f o s 表达，此序列被称为核定位序列( n l s ) ，也 称核转位区。y 叩等 2 司认为n l s 有两个功能：一是介导a f g f 的核转位，即a f g f 与受体结合 后进入胞内，通过n l s 与其他胞内机制发生联系，引起a f g f 发生核转移；二是n l s 赢接 作为a f g f 诱导核分裂的信号。 1 3 3 酸性成纤维细胞生长因子的生理功能 a f g f 具有广泛的生物学作用，能影响多种细胞如问充质细胞( 血管内皮细胞、平滑 肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、角化细胞) 、内分泌细胞( 卵泡粒层细胞、肾上腺皮质 细胞) 、神经细胞( 星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元等) 的生长、分化及功能，在正 常生理和病理过程中参与生长发育和组织损伤的修复过程。 胚胎发育：在爪蟾，a f g f 及其受体集中分布于半球，可能作为一种中胚层诱导因 子，诱导中胚层的形成。研究显示，在胚胎发育的早期阶段有a f g f 的表达。a f g f 存 在于卵母细胞和受精卵中，在中胚层形成期间发挥作用。a f g f 在原肠作用期间，由胚 胎基因组表达，之后集中在正在形成中的中胚层中表达。 创伤愈合及组织修复：a f g f 能主动与伤口附近细胞膜上的特异性受体相结合，诱 导伤口附近细胞分裂、增殖，促进皮肤和黏膜创面愈合并减少疤痕收缩和皮肤的畸形增 生，快速高效修复创伤。 对神经生长和营养作用：a f g f 对多种体外培养神经元有神经营养作用，表现为促 进神经元的存活和突起生长，这些神经元包括中枢性的，如皮质、海马、纹状体、隔、 下丘脑、脊髓等神经元：也有外周性的，如睫状神经结、视网膜神经节细胞；此外，a f g f 对神经胶质细胞也有促分裂作用。 a f g f 促进骨骼生长：a f g f 可刺激骨生成、细胞增殖和毛细血管生成。在活体实验 中，a f g f 可促进骨长入多孔羟基磷灰石，使脱矿骨基质植入后新形成骨量明显增加， 植入a f g f 可促使大鼠颅骨缺损出现骨愈合。 a f g f 促进睫状体上皮细胞生长：f g f 有酸性和碱性两种基本类型，即a f g f 和b f g f ， 已证实眼内存在两类a f g f 。n 0 j i 等【2 7 】用原位杂交的方法查明，视网膜、脉络膜及睫状体 的色素上皮细胞、角膜及晶体的上皮细胞等都可表达a f g f 基因，而b f g f 基因只在光感 受细胞内合成。已经发现a f g f 对多种眼细胞的生理及病理起着重要作用【2 8 9 】，通过细 胞形态的观察、细胞计数及 f r r 比色分析，表明a f g f 对p e 细胞增殖及活力具有明显的 促进作用。 2 1 实验材料 2 1 1 植物材料： 2 材料与方法 野生型烟草 k o 砌n 口6 e 砒b 册面目口由英国s a i n s b u r y 实验室b a u l c o m b 教授惠赠： 转p v y 沉默抑制因子h c - p r 0 的转基因烟草 k o 妇 d6 p n 砌m 切2 弘胁- p 阳由s w e d i s h u 1 1 i v e r s 时o f a 鲥c u l t u r a ls c i e n c e s 的遗传中心惠赠。 2 1 2 质粒和菌种 质粒p c 伽曲i a l 3 9 0 及p c _ 址忸n 1 3 0 3 由澳大利亚国际农业分子生物学应用中心惠赠： 质粒p w e n 5 f 由中科院遗传与发育研究所薛永彪博士惠赠： 质粒p e t 3 c - h a f g f 由暨南大学生物技术中心提供； 大肠杆菌菌种d h 5 a 为本实验室保存； 农杆菌菌种g v 2 2 6 0 由俄勒冈大学j 锄e sc c a r r i n 群o n 博士惠赠。 2 1 3 试剂、酶类及抗体 d n ac 圯le x n 认c o n t 凝胶回收及p c r 产物回收试剂盒购自上海生工生物工程 公司： t a 克隆试剂盒购自p r o m e g a 公司； 核酸限制性内切酶k p n1 、s p ei 、h i i l di i i 、e c o ri 来自大肠杆菌碱性磷酸酶( b a p ) ， t 4 d n a 连接酶，1 均酶( o n es h o r t l a p c r m i x ) 购自大连宝生物公司； e l i s a 用一抗为本实验室自行制备的小鼠抗人a f g f 多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物 酶( h r p ) 标记的山羊抗小鼠i g g ，购自北京中山生物技术有限公司。 2 1 4 培养基 l b 液体培养基( 1 l ) ： 1 0 9 胰蛋白胨，5 9 酵母提取物，1 魄n a c l ，p h 值为7 o 。 l b 固体培养基： l b 液体培养基中加入1 5 的琼脂粉。 发芽培养基( 1 2 m s o 培养基l l ) ： 2 1 5 9 m s 盐，o 0 5 9 肌醇，2 m g v b l ，0 5 m g 6 ，0 5 m g 烟酸，l o g 蔗糖，p h = 5 8 。 2 1 5 实验所用弓l 物 h a 引物( 引物l ，引物2 ) ，h 擞d e l 引物( 引物l ，引物3 ) ，s p h 曲e l 引物( 引物4 ，b 物5 ，引物6 ，引物3 ) 由上海生物工程公司合成，其中引物4 ，引物5 ，引物6 为嵌合g 物。 引物1 ： 引物2 ： 引物3 ： 引物4 ： 引物5 ： 引物6 ： g g l a c c a t g g c t aa r r a c a a g a a g c g a g c t c t l l a a t c a g a a g a g a c t g g c a g a g c t c t t a a a g t t c a r c c t l a t c a g a a g a g a c t g g c a t c t g c t t g t c g c t g t c g t c t c c g c t g a t 芦j c a t g g c t a a t t a c a a ga a g 1 ：a g c t c t c t c c a t c t aa t t a c t g 玑盯t c t c t c t g c t t g t c g c t g t c g g l a c c a t g g c t a c t c a a c g a a g g g c aaa c c c t a g c t c t c t c c a t ct a 2 2 实验方法 2 2 1 植物表达载体的构建 一、引物设计、p c r 扩增及产物的回收。 ( 一) 、利用引物设计软件p r i m e r5 o 设计引物，以p e t 3 c - h a f g f 为模板，以引物1 与 引物2 ，扩增h a 。 p c r 反应体系： o n es h o t l a p c r m i ) 【 2 5u l 弓l 物l ( 5 p m )3 肛l 引物2 ，( 5 州)3 山 质粒d n a ( p e t 3 c _ h a f g f )1 山 d d h 2 0 1 8u j p c r 参数：9 5 4 m i n ；9 5 5 0s e c ，6 0 5 0s e c ，7 2 5 0s e c ，共3 0 个循环；7 2 ， 2 1 1 1 i n 。 回收p c r 产物( 用购自t a k a r a 的d n ag e le x t r a c n o nk i t 试剂盒对p c r 产 物分别进行纯化，操作过程按说明书) ，称为p c r 产物1 。 ( 二) 、以p e t 3 c _ h a f g f 为模板，以引物1 ，引物3 ，扩增h 擞d e l 。 p c r 反应体系： o n es h o t l a p c r m i x2 5u 1 引物1 ( 5 脚)3 山 引物3 ( 5 “m )3 山 r 质粒d n a ( p e t 3 c h a f g f )1 山 d d h 2 01 8u l p c r 参数：9 5 4 i n i n ；9 5 5 0s e c ，6 0 5 0s e c ，7 2 5 0s e c ，共3 0 个循环：7 2 ， 2 m m 。 回收p c r 产物，称为p c r 产物2 。 ( 三) 、以p e t 3 c h a f g f 为模板，以引物4 与引物3 ，第一步扩增s p h a k d e l 。 p c r 反应体系： 0 n es h o t l a p c r m i x 2 5u l 弓i 物4 ( 5 u m )3u l 引物3 ( 5 )3u l 质粒d n a ( p e ”c h a f g f ) 1u l d d h 2 0 1 8u 1 p c r 参数：9 5 4 i i l i n ；9 5 5 0s e c ，6 2 5 0s e c ，7 2 5 0s e c ，共3 0 个循环：7 2 ， 2 m i n 。 回收p c r 产物，称为p c r 产物3 。 以p c r 产物3 为模板，以引物5 与引物3 ，第二步扩增s d h a k d e l 。 p c r 反应体系： o n es h o t l a p c r m i x 2 5u 1 引物5 ( 5 州)3u 1 引物3 ( 5 脚)3u 1 p c r 产物3 d 姐2 0 p c r 参数：9 5 4 m i n ；9 5 5 0s e c ， 2 l i n 。 1 山 1 8u l 6 2 5 0s e c ，7 2 5 0s e c ，共3 0 个循环；7 2 回收p c r 产物，称为p c r 产物4 ， 以p c r 产物4 为模板，以引物6 与引物3 ，第三步扩增s p h 擞d e l 。 p c r 反应体系： 0 n es h o t l a p c r m i x 2 5u l 引物6 ( 5 州) 3u 1 弓i 物3 ( 5 “m ) 3u 1 p c r 产物41u 1 d d h 2 0 1 8u l p c r 参数：9 5 4 m i n ；9 5 5 0s e c ，6 2 5 0s e c ，7 2 5 0s e c ，共3 0 个循环；7 2 2 m i n 。 回收p c r 产物，称为p c r 产物5 。 二、t a 克隆 9 分别取回收片段p c r 产物1 ，p c r 产物2 ，p c r 产物5 ，与t a 克隆载体p g e mt - e a s y 连接，反应体系如下： 2 x 1 、4 d n a 连接酶缓冲液5 “l 纯化的p c r 片段2 5 肛l p 衄mt _ e a s y ( 5 0 n g 肚1 ) o 5 i t 4 d n a 连接酶1 山 d d h 2 0l l 4 过夜，将连接产物转化感受态宿主细胞d h 5 ，从过夜培养的氨基苄青霉索抗性 的平板上取白色菌落，接种于5 i n ll b 培养液中( 含5 0 扯g ，m l 氨基苄青霉素，3 7 振荡 培养过夜，碱裂解法小量制备质粒，以i ：p n l ，s p e l 对制备的三种质粒分别酶切，筛选 出重组的t a 克隆。将h a ，h 擞d e l ，s p 冰d e l 的重组质粒分别命名为p t e - h a ，p t e h a k d e l 及p t e s p h a k d e l 。 三、重组质粒p m 3 9 0 r 的构建 ( 一) 插入片段的制备 用h i n d i i i 及e c o m 双酶切消化质粒p w e n 5 f ： 质粒p w j n 5 f 2 0 1 1 0 x mb u 自f e r 6u j h i n d i i i 3 且i e c o r j3 山 d d h 2 0 2 8m 3 7 放置3 小时，1 琼酯糖凝胶电泳，目的片段用d n ag e le x r r a c t l 0 n t 纯化回收。 ( 二) 载体制备 以e c o r j 与h i n d i i i 酶切消化重组质粒p m l 3 9 0 ，反应体系如下： 质粒p m l 3 9 0 2 0 1 1 0 x m b u 拄矗6u l h i n d i i i3u 1 e c o r i3u l d d h 2 02 8 儿l 3 7 保温3 小时，l 琼酯糖凝胶电泳，载体片段用d n ag e le x t r a c t i o n t 纯化回收。 ( 三) 连接及鉴定 建立以下连接反应体系： 制备载体 制备插入片段 1 0 x t 4d n a 连接酶b u 腩r 3u 1 1 3l l l 2u l t 4 d n a 连接酶2 山 1 6 放置过夜，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞d h 5 ，将转化菌液涂l b 平 板上( 含5 0 蚓l i l l k a i l a 1 ) i n ) ，3 7 过夜培养，挑取平板上长出的单菌落接种于5 血l b 培养液中( 含5 0 p g m lk a n 锄y c i n ) ，3 7 振荡培养过夜，碱裂解法小量制备质粒，用e c o 及h i n d i i i 双酶切鉴定，将重组质粒命名为p m l 3 9 0 r 。 四、表达载体p m 3 9 0 h a ，及p m 3 9 0 h a k d e l ，p m 3 9 0 - s p h 擞d e l 的构建 ( 一) 插入片段的制备 将t a 克隆载体p f e h a ，p t e h a k d e i ，及p t e l s p h a k d e l 分别用k p n i 及s p e i 双酶切： 质粒d n a 1 0u l l o x m b 斌矗 4u l k p n i2 “1 s p e i 2 “l d d h 2 02 2 山 3 7 放置6 小时，l 琼酯糖凝胶电泳，目的片段用d n a g e l e x i a c t i o n t 纯化回收。 ( 二) 载体制备 将质粒p m 3 9 0 r 以k p i l i 及s p e i 酶切： 质粒p m 3 9 0 r 1 0 山 1 0 x m b u 丑h 4 儿l k p n j 2p 1 s p e i 2m d d h 2 02 2 “l 3 7 放置6 小时，l 琼酯糖凝胶电泳，目的片段用d n ag e le x t r a c t l 0 n t 纯化回收。 ( 三) 连接及鉴定 建立以下连接体系： 制备载体2 山 制备插入片段1 3 山 1 0 x t 4d n a 连接酶b u 虢r 2 5 山 t 4 d n a 连接酶1 “1 d d h 2 06 5 山 1 6 放置过夜，将连接液转化大肠杆菌感受态细胞d h 5 ，将转化菌液涂于l b 平 板上( 含5 0 p g m l k a l l 锄y c i l l ) ，3 7 过夜培养，挑取平板上长出的单菌落接种于5 m l l b 培养液中( 5 0 肛g m lk a l l 锄y c i l l ) ，3 7 振荡培养过夜，碱裂解法小量制备质粒，用k p n i 及s p e i 双酶切鉴定，将重组质粒分别命名为p m 3 9 0 h a ，及p m 3 9 0 - h 擞d e l ，p m 3 9 0 一 1 1 s p h l k d e l 。 ( 四) 农杆菌转化 利用冻融法将质粒p m l 3 9 0 h a ，及p m l 3 9 0 一h a k d e l ，p m l 3 9 0 s p h 擞d e l 分别 转入农杆菌菌株( 2 2 6 0 ，利用p c r 鉴定，确定所得到的菌落为含目的质粒的转化株。 五、d n a 测序 重组过程中，经过p c r 扩增的序列均进行了测序，测序工作由上海生工公司完成。 2 2 2 利用真空渗透的方法农杆菌介导的瞬时表达体系 一、植物材料准备： 1 将烟草种子播种于1 2m s 培养基中。 2 一周之后转移移至盆中。 3 叶片直径约3 厘米时，真空渗透。 二、菌液的准备： 1 挑菌落于5m l 液体l b 培养基中，加相应抗生素，过夜培养。 2 将菌液转移到m 培养基中，培养至对数生长期，o do _ 8