（果树学专业论文）橄榄叶总黄酮代谢和提取工艺优化及其抗氧化作用.pdf

福建农林大学硕士学位论文 缩写词表 缩略词表 缩略词英文全称中文全称 p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a 苯丙氨酸解氨酶 c 4 hc i n n a n u i ca c i d4 - h v d r o x y l a s e 肉桂酸一4 一羟化酶 4 c l 4 - - c o u m a r a t e ：c o a l i g a s e 4 一香豆酸辅酶a 连接酶 1 d p p h 1 , 1 一d i p h e n y l 一2 一p i c r y l h y d r a z y l1 ，1 一二苯基2 一三硝基苯肼 b h t 2 ，6 一d i t e r t 一r l 一4 2 ，6 一二叔丁基一4 一甲基苯酚 m e t h y i p h e n o l p v p p o l y ( v i n y lp y r r o l i d o n e ) 聚乙烯吡咯烷酮 4 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中己作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 豁文作者季笔签名：姝癣 日期：如s ，f 加 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。口 不保密，本论文属于不保密。留 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：钛婢 日期：孰g ，2 口 指导教师亲笔签名： 槲 日期： 杪彦多印 福建农林大学硕士学位论文中文摘要 摘要 本文对橄榄叶总黄酮的测定方法、提取工艺和抗氧化能力进行了研究；同 时以檀香、长营和惠圆3 个橄榄品种的叶片为试材，在不同的时期分析了总黄酮、 花青苷、简单酚类的含量和p a l 、c 4 h 、4 c l 活性的变化情况。研究结果如下： 1 通过各种定性颜色反应，初步确定橄榄叶中存在黄酮类化合物，其类型 可能为黄酮及黄酮醇。采用分光光度法定量分析橄榄叶总黄酮，方法具有较好的 重现性和准确性。 2 实验采用乙醇加热回流提取，应用石油醚预处理，通过单因素试验、正 交试验及方差分析，确定了总黄酮热回流提取最佳条件：乙醇浓度为6 0 ，提取 温度为8 0 ，提取时间为1 5h ，液固比为2 0 ：1 。 3 对檀香、长营和惠圆3 个橄榄品种叶片中总黄酮、花青苷和简单酚类含 量不同时期的测定结果表明：花青苷可能不是影响总黄酮合成的主要因素，简单 酚类和总黄酮存在一定的依存关系。对檀香、长营和惠圆3 个橄榄品种叶片中 p a l 、c 4 h 和4 c l 活性不同时期的测定结果表明：p a l 、c 4 h 、4 c l 三者间呈 同步变化；总黄酮含量与p a l 、c 4 h 及4 c l 活性呈显著正相关，相关系数分别 为o 9 1 3 2 - 0 9 3 8 9 、o 7 5 1 8 - 0 7 8 8 和0 8 0 1 - 0 8 0 6 ；p a l 在总黄酮合成过程中可 能起到重要作用。 4 与其他植物叶片比较，橄榄叶片总黄酮含量为3 0 9 - 5 6 3 ，处于中 上水平。檀香叶片的总黄酮含量明显高于长营和惠圆，三个品种均以5 月叶龄的 叶片总黄酮含量最高。如果作为提取黄酮的原料，宜在1 2 月到1 月间采摘约5 月9 月左右叶龄的叶片。 5 对橄榄叶总黄酮提取物进行了抗氧化能力的测定，结果表明橄榄叶总黄 酮提取物还原能力和清除o h 的能力低于b h t ，但强于v c ；清除0 2 。的能力高 于b h t 和v c ；清除d p p h 的能力远高于b h t ，在低浓度时，低于v c ，高浓 度时，则相反。从橄榄叶黄总酮清除各种自由基的i c 5 0 来看，清除超氧阴离子的 能力最强，其次是羟自由基，最后是d p p h 。这表明橄榄叶总黄酮提取物具有良 好的抗氧化能力。 关键词：橄榄叶；总黄酮；提取；合成代谢规律；抗氧化 福建农林大学硕士学位论文 英文摘要 s t u d i e so nm e t a b o l i s m ，e x t r a c t i o nt e c h n o l o g ya n d a n t i o x i d a t i o no ft o t a lf l a v o n o i d si nc h i n e s ew h i t eo l i v el e a v e s t a k i n gt h el e a v e so fc h i n e s ew h i t eo l i v ea sm a t e r i a l ，t h ep a p e rs t u d i e dt h e m e t h o d so fa n a l y z i n ga n dd e t e r m i n a t i o no ft o t a lf l a v o n o i d s ，t h eo p t i m u me x t r a c t i o n t e c h n i q u e so ft o t a lf l a v o n o i d sa n dt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so ft o t a lf l a v o n o i d s p a l a c t i v i t y , c 4 ha c t i v i t y , 4 c la c t i v i t y , t h ec o n t e n t so ff l a v o n o i d s ，a n t h o c y a n i na n d s i m p l ep h e n o l si nt a n x i a n g ，h u i y u a na n dc h a n g y i n gw e r ea l s od e t e r m i n e dd u r i n g d i f f e r e n ts t a g e s ，a n dt h ed y n a m i cc h a n g e so ft h o s ew e r ea n a l y z e d t h er e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： 1 t h eq u a l i t a t i v ea n a l y s i so ft o t a lf l a v o n o i d sb yc o l o rr e a c t i o ns h o w e dt h a tt h e e x t r a c t i o ns o l u t i o nf r o mc h i n e s ew h i t eo l i v el e a v e sc o n t a i n sf l a v o n e sa n df l a v o n o l s s p e c t r o p h o t o m e t r yw a sa p p l i e dt od e t e c tt h ec o n t e n to ft o t a lf l a v o n o i d si n t h e e x p e r i m e n t ，t h em e t h o dp r e s e n t e dg o o dr e p r o d u c i b i l i t ya n da c c u r a c y 2 t h ee x t r a c t i o np r o c e s so ft h et o t a lf i a v o n o i d sf r o mt h el e a v e so fc h i n e s e w h i t eo l i v eb ys i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a l t e s tw a ss t u d i e d t h eo p t i m u me x t r a c t i o n c o n d i t i o nw a se s t a b l i s h e da sf o l l o w s ：s o l v e n t6 0 ( v me t h a n o l ，e x t r a c t i o n t e m p e r a t u r e ( w a t e rb a t h ) 8 0 c ，e x t r a c t i o nt i m e1 5 h ，a n dr a t i oo fl i q u i dt om a t e r i a l ( m e g ) 2 0 ：1 3 t a k i n gt h el e a v e so ft a n x i a n g ，h u i y u a na n dc h a n g y i n ga sr a wm a t e r i a l ，t h e e x p e r i m e n t r e s u l t ss h o w e dt h a ta n t i o x i d a n tm i g h tn o tb et h em a i nf a c t o ro f i n f l u e n c i n gt o t a lf l a v o n o i d st os y n t h e s i z e t h e r ew a sc e r t a i nd e p e n d e n c yr e l a t i o n b e t w e e nt o t a lf l a v o n o i d sa n ds i m p l ep h e n o l s t h e r ew e r es y n c h r o n o u st r e n d so f c h a n g ea m o n gp a la c t i v i t y , c 4 ha c t i v i t ya n d4 c la c t i v i t y t h ec o n t e n to ft o t a l f l a v o n o i d sw a sc o r r e l a t e dp o s i t i v e l y 、析t hp a la c t i v i t y , c 4 ha c t i v i t ya n d4 c l a c t i v i t y t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tb e t w e e nf l a v o n o i d sa n dp a l r a n g e df r o m0 913 2t oo 9 38 9 t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tb e t w e e nf l a v o n o i d sa n dc 4 h r a n g e df r o m0 7 518t oo 7 8 8 t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tb e t w e e nf l a v o n o i d sa n d4 c l r a n g e df r o mo 8 0 1t o0 8 0 6 p a lm i g h tp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nf l a v o n o i d ss y n t h e s i z e d 4 c o m p a r e d 晰ml e a v e so fo t h e rp l a n t s ，t h ec o n t e n to ft o t a lf l a v o n o i d si n 2 福建农林大学硕士学位论文 英文摘要 l e a v e so fc h i n e s ew h i t eo l i v ew a sal i t t l eh i g h e rt h a nm i d d l i n gw h i c hr a n g e df r o m 3 0 9 t o5 6 3 t h ec o n t e n to f t o t a lf l a v o n o i d si nt a n x i a n gw a sh i g h e rt h a nh u i y u a n a n dc h a n g y i n g ，a n dl e a v e sw h i c hh a da b o u tf i v em o n t h so fl e a fa g eh a dt h eh i 曲e s t c o n t e n to ft o t a lf l a v o n o i d sa m o n gt h r e ev a r i e t i e s i fw eu s e dt h el e a v e so fc h i n e s e w h i t eo l i v ea sm a t e r i a lt oe x t r a c tf l a v o n o i d s ，t h eb e s tt i m ef o rp i c k i n gl e a v e sw e r e f r o md e c e m b e rt oj a n u a r y , a n dt h eb e s tl e a fa g ew a sb e t w e e nf i v em o n t h sa n dn i n e m o n t h s 5 t h eo x i d a t i o n r e s i s t a n te x p e r i m e n t sw e r es t u d i e db yt o t a lf l a v o n o i d se x t r a c t e d f r o ml e a v e so fc h i n e s ew h i t eo l i v e ，i t sa b i l i t yo fr e d u c i n gp o w e ra n ds c a v e n g i n g o h w e r es t r o n g e rt h a nt h a to fv c ，b u tl o w e rt h a nt h a to fb h t , i t sa b i l i t yo f s c a v e n g i n g0 2 。 w a s s t r o n g e rt h a nt h a to fb h ta n dv c ，i t sa c t i v i t yo fs c a v e n g i n gd p p hw a ss t r o n g e r t h a nt h a to fb h t , a n dw h e ni t sc o n c e n t r a t i o ni sl o w e r , i t sa c t i v i t yo fs c a v e n g i n gd p p h w a sl o w e rt h a nt h a to fv c ，h o w e v e r , w h e ni t sc o n c e n t r a t i o nw a s h i g h e r , i t sa c t i v i t yo f s c a v e n g i n gd p p hw a ss t r o n g e rt h a nt h a to fv c ，b a s eo nt h e5 0 e f f e c t i v ed o s eo f s c a v e n g i n gf r e er a d i c a l sf o rt o t a lf l a v o n o i d s ，i t ss c a v e n g i n ge f f e c to n0 2 。w a st h e s t r o n g e s t ，t h es e c o n do ns c a v e n g i n g 。o h ，a n dt h ew e a k e s to ns c a v e n g i n gd p p h t h e r e s u l t ss h o w e dt o t a lf l a v o n o i d so fc h i n e s ew h i t eo l i v el e a v e sh a dw e l l o x i d a t i o n r e s i s t a n ta b i l i t y k e yw o r d s ：c h i n e s ew h i t eo l i v el e a v e s ( c a n a r i u ma l b u m ( l o u r ) r a e u s c h ) ；t o t a l f l a v o n o i d s ；e x t r a c t ；a n a b o l i s mr u l e ；a n t i o x i d a t i o n 福建农林大学硕士学位论文第一章引言 第一章引言 自由基是指能独立存在的，含有1 个或1 个以上的不配对电子的任何原子或原 子团。人体内总自由基中约9 5 以上属于氧自由基【1 1 。对于生物体而言，氧自由 基的产生与需氧细胞的正常代谢有关。细胞生长时会消耗大量氧，结果导致大量 氧自由基的产生，这种现象即称“氧化压力”( o x i d a t i v es t r e s s ) 。相应的，生物体内 的抗氧化物质、超氧化物歧化酶和过氧化物酶等通过一系列化学反应及时清除过 多的自由基，体内自由基的生成和清除处于动态平衡状态中。但在病理情况下， 由于各种原因导致自由基产生过多，或者机体抗氧化机制受到严重损害以致不足 以清除生理水平的自由基时，那么细胞氧化过程中产生的单线态氧( 1 0 2 ) 、超过氧 化物阴离子( 0 2 。) 、羟自由基( o h ) 以及过氧自由基( r o o ) 净水平增加。此类自 由基可与体内大量生命所必需的分子( 如核酸、蛋白质) 相作用，从而对后者产生 毒害作用【2 】。因此，为了减轻自由基的危害、提高人群的生活质量，寻找高效、 价廉、低毒的阻断自由基反应的抗氧化剂的研究工作就显得格外重要。 在生物体系中，抗氧化剂指其浓度比可被氧化的底物浓度低，而又能显著 的抑制或阻止这种底物被氧化的任何物质，抗氧化物可以从整体上降低癌症、心 血管疾病、关节炎等慢性病的发病率【3 1 。在食品体系中，抗氧化剂被定义为：能 够阻止或延缓食品氧化，以提高食品稳定性和延长贮藏期的食品添加剂【4 】。抗氧 化剂按来源可分为合成抗氧化剂和天然抗氧化剂两类。合成抗氧化剂女u b h a ( 丁 基羟基茴香醚) 、b h t ( - 丁基羟基甲苯) 、p g ( 没食子酸丙酯) 等。许多食品添加它 们以防止酸败和油脂类的氧化。由于担心合成抗氧化剂对健康的潜在危害，如 b h a 在动物实验中被发现可致癌【5 】。因此，在植物中寻找安全的天然抗氧化物质 的研究不断在进行着。 近年来，对其中的很有潜力作为天然抗氧化剂的黄酮类化合物的研究进展 非常迅速。在上个世纪6 0 年代发现黄酮类化合物的抗油脂氧化作用的基础上，8 0 年代以来，逐渐将黄酮类化合物的研究领域扩展到其清除自由基的能力、抗衰老 及老年病的防治功效等方面。下面简要介绍黄酮类化合物的研究进展。 福建农林大学硕士学位论文第一章引言 1 黄酮类化合物的概况和结构分类 黄酮类化合物( f l a v o n o i d s ) 又称黄酮体、黄碱素，是植物代谢过程中产生 的一类重要天然有机化合物，近3 0 年来一直是国内外研究开发的热剧6 1 。这类化 合物多存在于双子叶植物及裸子植物中。苔类中很少含有黄酮，而藻类、微生物、 细菌中没有发现黄酮类化合物存在。黄酮类化合物存在于多种植物的叶、皮、根 和果实中，在植物体内大部分与糖成苷，一部分以苷元形式存在，它们对植物的 生长、发育、开花、结果以及抵御异物的侵入起着重要的作用。在1 9 5 2 年以前， 黄酮类化合物主要指基本母核为2 一苯基色原酮的一系列化合物，是一类具有 c 6 c 3 c 6 基本母核的天然产物。由于这类化合物大多是黄色或淡黄色，因此被称 为黄酮。自1 8 1 4 年第一个黄酮类化合物白杨素( c h r y s i n ) 被发现后，新的黄酮类化 合物数量每年都在快速增长，至u 2 0 0 0 年总数己超过8 0 0 0 个【7 】。黄酮类化合物有 两类，一类属人工合成，一类是从植物中提取【9 】。与人工合成相比，植物黄酮类 化合物毒副作用小，生理活性强，在医药、食品和轻工等领域有着广阔的应用前 景和潜在的开发利用价值。因此，该类物质在植物中的分布规律及从植物中挖掘 新的黄酮资源，并对其生物活性进行深入研究和产品开发应用等，己成为该领域 研究的热点。 种类繁多的黄酮类化合物的共同结构特点为均有一个三环的核心，其基本 结构是由两个苯环( a 和b ) 通过中间杂环的吡喃或吡喃酮( c ) 相连接，如图 1 。 54 图1 黄酮类化合物基本结构 依据c 环2 ，3 ，4 位碳间是否存在单双键及b 环羟基的位置以及三碳链是否 构成环状等特点，可将主要的天然黄酮类化合物进行分类【1 0 1 ，如表1 。此外，尚 有由两分子黄酮或两分子二氢黄酮，或一分子黄酮及一分子二氢黄酮按c c 或 c o c 方式联接而成的双黄酮类化合物。另有少数黄酮类化合物结构很复杂。 6 福建农林大学硕士学位论文 第一章引言 表1 黄酮类化合物的分类 名称 三碳链结构名称 三碳链结构 黄酮类 二氢黄酮类 异黄酮类 黄烷3 ，4 二醇类 查耳酮类 花青苷类 双苯呲酮类 o o o o h o o h 黄酮醇类 二氢黄酮醇类 二氢异黄酮类 黄烷3 醇类 二氢查耳酮类 h 橙酮类 高异黄酮类 o o o o h h h c h o 7 福建农林大学硕士学位论文第一章引言 2 黄酮类化合物的生物活性 大量研究证明，黄酮类化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、 抗炎症、抗过敏、抗糖尿病并发症等多种生理活性及药理作用，且无毒无害，对 人类的肿瘤，衰老，心血管病等疾病的治疗和预防有重要的意义【1 1 m 】。 2 1 抗氧化作用 大量研究表明，很多天然植物中的黄酮类物质具有抗氧化作用。如茶叶提取 的茶多酚、法国海岸松的碧罗芷、葡萄籽和苹果的花青素、大豆的染料木素和大 豆素等都属于黄酮类化合物，其本身的抗氧化活性较强，与v c 、v e 同时存在时 具有协同效应1 0 h 9 1 。李云雁和宋光森研究发现板栗壳色素为黄酮类色素，抗氧 化活性比b h t 和v c 强，且具有很好的耐光性1 2 0 。王静和刘大川研究发现紫( 白) 苏叶黄酮类化合物有很好的清除超氧阴离子和过氧化氢能力，有较好的还原能 力，几乎可与人工合成抗氧化剂b h a 媲美【2 l 】。黄酮也是许多中草药提取物的抗 氧化活性成分，竹叶的总黄酮含量及其清除r o s 的能力与银杏叶中总黄酮具有可 比性，是一种优良的天然抗氧化剂新资源 2 2 1 。由于天然无毒性，一些人们长期 食用的植物所表现的抗氧化活性引起了研究者的极大兴趣，紫葡萄皮、山楂、菠 菜、甘薯叶、茄子皮和山西黑苦荞麸皮等提取物中分离的黄酮类物质均具有较强 的清除自由基能力1 2 3 之5 1 。 2 2 抗肿瘤功能 许多黄酮类化合物具有抗肿瘤功能。赵铁华等通过2 次重复实验，发现3 个剂 量的黄答茎叶总黄酮皆可抑制移植肉瘤s 1 8 瘤株的体内增殖，具有高效低毒的抗 肿瘤活性 2 0 q 。徐德平等发现分离纯化的大豆异黄酮对乳腺癌m c f 一7 细胞株，子宫 癌h e l a 细胞株和卵巢癌h o 8 9 1 0 细胞株均有抑制作用【2 7 】。李伟东等通过人肝癌细 胞( h e p 2 ) 进行体外实验，结果表明刺果甘草活性成分莫紫檀素、美迪紫檀素均 有一定的杀灭人肝癌细胞的作用，并且美迪紫檀素的作用强于莫紫檀素【2 羽。作 用之一是通过直接杀灭肿瘤细胞、阻止其分裂繁殖而达到抗肿瘤的作用；黄酮类 第二种抗肿瘤方式是通过增强其他物质的活性间接杀死肿瘤细胞；第三种方式主 要是指能减小甚至消除一些化学致癌物的致癌毒性【2 9 。3 0 】。 2 3 抗菌消炎作用 银杏叶中的提取物具有抗炎作用，可用于烧伤、烫伤、放射病、脓毒病、胰 8 福建农林大学硕士学位论文第一章引言 腺炎等急救作用。w a n g 等的试验表明樱桃花青素具有强的抗炎作用，可有效 缓解关节疼痛【3 l 】。从c o r d i ar e r b e n a c e a 的叶中提取的五甲氧基黄烷醇苷具有明 显的抗炎活性，可有效抑制海藻诱导的瓜水肿疾病【3 2 】。还有一些结构较为简单 的黄酮类化合物如芹黄素和栎精也显示出抗炎活性。 2 4 对心血管方面的作用 早在2 0 0 0 年前，槐花就作为心血管方面的用药记载于神农本草中，1 9 2 9 年发现了其中含有的芦丁是降低血管通透性，防止毛细血管脆性的活性化合物。 随着研究的发展，一系列对心血管活性的黄酮类被发现，从银杏叶中提取的黄酮 类化合物用于豚鼠离体心脏灌流，会引起冠状血管扩张，并对大鼠后肢血管有扩 张作用【3 3 1 。马日娜等通过实验证实广枣总黄酮( t p c a ) 对阿霉素( a d r ) 引起大鼠 心肌过氧化损伤具有保护作用【3 4 j 。刘惟莞等发现水杉总黄酮可在不明显降低血 压的情况下，防止肾性高血压大鼠左心室肥厚的发生，机制可能与对心肌细胞的 钙拮抗作用有关【3 5 刁6 1 。 目前，从自然界植物中不断研究发现有许多黄酮类物质有降血压、调血脂作 用。实验显示总黄酮类提取物( f e w g ) 能显著提高实验性高脂血症大鼠血清 h d l c 含量，同时显著降低血清t c 和t g 含量【3 7 1 。荞麦种子总黄酮能抑制喂饲 胆固醇和高脂血症大鼠血清t c 和t g 的升高，抑制肝脏脂质过氧化f 3 8 1 。显齿蛇 葡萄总黄酮( t f a g ) n - i n 显降低蛋黄性高脂血症小鼠血清t c ，t g 及m 值，对实 验性高脂血症鹤鹑可明显降低血清t c ，t g ，升高血清h d l c ，降低触值，明 显减少主动脉及肝脏t c 含量，抑制动脉粥样硬化及肝脏脂肪病变【3 9 1 。银杏叶黄 酮可明显降低血清t c 和t g 水平，有明显的降血脂作用【4 0 】。大豆总黄酮可降低 去卵巢大鼠血清t c ，l d l ，对减少肝脏胆固醇的蓄积有明显作用【4 1 】。 2 5 黄酮类化合物的其他作用 陈志武等对银杏叶总黄酮的镇痛作用进行了研究。在小鼠扭体模型上，皮下 注射银杏叶总黄酮2 0 - 8 0 m g k g ，可显著减少小鼠扭体数，并且呈依赖关系。在 小鼠热板模型上，皮下注射和侧脑室注射银杏叶总黄酮均可显著地延长小鼠舔足 潜伏期，结果表明银杏叶总黄酮有明显镇痛作用，其镇痛作用可能有中枢机制的 参与1 4 2 1 。宋必卫等对芦丁的镇痛作用研究结果表明芦丁有镇痛作用。其镇痛作 用比阿斯匹林强，但比吗啡弱【4 3 1 。敖英等通过研究发现水杉总黄酮有抗血小板 9 福建农林大学硕士学位论文第一章引言 聚集活性，改善血液流变性作用，其机制可能与抑制血小板释放反应，增加体内 n o 合成及c a 2 + 拮抗作用有关阻】。许东晖等发现水稻总黄酮对肝脏纤维化有明显 抑制作用，还可显著改善肝功能【4 5 】。此外，黄酮类化合物还具有延缓衰老，防 治骨质疏松，改善记忆，消除手脚麻木等作用【4 6 铆】。 3 黄酮类化合物生物合成的途径 1 9 5 7 年前后，示踪元素被应用于黄酮类化合物生物合成研究中【5 2 1 。多年的 研究表明，植物中的黄酮类化合物主要是通过苯丙烷类代谢途径形成，这个过程 是由来自莽草酸途径的莽草酸通过分枝酸、预苯丙酸经转氨作用形成苯丙酸，从 而进入苯丙烷类代谢途径。反式肉桂酸、香豆酸是这个途径的中间产物，这些酸 可以进一步形成c o a 酯再进一步转化为黄酮类【5 3 1 ，其中的莽草酸途径已被阐明 清楚【5 4 1 。 黄酮的基本骨架是由3 个丙二酰辅酶a ( m a l o n y lc o a ) 和1 个香豆酰辅酶 a ( c o u m a r o y lc o a ) 结合而产生的。经同位素标记实验证明，3 个丙二酰辅酶a 来 源于多酮化途径并通过环化作用生成黄酮类化合物骨架a 环，而b 环则来自于 香豆酰辅酶a 。其中，香豆酰辅酶a 是以苯丙氨酸和酪氨酸( 两者均来源于莽草 酸途径) 为前体合成的；参与这一过程的相关酶有苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 、肉桂酸 4 一羟化酶( c 4 h ) 和对一香豆酸辅酶a 连接酶( 4 c l ) ，可能还有酚酶( p h e n o l a s e ) 和 甲基转移酶( d m e t h y t r a n s f e r a s e ) 等。随后，3 个丙二酰辅酶a 和1 个香豆酰辅酶 a 在查耳酮合成酶( c h s ) 的作用下生成查耳酮，再在查耳酮异构酶( c h i ) 的作用下 形成黄烷酮( 或二氢黄酮) ，其他黄酮类化合物大都是经过二氢黄酮在各种酶的作 用下合成的【5 5 】。 但在很多研究中也存在不同的结果，在茶树的枝条中，莽草酸作为儿茶素和 黄酮类化合物的前体要比l 苯丙氨酸和桂皮酸更为有效5 6 1 。s t a f f o r dha 等研究 认为黄酮类化合物的生物合成是由多酶体系的作用，而且提出黄酮生物合成代谢 的底物并不仅限于苯丙氨酸和肉桂酸 5 7 - 5 8 】。方从兵等以野葛细胞悬浮系为实验体 系，研究结果表明与黄酮类化合物生物合成有关的物质一香豆酸是以预苯酸为 前体化合物，越过了苯丙氨酸和桂皮酸( 或肉桂酸) 的中间代谢过程【5 9 1 。这些研究 结果均显示黄酮类化合物的生物合成仍存在其他途径的可能性 6 0 旬】。 1 0 福建农林大学硕士学位论文第一章引言 4 植物苯丙烷类代谢途径的研究现状 黄酮类化合物生物合成途径是苯丙烷类代谢途径的一个重要分支，其中苯丙 烷类代谢途径是指从苯丙氨酸到羟基肉桂酸( 或香豆酸) 及其衍生物的合成途径， 该途径广泛存在于植物中，与酚酸、类黄酮等酚类物质和木质素、羟基肉桂酸酯、 木聚素等许多代谢物的合成有关。 研究发现有多种酶参与苯丙烷类代谢途径，主要有苯丙氨酸解氨酶( p a l ) ， 肉桂酸一4 一羟化酶( c 4 h ) ，4 一香豆酸辅酶a 连接酶( 4 c l ) ，查耳酮合成酶( c h s ) ， 甲基转移酶( o m t ) ，酚酶等。己有大量研究证实p a l ，c 4 h ，4 c l 是苯丙烷类代 谢途径的三个关键酶 6 4 - 6 5 j 。 k o u l o l 和c o m a 发现了苯丙烷类代谢途径的第一个酶苯丙氨酸解氨酶 ( p a l ) 6 5 】。p a l 存在于植物及某些真菌、细菌和藻类中，它催化l - 苯丙氨酸非氧 化性脱氨生成反式肉桂酸( c i n n a m i ca c i d ，c a ) ，c a 是植物苯丙烷类次生物质如 黄酮、香豆素、木质素及某些酚类的生物合成起始物，因而该酶在植物次生代谢 中具有极其重要的位置。有研究表明，不同植物中p a l 活性不同，如水稻叶的 p a l 活性远比小麦的高。在同一株植物中，不同的组织部位p a j l 活性也不同 6 6 - 。 植物的p a l 主要分布于叶绿体和细胞质、白色体、线粒体、乙醛酸体等一些细 胞器中【6 7 1 。随着对酶的分离纯化、组成结构、催化过程与化学机制以及基因克 隆等方面研究取得了较大进展，研究表明p a l 酶蛋白一般是一个分子质量为 2 2 0 - 、- , 3 3 0k d 的酸性蛋白，由4 个亚基组成，多数p a l 有均一的亚基，分子质量 为5 5 8 8k d ，但不同植物稍有差异。 肉桂酸一4 一羟化酶( c 4 h ) ，又称反式肉桂酸一4 一单氧化酶，c 4 h 催化苯 丙烷类途径中的第二步反应：反式肉桂酸对位羟基化的反应。该酶由r u s s e l l 和c o r m 首次从豌豆芽中发现，此后该酶的活性在许多植物中陆续被检出【6 8 1 。c 4 h 是一种细胞色素p 4 5 0 的单氧化酶复合物，催化作用依赖于n a d p h 和0 2 ，对底 物具有高度的专一性，能被顺式肉桂酸和反式一4 一香豆酸所抑制。苯乙酸、苯 甲酸、水杨酸以及苯丙氨酸的氧化与该酶无关【6 9 】。c 4 h 是植物中最主要的、分 布最广泛的p 4 5 0 之一，与其他p 4 5 0 相比，c 4 h 具有在植物各组织中均具有很 高活性的特点。在某些植物中，该酶和p a l 一样，常由于植物组织的损伤、光 照或培养细胞的老化等因素的影响而诱导活性。 福建农林大学硕士学位论文第一章引言 在植物体内，从苯丙氨酸生成羟基桂皮酸以后，代谢途径可以分成木质素、 类黄酮以及脂类三大支路。这三条途径各自都必须经过一个共同的活化中间产 物一香豆酸c o a 酯。4 一香豆酰辅酶a 连接酶( 4 c l ) 是苯丙烷类代谢途径中对香 豆酸盐的还原基团起活化作用的代谢酶，4 c l 能催化香豆酸等c o a 酯的合成。 此酶由m a n s e l l 等首次从嫩柳枝的形成层中提取出来的【7 0 1 。 综上所述，一般意义上的苯丙烷类代谢途径是由上述的3 个酶即p a l 、c 4 h 和4 c l 催化的。 5 研究展望 近年来形成了对黄酮类化合物的研究热潮。但是，迄今为止，以果树为试材 进行其黄酮含量动态变化及合成代谢规律的研究却很少，同时，这也将是今后研 究的焦点之一，加强这方面的理论研究工作，有助于挖掘果树除食用外的利用价 值，加速黄酮类化合物资源的开发与利用，促进果树产业的可持续发展。 6 本研究的意义 黄酮类化合物( f l a v o n o i d s ) 广泛分布于植物界，存在于植物的叶、花、果 等组织中。几乎绝大多数植物都能合成，大多数以苷的形式存在，少数以游离形 式存在。许多黄酮类化合物除药用价值外，其中的部分黄酮类化合物( 特别是来 源于药食两用的植物) 显然可以作为抗氧化剂应用于食品中。近年来，国内外对 橄榄的研究主要集中在木犀科( o l e a c e a e ) 木犀榄属( o l e al ) 的欧橄榄( 木犀 榄) o l e a e u r o p a e al 。现代生物分析研究表明【7 1 。7 3 1 ，欧橄榄叶中活性物质主要有 橄榄多酚、黄酮类、裂环烯醚萜类( 包括橄榄苦苷) 、双黄酮等，并且其抗氧化生 物活性物含量高于欧橄榄果和茎。而我国传统中药所用的橄榄为橄榄科植物橄榄 c a n a r i u m a l b u m ( l o u r ) r a e u s c h 的果实，与欧橄榄( 木犀榄) o l e a e u r o p a e al 不是同 科同属植物，而且二者差别也未见文献报道。本文研究的橄榄为橄榄科橄榄属植 物。福建作为我国橄榄的主要产区之一，传统生产上以收获果实为主，并将其作 为药、食两用植物，如何开发利用橄榄叶黄酮类化合物，是一个值得深入研究的 课题。橄榄叶总黄酮是指从橄榄叶中提取的黄酮类化合物，本研究拟以橄榄叶总 黄酮为研究对象，对其进行体外抗氧化试验，初步评价其抗氧化活性，同时对橄 榄叶总黄酮含量的动态变化和其代谢规律进行初步研究，为开发橄榄叶这一宝贵 的植物资源提供理论依据。 1 2 福建农林大学硕士学位论文第二章橄榄叶总黄酮的定性和定量分析 第二章橄榄叶总黄酮的定性和定量分析方法的确定 目前在植物成分定量分析中使用的方法有分光光度法、高效液相色谱法和气 相色谱法。分光光度法是根据比尔定律，以选定的标准样品，做出标准曲线，由 吸光系数与溶液浓度成正比的特性，测出溶液的吸光度从而求出溶液浓度，目前 使用较广。高效液相色谱法相对于比色法来说设备要求较高，操作费用昂贵，应 用不普遍。黄酮类化合物的沸点较高，难于气化，故气相色谱法不适合用来测定 黄酮。本章以檀香橄榄为试材，定性研究了橄榄叶中是否含有黄酮类化合物及类 型，并判定分光光度法是否适合定量测定橄榄叶中提取的黄酮类化合物即总黄 酮。 1 材料与方法 1 1 材料 橄榄叶于2 0 0 7 年3 月1 日采自福州保福山的1 5 年实生橄榄树，品种为檀 香，随机采叶片5 0 张。供试样品以蒸馏水冲洗干净，晾干后于1 0 5 的烘箱中 2 0m i n 杀酶，再在6 5 条件下烘干至恒重，然后粉碎，过6 0 目筛备用。 1 2 方法 1 2 1 橄榄叶总黄酮提取液的制备 将干燥的橄榄叶粉末准确称重5 0g ，加入5 0m l 体积分数为5 0 的乙醇溶 液，在7 0 的恒温水浴中，回流浸提1 0h ，过滤得到总黄酮提取液。 1 2 2 橄榄叶总黄酮的定性分析方法的确定 显色反应是检查是否有黄酮类化合物的最常用方法。黄酮类化合物分子中酚 羟基和丫吡喃酮环能与某些还原剂产生颜色反应，与某些金属离子生成有色的络 合物，各类黄酮类化合物的显色反应如表2 1 【7 4 】。 福建农林大学硕士学位论文第二章橄榄叶总黄酮的定性和定量分析 + 表不有荧光；- ”表示无变化，下同 ( 1 ) 盐酸锌粉试验 取橄榄叶片的提取液约l m l 于试管中，加入少量锌粉，然后再滴入数滴浓 盐酸，观察记载显色情况( 另一试管提取液仅加入盐酸进行对比，以排除本身颜 色干扰) 。 ( 2 ) 醋酸镁试验 用玻璃棒蘸取提取液涂于滤纸上，吹干，喷1 醋酸镁的乙醇溶液，吹干后 于紫外灯下观察记载显色情况。 ( 3 ) 三氯化铝试验 用玻璃棒蘸取提取液涂于滤纸上，吹干，喷1 a 1 c 1 3 的乙醇溶液，吹干后 于紫外灯下观察记载显色情况。 ( 4 ) 氢氧化钠试验 用玻璃棒蘸取提取液涂于滤纸上，吹干，喷4 氢氧化钠溶液，吹干后观察 记载显色情况。 ( 5 ) 浓硫酸试验 取橄榄叶片的提取液约l m l 于试管中，加入浓硫酸数滴，混匀，喷于滤纸 上，吹干后观察记载显色情况。 1 2 3 橄榄叶总黄酮的定量分析方法的确定 分光光度法是定量分析的一种最常用方法。该法具有操作简便、快速、仪器 设备不复杂、应用广泛等特点。 黄酮类化合物在亚硝酸盐存在的碱性条件下与a l ( n 0 3 ) 3 形成稳定的红色络 1 4 福建农林大学硕士学位论文第二章橄榄叶总黄酮的定性和定量分析 合物。黄酮类化合物的种类很多，要直接测定这些成分的含量，由于标准物的限 定而很难做到，所以目前一般采用芦丁作为标准物质分析总黄酮的含量。 芦丁能与触( n 0 3 ) 3 反应，生成黄色络合物，在n a n 0 2 的碱性溶液中呈红橙 色，并在波长4 0 0 - - - 6 0 0n l n 有一最大吸收峰。根据郎伯一比耳定律，当波长和强 度一定的入射光通过光程长度固定的有色溶液时，吸光度a 与物质的浓度c 之 间有如下关系： a = k c 式中k 为比例常数。因此，只要测得某一溶液在某一波长的吸光度a ，就可 计算出该溶液的浓度c 。 ( 1 ) 标准液的制备 精确称取芦丁1 0m g ( 1 0 s 。c z l z 燥至恒重) ，加7 0 7 , 醇适量，置水浴中加热溶 解放冷，以7 0 乙醇定容至1 0 0m l ，摇匀，得到终浓度为0 1 0m g m l 的芦丁标 准液。 5 n a n 0 2 ：称取分析纯n a n 0 25g ，用蒸馏水溶解并定容至1 0 0m l ，当天 配制。 1 0 a 1 ( n 0 3 ) 3 ：称取分析纯a l ( n 0 3 ) 31 0g ，用蒸馏水溶解并定容至1 0 0i n l 。 lm o l l n a o h ：称取分析, 纯n a o h4g ，用蒸馏水溶解并定容至1 0 0m l 。 ( 2 ) 最大吸收波长的确定 取1 0m l 芦丁标准液于具塞试管中加7 0 乙醇使成5m l 。加5 n a n 0 2 溶液 0 3m l ，摇匀，放置6m i n ， j i l l 0 a i ( n 0 3 ) 3 溶液0 3m l ，摇匀，放置6m i n ，加1 m o l l n a o h 溶液4m l ，3 1 6 0 乙醇0 4m l ，摇匀，放置1 0m i n ，在波长4 0 0 衄 6 0 0n l l 区间内，每隔5i u n 测定一次吸光度，并以吸光度为纵坐标，波长为横坐标 作图，从图中可确定芦丁标准溶液的最大吸收波长。 ( 3 ) 标准曲线的制作 分别取o 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0m l 芦丁标准液于6 只具塞试管中，力1 ：i 6 0 乙醇使成5m l 。加5 n a n 0 2 溶液0 3m l ，摇匀，放置6r a i n ，加1 0 a 1 ( n 0 3 ) 3 溶液0 3m l ，摇匀，放置6m i n ，加1 m o l l n a o h 溶液4m l ，加6 0 乙醇0 4m l 摇 匀，放置1 0m i n ，以第一管为空白于最大波长处测定吸光度。 以吸光度a 为纵轴，芦丁标准液含量m g m l 为横轴做图得芦丁标准曲线。同 福建农林大学硕士学位论文第二章橄榄叶总黄酮的定性和定量分析 时测得a 值经一元线性回归处理，得芦丁标准曲线的回归方程。 ( 4 ) 样品中总黄酮含量的测定 吸取1m l 提取液置于10m l 具塞试管，按上述芦丁标准曲线绘制方法配制溶 液，并以试剂空白为参比液调零，测取其吸光度记为a ，将其代入标准曲线得到 提取液浓度c ( m g m l ) ，按下面公式计算总黄酮含