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卜氯甲基杂氮硅三环遗传毒性和生殖毒性研究 摘要 目的研究一种新开发的生物有机硅化合物一卜氯甲基杂氮硅三环在遗传和生殖方面 的毒性作用，可为下一步实验的剂量选择提供依据，最终结合人群流行病学调查资料来全 面阐明该化合物的毒性及其潜在危害，预测人类接触或使用该化合物时的安全程度，为制 订相应的卫生标准提供科学依据，同时也为生物有机硅化合物作为药物走向临床提供有意 义的基础研究资料。 方法按照o e c d 准则采用细菌回复突变实验和大鼠两代繁殖毒性实验来检测卜氯甲 基杂氮硅三环在遗传和生殖方面的毒性作用。细菌回复突变实验选择组氨酸缺陷型鼠伤寒 沙f 箝t a 9 7 、t a 9 8 、t a l 0 0 、t a l 0 2 四个菌株，卜氯甲基杂氮硅三环设5 个剂量组：8 、4 0 、 2 0 0 、1 0 0 0 和5 0 0 0r t g m 1 ，同时设置阳性对照组、溶剂对照组和空白对照组，采用平板掺 入法，在加与不加诱导剂s 9 的条件下，测其回变菌落数，回变菌落数超过空白对照组自发 回变菌落数2 倍以上，并呈剂量一效应关系时，判定结果为阳性，提示该物质具有潜在的致 突变作用。大鼠两代繁殖毒性实验选用健康s p f 级s d 大鼠2 4 0 只，随机分为4 个组，每组雌 雄各3 0 只，设低、中、高三个剂量组，同时设空白对照组。采用连续繁殖两代，每代各一 窝的方法，卜氯甲基杂氮硅三环按0 、1 2 8 、5 0 9 和2 0 3 7m g k g q d 。1 的剂量掺入饲料中， 至少连续喂养大鼠8 周后交配。实验过程中观察动物的一般反应，称量亲代动物体重及子 代动物的体重、身长、尾长、窝重等指标，测定大鼠血常规w b c 、r b c 、h g b 、p l t 、 h c t 、m c v 、m c h 、m c h c 、p d w 、m p v 、p l c r 、白细胞分类及生化a l ，t 、a s t 、a s t a 【，t 、 t p 、a l b 、g l b 、a g 、t b i l 、b u n 等指标，取大鼠和仔鼠的生殖器官称重计算脏体比， 进行病理组织学检查，并计算繁殖指数、实际染毒剂量。 结果细菌回复突变实验中，鼠伤寒沙门菌t a 9 8 菌株在加入诱导剂s 9 的条件下卜氯 甲基杂氮硅三环各剂量组回变菌落数都大于空白对照组自发回变菌落数的2 倍，且呈剂量 一效应关系，实验结果为阳性。两代繁殖毒性实验中各组动物进食、饮水、活动均未见明 显异常。低剂量组子一代大鼠受孕率增高( 尸 0 0 5 ) ，子二代仔鼠哺育成活率增高( 尸 0 0 5 ) ，中剂量组子一代仔鼠出生存活率增高( 尸 0 0 5 ) ，子二代仔鼠哺育成活率下降( p o 0 5 ) ，高剂量组子二代仔鼠哺育成活率下降( 尸 0 0 5 ) 。各剂量组大鼠部分时间段平 均体重与对照组相比有增加( 尸 o 0 5 ) ，血常规检查p d w 、m p v 、p l c r 都明显升高( 尸 o 0 1 ) ，仔鼠出生时平均体重、身长、尾长与对照组相比都降低( 尸 0 0 5 或p 0 0 1 ) ， 之后恢复正常，2 1 天时高剂量组仔鼠平均体重、身长高于对照组( p o 0 5 或p 0 0 1 ) 。 其余指标未见明显异常。 结论卜氯甲基杂氮硅三环对于鼠伤寒沙门菌没有抑制作用，细菌回复突变实验结果 阳性，提示其有潜在的致突变作用。大鼠两代繁殖毒性实验低剂量组未观察到明显的生殖 i i i 山西医科大学硕士学位论文 毒性反应，而中、高剂量组出现仔鼠哺育成活率下降，出生时体重、身长、尾长降低，所 以卜氯甲基杂氮硅三环对于s d 大鼠的最大无作用剂量为雌性1 4 6m g k g 1 d 一、雄性1 5 5 m g k g q d 。大鼠部分时间段的体重有增加，仔鼠2 l 天时高剂量组体重增高，血常规检查 p d w 、m p v 、p l c r 明显升高，提示卜氯甲基杂氮硅三环可能会影响大鼠的生长发育和 凝血系统。此化合物作为新型的植物生长促进剂广泛应用于农业生产或用于临床药物的开 发还需要做进步的实验来全面阐明其毒理学方面的作用。 关键词卜氯甲基杂氮硅三环，生物有机硅化合物，植物生长促进剂，致突变作用， 生殖毒性 i v 山西医科大学硕士学位论文 a s t u d yo ng e n e t i ca n dr e p r o d u c t i v et o x i c i t yo f c h l o r o m e t h y l s i l a t r a n e a b s t r a c t o b j e e t s ：t os t u d yt h eg e n e t i ca n dr e p r o d u c t i v et o x i c i t yo fan e wb i o o r g a n o s i l i c o n c o m p o u n d - - - - c h l o r o m e t h y l s i l a t r a n e w i t ht h er e s u l t so f t h e s et e s t s ，o t h e rt e s t sc a l lb ef o l l o w e du p ， a n de v e n t u a l l yt oc l a r i f yt h et o x i c i t ya n dp o t e n t i a lh a z a r d so ft h ec o m p o u n db yc o m p r e h e n s i v e e p i d e m i o l o g i c a li n v e s t i g a t i o ni n f o r m a t i o na n dt op r e d i c th u m a ne x p o s u r el e v e la n dt h er i s kw h e n i ti su s e d s c i e n t i f i cg u i d e l i n ef o rd e v e l o p m e n to fh e a l t hs t a n d a r d sc a nb ea c h i e v e d a tt h es a m e t i m em e a n i n g f u li n f o r m a t i o nc a nb eg o tf o rb i o o r g a n o s i l i c o nc o m p o u n d sa sd r u g so nc l i n i c a l r e s e a r c h m e t h o d s ：b a s e do no e c dg u i d e l i n e sw ea d o p t e dab a c t e r i a lr e v e r s em u t a t i o nt e s ta n da t w o g e n e r a t i o nr e p r o d u c t i o nt o x i c i t ye x p e r i m e n tt od e t e c tt h eg e n e t i ca n dr e p r o d u c t i v et o x i c i t y o f c h l o r o m e t h y l s i l a t r a n e f o u rs t r a i n so f s t y p h i m u r i u m ，t a 9 7 ，t a 9 8 ，t a l 0 0a n dt a l 0 2 ，w e r e s e l e c t e di nt h eb a c t e r i a lr e v e r s em u t a t i o nt e s tw i t hf i v ed o s e sl e v e l so f8 ，4 0 ，2 0 0 ，10 0 0 ，5 0 0 0 嵋 p e rp l a t e a tt h es a m et i m et h ep o s i t i v ec o n t r o lg r o u p s ，as o l v e n tc o n t r o lg r o u pa n dan e g a t i v e c o n t r o lg r o u pw e r ea l s os e tu p p l a t e - i n c o r p o r a t i o na s s a yw a sc o n d u c t e dw i t ha n dw i t h o u ts 9 a c t i v a t i o n t h ec o l o n i e sw e r ec o u n t e da n dap o s i t i v er e s u l tw a sj u d g e dw h e nt h er e v e n a n t c o l o n i e so fe x p e r i m e n t a lg r o u p sw e r et w ot i m e sm o r et h a nt h o s eo ft h en e g a t i v ec o n t r o lg r o u p ， a n du n d e rt h ec o n d i t i o no fh a v i n gad o s e - e f f e c tr e l a t i o n s h i p i nt h et w o g e n e r a t i o nr e p r o d u c t i o n t o x i c i t ye x p e r i m e n t ，2 4 0h e a l t h ys p f - s dr a t sw e r es e l e c t e da n dr a n d o m l yd i v i d e di n t of o u r e x p e r i m e n t a lg r o u p s e a c hg r o u ph a d3 0f e m a l er a t sa n d3 0m a l er a t s t h ed o s e so f c h l o r o m e t h y l s i l a t r a n ew e r e0 ，1 2 8 ，5 0 9a n d2 0 3 7m g k g - 1 d - 1 w eb r e dt h e r a t sf o rt w o g e n e r a t i o n sa n dt h er a t so fe a c hg e n e r a t i o nh a dt h e i ro f f s p r i n go n c e c h l o r o m e t h y l s i l a t r a n ew a s m i x e dw i t hf e e d r a t sw e r ee x p o s e dt oc h l o r o m e t h y l s i l a t r a n ef o ra tl e a s te i g h tw e e k si ne a c h g e n e r a t i o n d u r i n gt h ee x p e r i m e n t ，t h ei n d e x e sw e r eo b s e r v e di n c l u d i n gg e n e r a lr e a c t i o n s ， w e i g h t ，l e n g t h ，t a i ll e n g t ho fo f f s p r i n g ，w e i g h to fe a c hn e s t ，l e v e l so fw b c ，r b c ，h g b ，p l t ， h c t ，m c v ，m c h ，m c h c ，p d w ，m p v ，p l c r ，c l a s s i f i c a t i o no fl e u k o c y t e s ，l e v e l so fa l t ， a s t ，a s t a l t ，t p ，a l b ，g l b ，g ，t b i l ，b u na n do t h e ri n d i c a t o r s o fr a tb l o o d r e p r o d u c t i v eo r g a n sw e r et a k e nt oc a l c u l a t et h er a t e so fo r g a n b o d yc o e f f i c i e n ta n dt oe x a m i n e t h e i rp a t h o l o g i c a lc h a n g e s ，a n dt oc a l c u l a t eb r e e d i n gi n d e x e sa n da c t u a ld o s e so ft h et r e a t e d g r o u p s r e s u l t s ：i nb a c t e r i a lr e v e r s em u t a t i o nt e s t ，t h er e v e n a n tc o l o n i e so fst y p h i m u r i u mt a 9 8w i t l l s 9w e r et w ot i m e sm o r et h a nt h o s eo ft h en e g a t i v ec o n t r o lg r o u p ，a n d 谢t had o s e e f f e c t r e l a t i o n s h i p t h er e s u l tw a sp o s i t i v e i nt w o g e n e r a t i o nr e p r o d u c t i o nt o x i c i t ye x p e r i m e n t ，t h e v 山西医科大学硕士学位论文 r a t s e a t i n g ，d r i n k i n g ，a c t i v i t i e so fe a c hg r o u ph a dn oo b v i o u sa b n o r m a l i t i e s p r e g n a n c yr a t eo f f1 g e n e r a t i o na n df e e d i n gs u r v i v a lr a t e so ff 2g e n e r a t i o ni n c r e a s e di n1 2 8m g 。k g q d 1g r o u p 伊 o 0 5 ) s u r v i v a lr a t eo fo f f s p r i n gi nb i r t ho ff 1g e n e r a t i o ni n c r e a s e da n df e e d i n gs u r v i v a lr a t e s o ff 2g e n e r a t i o nd e c r e a s e di n5 0 9m g k g q d 1g r o u pp 0 0 5 ) f e e d i n gs u r v i v a lr a t e so f f 2 g e n e r a t i o nd e c r e a s e di n2 0 3 7m g k g q d - 1g r o u p ( p o 0 5 ) t h ew e i g h t so fm a t e r n a lr a t si ne a c h g r o u pw e r ei n c r e a s e di ns o m et i m e s p d w ，m p va n dp - l c ri n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y 俨 o 01 ) a n dw e i g h t ，l e n g t ha n dt a i ll e n g t ho fo f f s p r i n gi nb i r t hr e d u c e d 妒 5 0 0 0 m g k 分1 ，大鼠急性经皮l d 5 0 2 1 5 0 m g k g ；对兔皮肤、眼睛 均无刺激性；豚鼠皮肤变态反应( 致敏) 试验的致敏率为0 ，无致敏作用。但是以上毒性试 验数据资料并没有注明来源。 1 3 本论文的研究目的、方法和意义 卜氯甲基杂氮硅三环是一种在医药、农业等领域具有良好市场前景的化合物，很有开 发价值，然而有关其毒性作用的文献报道国内少见。 山西医科大学硕士学位论文 本研究根据o e c d ( o r g a n i z a t i o nf o re c o n o m i cc o o p e r a t i o na n dd e v e l o p m e n t ) 、f d a ( u n i t e ds t a t e sf o o d a n dd r u ga d m i n i s t r a t i o n ) 、e m e a ( e u r o p e a na g e n c yf o rt h ee v a l u a t i o no f m e d i c i n a lp r o d u c t s ) 、u s e p a ( u n i t e ds t a t e se n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na g e n c y ) 、i s o 等组织 的化学品测试方法，并参照我国国家环境保护局化学品测试准则m 1 ，化学品测试方 法h 7 1 ，化学品毒性鉴定技术规范m 1 和g b l 5 6 7 0 1 9 9 5 农药登记毒理学试验方法旧1 进行实验设计和实验方法的选择及规范。 选用一组鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型实验菌株测定卜氯甲基杂氮硅三环的诱变性，通 过检测其是否引起菌株产生碱基置换或移码突变，对其遗传毒性以及是否具有潜在致癌作 用进行探究，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性。 另一方面，通过s d 大鼠两代繁殖毒性实验，检测卜氯甲基杂氮硅三环对大鼠整个生 殖过程的毒性作用，以阐明其对s d 大鼠性功能、性周期、交配行为、受孕功能、妊娠过 程、分娩及子代生长发育的影响，获得其对动物亲代生殖与子代早期发育影响的一般性资 料，同时取得子代死亡、畸形等方面初步资料。 通过以上实验结果，为下一步实验剂量选择提供依据，最终结合人群流行病学调查资 料来全面阐明该化合物的毒性及其潜在危害，预测人类接触或使用该化合物时的安全程 度，为制订相应的卫生标准提供科学依据，也为扩大生物有机硅化合物作为治疗剂走向临 床提供有意义的基础研究资料。 6 山西医科大学硕士学位论文 2 1 材料 第二章细菌回复突变实验 2 1 1 受试物 卜氯甲基杂氮硅三环，白色粉末，有异味，由某公司提供。 2 1 2 菌株 鼠伤寒沙门菌( t y p h i m u r i u m ) t a 9 7 、t a 9 8 、t a l 0 0 、t a l 0 2 菌株，由广州市疾病预 防控制中心赠送。 2 1 3 试剂 2 1 3 1 代谢活化系统 肝混合功能氧化酶混合液( s 9 混合液) ，由广州市疾病预防控制中心赠送。 2 1 3 2 阳性对照试剂 叠氮化钠( n a n 3 ) ，上海化学试剂公司，批号1 2 9 h 0 0 6 8 ； 2 一氨基芴( 2 - f a ) ，s i g m a ，批号4 3 1 0 1 2 ； 敌克松( d e x o n ) ，s i g m a ，批号4 0 1 2 0 1 ； 丝裂霉素c ( m y t o m y c i nc ，m m c ) ，s i g m a ，批号2 0 3 0 1 6 ； l ，8 一二羟葸醌，s i g m a ，批号2 2 0 5 1 2 。 2 1 3 3 其它试剂 二甲基亚砜( d m s o ) ，s i g m a ，色谱纯，批号1 2 9 h 0 0 6 8 ； d 一生物素( 分子量2 4 4 ) ，上海化学试剂公司，批号0 6 0 5 0 1 ； l 一组氨酸( 分子量1 5 5 ) ，上海化学试剂公司，批号0 1 0 1 0 9 ； 氨苄青霉素，齐鲁制药厂，批号2 0 0 7 0 2 0 0 3 9 ； 结晶紫，北京化学试剂公司，批号0 7 0 1 2 5 ： 四环素，齐鲁制药厂，批号2 0 0 7 0 2 0 0 4 8 。 实验中所需其余试剂，氯化钾( k c l ) 、氯化镁( m g c l 2 6 h 2 0 ) 、磷酸二氢钠 ( n a i l 2 p 0 4 2 h 2 0 ) 、磷酸氢二钠( n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ) 、枸椽酸( c 6 h 8 0 7 h 2 0 ) 、磷酸氢 二钾( k 2 h p 0 4 ) 、磷酸氢氨钠( n a n h 4 h p 0 4 4 h 2 0 ) 、硫酸镁( m g s 0 4 7 h 2 0 ) 、琼脂粉、 氯化钠( n a c l ) 、葡萄糖、牛肉膏、胰胨，均购于广州化学试剂厂，分析纯。 2 1 4 仪器设备 千分之一电子天平，b s 3 2 3 s 型，北京赛多利斯；二氧化碳培养箱，3 7 1 型，f o r m a ： 生物显微，o l y m p u s ；全自动高压蒸汽灭菌器，c l 一3 2 l 型，日本a l p ；超净工作台，s w c j i f 型，苏州安泰；生物安全柜，1 2 8 5 型，f o r m a ；液氮冰箱，v 一1 5 0 0 型，c b s ；普通冰箱， h i s e n s e ；自动双重纯水蒸馏器，6 3 1 u v u f ，a r i u m ；台式p h 计，5 1 0 型，e u t e c h ；水浴 7 山西医科大学硕士学位论文 恒温振荡器，s h z 一8 8 型，江苏金坛；电热恒温干燥箱，d g g 一9 1 4 0 a 型，上海森信。 2 2 方法 2 2 1 剂量设计 依据o e c dg u i d e l i n e sf o rt e s t i n go f c h e m i c a l s 随川和我国卫生部化学品毒性鉴定技术规 范h 引。卜氯甲基杂氮硅三环按5 - - 5 0 0 0 斗g 皿剂量设定5 个等比组距剂量组，分别为8 、 4 0 、2 0 0 、1 0 0 0 、5 0 0 0r t g 皿。同时设置阳性物对照组，溶剂对照组( d m s o ) 和空白对照 组( 无菌双蒸水) 。阳性物对照分别为叠氮化钠1 5i - t g 1 1 1 1 、2 一氨基芴1 0l x g l l k 、敌克松 5 0l a g i m 、丝裂霉素c4 肛g m t 、1 ，8 一二羟葸醌5 0 “g l l l l 。 2 2 2 试剂配制 2 2 2 12 0 葡萄糖溶液 称取2 0 0 9 葡萄糖，加入双蒸水至1 0 0 0 m l ，0 0 6 8 m p a 高压灭菌2 0 分钟，贮于4 c 冰箱 备用。 2 2 2 2l 一组氨酸溶液 准确称取l 一组氨酸4 0 4 3 m g ，溶于1 0 0 m l 双蒸水中，0 1 0 3 m p a 高压灭菌2 0 分钟，贮 于4 冰箱备用。 2 2 2 3d 一生物素溶液 准确称取d 一生物素1 2 2 m g ，溶于1 0 0 m l 双蒸水中，0 1 0 3 m p a 高压灭菌2 0 分钟，贮 于4 冰箱备用。 2 2 2 40 5 m m 0 1 l 1 组氨酸一o 5 m m o l l d 生物素溶液 成分：d 一生物素 1 2 2 m g l 一组氨酸 7 8 m g 双蒸水至1 0 0 0 m l 使用无菌玻璃器皿配制，贮存于40 c 冰箱备用。 2 2 2 5 盐溶液( 1 6 5 m o l l dk c l + 0 4 m o l l “m g c l 2 ) 成分：氯化钾( k c l )6 1 5 9 氯化镁( m g c l 2 6 h 2 0 ) 4 0 7 9 双蒸水至5 0 0 m l 调p h 值至7 4 ，0 1 0 3 m p a 高压灭菌3 0 分钟，贮于40 c 冰箱备用。 2 2 2 6 0 2 m o l l 。1 磷酸盐缓冲液 成分：磷酸二氢钠( n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 )2 9 6 5 9 磷酸氢二钠( n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 )2 9 0 1 5 9 双蒸水至5 0 0 m l 调p h 值至7 4 ，0 1 0 3 m p a 高压灭菌3 0 分钟，贮于4 c 冰箱备用。 8 2 2 2 70 1 5 m o l l 1 氯化钾溶液 称取氯化钾1 1 1 8 9 ，用蒸馏水稀释至1 0 0 0 m l ，0 1 0 3 m p a 高压灭菌3 0 分钟，贮于4 c 冰箱备用。 2 2 2 80 8 氨苄青霉素碱性溶液 无菌条件下，称取氨苄青霉素8 0 m g ，加入0 0 2 m o l - l dn a o h 溶液1 0 m l ，混匀，贮于 4 。c 冰箱备用。 2 2 2 9 0 1 结晶紫溶液 称取结晶紫1 0 m g ，加1 0 m l 无菌水混匀，抽滤消毒，贮于4 。c 冰箱备用。 2 2 2 1 00 8 四环素溶液 无菌条件下，称取四环素4 0 m g ，加入0 0 2 m o l l 。1h c l 溶液5 m l ，贮于4 。c 冰箱备用。 2 2 2 1 1 顶层琼脂培养基 成分：琼脂粉 1 2 9 氯化钠1 0 9 双蒸水至2 0 0 m l 加热融化，每1 0 0 m l 中加入1 0 m l0 5 m m o l l d 组氨酸一o 5 m m o l l d 生物素溶液，混匀， 调p h 值至7 4 ，0 1 0 3 m p a 高压灭菌3 0 分钟，贮于4 。c 冰箱备用。 2 2 2 1 2 v o g e l b o n n e r ( v b ) 培养基e 成分：枸椽酸( c 6 h 8 0 7 h 2 0 )1 0 0 9 磷酸氢二钾( k 2 h p 0 4 )5 0 0 9 磷酸氢氨钠( n a n h 4 h p 0 4 4 h 2 0 ) 1 7 5 9 硫酸镁( m g s 0 4 7 h 2 0 ) 1 0 9 双蒸水至1 0 0 0 m l 先将前三种成分加热溶解后，再将硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水稀释至1 0 0 0 m l ， 分装后0 1 0 3 m p a 高压灭菌3 0 分钟，贮于4 。c 冰箱备用。 2 2 2 1 3 底层培养基 成分：琼脂粉7 5 9 双蒸水480ml v - b 培养基e 1 0 m l 2 0 葡萄糖溶液 1 0 m l 先将前两种成分混匀，0 1 0 3 m p a 高压灭菌3 0 分钟，无菌条件下再加入后两种成分， 充分混匀倒底层平板。按每皿2 5 - - 一3 0 m l 倒平皿，冷凝固化后倒置于3 7 c 培养箱中过夜， 以除去水分及检查有无污染，备用。 2 2 2 1 4 营养肉汤培养基 成分：牛肉膏 2 5 9 9 山西医科大学硕士学位论文 胰胨 5 0 9 氯化钠 2 5 9 磷酸氢二钾( k 2 h p 0 4 )1 0 9 双蒸水至5 0 0 m l 将上述成分混合加热溶解后，调p h 值至7 4 ，0 1 0 3 m p a 高压灭菌3 0 分钟，贮于4 。c 冰箱备用。 2 2 2 1 5 肉汤琼脂培养基 将琼脂粉7 5 9 加入5 0 0 m l 营养肉汤培养基中，加热溶化后调p h 值至7 4 ，0 1 0 3 m p a 高压灭菌3 0 分钟后贮于4 冰箱备用。 2 2 2 1 6 受试物溶液配置 称取5 0 0 m g ，溶于l m ld m s o 中，逐步稀释后，配置成1 0 m g m l - 12 m g m l 、0 4 m g m l 一、 0 0 8 m g m l ，过滤除菌后备用。 2 2 2 1 7 阳性对照物溶液配置： 无菌条件下，阳性对照物分别按照以下剂量溶于d m s o 中，贮于4 c 冰箱备用。 1 ，8 一二羟葸醌 5 0 0 1 t g m l 1 叠氮化钠 1 5 9 9 m l d 2 一氨基芴 1 0 0 1 t g m l 。1 敌克松 5 0 0 1 t g m l 以 丝裂霉素c 4 0 1 t g m l “ 2 2 3 菌株鉴定 实验前首先进行菌株的生物特性鉴定。 2 2 3 1 分离增菌 将保存的t a 9 7 、t a 9 8 、t a l 0 0 、t a l 0 2 菌株分别划线接种于营养琼脂平板，3 7 。c 培养 1 8 - - - 2 4 小时。用接种环分别刮取主平板中分离好的单个菌落接种于5 m l 新鲜营养肉汤培养 基内增菌，3 7 。c 振荡( 每分钟1 0 0 次) 培养1 0 小时。使该菌株培养物不少于每毫升1 - - - 2 1 0 9 个活菌数。 2 2 3 2 鉴定方法 实验菌株应符合如附录中表2 - 1 所示的鉴定标准，且鉴定实验重复一次。 2 2 3 2 1 组氨酸缺陷性的鉴定 加热融化底层培养基两瓶，一瓶不加组氨酸，每1 0 0 m l 底层培养基加d 一生物素溶液 0 6 m l ；一瓶加组氨酸，每1 0 0 m l 底层培养基加l 一组氨酸溶液l m l 和d 一生物素溶液0 6 m l ， 冷却至5 0 。c 左右各倒8 个平皿。冷凝后，将t a 9 7 、t a 9 8 、t a l 0 0 、t a l 0 2 菌株分别用划 线法接种于含有和不含有组氨酸的培养基中，3 7 。c 培养2 4 小时，观察细菌生长情况。组 氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长。 2 2 3 2 2 脂多糖屏障缺陷性的鉴定 1 0 山西医科大学硕士学位论文 具有深粗糙( r f a ) 的菌株，其表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些大分子物质如结晶 紫能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影响。 取0 1 m l 营养肉汤增菌液加到2 m l4 5 - - 4 6 已融化的顶层琼脂培养基中，摇匀，立即 倒在肉汤琼脂培养基上，使其均匀分布。待琼脂凝固后，在平皿中央放一直径为6 m m 的 圆滤纸上，然后将0 1 结晶紫溶液1 0 沮滴在滤纸上。3 7 培养2 4 小时。假若待测菌在滤 纸片周围有清晰透明的抑菌圈，即表示结晶紫的分子已进入细菌体内，说明该待测菌株具 有r f a 突变。 2 2 3 2 3 紫外线损伤修复缺陷的鉴定 具有紫外线损伤修复缺陷( u v r b 突变) 的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后， 不能生长，而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。 在肉汤琼脂培养基平皿的底部背面，用红笔划一直线，在培养基上沿红线用划线法接 种细菌后，用黑纸覆盖平皿的1 2 ，在1 5 瓦的紫外灯下，距离3 3 c m 处照射8 秒钟。3 7 培养2 4 小时。具有a u v r b 突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具有完整 的切除修复系统的菌株，则照常生长。 2 2 3 2 4 抗氨苄青霉素r 因子的鉴定 含r 因子的实验菌株对氨苄青霉素有抗性。因为r 因子不太稳定，容易丢失，故用氨 苄青霉素确定该质粒是否存在。 在肉汤琼脂培养基平皿背面中线，用红笔划一直线，再用微量注射器在培养基上沿红 线将1 0 i t l0 8 氨苄青霉素碱性溶液涂成一条带，待其干后，与红线垂直方向划线接种细 菌，3 7 c 培养2 4 小时。若待测菌在涂有氨苄青霉素的部位生长，说明该菌具有抗氨苄青 霉素作用，表示含有r 因子，否则表示待测菌不含r 因子或r 因子丢失。 2 2 3 2 5 抗四环素p a q l 质粒鉴定 含p a q l 质粒的实验菌株对四环素有抗性。因为p a q l 质粒不太稳定，容易丢失，故 用四环素确定该质粒是否存在。 在肉汤琼脂培养基平皿背面中线，用红笔划一直线，再用微量注射器在培养基上沿红 线将1 0 9 l0 8 四环素溶液涂成一条带，待其干后与红线垂直方向划线接种细菌，3 7 c 培 养2 4 小时。若待测菌在涂有四环素的部位生长，说明该菌具有抗四环素作用，表示含有 p a q l 质粒。否则表示待测菌不含p a q l 质粒或p a q l 质粒丢失。 2 2 3 2 6 自发回变的鉴定 每一种实验菌株都以一定的频率自发地产生回变，称为白发回变。 准备底层培养基平皿8 个，含组氨酸一生物素的顶层琼脂培养基8 管( 每管2 m l ，4 5 水域中保温) ，将待测菌株增菌液0 1 m l 加到顶层琼脂培养基的试管内，混匀后铺到底 层琼脂平板上，转动平皿，使顶层培养基均匀分布，平放固化后，置3 7 c 培养箱中孵育 4 8 小时，记数每皿回变菌落数。 2 2 3 3 鉴定结果 山西医科大学硕士学位论文 实验鉴定结果如附录中表2 - 2 、表2 - 3 所示，本实验所用鼠伤寒沙门菌t a 9 7 、t a 9 8 、 t a l 0 0 、t a l 0 2 菌株两次鉴定结果都符合标准。 2 2 4 实验方法 参照化学品测试方法“7 1 和化学品毒性鉴定技术规范m 3 采用平板掺入法。 倒平板：先将底层培养基加热溶解，4 5 。c 时按每皿2 5 - - 一3 0 m l 倒平板，冷凝固化后倒置 于3 7 培养箱中过夜，以除去水分及检查有无污染。无菌落生长方可使用。 接种：将含0 5 m m o l l j 组氨酸- 0 5 m m o l l d 生物素溶液的顶层琼脂培养基2 0 m 1 分装 于试管中，4 5 水浴中保温，然后每管依次加入实验菌株增菌液0 1 m l 、卜氯甲基杂氮硅 三环各剂量组溶液0 1 m l 和s 9 混合液0 5 m l ( 需代谢活化时) ，充分混匀，迅速倾入底层琼脂 平板上，转动平板，使之分布均匀。水平放置待冷凝固化后，倒置于3 7 培养箱里孵育4 8 小时。每受试样品检测皿加或不加s 9 混合液均作三个平行皿。 对照：各阳性物对照、溶剂对照和空白对照，也按照以上方法每管加入0 1 m l 和s 9 混 合液0 5 m l ( 需代谢活化时) ，均作三个平行皿。观察自发回变菌落数。 2 2 5 结果统计与判定 记录卜氯甲基杂氮硅三环各剂量组、空白对照组、溶剂对照组及阳性对照组的每皿回 变菌落数，并求平均值和标准差。 细菌回变菌落数超过自发回变菌落数2 倍以上，并呈剂量一效应关系，判定实验结果为 阳性。经四个实验菌株检测后，无论在加s 9 或不加s 9 条件下，只要有一个实验菌株为阳 性时，即判定卜氯甲基杂氮硅三环诱变实验结果为阳性。如果四个实验菌株在加s 9 和不 加s 9 条件下均为阴性，且重复实验结果一致时，则判定该物质诱变实验结果为阴性。 2 3 结果 实验结果如附录中表2 4 所示，各阳性物对照组回变菌落数均大于空白对照组自发回 变菌落数的2 倍，而溶剂对照组回变菌落数未见明显增加。 卜氯甲基杂氮硅三环各剂量组，鼠伤寒沙门菌t a 9 8 菌株在加s 9 条件下回变菌落数都 大于空白对照组自发回变菌落数的2 倍，并呈剂量一效应关系趋势，且实验平皿背景模糊， 可见大量散在的背景菌落，实验结果为阳性。 1 2 山西医科大学硕士学位论文 3 1 材料 第三章两代繁殖毒性实验 3 1 1 受试物 卜氯甲基杂氮硅三环，白色粉末，有异味，由某公司提供。 3 1 2 实验动物 s p f 级s p r a g u e d a w l e y ( s d ) 大鼠，由广东省卫生厅医学实验动物中心提供( 粤监证 字第2 0 0 6 a 0 1 5 号) ，选择5 0 - 7 0 93 周龄大的健康大鼠2 4 0 只，雌雄各半。 3 1 3 实验设施 广东省卫生厅医学实验动物中，l , s p f 级动物实验室，取得广东省科学技术委员会颁发的 广东省动物实验环境设施合格证( 粤检证字2 0 0 6 c 0 8 2 号) 。大鼠饲养温度2 2 3 c ，相 对湿度3 0 - - - 7 0 ；人工昼夜，1 2 小时照明，1 2 d , 时黑暗，光照强度为1 3 0 - - - , 3 2 5 勒克斯；氨 浓度、 o 0 5 ) ；受孕率亲代低、高剂量组升高、中剂量 组下降，子一代低、中剂量组都升高，且低剂量组与对照组相比差异有显著性意义( 尸 0 0 5 ) 。 子一代仔鼠低剂量组与对照组相比出生存活率和哺育成活率降低，第0 天和第4 天的 窝重也下降，但无显著性差异( 尸 o 0 5 ) ；中剂量组出生存活率、哺育成活率、每窝平均 活仔数、窝重与对照组相比都升高，且出生存活率与对照组相比有显著性差异( p o 0 5 ) 。 子二代仔鼠低剂量组与对照组相比出生存活率、哺育成活率、每窝平均活仔数、窝重 都升高，且哺育成活率与对照组相比有显著性差异( p o 0 5 ) ，而中、高剂量组哺育成活 率下降，与对照组相比均有显著性差异( 尸 0 0 5 ) 。 3 3 3 成年大鼠体重及孕鼠体重 1 6 山西医科大学硕士学位论文 3 3 3 1 亲代大鼠体重 亲代雌性大鼠低剂量组平均体重与对照组相比略有升高，第四周平均体重与对照组相 比差异有显著性意义( p 0 0 5 ) ；中剂量组平均体重与对照组相比也略有升高，第三、四、 五、六、七周平均体重与对照组相比差异有显著性意义( p o 0 5 ) ，之后平均体重与对照组相 比升高，第三、八、九周平均体重与对照组相比差异有显著性意义( p 0 0 5 ) 。见附录中表3 4 。 亲代雄性大鼠各剂量组平均体重与对照组相比也略有升高。低剂量组第三、四、五、 六、七、八周平均体重与对照组相比差异有显著性意义( 尸 0 0 1 或p o 0 5 ) ；中剂量组 第三、四周平均体重与对照组相比差异有显著性意义( 尸 0 0 1 ) ；高剂量组第三、四周平 均体重与对照组相比差异有显著性意义( 尸 0 0 5 ) 。见附录中表3 5 。 3 3 3 2 子一代大鼠体重 子一代雌性大鼠低剂量组与对照组相比平均体重下降，第五、八周有显著性差异( 尸 0 0 5 ) ，见附录中表3 6 。 雄性大鼠低剂量组与对照组相比平均体重下降，第八周有显著性差异( p 0 0 5 ) ；中 剂量组平均体重曲线与对照组基本重合；高剂量组平均体重与对照组相比第四周前略高， 第五周体重下降，第六、七、八周又升高，第七周与对照组相比差异有显著性意义( 尸 0 0 5 ) ，见附录中表3 7 。 3 3 3 3 孕鼠体重： 亲代孕鼠各剂量组平均体重与对照组相比都有所升高，且剂量越大平均体重越高，低 剂量组第0 天，中剂量组第0 、7 天，高剂量组第0 、7 、1 4 天与对照组相比差异有显著性 意义( 尸 o 0 5 或p o 0 1 ) ，见附录中表3 8 。 子一代孕鼠低剂量组第一周平均体重低于对照组，之后体重升高，1 9 天时与对照组相 比有显著性差异( 尸 o 0 5 ) ，中、高剂量组平均体重都高于对照组，1 9 天时中剂量组与对 照组相比差异有显著性意义( 尸 o 0 1 ) ，见附录中表3 9 。 3 3 4 仔鼠体重、身长、尾长 子一代仔鼠的平均体重、身长、尾长数据分别见附录中表3 1 0 、表3 一1 1 、表3 1 2 。 低剂量组平均体重0 天时与对照组相比低，差异有显著性意义( 尸 0 0 5 ) ；平均身长与对照组相比短，0 、1 4 、2 1 天时差异有 显著性意义( 尸 0 0 1 ) ；平均尾长与对照组相比也短，0 、1 4 、2 1 天时差异有显著性意义 ( j p o 0 1 或p o 0 5 ) 。 中剂量组平均体重0 天时与对照组相比低( 尸 0 0 5 ) ；平均身长0 、7 、2 1 天时与对照组相比短( 尸 o 0 1 或p o 0