（细胞生物学专业论文）slap与凋亡相关性的研究及其多克隆抗体的制备.pdf

摘要s l a p 是本实验室利用m r n a 差异显示技术在可见光诱导的凋亡早期的猪视网膜色素上皮( r p e ) 细胞中克隆的一个新的基因，g e n b a n k 登录号为a f 5 0 9 4 7 2 。s l a p 基因具有一个开放阅读框架，可编码1 0 1 个氨基酸。因为s l a p 基因的m r n a 只表达在可见光损伤的r p e 细胞，而在正常的r p e 细胞中则不表达，因此我们推测该基因与可见光所致的r p e 细胞损伤具有密切关系，但对s l a p 的作用及机制尚不清楚。本研究首先构建了p c d n a 3 1 s l a p g f p 真核表达载体，并通过转染四种哺乳动物细胞来观察s l a p 蛋白的细胞内定位，结果表明s 一1 a p 蛋白分布在整个细胞，但以细胞核表达为主，提示s l a p 可能在细胞核内发挥作用。因为s l a p 是在光损伤的凋亡早期的r p e 细胞中表达的一个基因，所以我们进一步对s l a p 的超表达与细胞凋亡之间的相关性进行了研究。虽然基因组电泳结果显示在超表达s 一1 a p 基因的2 9 3 t 细胞中没有出现标志细胞凋亡的d n a 梯状带，但超表达s l a p基因后的细胞周期检测结果却表明，s l a p g f p 融合蛋白可使2 9 3 t 细胞周期发生明显的改变，可使g 2 m 期明显阻滞。推测s 一1 a p 基因可能通过影响细胞周期来参与细胞凋亡的过程。为了进一步研究s l a p 蛋白的组织分布及其功能，制备抗s 一1 a p 抗体是十分重要的。因此我们构建了p e t 一2 8 a ( + ) s l a p 原核表达载体，并在大肠杆菌b l 2 1 中通过i p t g 诱导表达，然后利用n i 2 + 柱进行亲和层析对重组蛋白进行纯化。用纯化的带组氨酸标签的s l a p 蛋白免疫b a l b c 小鼠，制备了抗s l a p 蛋白的多克隆抗体，并通过免疫印迹检测了此多克隆抗体的特异性，结果表明，抗s 一1 a p 抗体( 1 ：4 0 0 稀释) 可以和s l a p蛋自特异性结合。此抗体的制备为进一步研究s 一1 a p 基因与凋亡发生的相关性及其机制奠定了坚实的物质基础。关键词：r p e 细胞；光损伤；s l a p ：细胞周期；多克隆抗体a b s t r a c ts 。i a p ，an o v e ig e n ee x p r e s s e di nt 壬l ef o r e p a r t 印o p t i cp o r c i n er e t i n a lp i 掣n e me p i t h e l i a l( r p e ) c e l i si n d u c e db yv i s i b l el i g h t ，w a sc l o n e db yr i l 王l n a ( 1 i i 毪r e m i a ld i s p l a ya l l a l y s i si no u rl a b t h er e g i s t e rn l l i l l b e ro fs l a phg e l l b a l l ki sa f 5 0 9 4 7 2 s 一1 印g e n eh a sa i lo p e nr e a d i n g疗a m ea n de n c o d e sap 0 1 y p 印t i d eo f10 1 锄i n oa c i d s i n c et h em i ao fs - l a po i l l yc a l lb ee x p r e s s e di nt h ed a i i l a g e d 砌慢c e l l si n d u c e db yv i s i b l ei i g h t ，b u td i d n te x p r e s si nn o m a lr p ec e l l s ，w ep r o p o s e dm a ts l a pi sc l o s e l yr e l a t e d 谢t ht h ed 锄a g eo fr p ec e l l sc a u s e db yv i s i b l e1 i g h t h o w e v e r ，伽e 劬c t i o na i l di t sm e c s mo fs l 印a r es t i l lu n c l e 札i np r e s e m 蚰l dy 血ee u k 瓤y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ro fs l a p ，p c d n a 3 1 s - l a p ，g f pw a sc o n s t n l c t e da i t h ec e l l u l a r1 0 c a t i o no fs l a pw a si n v e s t i g a t e db y 台a n s f e c t i n gf o l 】rd i 仃色r e n tm 瑚a l i a nc e l l1 i n e sw i t ht h er e c o m b i n a n tp l a s m i d t h er e s u l t ss h o 、v e dt h a ts 1 a pp r o t e i nd i s t r i b u t e di n 廿1 e 、v h o l ec e l lb u tg i v ep r i o r i t yt ot h en u c l e a r w h i c hi n d i c a t e di th a ss o m ef u n c t i o ni nt h en u c l e a r a ss l 印。工l l ye x p f e s s e di nm ef o r 印舐印o p f i cr p ec e l l si n d u c e db yv i s i b l e1 i 曲t ，w e向n h e ri n v e s t 培a t e dt h er e l a t i o n s h i pb e t 、v e e no v e r e x p r e s s i o no fs l a pa 1 1 da p o p t o s i s a f t e ro v e r e x p r e s s i o no fs l a pi i l2 9 3 tc e l l s ，t h eg e n o m e ，a se x t r a c t e da n de x a m i n e db ye l e c t i n p h o r e s i s ，t h er e s u hd i dn o ts h o wt h et y p i c a ld n al a d d e rw h i c hi st h em a r k e ro fa p o p t o s i s n e v e m l e l e s s ，m ec e l lc y c i ea j l a l y s i sf o r2 9 3 tc e l l so v c r e x p r e s s e ds l 印i n d i c a t et h a ts l a p g f pc a nm a k ead i s t i n c tc h a n g ei nc e l lc y c l ed i s t r i b u t i o no f2 9 3 tc d l s ，c e l ln 砌b e ri i lg 2 mp h a s ew a si n c r e a s e dd r 锄撕c a l l ys ow ea s s 啪et l 】a is l a pg e n em a yp a n i c i p a t ei nt h e 印o p t o s i sp r o c e s sv i ai t se 虢c t0 nc e l lc y c l e p r e p a r a t i o no fa 1 1 t i b o d ya g a i n s ts l a pp r o t e 协i se s s e n t i a if o rt h e 劬k rs t u d ys u c ha st i s s u ed i s t l l i b u t i o na n df u n c t i o no fs l a p s ot h ep r o k a r ) ，o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t 一2 8 a ( + ) s l 印w a sc o n s t r u c t e da i l de x p r e s s e ds l 印p r o t e i ni nt h ee c 0 1 ib l 21i n d u c e d b yi p t gm e nt h es - l a pr e c o m b i n a n tp r o t e i nw i t hp o l y h i st a g 血t h en - t c r m i n a lw a sp u r i f i e db yn ra m i l i 哆c h r o m a t o 黟印h y p o l y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s ts l 印w a sg e n e r a l _ e db yi r n m u n i z i n gb a l b cm i c ew i mp u r f i e dh i s - t a g g e ds 一1 a pp r o t e i n ，a n di t ss p e c i f i c i t yw a st e s t e db yw e s t e mb l o m n t 1 1 er e m l ts h o w e dt h a tt l l ep o l y c l o n a la i 】t i b o d ya g a i n s ts l a pp m t e i n ( 1 ：4 0 0d i l u t e d ) h a dg o o di m m u n o r e a c t i v i t y ，i tc o u l db i n dt h er e c o m b i i l a n ts l a pp r o t e i ns p e c i 蠡c a l l y o u rs l a p 砌b o d ye s t a b l i s h e sas u b s t a l l t j a lf o u n d a t i o nf o r 五l r t h e rr e s e a r c ho nt h er e l a t i v i t yb e t w e e ns - l a pa 1 1 d 印叩t o s i so c c u r r e n c ea 1 1 di t sm o l e c u l a rm e c h a n i s m k e yw o r d s ：r p ec e l l s ；l i g h tda ：m a g e ；s l a p ；c e l lc y c l e ；p o l y c l o n a la n t i b o d y主要英文缩写词表氨苄青霉素碱基对小鼠黑色素瘤细胞中国仓鼠卵巢细胞差异显示聚合酶链式反应d u l b e c c o 改良的e a g l e 培养基绿色荧光蛋白人宫颈癌细胞异丙基硫代一b d 一半乳糖苷卡那霉素千道尔顿，相对分子质量单位l u r i a b e r t a n i 液体细菌培养基光密度磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应蛋白激酶c视网膜色素上皮十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳三( 羟甲基) 氨基甲烷5 一溴一4 一氯一3 一吲哚糖核苷酸人胚肾细胞v i帅岫眺一嘲胁崛|坌眦眦|耋一胁蝌鲫独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：望龟塑堕日期：竖：! 皇塑学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) ，、学位论文作者签名：j 鞋嗣睁指导教师签名：么多衫乡矽日期：q ! ：! 兰! 驾日期学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：月u昂一、文献综述长期的光辐射可以引起视网膜损伤，并且这种光照所致的视网膜损伤具有累积效应，各种环境和人造光源都可能是视网膜光损伤的潜在威胁。但是，随着社会的发展，人们在学习、工作和生活中与光源接触时间越来越长，人类视网膜光损伤问题也就日益严重。与光损伤有关的视力障碍疾病如白内障、老年黄斑变性等是危及老年人视力的严重眼病，且为主要致盲眼病，其患病率随年龄增加而明显上升。此外，各种常用眼科器械，包括间接检眼镜、裂隙灯、激光及手术显微镜等造成医源性视网膜光损伤的现象也正不断地被报道。尽管有关光损伤的研究一直是眼科学领域的热点，但到目前为止尚无有效的方法能防止视网膜光损伤的发生。( 一) 视网膜光损伤的机制早在6 0 年代，n o e l l 等“1 就开始了视网膜光损伤方面的实验研究。在对光性视网膜损伤及其机制的研究中，人们进行了大量的动物实验研究。目前认为：光性视网膜损伤的机制至少包括以下3 个方面。“，即热损伤、机械损伤和光化学损伤。热损伤是高能量被组织吸收转化为热能，使局部组织内的温度升高，当组织内的温度升高到超出体温限度时，即可使组织内的各种蛋白质成分( 包括酶系统) 发生变性凝固而产生损伤；机械性损伤，是组织在极短的时间内接受强光照射( 如激光) 使组织在光子的冲击下发生瞬间的变化而受到的机械性损伤；光化学损伤则是由不引起明显温度升高的、低能量的、相对较长时间的光照所引起的视网膜组织的损伤。迄今为止，对上述三种损伤之间的关系尚不完全清楚。许多研究者认为大多数光损伤属于光化学损伤，因此有关光化学损伤的机制研究较多，现归纳如下：1 视色素介导的损伤0 r g a n i s c i a k “3 在大白鼠动物模型中证明，光损伤作用的光谱类似于视紫红质的吸收曲线，这提示视紫红质可能是光子能量的吸收物，而视紫红质的遇光分解则是视网膜光性损伤的生物化学能量来源。p e n n 等0 1 亦发现：视紫红质在视网膜内的含量与视网膜光损伤的易感性呈f 相关，因为经长时间暗适应的大鼠视网膜内的视紫红质含量比正常昼夜周期下喂养的大鼠高许多。光照后，暗适应的大鼠受损的感光细胞的数量也相应地比对照组高。h 锄等“7 1 在猴及大鼠的光损伤实验中发现，在一定的范围内，随着波长的变短，视网膜光损伤的易感性增加，并指出，当视网膜受光能量低，视紫红质存在时，光损伤的作用光谱对视紫红质起作用，而当视网膜上受光能量高时，视紫红质处于漂白状态，这时的光损伤作用光谱( 即短波长作用光谱) 并不与视紫红质吸收峰的特征相符。但近年来，通过比较视色素的吸收光谱与光性视网膜损伤的作用光谱”3 ，发现虽然某些波长光l的作用光谱( 如蓝色光或近紫外光) 与视紫红质的吸收光谱不一致，但它的漂白产物的吸收光谱却与短波长光引起的光损伤的作用光谱一致，如视紫红质的漂白产物全反维生素a 醛和全反维生素a 醇，两者的吸收光谱分别为3 8 7 册和3 3 0 n m ，而细胞色素c 氧化酶具有大约在4 2 0 n m 波长的吸收光谱，与体外培养的牛r p e ( 视网膜色素上皮) 细胞光损伤作用光谱相一致。显而易见，由于视色素在光线的接受与传导方面的重要作用，其含量水平与光损伤易感性有密切的相关性，使人们不得不对它在光损伤中的地位刮目相看，但迄今为止，视色素与光损伤间的确切关系仍然不很清楚，尚有待进一步的探索与验证。2 自由基与脂质过氧化物介导的损伤n o e l l 等最先提出脂质过氧化在光性视网膜损伤中起重要作用。许多前期的研究。1表明，视网膜的光损伤是光照激发产生自由基，引起组织发生过氧化的结果。感光细胞外节盘膜中含有高水平的长链多不饱和脂肪酸，这些不饱和脂肪酸( 如廿二碳六烯酸)具有易受自由基攻击的亚甲基结构，对过氧化反应最为敏感，易与o h 反应形成脂质自由基，并攻击其它不饱和脂肪酸引起连锁反应。况且，与其它组织相比，光感受细胞内段富含线粒体，对氧的需求很大，在正常时氧从脉络膜毛细血管，通过b r u c h 氏膜，r p e 及光感受细胞外段向内层扩散，使光感受细胞外段处于一高张氧的环境中，当光子被视紫红质吸收时，则可激发电离，产生单线态氧、过氧化氢及羟基自由基等一系列自由基，从而使核膜、盘膜、线粒体膜和内质网膜内的脂类发生过氧化，从而导致感光细胞外段解体、内节线粒体肿胀变性，呼吸链生理功能也随之降低。此外，脂质过氧化产物中的醛类化合物也有细胞毒性，如丙二醛可作为交联剂与蛋白质、核酸等含氮化合物反应，使之发生交联而丧失功能“，使膜的流动性、通透性改变而发生不可逆的损伤，严重者导致这些生物膜溶解和细胞死亡，从而造成视网膜组织的光性损伤。已知正常情况下，机体内自由基的产生与清除过程处于动态平衡，如果遭受各种外界因素的影响，这一平衡被破坏，将对机体造成损害。研究结果表明，视网膜各层细胞内均存在清除自由基的天然保护系统，包括抗过氧化物酶( 如谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶) 和自然抗氧化剂( 如：还原型谷胱甘肽、维生素c ，e ，a ；辅酶q ，硒，巯基化合物等) “，它们可以通过各种化学反应而终止自由基链反应，达到清除有害自由基，防止组织破坏的目的。t s o 等“2 1 报告狒狒和豚鼠视网膜受光照后，神经视网膜层中还原型抗坏血酸含量下降，而氧化型抗坏血酸含量增多，证明抗坏血酸是视网膜抗氧化机制中重要的化学物质。也有实验证明，光照使r p e 细胞内s 0 d 水平下降“3 “3 。最近，关于视网膜光损伤包含有自由基激发过氧化反应的机制得到了更进一步的证实，k u t t y 等“”应用逆转录p c r ，对光照后大鼠视网膜中血红素氧合酶i ( h o _ 1 ) 的m r n a表达水平进行研究，发现光照后，视网膜中h o 一1 的m r n a 水平明显增加，同时其h 0 1 蛋白质的含量水平也大大地增加，虽然对h o 一1 在视网膜的表达究竟是一个有益或有害的细胞反应尚不清楚，而在其它组织中对h o - l 的研究普遍认为，h o 一1 的表达是机体对氧化损伤的保护性反应。进一步的实验还显示，用抗氧化剂d m t u ( 二甲基硫脲) 预先处理动物，可有效地减少h o l 的瑚r n a 的表达。这些研究结果都表明氧化损伤至少是导致光性视网膜损伤的部分原因。3 眼部色素与视网膜损伤黑色素和脂褐素是眼色素膜( 脉络膜、睫状体和虹膜) 及视网膜色素上皮( r p e ) 中常见的两种颗粒状物质。黑色素可吸收大量的可见光，对眼有一定的保护作用。此外，黑色素还可结合具有氧化还原活性的重金属离子如f e ”，螯合状态的金属离子可减少对色素上皮的损伤”。但也有研究表明“。黑色素在长期的强光照射下能将氧分子还原成超氧阴离子和过氧化氢，对眼产生光毒性反应。但黑色素在光损伤中的作用目前尚有争议。脂褐素( 1 i p o f u s c i n ，l f ) 在色素上皮中的含量仅次子黑色素，它是r p e 细胞吞噬和消化视杆细胞、视锥细胞外节的残留物。脂褐素能产生荧光物质，是视网膜中主要的生色团，在有氧的条件下，它可激发细胞色素c 的光还原作用产生单线态氧、超氧阴离子和过氧化氢等活性氧来损伤组织“。”1 。l f 的光敏反应还可导致脂质过氧化，使丙二醛等细胞毒性物质含量增加“。因此，l f 作为一个潜在的光敏分子，增加了视网膜光损伤的危险性。现已证实“，l f 的不断累积与年龄相关性黄斑变性中视网膜色素上皮的破坏有密切关系。( 二) 光损伤与r p e 细胞1 视网膜光损伤分型i ( r e m e r 和v a nn o r r e n “”综合大量的实验结果及数据后，把光性视网膜损伤分为i 型损害和i i 型损害两大类。这一分类比较清晰地描述了最先受损部位与损伤之间的关系。i 型损害最初发生于长期、低强度的白光照射，这类损害多发生于光感受器部分。i i 型损害最初发生于短时、高强度的白光照射，这类损害多发生于r p e 细胞。n o e l l 认为两种损伤均是由光作用于视紫红质从而激发光感受器细胞膜而产生损伤反应所致。2 光损伤与r p e 细胞凋亡视网膜色素上皮( r p e ) 是视网膜的最外层，细胞之间有紧密连接、中间连接和缝隙连接等，具有屏障作用。色素上皮细胞的主要特点是细胞质内含有大量粗大的圆形或卵圆形黑素颗粒和吞噬体。r p e 具有多种功能，其作用包括储存、异构化和产生视紫红质的异构体，并且向神经视网膜层转运营养成分，并吞噬外节脱落的盘膜。它还参与血一视网膜外屏障的组成，对视网膜内层起保护作用。生理情况下，r p e 细胞的结构完整对维持正常视网膜功能至关重要，r p e 一旦死亡便不能再生，只有依靠邻近r p e 细胞扩张和移行来填补缺损区“。而r p e 细胞死亡或增殖，在许多玻璃体视网膜疾病的病理过程中起到关键的作用。有研究结果表明。，视网膜光损伤过程中r p e 的改变最先发生，而光感受器的改变为继发性的。b u c h i o ”等研究了光损伤对a 1 b i n o 系小鼠r p e 细胞和神经视网膜的作用。a 1 b i n o 系小鼠静脉注射孟加拉玫瑰红( 4 0 m g 垤) 后，暴露于1 5 0 0 0 1 7 0 0 0f t c d 强度光照下2 1 5 m i n ，应用光镜和电镜检查发现r p e 细胞出现两种类型的细胞死亡：类是典型的细胞坏死，另一类呈现出细胞凋亡的改变。国内学者”在对可见光对原代培养的人r p e细胞的光化学损伤的研究中观察到r p e 细胞的损伤出现凋亡和坏死两种形式，且在低光照强度下表现为光照时间的依赖性，随光照强度和时间的增加，细胞发生坏死以及凋亡继发性坏死的比例显著增加。推测在日常环境，光的中低强度辐射下，接受光照的相对3强度和时间，是决定人跟的视网膜及r p e 细胞是否受到损伤的重要因素。可见光长期照射有关的慢性眼疾，其眼底细胞的损伤可能主要通过凋亡的死亡形式，或由凋亡走向坏死。h a f e z i 等。”首次在体内经光损伤后诱导出r p e 细胞凋亡。因此，研究r p e 细胞凋亡在光损伤中的作用，以及光损伤相关眼疾的病理过程是否涉及r p e 细胞的凋亡，在何种情况下发生r p e 细胞凋亡以及r p e 细胞凋亡的调控机制对于光损伤相关眼疾的预防与治疗至关重要。( 三) r p e 细胞凋亡的相关基因细胞凋亡是一种由基因调控的、自主有序的细胞死亡机制。通过这一机制机体控制组织中的细胞数目，清除无用的、有害的以及异常的细胞，从而维护机体的自身稳定。同样，r p e 细胞凋亡也受相关基因的调控。1 c a s p a s e 家族c a s p a s e 家族是些具有天冬氨酸残基切割的半胱天冬氨酸特异蛋白酶( c y s t e i n y la s p a r t a t e s p e c i f i cp r o t e i n a s e ) ，与线虫( c e l e g a n s ) 凋亡基因蛋白产物c e d 3 有同源性。它们均以酶原的形式存在于胞质中，可被自身或其他c a s p a s e 或颗粒酶b 切割活化“”。有证据表明，在蛋白酶级联切割过程中c a s p a s e 一3 处于核心位置，可能发挥非常重要的作用o 。众多研究表明，c a s p a s e 一3 在r p e 细胞凋亡过程中起着非常关键的作用。s p a r r o w 等在蓝光诱导的富含a 2 e 的人r p e 细胞凋亡中，采用荧光标记法测量c a s p a s e 一3酶原的裂解片段发现，蓝光照射后5 h 即有c a s p a s e 一3 活性片段出现。与此同时，在应用c a s p a s e 一3 酶抑制剂z d e v d f m k 对照组中，凋亡细胞数目较实验组减少了5 5 ，显示c a s p a s e 一3 引起的凋亡作用被有效削弱。应用另一种c a s p a s e 一3 抑制剂z v a d f m k “，同样可以抑制c a s p a s e 一3 发挥其引发细胞凋亡的活性。j i n m l 等报道在用不同浓度h 。o ，诱导培养的r p e 细胞发生凋亡的过程中，在h 。o 。暴露组c a s p a s e 一3 含量显著增加，作者认为是氧自由基的产生和r p e 线粒体功能紊乱，激活了c a s p a s e 一3 ，从而引起细胞凋亡。2 b c 卜2 家族b c 卜2 家族的成员有很多，与r p e 细胞凋亡相关的成员可分成两类：( 1 ) 抑制细胞凋亡类，包括b c 卜2 、b c 卜x 。和b c l - w ；( 2 ) 促进细胞凋亡类，包括b a x 、b a k 和b a d 4 8 j 。b c l 一2 蛋白主要存在于线粒体膜、核膜和内质网膜上。b c 卜2 蛋白通过抗氧化效应，阻止胞内c a 2 + 流动，阻止p 5 3 和c m y c 的核内定位以及抑制线粒体膜释放细胞色素c ，进而抑制c a s p a s e 的活化”“。多种刺激因子所致r p e 细胞凋亡中，可以检测到b c 卜2 蛋白的下降”“。现已知缺血可诱导人r p e 细胞发生凋亡。研究者采用兴奋性氨基酸受体( n m d a )抑制剂f l u p i r t i n e 对抗缺血所致的凋亡效应研究中，应用免疫印迹法检测b c 卜2 蛋白含量时发现，加入f l u p i r t i n e 组较对照组b c 卜2 蛋白含量上升。b c 卜x 。是b c l 家族中另一抑制凋亡成员。b r y c k a e r t “1 和m a s c a r e l l i 3 ”报道了f g f 2 可增强r p e 细胞对f g f l 诱导的细胞凋亡的抵抗能力。其中，f g f 2 诱导凋亡前b c 卜x 。基因的从头合成和b c l x 。蛋白表达增加起关键作用。如果使用e r k 2 抑制剂减少b c 卜x 蛋白合成，或者使用反义寡核苷酸处理b c 卜x 基因均可削弱f g f 2 的保护效应。这些结果提示，b c 卜x 。蛋白是f g f l 诱导的r p e 细胞凋亡的重要保护因素。b a x 是b c 卜2 家族中另一重要的成员。在体内b a x 可形成二聚体( b a x b a x ) ，或与b c l 2 形成异二聚体( b a x b c 卜2 ) 。b a x b c 卜2 异二聚体形成是细胞凋亡调控中的一个非常重要的环节，即可概括为“二聚体决定细胞命运”。当b a x b c 卜2 过量表达时，可促进细胞凋亡。l i a n g 3 等在u v a 和柔红霉素诱导r p e 细胞凋亡实验中，采用抗体法和流式细胞仪检测细胞b c l 一2 、b a x 和b c 卜x l ，发现正常情况下b c l 2 高表达同时b a x 低表达，从而保证r p e 细胞抵抗诱导凋亡刺激的作用。而在u v a 光照射和柔红霉素处理后，b a x 与b c 卜2 的含量发生变化：b a x 含量上升而b c 卜2 含量下调。利用抗癌药物的这种作用，以局部注射的方式导入，诱导增殖的r p e 细胞凋亡，为临床提供了一条治疗p v r 的新思路。3 t n f 受体家族能与配体结合并启动细胞死亡的细胞膜表面分子，称为死亡受体( d e a t hr e c e p t o r ，d r ) 。死亡受体部属于t n f 受体超家族。死亡受体与配体结合后，活化c a s p a s e 引起细胞凋亡。近1 0 年来在生物医学各个领域，t n f 受体家族中的f a s f a s l ( c d 9 5 c d 9 5 l ) 系统被广泛而深入的研究。正常情况下，f a s 和f a s l 在眼角膜上皮、角膜内皮细胞和一些基质细胞强表达，在虹膜和睫状体弱表达。在视网膜、视网膜神经上皮表达f a s 和f a s l 的阳性信号，r p e 细胞弱表达f a s 和f a s l 。e s s e r 用流式细胞仪和免疫组织化学技术显示，人r p e 细胞表面组成性表达c d 9 5 。i n f y 和t n f 一处理可增强c d 9 5 表达。1 0um o l l 地塞米松作用2 4 h 可以减弱c 5 介导的r p e 细胞凋亡，同时地塞米松抑制炎症与瘢痕的作用，使其似乎有益于人眼p v r 的治疗。c h a n g ”等的研究表明，c d 9 5 介导的人r p e 细胞凋亡只发生在增殖期的r p e 细胞上，而对最初处于非增殖状态的r p e 细胞，虽然细胞表面同样表达c d 9 5 ，然而加入c d 9 5 抗体却不能诱导出细胞凋亡。这表明c d 9 5 c d 9 5 l 抗体系统在生理状态下，主要起到去除异常增殖r p e 细胞的作用。4 p 5 3野生性p 5 3 的一个重要功能是作为一种转录因子，在细胞的g 1 期监控细胞基因组d n a的完整性。如果d n a 受损，p 5 3 使细胞停滞在g 1 期，修复后再进入m 期：如果不能修复，则诱导细胞凋亡，避免细胞癌变”。在许多诱导剂诱导的r p e 细胞凋亡中，均发现了p 5 3含量的升高o 。j i n ”等利用视杆细胞外节( r 0 s ) 诱导r p e 细胞凋亡，应用免疫印迹法检测样本中p 5 3 蛋白的含量，结果显示与未加r o s 组比较，实验组p 5 3 蛋白含量上升了1 0 0 。作者认为，在r o s 的诱导下，同时启动了d n a 修复和促凋亡基因p 5 3 表达的增加，诱发r p e 细胞凋亡可提供一种防护机制，使受损细胞不能存活。5 c m y c已知c m y c 基因具有双重作用。激活c y c 基因的转录所表达的m y c 蛋白，与其伴随体m a x 结合发挥转录因子功能，一方面激活介导增殖基因，另一方面又引发细胞凋亡过程“。而决定细胞选择哪种情况必须有外来的第二信号参与。管红兵“7 1 等对p v r 患者玻璃体切除物组织细胞进行t u n e l 染色和免疫组织化学检测发现，r p e 细胞有不同程度凋亡，与之对应的在凋亡细胞中c m y c 蛋白检测阳性。作者认为在p v r 中c m y c 基因的表达可能与凋亡的调控相关。56 c f o s已发现原癌基因c f o s 有诱导神经细胞凋亡的作用“。其编码的产物c f o s 蛋白是转录因子活化蛋白2 l ( a p 2 1 ) 复合体中的一员，后者是由f o s 家族( c f o s 、f r a 一1 、f r a 一2 、f o s b ) 和j u n 家族( c j u n 、j u n d 、j u n b ) 的成员构成的异源二聚体，a p 2 1 参与调控视网膜中多种基因的表达“。最近的研究表明“，c f o s 在光诱导的感光细胞凋亡中是必不可少的。l i a n g 等“5 1 将离体培养的人胚r p e 细胞在1 8 1 7 5 3 0 0 l x 下光照3 0 m i n 进行光损伤后进行细胞原位杂交检测到c f o s 基因的表达，推测由于光损伤导致的d n a 的破坏“o和破坏产物引起了c f o s 基因的表达，并认为c f o s 基因的表达是r p e 细胞受到光损伤的最早信号。( 四) r p e 细胞凋亡与玻璃体视网膜疾病随着对r p e 细胞凋亡诱导因素、基因调控等方面的逐渐深入研究，发现越来越多的眼底疾病与r p e 细胞凋亡有关。l _ 年龄相关性黄斑变性年龄相关性黄斑变性( a g e r e l a t e dm a c u l a rd e g e n e r a t i o n ，a r m d ) 是西方国家老年人的一个主要致盲眼病，其发病率和致盲率与年龄的增长密切相关。关于a r m d 的病因并未完全明了，有研究表明r p e 细胞的损害发生于a r m d 早期，a r m d 可能是各种因素造成r p e 功能代偿失调和细胞死亡导致的黄斑变性退变“。体外实验证实，氧化应激可以诱导r p e 细胞发生凋亡，这可能是a r m d 早期r p e 细胞死亡的一个途径m 。s e k o “”等使用电镜和t u n e l 染色观察蓝光( 波长4 4 0 n m 1 0 珊) 照射不含吞噬体小鼠r p e 细胞后发现，r p e 细胞暴露在2 7 m w c m 2 蓝光下2 4 h 后，电镜可见凋亡小体的出现。经2 o m w c m 2 蓝光照射6 0 h ，可以同时观察到凋亡小体、核固缩、核碎裂和少量t u n e l 阳性细胞。4 0 m w c 莳蓝光照射引起r p e 细胞坏死。使用3 0 l t 0 1 几的n a c ( 一种自由基清除剂) 的对照组，t u n e l 染色无阳性。这说明，中等强度的蓝色光能够通过氧自由基引起r p e 细胞的凋亡。沉积在r p e 细胞中的脂褐质也有类似的毒性作用。s u t e r 等“”发现一种荧光性的脂褐质成分a 2 e( n r e t i n y l n r e t i n y l i d e n ee t h a n o l 锄i n e ) 可以通过线粒体途径诱导出r p e 细胞的凋亡。同时，a 2 e 还可以协同光毒性，一起造成r p e 细胞发生凋亡。这可能是a r m d 视网膜上r p e 代谢紊乱和坏死、感光细胞死亡，最终导致视力丧失的原因。体外实验同样证实，微量元素和抗氧化剂能减弱由各种因素损伤视网膜后激发的自由基的活性，可提高r p e细胞凋亡的敏感性，进而阻止a r m d 的发生和发展o “。这为a r m d 的早期防治提供了一条可能的途径。2 脉络膜新生血管膜形成脉络膜新生血管膜形成( c h o r o i d a ln e o v a s c u l a r i z a t i o n ，c n v ) 在a r m d 患者中的发生率约1 5 ，但却是导致a r m d 严重视力丧失的首要原因( 约占8 0 ) “。多位研究者的研究发现，从发生c n v 的a r m d 患者眼中切除的c n v 膜中有细胞凋亡的发生“。h i n t o n 5 ”等采用t u n e l 染色、免疫组化技术和细胞抗原定型等方法，对1 0 例行手术切除的c n v 膜进行了分析。结果显示有9 例标本t u n e l 染色阳性，f a s f a s l 分布与t u n e l 阳性细胞一致。细胞抗原定型显示t u n e l 阳性细胞主要为c k 1 8 标记的r p e 细胞，在过度血管化的基质中6有大量t u n e l 阳性细胞沿血管缘分布：在纤维化的膜中仅有少量t u n e l 阳性细胞；在相邻的r p e 单细胞层和视网膜神经层中没有发现t u n e l 阳性细胞。同时f a s 在c n v 膜中表达与发生细胞凋亡的数目具有相关性，组织化学染色证实f a s 高表达于r p e 细胞上。这说明在c n v的发生过程中，细胞凋亡机制致使大量细胞成分以非炎性途径死亡，从而导致血管膜演变成瘢痕组织，最终阻止了营养物质从脉络膜向视网膜内层的扩散，导致视网膜感光细胞和神经层进一步损害。详细地阐明这一机制将有助于更好地治疗a r m d 相关的c n v 。3 增生性玻璃体视网膜病变国内外学者在人眼增生性玻璃体视网膜病变( p r o l i f e r a t i v ev i t r e or e t i n o p a t h y ，p v r ) 标本上发现了r p e 细胞凋亡现象。e s s e r ”等应用末端标记的d u t p 在p v r 患者切除的视网膜中检测出不同细胞类型的凋亡小体。w e l l e r “”等报道了在外伤性p v r 患者的牵引膜中发现有死亡受体的表达。国内学者也在p v r 患者玻璃体切割术获得的增殖膜和视网膜前膜标本中，检测到不同程度的r p e 细胞的凋亡现象“”。咀上实验均证实了增生性玻璃体视网膜病变中确有r p e 细胞凋亡现象。组织病理和超微结构研究表明，p v r 的增殖膜内存在已转化的r p e 细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞及巨噬细胞。r p e 细胞被认为在p v r膜形成中尤为重要。最近，e s s e r “”等对4 6 例玻璃体视网膜疾病( 增生型糖尿病视网膜病变、外伤性p v r 、自发性p v r 和黄斑视网膜前膜) 患者行玻璃体切割术，取视网膜前膜样本进行分析，发现黄斑视网膜前膜的标本中，r p e 和胶质细胞均为主要细胞型。在r p e细胞发生凋亡的同时，胶质细胞t u n e l 染色和g f a p 抗体染色阴性，提示星形胶质细胞并未发生凋亡。这可能是p v r 膜中细胞成分逐渐减少，胶质瘢痕逐渐形成的原因。可以推测p v r 增殖膜的病理进程，是细胞增殖和凋亡双重网络调节作用的结果，改变这种平衡使之朝着凋亡方向发展可以提供一种治疗p v r 的新手段。( 五) r p e 细胞凋亡相关疾病的治疗现状随着对r p e 细胞凋亡基因调控以及对有关该细胞凋亡相关疾病两方面的逐步深入研究，基因治疗、细胞因子或生长因子以及视网膜移植的应用已成为目前治疗该类疾病研究的热点。1 基因治疗目前已经了解到有许多基因都能促进或抑制r p e 细胞的凋亡。通过改变细胞内控制凋亡基因的表达，或者从体外导入表达正常的功能基因来调节细胞凋亡的发生，已经成为目前治疗遗传性疾病的一个主要研究方向，即基因治疗。应用载体( 如病毒载体) 、化学或物理方法( 如显微注射、电穿孔等) 将正常基因导入眼组织相应细胞内使其表达以代替缺陷基因。1 9 9 2 年，t r a v i s 等用表达正常基因转染到视网膜变性鼠( r e t i n a ld e g e n e r a t i o ns l o w ，r d s ) 的受精卵中，成功挽救了部分光感受器细胞的丧失，开创了基因治疗在眼科应用的先河。基因导入眼内的方法有两种，一种是将基因转染到培养的视网膜细胞、r p e 细胞或者成纤维细胞，然后再将转染基因的细胞导入视网膜下腔或玻璃体；另一种方法就是使用载体将基因直接转染到原位载体细胞。最常用的基因载体有单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体以及逆转录病毒载体“3 。每种载体各有优缺点。b e n n e t t 等”将带有鼠正常基因b p d e 的c d n a 整合到腺病毒载体后注入7视网膜变性( r e t i n a ld e g e n e r a t i o n ，r d ) 鼠( b p d e 基因缺陷) 的视网膜下腔中，结果b p d e 基因成功转染，p d e 的活性增加，并且光感受器死亡时间延缓了6 个星期。这是迄今为止报道最成功的视网膜变性疾病方面的基因治疗。最近，l e w i n 等“”利用腺病毒相关病毒载体，在转基因的视紫红质p 2 3 h 突变大鼠上用核糖核酸挽救了光感受器的变性。国内也有相应的研究”，将稳定转染g f p 基因的人r p e 细胞植入兔眼视网膜下间隙，通过激光共聚焦显微镜观察到g f p 能长期稳定地表达。基因治疗目前仍属实验探索阶段。基因治疗的效果尚不清楚是由于基因表达的作用还是伴随生长因子的释放引起的或者是机体对病毒载体的免疫反应所致。有证据表明，基因治疗可导致神经营养因子的释放，而它的释放亦能防止光感受器细胞的变性”。基因治疗虽然给人们展示了一个美好的前景，但仍有许多问题亟待解决，如目的基因的有效转染，功能基因的长期表达，并且不会直接或间接地对人体造成损害等方面仍需进一步研究。2 细胞因子或生长因子细胞因子是一大类多肽或糖蛋白分子，在细胞生长及分化的调控及信号传导过程中起重要作用。生长因子是细胞生长所必需的一类细胞因子。近年来的研究发现，细胞因子或生长因子在细胞凋亡过程中也有非常重要的作用。一般来说，凡是对细胞分裂增殖有刺激作用的生长因子，如成纤维细胞生长因子( g r o w t hf i b r o b l a s tf a c t o r ，f g f ) 、神经生长因子( n e r v eg r o w t hf a c t o r ，n g f ) 、上皮细胞生长因子( e p i d e r m a lg r 0 w t hf a c t o r ，e g f ) 等都对细胞凋亡有抑制作用。相反，某些细胞因子可直接引起细胞凋亡，如具有多种生物学功能的肿瘤坏死因子( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r ，t n f ) 不仅可诱导肿瘤细胞、树突状细胞及大鼠肝细胞出现凋亡，也能诱导r p e 细胞凋亡嘟1 。因此，生长因子可调节细胞凋亡。通过应用生长因子可作为治疗由细胞凋亡所致疾病的一种方法。最先由f a k t o r o v i c h 等蚓将碱性成纤维细胞生长因子( b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ，b f g f ) 注射到皇家外科学院( r o y a lc 0 1 1 e g eo fs u r g e o n s ，r c s ) 大鼠的玻璃体腔中，结果光感受器长期存活。其潜在的不足之处是b f g f 作用于多种细胞，缺乏特异性。它能引起实验兔的白内障和增生性玻璃体视网膜病变“。后来，一类存在于中枢神经系统，并对神经元的发生、分化、存活起重要作用的神经营养因子受到重视，包括脑源性神经营养因子( b r a i n d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r ，b d n f ) 、n g f 、睫状神经营养因子( c i l i a r yn e r v e t r o p h i cf a c t o r ，c n t f ) 以及神经营养素4 5