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脂肪酶合成糖酯的催化作用研究 摘要 糖酯是一种优良的非离子型生物表面活性剂，由于其无毒并且能够完 全生物相容的特点被广泛应用于食品、化妆品、清洁剂和医药行业。自1 9 8 4 年k l i b a n o v 等发现脂肪酶在有机溶剂中有催化酯交换反应的活性以来，非水 酶学获得了很大发展，越来越多的人涉及到这些方面的研究。本文采用脂 肪酶n o v o z y m 4 3 5 分别催化1 0 十一碳烯酸( 1 0 u n d e c y l e n i ca c i d ，u a ) 与葡萄 糖和木糖在有机溶剂中分别合成了葡萄糖酯和木糖酯，因为1 0 十一碳烯酸 末端有双键，采用k 2 s 2 0 8 为化学引发剂合成了含糖聚合物。并考察了糖酯 和含糖聚合物在实际中的应用。 本研究以葡萄糖和木糖为原料，在脂肪酶的催化作用下与1o 十一碳烯 酸直接酯化，在非水相体系中采用单因素法和正交试验法对反应条件进行 了优化，得出了反应的最佳条件，用f t i r 、h p l c 、m s 、n m r 和t l c 等手 段对分离纯化后的产物葡萄糖酯和木糖酯进行表征，确定了葡萄糖酯和木 糖酯的具体结构。 l 、在合成葡萄糖酯的研究中，分别利用单因素法对反应溶剂、反应温 度、反应原料摩尔比、分子筛加入量、酶的加入量和酶的重复利用等因素 进行了考察，确定了对反应影响比较大的几个因素，通过正交试验确定了 此反应的最佳条件的摩尔比为2 ：1 、温度为5 0 。c 、分子筛用量为5 6m g m l 、 加酶量为1 0m g r n l 。在最佳条件下，糖酯的产率达到了9 2 9 8 。 t 2 、在合成木糖酯的研究中，利用单因素和正交法结合的试验方法进行 研究，分别考察了反应摩尔比、分子筛加入量、酶添加量、反应时间和酶 的重复利用几个因素，确定了此反应的最佳条件为摩尔比为2 ：1 、温度为6 5 、分子筛用量为4 8m g m l 、加酶量为2 0m g m l 。在最佳条件下，糖酯的 产率达到了8 1 2 5 。 3 、将葡萄糖酯产物通过硅胶柱分离纯化后，通过采用k 2 s 2 0 8 作为化学 引发剂，控制反应时间和引发剂浓度得到具有理想分子量和分子量分布的 葡萄糖基聚合物。将制得的葡萄糖基聚合物通过复凝聚法与非诺洛芬钙制 成载药微球，通过正交试验优化制备微球的条件，其最佳条件为：葡萄糖 基聚合物与海藻酸钠的质量比为1 ：2 ，成球p h 值为3 ，搅拌速度为4 0 0 r p m ， 成球温度为4 5 。按此最佳条件制成载药微球，测定其平均药物包封率为 ( 7 3 7 4 - 4 - 3 1 2 ) 。将载药微球放入人工肠液中进行释放研究，在释放2 4 h 后释 放度接近9 0 ，微球释药效果明显。 4 、进行了葡萄糖酯在抑菌方面的研究，结果发现葡萄糖酯对白假丝酵 母菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌、变形杆菌具有良好的抑 制作用，其最低抑菌浓度分别为1 0m g m l 、4m g m l 、3m g m l 、4m g m l 、 3m g m l ，抑菌效果良好。 酶法合成糖酯反应条件温和，能耗少，对环境污染小等优点，使其成 为近年来研究的热点。因为本研究中采用的是末端具有活泼双键的1 0 。十一 碳烯酸为酰化试剂，因此提供了聚合的可能条件，通过对单酯的聚合以及 糖基聚合物的应用，扩大了糖酯的应用范围。l o 十一碳烯酸具有抑菌的效 果，本研究也同样考察了合成的糖酯对抑菌方面的研究，体外抑菌效果明 显，为其在以后的应用方面的研究打下了基础。 关键词：糖酯脂肪酶糖基聚合物化学聚合药物缓释体外抑菌 i i i s t u d i e so nt h ec a t a l y s i so fl i p a s et os y n t h e s i s s u g u a re s t e r s a bs t r a c t t h es u g a re s t e ri sa ne x c e l l e n ts u r f a c ea c t i v er e a g e n t ，f a t t ya c i de s t e r so f s u g a rh a sb e e nw i d e l yu s e di nf o o d ，c o s m e t i c ，d e t e r g e n t ，a n dp h a r m a c e u t i c a l i n d u s t r i e sd u et ot h e i rn o n t o x i c ，c o m p l e t e l yb i o d e g r a d a b l ec h a r a c t e r i s t i c s ，s i n c e k l i b a n o va n dh i sc o w o r k e r sh a sf o u n dt h el i p a s eh a dc a t a l y s i sa c t i v i t i e so nt h e t r a n s e s t e r i f i c a t i o nr e a c t i o n ，t h et h e o r yo ne n z y m ei nn o n a q u e o u s ( o r g a n i cp h a s e a n dr e v e r s em i c e l l es y s t e m ) p h a s eh a sag r e a td e v e l o p m e n t ，m o r ea n dm o r e p e o p l et h r e wt h e m s e l v e si n t ot h i s f i e l d t h i sd i s c o u r s ec a t a l y z e du n d e c y l e n i c a c i d ( u a ) w i t hg l u c o s ea n dx y l o s et op r o d u c ts u g a re s t e r si no r g a n i cs o l v e n t r e s p e c t i v e l yw i t hl i p a s en o v o z y m 一4 35 ，a su a h a sa nd o u b l eb o n da tt h ee n do f t h em o l e c u l a r , s ow eu s e dk 2 8 2 0 8a sa nc h e m i c a li n i t i a t o rt os y n t h e s i z e s u g a r - c o n t a i n i n gp o l y m e r a n da l s od i dr e s e a r c ho nt h ea p p l i c a t i o no fs u g a re s t e r a n ds u g a r - c o n t a i n i n gp o l y m e rr e s p e c t i v e l y w eu s e dal i p a s ee n z y m ec a t a l y z e du aw i t hg l u c o s ea n dx y l o s ef o r m i n g s u g a re s t e r sr e s p e c t i v e l y , t h eo p t i m i z a t i o nr e a c t i o nc o n d i t i o nw a sf o u n dw i t h s i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a lm e t h o d ，a f t e rp u r i f i e dt h es u g a re s t e r su s i n gf t i r , h p l c ，m s ，n m ra n dt l c t oc o n f i r mt h e i rs t r u c t u r e i v 1 i nt h er e a c t i o no fs y n t h e s i sg l u c o s ee s t e r , w ei n v e s t i g a t e ds o l v e n t ， t e m p e r a t u r e ，m o l er a t i oo fr a wm a t e r i a l ，t h ec o n c e n t r a t i o no fm o l e c u l a rs i e v e s ， d i f f e r e n ta m o u n t so fe n z y m ei nt h er e a c t i o n s y s t e ma n dr e p e a t e d u s eo f n o v o z y m 一4 3 5w i t hs i n g l ef a c t o rm e t h o d ，f o u n dt h ef a c t o r sw h i c hh a dt h e i m p o r t a n ti n f l u e n c eo nt h er e a c t i o n ，t h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o nw a sd e c i d e d b yo r t h o g o n a lm e t h o d ，t h eb e s t c o n d i t i o n sa r et h a tm o l er a t i oi s 2 ：1 ， t e m p e r a t u r ei s5 0 。c ，t h ec o n c e n t r a t i o no f m o l e c u l a rs i e v e si s5 6 m g m l ，a n dt h e a m o u n to fe n z y m ei slo m g m l ，u n d e rt h er e a c t i o nc o n d i t i o nt h ey i e l di s 9 2 9 8 2 i nt h er e a c t i o no fs y n t h e s i s x y l o s ee s t e r , w ei n v e s t i g a t e ds o l v e n t ， t e m p e r a t u r e ，m o l er a t i oo fr a wm a t e r i a l ，t h ec o n c e n t r a t i o no fm o l e c u l a rs i e v e s ， r e a c t i o nt i m e ，d i f f e r e n ta m o u n t so fe n z y m ei nt h er e a c t i o ns y s t e ma n dr e p e a t e d u s eo fn o v o z y m 一4 35w i t hs i n g l ef a c t o rm e t h o d ，a n dt h eo p t i m u mr e a c t i o n c o n d i t i o nw a sd e c i d e db yo r t h o g o n a lm e t h o d ，t h eb e s tc o n d i t i o na r et h a tm o l e r a t i oi s2 ：li n2 - m e t h y l - 2 - b u t a n o l ，t e m p e r a t u r ei s6 5 ，t h ec o n c e n t r a t i o no f m o l e c u l a rs i e v e si s4 8 m g m l ，u n d e rt h i sr e a c t i o nc o n d i t i o nt h ey i e l di s81 2 5 3 a f t e rp u r i f i e dt h eg l u c o s es u g a re s t e rw i t hs i l i c ag e l ，t h eg l u c o s e b a s e d p o l y m e rw e r ep r e p a r e du s i n gk 2 s 2 0 8a sac h e m i c a li n i t i a t o r c o n t r o l e dr e a c t t i m ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft h ei n i t i a t o rt o p r o d u c tp o l y m e rw i t hg o o d m o l e c u l a rw e i g h ta n dm o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i n g ，s u i t a b l es u s t a i n e d r e l e a s e m i c r o s p h e r e sc o n t a i n i n gf e n o p r o f e nc a l c i u mw e r ep r e p a r e du s i n gg l u c o s e b a s e d p o l y m e r sa n ds o d i u ma l g i n a t ea sb a s em a t e r i al ，t h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t a l v d e s i g nt oo p t i m i z et h ep r e p a r a t i o np r o c e d u r eo ft h em i c r o s p h e r e s t h eb e s t c o n d i t i o n sa r et h a tm a s sr a t i oo fp o l y m e ra n da l g i n a t ei s s p e e dw a s4 0 0r p m ，a n dt h et e m p e r a t u r ei s4 5 c t h ep a r t i c l es i z er a n g eo ft h e m i c r o s p h e r e si s 10 - 2 0 u m t h ea v e r a g ed r u ge n v e l o p m e n ti s ( 7 3 7 4 + 3 12 ) t h ed e g r e eo fr e l e a s ei nv i t r oo ft h em i c r o s p h e r e si n d i c a t e dt h a tt h e s e m i c r o s p h e r e sw e r eb e s t t h ed e g r e eo fr e l e a s ec a nr e a c h9 0 a f t e r2 4 h 4 a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo ft h eg l u c o s ee s t e ra l s os t u d i e d ，t h ee f f e c to n c a n d i d aa l b i c a n sg r a m - p o s i t i v eb a c t e r i aa n dg r a m n e g a t i v eb a c t e r i aw a sg o o d t h em i co fc a n d i d aa l b i c a n sc o l o nb a c i l l u sb a c i l l u ss u b t i l i ss t a p h y l o c o c c u s a u r e u sp r o t e u si slo m g m l ，4 m g m l ，3 m g m l ，4 m g m la n d3 m g m l r e s p e c t i v e l y t h ee f f e c tw a sg o o d t h er e a c t i o no fs y n t h e s i z e ds u g a re s t e ri se n v i r o n m e n t a l ，s oi tb e c o m e sa h o ts t u d y a sw ec o n s i d e ru aa st h ea c r y ld o n o rw h i c hh a sad o u b l eb o n d ，a n ds o i ti sp o s s i b l et op o l y m e r i z e d ，w ee n l a r g et h er a n g eo ft h es u g a re s t e rt h r o u g ht h e r e s e a r c ho nt h ea p p l i c a t i o no ft h es u g a re s t e ra n di t sp o l y m e r t h es u g a re s t e r h a sa g o o d a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y , a n dm a k e sag o o db a s eo nl a t e rr e s e a r c h k e y w o r d s ：s u g a re s t e r ；l i p a s e ；s u g a r - p o l y m e r ；c h e m i c a lp o l y m e r i z e d ； d r u gr e l e a s e ； i nv i t r oa n t i b a c t e r i a l v i 符号说明 意义 换热管传热面积 自旋扭带宽度 换热管的内径 范宁摩擦系数 重力加速度 节距，自旋扭带旋转1 8 0 0 的轴向长度 u 形管压差计水银液面读数差 总传热系数 湍动能 进口湍动能 进口混合长度 扭带长度 流体对扭带施加的旋转力矩 扭带旋转阻力矩 自旋扭带转速 x l 单位或量纲 m 2 m m m s 2 m m w m - 2 k 1 m 2 s 。2 m 2 s 2 m m n - m n m r m i n 1 特 么 d 讲 厂 g 日 厅 k 七 m 膨 珂 z 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 王据伤 ，刎年占月7 9 同 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的e e jj 昂i j 本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 凼| 时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 黼糍畏衫靳妣圆叫年易月码r 广西大掌硕士掌位论文脂肪酶合成糖酯的催化作用研究 第一章绪论 1 1 糖酯及其聚合物的研究概述 糖酯是一类性能优良的非离子型生物表面活性剂，在食品、化妆品、医药、洗涤剂、 纤维等工业中有着重要用途【1 。2 】。如蔗糖酯广泛用作食品、化妆品和药物的乳化剂，一些糖 酯还是合成甜味剂、食品原料和药物的重要前体物质。 糖酯一般由长链脂肪酸和糖通过酯化作用而形成。该分子为两性分子，同时具有非极 性部分和极性部分，从而具有表面活性剂作用。表面活性剂根据结构特点不同，可分为离 子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。糖酯分子是典型的非离子型表面活性剂。非离子 型表面活性剂往往对p h 值和离子强度等不敏感，从而具有一些特殊用途。 在糖分子上面引进一些具有可聚合的基团( 如末端双键) 可进行化学聚合生成糖基聚 合物，它是一种功能性的高分子材料。如利用含糖聚合物中糖的组分在细胞间识别及产生 生物功能方面的特性，可以用来模拟生物聚合物材料、用于手性识别、信号传感等。含糖 的聚合物水凝胶，可作为一种新的细胞生长介质。 1 1 1 糖酯合成的研究进展 在催化剂存在的情况下，糖酯的合成按催化剂的种类可分为两类：化学法合成和酶法 合成。 1 1 1 1 化学法合成 糖分子中含有多个羟基且伯、仲羟基的化学反应活性相差很大，采用化学法制备某些 特定糖酯衍生物时，必须采用一定方法( 如三苯甲基化法、环酯化等) p 】保护不需要取代或 酰化的羟基。然后通过水解除去保护基，这不仅使反应过程更加复杂、制备时间增加、成 本提高而且产物的纯度大大受到影响。 糖酯的化学法合成方法有很多，酰氯酯化法，此法按照工艺又可分为两种方法，一种是 在含氮有机化合物如二甲基甲酰胺( d m f ) 、喹啉或吡啶中，使蔗糖和脂肪酸酰氯发生酯化 反应生成糖酯阵卯另一种是先把蔗糖悬浮于大量的无水乙酸中，在氮气保护下滴加酰氯使 蔗糖发生酰基化反应生成蔗糖酯。 酯交换法【6 】是先把各种脂肪酸甲酯化或乙酯化，再在催化剂存在下使糖和脂肪酸酯发 生酯交换反应生成糖酯。目前更趋向于直接用天然动植物油酯代替单一脂肪酸进行酯交换 制取混合型蔗糖酯，像猪油、椰子油、棕榈油、棉籽油、豆油等。化学法合成糖酯的选择 性差，对糖的羟基需要进行适当的预保护，故工艺复杂、反应条件苛刻、副产物多、转化 率较低。 1 广西大学硕士掌位论文 用i 肪酶合成糖酯的催化作用研究 1 1 1 2 酶法合成 酶是高效、特异的生物催化剂，能够根据化合物( 底物) 的化学功能对化合物加以区分， 酶法合成糖酯不仅可以避免化学合成法中烦琐的反应过程以及副产物多、难纯化等缺点， 而且条件温和，具有区域选择性，得到的生物糖酯产品表面张力大，乳化性能、增溶性、 泡沫性能等均优于化学合成法的糖酯产品。还具有增强免疫、抗肿瘤等性能，拓展了糖酯 类物质的应用范围，是一种很有前途的方法。 蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶( s u b t i l i s i n ) 由于具有与脂酶相同的亲核活性中心，故具有相 同机理的转酯化作用，酶的主要来源见表1 1 。 表1 1 催化糖类选择性酰化或脱酰的酶的主要来源 t a b1 - 1t h es o u r c e so fd i f f e r e n te n z y m e 各种酶的分子结构、活性中心不同，在催化糖类酰化或转酯化反应中，表现出对糖分 子中不同类型、不同位置羟基的选择性及不同的催化反应活力。脂酶催化糖类选择性酰化 和脱酰反应的介质，首先要考虑溶剂对底物的溶解能力以及对酶活力的影响等因素。在合 成糖酯的反应中一般采用有机溶剂作为脂酶催化糖酯合成的反应介质。有机溶剂的极性和 种类可影响到某些脂酶的区域选择性，且只有少数几种有机溶剂如吡啶、d m f 、二异丙醚 等对糖类有较好的溶解能力，因此实际可选用的有机溶剂不多。 该类反应在糖酯的选择性合成中被广泛地研究和应用，显示了强大的发展潜力和广阔 的应用前景，国内外均有不少研究成果。 t h e r i s o d 掣7 】研究了几种脂酶( 猪胰脂酶，细菌脂酶，酵母脂酶和真菌脂酶) 催化6 一位被 保护的单糖与丁酸三氯乙酯在有机溶剂中的转酯化反应，脂酶对于6 位被保护的葡萄糖、 半乳糖和甘露糖的4 个仲羟基有显著的辨别能力。 i k e d a 等【8 】用假单胞菌( p s e u d o mo n a s s p ) 的脂蛋白脂酶和假丝酵母( c a n d i d a c y l i n d r a c e a ) 的脂酶研究了叔丁醇溶剂中葡萄糖等单糖( 或双糖) 在苯基硼酸存在下与丙烯酸 2 g - 西大学硕士学位论文脂肪酶合成糖酯的催化作用研究 乙烯酯的酯交换。结果表明，假单胞菌酶催化酰化的活力远远高于假丝酵母脂酶，并且对 葡萄糖主要酰化6 位羟基。 r i v a 等 9 1 研究了无水d m f 中枯草杆菌蛋白酶催化二糖( 乳糖、麦芽糖、纤维二糖和蔗 糖) 的区域选择性酰化；j o n a t h a n 等研究了细菌脂酶( p s e u d o m o n a ss p ，l i p a s ep a m a n o ) 在 有机介质( 吡啶) 中催化蔗糖与乙酸异丙烯酯的反应；w a r d 等【l o 】用8 种脂酶催化l ，2 一o 2 异亚丙基2 d 木呋喃糖和不饱和脂肪酸如花生四烯酸合成糖酯，其中c a n d i d aa n t a r c t i c a 的 脂酶l i p a s en - 4 3 5 酯化产率最高。含花生四烯酸的糖酯是一种重要的生物体物质可应用于 食品、化妆品和医药工业。 酶催化酰化或脱酰合成糖酯的方法可以克服化学合成过程中的缺点，有些化学方法难 以合成的糖酯而利用酶法很容易完成。研究酶催化法合成糖酯具有重要的理论和实际意 义。 1 2 糖基聚合物的研究概况 糖基聚合物即含糖聚合物，含糖聚合物是由糖组分通过不同的化学反应途径引入到聚 合物分子链中而形成的，它是一种功能性高分子材料。含糖聚合物材料的研究为糖的综合 利用和功能化创造了良机。糖及其衍生物具有多个官能团，限制了结构确定的含糖聚合物 的制备。对这类聚合物的合成，主要通过含糖的不饱和单体聚合得到，或聚合物与糖进行 大分子反应得到含糖的聚合物【l 卜1 4 j 。 1 2 1 自由基聚合引发剂的研究进展 自由基聚合是大规模生产各种烯类聚合物的有效方法。自由基聚合引发体系归纳为过 氧化物类引发剂、偶氮引发剂、二硫化物引发剂、氧化还原引发体系、双官能度和多官能 度引发剂和大分子引发剂等。其中过氧化物类引发剂、二硫化物引发剂和氧化还原引发剂 出现的比较早，也是比较常用的引发剂。现简单介绍两种比较常见的引发剂体系。 1 2 1 1 水溶性偶氮引发剂 近年来，人们开发出来一种水溶性偶氮类引发剂，这种水溶性引发剂普遍适用于高分子 合成的水溶液聚合与乳液聚合中。与一般类型的偶氮引发剂相比，水溶性偶氮引发剂引发 效率高，产品的相对分子质量相对比较高、水溶性好、且残留体少。常见的水溶性偶氮类 引发剂如： i n pf h 3 hl i广广萨厂l 2 h q ip m 啦刊 lrrj 3 广西大掌硕士掌位论文用i 肪酶合成j 膏酯的催化作用研究 r 可以为h 一、c 4 h 9 、- - c h 2 c h 2 n h 2 、c h 2 c h 2 0 h 、c 6 h 5 等等，a 和b 是活性端基( o h 或 o o h 等) 。 水溶性偶氮引发剂是将原来的油溶性的有机引发剂( 如：2 ，2 偶氮二异丁腈( a i b n ) ) 转变成为水溶性的，扩大了使用范围，若带有端基的水溶性引发剂，还可以用于制备遥爪聚 合物。将水溶性偶氮引发剂引发丙烯酰胺聚合，聚合温度大约在3 5 - - 9 0 c ，一般温度在4 0 左右就可以，聚合时间平均在4 h ，得到的聚丙烯酰胺的相对分子质量大约为1 4 0 0 - - - 1 8 0 0 万之间，产品的溶解性好【l5 1 。 1 2 1 2 过氧类引发剂 有机过氧类代表物为过氧化二苯甲酰( b p o ) ，b p o 中咖键部分的电子云密度大 而相互排斥，容易断裂，通常在4 5 6 5 分解。 c 等。0 二co 广 b p o 按两步分解：第一步均裂成苯甲酸基自由基，由单体存在时，即引发聚合；无单 体存在时，进一步分解成苯基自由基，并析出c 0 2 ，但分解不完全。如下图所示 c 4 h 薛一0 0 一年c 4 h 5 2 c 4 h 爵一啦一2 c 4 5 + 2 c 0 2 0 0 b 无机过氧类的引发剂代表物为无机过硫酸盐，如过硫酸钾k 2 8 2 0 8 和( n h 4 ) 2 s 2 0 8 ，这类引发 剂能溶于水，多用于乳液聚合和水溶液聚合。 ooo k o 耋oo ：耋o k屹女6 善o k o 卜d 舟 c 一_ h oh l “一 m oo c h 卜 歹：j 。掣! o r - h f 1 0 0 6 05 04 03 02 01 o m 0 2 图2 1 4 糖酯的在c d 3 0 d 中1 h 1 3 ch s q c 谱图 f i g 2 1 41 h 1 3 ch s q cs p e c t r u m ( i nc d 3 0 d ) o f t h es u g a re s t e r 在碳谱中葡萄糖c 6 的共振信号( 6 4 7 8p p m ) 出现在比其未发生取代时更低场的位置 惭】，进一步证实了此c 6 发生了取代。另外，两种构型( 仅和d ) 的葡萄糖都在碳谱中得到证 实，其中q 构型的峰( 从碳1 到碳6 依次为9 3 9 3 ，7 3 7 3 ，7 4 7 1 ，7 1 8 8 ，7 0 6 2 和6 4 7 8p p m ) 比p 构型的峰( 9 8 1 8 ，7 6 1 4 ，7 7 8 7 ，7 1 6 6 ，7 5 3 0 ，和6 4 7 8p p m ) 在我们实验的条件下要明显占压 倒性的优势。从以上所有的数据可以得出所合成的单酯是6 o ( 1 0 一十一碳烯酸) 葡萄糖 酯。为了估算o f , 构型和p 构型的比率，对两种构型在氢谱中的1 位碳上氢h l ( 5 0 5p p m ) 和 h 1 ( 4 4 4p p m ) 的信号峰面积进行积分并比较，结果表明q 构型和d 构型的比率为7 4 1 ：l 2 6 ， 大致为3 比1 。 表2 4 汇总了1 hn m r 和1 3 cn m r 的数据，t a k a or a k u 5 7 】等人在利用蛋白酶催化葡萄糖 和l o 十一碳烯酸乙烯酯合成糖酯时，把葡萄糖c 2 的信号归属为比c 4 更低场，但在我们的 实验中，二维1 h 1 3 ch s q c 谱清楚表明c 2 的信号比c 4 的信号在更高场。 2 0 广西大掌硕士学位论文脂肪翻i 合成糖翻 的催化作用研究 表2 - 46 - 0 ( 1 0 十一碳烯酸) 葡萄糖酯在c d 3 0 d 中的1 h 和1 3 c 核磁共振的数据 t a b l e2 - 41 ha n d1 3 c - n m rd a t ao f6 0 ( 1o - u n d e c y l e n o y l ) - d g l u c o s ei nc d 3 0 d 1 hn m rc h e m i c a ls h i f t s ( 8v a l u e sw i t hm u l t i p l i c i t ya n d ”cn 1 、很c h e m i c a ls h i f t s p 0 s 8 c 1 3 p p m c o u p l i n gc o n s t a n t si nh z i np a r e n t h e s e s ) 8h 1 p p m g l u c o s em o i e t y f a t t ya c i dm o i e t y ( ) l ( i ) 2 ( ) 3 ( i ) 4 q 。p y r a n o s e 9 3 9 3 7 3 7 3 7 4 7 l 7 1 8 8 7 0 6 2 6 4 7 8 1 3 。p y r a n o s e 9 8 1 8 7 6 1 4 7 7 8 7 7 1 6 6 7 5 3 0 6 4 7 8 1 1 4 7 2 1 4 0 0 9 3 4 8 5 3 0 4 0 c h 2c h a i n 3 0 3 3 ；3 0 13 ；3 0 0 6 ( c 5 ，c 6 ，c 7 ，c 8 ) b q 2 5 9 8 3 4 9 6 q 。p y r a n o s eb - p y r a n o s e 5 0 5 ( 1h ，d ，4 0 h z ) 4 4 4 ( 1h ，d ，8 0 h z ) 3 2 2 ( m ) 3 1 0 ( i h ，d d ，8 8 h z , 8 0 h z ) 3 6 4 ( 1 h ，d d ，9 6 h z , 9 6 h z ) 3 2 5 ( m ) 3 9 l ( 1 h ，d d d ，1 0 0 h z , 5 2 h z , 2 0 h z ) 4 3 2 ( 1h ，d d ，12 0 h z , 2 0 h z ) 4 1 5 ( 1 h ，d d ，1 2 0 h z , 5 2 h z ) ) l a ：4 9 4 ( m ) 3 3 2 ( m ) 3 2 5 ( m ) 3 4 4 ( 1h ，d d d ，9 2 h z , 6 0 h z , 2 0 h z ) 4 3 6 ( ih ，d d ，12 0 h z ；2 0 h z ) 4 1 3 ( 1 h ，d d ，1 2 0 h z , 6 0 h z ) 5 7 7 ( m ) 2 0 1 ( a p p q ) 1 3 5 ( t ) 1 2 7 ( b r m ) 1 5 7 ( t ) 2 3 0 ( t ) ( ) l b ：4 8 4 ( m ) c a r b o n y lc 1 7 5 5 1 2 6 反应历程的推断 综合i r 、m s 和n 1 w 图谱的分析，葡萄糖和1 0 十一碳烯酸在n o v o z y m 4 3 5 ! l 勺催化下反 应区域选择性合成6 o ( 1 0 十一碳烯酸) 葡萄糖酯反应式见图2 - 1 5 。 l 2 3 4 5 6 广西大掌硕士掌位论文 脂肪葺- 8 - 成糖置旨的催化作用研究 h 一0inovozym-4350h h oc ( c h 2 ) s c h = c h 2 h 玲洲 9 h 2 0 c ( c h 2 ) 8 c h = c h 2 + 一 一n ，二， ” o h g l u c o s e 10 一u n d e c y l e n i ca c i d o h 6 - o - ( 1 0 - u n d e e y l e n o y l ) d - g l u c o s e 图2 - 1 5 脂肪酶n o v o z y m - 4 3 5 催化合成6 - 0 ( 1 0 十一碳烯酸) - 葡萄糖酯的反应式 f i g 2 15t h er e c t i o ne q u a t i oo f6 - o 一( 1o u n d e c y l e n o y l ) - d - g l u c o s e 2 7 小结 本章采用单因素法和正交试验法对n o v o z y m 一4 3 5 在有机相中催化葡萄糖和l o 十一碳 烯酸合成葡萄糖酯的反应条件进行优化，考察了有机溶剂种类、反应温度、摩尔比、酶质 量浓度等因素对葡萄糖酯产率的影响，得到了6 o ( 1 0 十一碳烯酸) 葡萄糖酯的最佳反 应条件为：以特戊醇为溶剂反应温度为5 0 ，葡萄糖肘a 的摩尔比= l ：2 ，分子筛加入量 为0 5 6 m g m l ，酶用量为1 0 m g m l 。产物经分离纯化后通过质谱、核磁分析确定了产物的 结构为6 o ( 1 0 十一碳烯酸) 葡萄糖酯，表明固定化脂肪酶n o v o z y m 4 3 5 在催化酯化过程 中具有很好的区域选择性。 广西大学硕士掌位论文用 肪酶合成糖酯的催化作用研究 第三章有机相中5 o ( 1 0 ) 十一碳烯酸木糖酯的酶法合成及表征 3 1 引言 木糖( x y l o s e ) 是一种戊糖，为白色结晶或结晶性粉末，易溶于水天然d 一木糖是以多 糖的形态存在于植物中，它的生理功能嘲。5 9 3 主要包括： 1 ) 不被消化吸收，没有能量值能最大限度地满足爱吃甜品又担心发胖者的需求。 2 ) 活化人体肠道内的双岐杆菌并促其生长，双岐杆菌是益菌，该菌越多越有益人体 健康；食用木糖能改善人体的微生物环境，提高机体的免疫能力。 3 ) 不被口腔内微生物所利用，具备膳食纤维的部分生理功能，可降低血清胆固醇的 预防肠癌等。 4 ) 木糖与食物的配伍性很好，食物中添加少量木糖，便能体现出很好的保健效果。 木糖与钙同时摄入，可以提高人体对钙的吸收率和保留率，还能防止便秘。 目前主要应用在食品、饮料中作为无热量的甜味剂，制作烤制品或用于高档酱油，将 其加氢制成木糖醇的用途更加广泛。 本章利用木糖与1 0 十一碳烯酸通过脂肪酶n o v o z ) ，m 4 3 5 进行催化合成木糖酯，使其成 为一种活性糖酯扩大了木糖的应用范围，在本章研究中考察了温度、反应物的摩尔比、反 应时间、分子筛加入量对反应的影响，同时考察了固定化脂肪酶的重复利用次数，通过正 交试验得出了酯化反应的最佳条件，同时通过红外、核磁等手段对产物糖酯进行了结构表 征。 3 2 试验材料与设备 3 2 1 试验材料 广西大国盼炙士掌位论文 用i 肪暑合成糖旨的催化作用研究 表3 - 1 试验材料 t a b3 - 1e x p e r i m e n t a lr e g e n t s 3 2 2 试验仪器设备 恒温培养摇床h w y 2 1 1上海智城公司 旋转蒸发仪 r e 5 2 9 8上海亚荣生化仪器厂 电子分析天平 s a r t o r i u sb s2 1 0 s 德国s a r t o r i u s 公司 马弗炉s r j x 4 1 3沈阳长城工业电炉厂 超纯水仪 w a t e r sp r op l u s ，m i l l i n o i sqp l u sp f 美国沃特斯公司 傅立叶红外光谱仪 n i c o l e t5 d x bu p g r a t et om o m n i c 美国n i c o l e t 公司 高效液相色谱仪 w a t e r s 2 0 1 d 美国w a t e r s 公司 色谱柱d i a m o n s i l c l 8 柱( 5 u m ，2 5 0 m m 4 6 m m ) 迪马公司 核磁共振仪 b r u k e ra v a r i c ea v 5 0 0 m h z 瑞士b r u k e r 公司 3 3 试验方法 3 3 1 无水有机溶剂的制备 n 将3 彳分子筛置于马弗炉内活化5 h ，活化温度为5 0 0 。c 。在干燥器中冷却后，放入预先 准备好的有机溶剂中，在1 5 0 r p m 的恒温摇床中振荡除水，4 8 h 后，滤去分子筛，得到近似 无水的有机溶剂。 3 3 2 有机相5 o ( 1 0 ) 十一碳烯酸木糖酯的合成 在具塞的玻璃瓶中加入无水溶剂、1 0 十一碳烯酸、木糖组成反应体系，在设定的温度 2 4 广西大掌硕士掌位论文脂肪葺合成糖酯的催化作用研究 和转速的摇床中振荡预混，加入一定量质量浓度的脂肪酶n o v o z y m 4 3 5 ，反应4 小时后加入 定量分子筛，反正4 8 h 后得到反应粗液，薄层色谱t l c 监控反应进程。反应结束后进行h p l c 分析，测定反应产率。考察反应摩尔比、反应温度、分子筛加入量、溶剂的选择及酶的重 复利用次数等对反应的影响。设计正交试验，寻找最佳条件并进行验证。 3 3 3 木糖酯的纯化 反应结束后，过滤除掉酶、分子筛及未反应的木糖，旋转蒸发掉反应溶剂，混合物过 硅胶柱分离，淋洗剂为氯仿甲醇( 2 0 ：1 ) ，收集组分，挥发溶剂后得到纯度为9 9 9 的产 物，产物为白色粉末固体。 3 3 4 木糖酯的检测 3 3 4 1 定性分析：薄层层析法 采用硅胶g 铺板，展开剂为v ( 氯仿) ：v ( 甲醇) = 1 0 ：l ，显色剂为1 0 的稀硫酸，在1 l o 的烘箱中烘烤8 m i n 显色。用于鉴别木糖、木糖酯及1 0 十一碳烯酸。木糖和糖酯均被碳化 成黑色，十一碳烯酸显紫红色。 3 3 4 2 定量分析：高效液相色谱法( h p l c ) w a l e r s2 0 1 d 高效液相色谱仪，手动进样，示差折光检测器( 美国安捷伦公司) ，色谱 柱为d i 锄o n s i lc 1 8 ( 2 5 0 m m x 4 6 r a m ) ，流动相为v ( 乙腈) ：v ( 水) = 7 5 ：2 5 ，流速为lm l m i n ， 进样量1 0 u l ，柱温3 0 。 3 3 5 糖酯产率的计算 分别称取1 0 十一碳烯酸利用甲醇配置成4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0 、1 2 0 、1 5 0 m m l 的不同浓 度的溶液，用高效液相色谱色谱测定不同浓度的十一碳烯酸的峰面积，做成标准曲线。反 应体系中剩余的十一碳烯酸的质量浓度由外标法求得。糖酯