（微生物学专业论文）产β甘露聚糖酶nk27菌株基因文库的构建.pdf

产目一甘露低聚糖酶n k - 2 7 菌株基因文库的构建 硕士生毕业论文 摘要 地衣芽孢杆菌n k 2 7 株可以产b 。甘露聚糖酶，通过质粒检测与质粒消除实 验证明产酶基因位于染色体上。随后用鸟枪法筛选目的基因。将n k 2 7 菌用溶 菌酶破壁后，经蛋白酶k ，苯酚除蛋白得到高分子量染色体，以最佳酶切条件 即7 0 u u g ，3 7 c3 h o u r ，用e c o r i 将其切割至长度为1 - 7 k b 左右，大量制备所 需大小的染色体片段，经琼脂糖凝胶电泳，用电洗脱法回收。纯化后与去磷酸 化的1g t l l 载体的e c o r i 臂连接成重组d n a ，经体外包装成为完整的重组噬菌 体，从而得到该菌基因组文库。经滴度测定符合建库要求。将重组噬菌体感染 大肠杆菌y 1 0 8 9 宿主株，获得溶源化细菌。通过筛选溶源化重组子，并检测表 达出的融合蛋白的b 甘露低聚糖酶活力的方法，筛到一株有产酶能力的溶源 子。经薄层层析分析，该融合蛋白可将魔芋粉分解为二糖、三糖。 关键词：b 一甘露聚糖酶 g m 载体y 1 0 8 9 基因文库 兰! ：苎壁堡窭堕墼坠! ! 堕楚墨里奎壁塑塑塞一坠兰壁垒坐! 生生 a b s t r a c t b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sn k 2 7s t r a i nc a np r o d u c e1 3 - m a n n a n a s e t h r o u g ht h e e x a m i n a t i o na n de l i m i n a t i o no ft h ep l a s m i d s w er e a c ht h ec o n c l u s i o nt h a tt h e 0 m a n n a n a s eg e n ei sl o c a t e do nt h ec h r o m o s o m eo f n k - 2 7 t h e n w ei s o l a t et h eg e n eb y g u n s h o ta p p r o a c h a f t e rl y s i s i n gt h en k - 2 7b yl y s 6 z y m e ，w eo b t a i ni t sc h r o m o s o m e w h i c hm o l e c u l a rm a s si sh i g hp r o t e i n sa r ed i g e s t e da n da b s t r a c t e db yp r o t e a s ek a n d p h e n o l t h ep u r i f i e dc h r o m o s o m ed n aa r ep a r t i a l l yd i g e s t e db ye c o r i ( 7 0 u u g ) i n 3 7 。cf o rt h r e eh o u r sa f t e rd i g e s t i o nt h ec h r o m o s o m e sa r ec l e a v a g e di n t o1 - 7 k b d n af r a g m e n t s p r e p a r e l a r g e a m o u n t so ft h e s ed n af r a g m e n t si nt h es a m e c o n d i t i o n ，e l e c t r o p h o r e s i si na g a r o s ea n dr e t r i e v et h e m a f t e rp u 曲n gl i g a t e t h ed n a f r a g m e n t st ot h ee c o r id i g e s t e da n dd e p h o s p h o r y l a t e dl a m b d ag t l l a r m s p a c k a g e t h er e c o m b i n a n td n aa n dt h e nb b t a i nt h eg e n o m i cl i b r a r y t h er e s u l to ft i t r a t i o n s u g g e s t s t h a tt h et i t e ro ft h e p h a g e s i s s a t i s f a c t o r y i n f e c tt h e e c o l iy 10 8 9b y r e c o m b i n a n tp h a g ea n dt h e ni s o l a t el y s o g e n s w eo b t a i nal y s o g e nw h i c hc a ne x p r e s s p r o t e i n w i t hb - m a n n a n a s ea c t i v i t y b ya s s a y i n gt h eb m a r m a n a s ea c t i v i t y o ft h e f u s i o np r o t e i ne x p r e s s e db y l y s o g e n s t h ef u s i o n p r o t e i n c a n h y d r o l y z ek o n j a c kg u m i n t od i s a c c h a r i d ea n d t r i s a c c h a r i d e k e y w o r d ： b - m a n n a n a s e g t l 1y 1 0 8 9 g e n o m i el i b r a r y 主! ：笪垦堡壅楚壁! 竺! ! 堕堡墨里奎壁竺塑堡 一生兰型型! 兰苎 1 前言 1 1 功能性低聚糖 由2 1 0 个相同的或不同的单糖以糖苷键聚合而成的糖( 可以是直链，也 可以是支链) 被称为低聚糖【1 1 ( o l i g o s a e e h a r i d e ) 。根据单糖分子的种类和单糖之 间糖苷键的类型的不同，低聚糖具有各自的名称，其理化性质和生理功能也有 区别。 所谓功能性低聚糖是指对人、动、植物具有特殊生理作用的低聚糖，它们 不被人体胃酸和消化道内的酶降解，不被小肠吸收，可到达人体的大肠部位， 促进双歧杆菌增殖。但同时，它们也具有糖类共同的特性，可直接代替蔗糖 来增加食品的甜味。目前前功能性低聚糖的生产有5 种方法；( 1 ) 从天然原料 中抽提；( 2 ) 利用转移酶、水解酶的转移反应生成。c 3 ) 利用酶水解天然多糖 生成。( 4 ) 利用酸水解天然多糖生成。( 5 ) 化学合成法生产。常见的功能性低 聚糖见表1 。 表1 常见功能性低聚糖 t a b l e l s e v e r a lc o m m o nf u n c t i o n a lo i i g o s a c c h a r i d e 糖基原料名称糖分子数常用制造方法 低聚异麦芽糖2 8 糖 葡萄糖、麦芽糖淀粉酶法 潘糖3 糖 果糖、葡萄糖蔗糖、菊苣低聚果糖3 5 糖酶法 半乳糖乳糖低聚半乳糖3 8 糖酶法 乳糖、果糖乳糖、蔗糖低聚乳果糖3 糖酶法 甘露糖、葡萄糖魔芋低聚甘露糖2 8 糖酶法 半乳糖、葡萄糖、果糖大豆根茎水苏糖4 糖天然物提取 半乳糖、果糖、葡萄糖甜菜、糖蜜棉籽糖3 糖天然物提取 木糖玉米芯低聚木糖2 5 糖酶法 功能性低聚糖与一般的食用糖如蔗糖、麦芽糖等比较，有以下优点： ( 1 ) 低甜度、低热量难以被人体消化，食用盾基本上不增加血糖血脂。 ( 2 ) 能对人体肠内双歧杆菌具有增殖作用，能抑制肠内有害菌及腐败物质 兰! ：苎墨堡墨壁壁! 竖! ! 堕堡墨里奎壁塑塑堡堡主竺兰! ! ! 鲨 的形成，增加维生素的含量，提高机体免疫力。 ( 3 ) 防龋齿功能，它们不被引起龋齿的链球菌所利用，不被口腔酶液所分 解。 ( 4 ) 近年来国外进行的小鼠试验显示，适量的低聚糖对脂类代谢有着良好 的影响，使高密度脂蛋白低密度脂蛋白( h d l l d l ) 的比例增大， 同时血清三酸甘油酯含量也减少。此外试验还显示：钙、铁、镁等矿 物质的保留大为增多。 功能性低聚糖在食品、医药、饲料添加剂以及植物保护等方面广阔的应用 前景引起各国学术和企业界的重视，尤其是具有双歧因子功效的低聚糖，因对 改善老年人的肠道菌群失调有明显效果，更加引人关注。据有关资料报导，1 9 9 5 年全世界的商业性各类低聚糖产量超过8 5 0 0 0 吨，有几种不同纯度级别的低聚 糖粉状产品，也有液体状产品，其中约有5 以上作为添加剂或配料上用在食 品、饮料等行业中。在医疗及酿造业中也广泛应用i l l 】。日本对于功能性低聚糖 的开发最为活跃，1 9 9 5 年日本保健品市场总销售额6 0 0 0 多亿日元，品种多达 2 0 0 个，1 9 种具有功能性低聚糖的消费量达4 7 万吨，产值超过百亿日元【3 】。 1 2 甘露聚糖 甘露低聚糖是上述功能性低聚糖中的一种，经b 甘露聚糖酶水解甘露聚糖 可以制取1 3 甘露低聚糖。甘露聚糖是存在于多种植物多糖中的一种半纤维素， 按多糖中的单糖成分可以把甘露聚糖的多糖分为三种类型：甘露聚糖、葡萄糖 甘露聚糖、半乳糖甘露聚糖，它们均呈线状或分枝的多糖苷链【4 】，多种植物胶 中含有甘露聚糖，如从长角豆的胚乳中提取的角豆胶，从瓜儿豆的胚乳中提取 的瓜儿豆胶为半乳糖甘露聚糖，从魔芋球茎制取的魔芋粉为葡萄糖甘露聚糖， 不同来源的甘露聚糖的分子量，甘露糖与葡萄糖或半乳糖之比例，分枝点位置 都不相同，各种甘露聚糖的性质见表2 降“。 有的甘露聚糖的主链是单一的甘露糖经8 1 4 糖苷键连接而成，有的则为 甘露糖与葡萄糖经b 1 4 糖苷键构成，分枝点则为半乳糖或葡萄糖由q 。1 6 键 连接。角豆胶和瓜儿豆胶甘露聚糖主链上的半乳糖支链分布较规则，魔芋胶中 的葡萄糖残基在主链中的分布无规则【1 】。瓜儿豆胶半乳甘露聚糖及魔芋葡萄甘 露聚糖结构见图1 、图2 。 主! ：笪墨堡鐾塑壁! ! ：! ! 堕堡苎里苎壁塑塑堡 堡圭竺兰! ! ! 生生 8 m “1 m n 卦c 图1瓜儿豆胶半乳甘露聚糖结构示意图 f i g1 s t r u c t u r eo fm a n n a n sf r o mg u a rg u m 图2 魔芋葡萄甘露聚糖的结构特性示意图 f i g 2s t m c t o r eo f m a n n a n sf r o mk o n j a c kg u m 表2 各种甘露聚糖的性质 t a b l e2 c h a r a c t e r so fd i f f e r e n tm a n n a n s 组成比例 种类分子量1 0 5主链组成支链组成分枝点位置 ( 甘：半，葡) 每隔2 个甘 角豆胶2 1 3 1甘露糖半乳糖4 ：l 露糖残基 每隔1 个甘 瓜儿豆胶 2 2 2甘露糖半乳糖2 ：l 露糖残基 甘露糖平均每隔3 9 魔芋粉1 2葡萄糖1 6 ：1 葡萄糖个己糖残基 13 b 一甘露聚糖酶 131 b 一甘露聚糖酶的分类 根据特异性基质的结构特征及酶对它们的作用特点，可以将水解b 甘露聚 3 主! ：苎墨堡墨塑堕竺! ! 堕堡差里奎壁塑塑垄 ，旦垡兰型! 些! 鲨 糖的酶分成三个主要类型：外切p 甘露聚糖酶( e x o 一1 3 m a n n a n a s e ) ，b 一甘露 糖苷酶( m a n n o s i d a s e ) 及内切b 甘露聚糖酶( e n d o - b m a n n a n a s e ) 。 外切b 。甘露聚糖酶能水解由三个或更多个单糖残基构成的多糖中的b - 1 4 糖苷键，此酶在进行水解反应时反应产物的异构体形式发生转变，不伴随转糖 基化作用。 b 甘露糖昔酶从甘露寡糖的非还原末端切下d - 甘露糖，在水解时，基质 中糖基部分的异构体形式照样保持，并伴随转糖基化作用。 研究最广泛的是内切p 。甘露聚糖酶，即本文所指0 - 甘露聚糖酶。它可以 分解线性，或有分枝的甘露聚糖，半乳甘露聚糖和葡萄糖甘露聚糖，生成低聚 甘露糖。水解反应进行时，异构体照样保持，并伴随有转糖基化作用。通过对 半乳甘露糖在高纯度b 一甘露聚糖酶作用下水解过程的研究，人们发现b 一甘露 聚糖酶分解半乳甘露聚糖的效率，程度及水解产物的组分取决于酶的微生物来 源，多糖的聚合程度，多糖主链被取代的程度和取代基的分布，也受乙酰化作 用的影响p “q 。 酶活性的测定方法对确定b 甘露聚糖酶的活性水平，特异性及归类均具有 重要意义。较普遍的测定b 甘露聚糖酶活性的方法是用不同的结构的可溶性半 乳糖和葡萄糖甘露聚糖作基质，测定反应混合物在一定时间内还原能力增长的 变化。但由于基质缺乏专一性，研究者只得利用结构和成分均不同的d 甘露糖 的多糖作为基质，因此，b 甘露聚糖酶的分类与鉴别仍需建立统一的测试标准。 1 32b 一甘露聚糖酶的来源 目前已发现很多种微生物能够产生1 3 甘露聚糖酶，包括真菌、细菌、放线 菌等，某些植物的种子也能产生。各种能产b 甘露聚糖酶的微生物总结于表 3 1 7 。 表3 各种产p 甘露聚糖酶的微生物 微生物名参考文献微生物名参考文献 产气杆菌枯草芽孢杆菌 a e r o m o n a s p f - 2 5 【3 3 】【3 4 】 4 6 】 b a c i l l u ss u b t i l i sn m - 3 9 棘孢曲霉卵型拟杆菌 a s p e r g i l l u sa c u s e a t u s 【3 5 】【4 7 】 4 8 】 b a c t e r o i d e so v a t i i s 溜曲霉 3 6 1短芽孢杆菌 【7 1 产b 一甘露低聚糖酶n k - 2 7 菌株基因文库的构建 硕士生毕业论文 a s p e r g i l l u st a m a r i i b a c i l l u sb r e v i s 黑曲霉 a s p e r g i l l u sn i g e r 【3 7 】【2 5 c a l d o e e l l u ms a e c h r o 【y t i c u m 蜡状芽孢杆菌肠球菌 b a c i l l u sc e r e u s 3 8 【4 9 】 e n t e r o c o c c u sc a r s e l i f l a r u sf l - 2 1 2 1 地衣芽孢杆菌变色多孔菌 b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 3 8 3 9 】 5 0 】 p o l y p o r u sr e s s i c o l o r 芽孢杆菌k k 0 1雪白根霉 b a c i l l u ss p k k 0 1 4 0 】 【5 1 】 r h z o p u sn i v o u s 芽孢杆菌a m 0 0 1齐整小核菌 b a c i l l u ss p a m - 0 0 1 【4 1 】 4 2 】 5 2 】 s c l e r o t i t i mr o f f s i i 芽孢杆菌n 1 6 - 5 浅青紫链霉菌 b a c i l l u ss pn 1 6 - 5 【3 0 】 【2 7 】 s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s 枯草芽孢杆菌栖热孢菌 b a c i l l u ss u b t i l i sk 5 0 4 3 】 p 3 】 t h e r m o t o g ah e a p o l i t a t e 短小芽孢杆菌 索孢壳菌 b a c i l l u sp n m i l u s 4 4 5 4 】 t h i e l a v i at e r r e s t r i s 嗜热脂肪芽孢杆菌术霉 b a c i l l u ss t e r o t h e r m o p h i l u s 4 5 】 【5 5 】 5 6 】 t r i c h o d e r m ar d ，s 西 多粘芽孢杆菌 b a c i l l u sp o l y m y x a 3 8 】 133 1 3 一甘露聚糖酶的性质 不同微生物所产生的1 3 - 甘露聚糖酶在组分、分子量、等电点、酶动力学特征、 底物专一性等方面均有一定的差异，几种不同的细菌所产b 甘露聚糖酶酶蛋白 的特性见表4 m 。 表4 不同来源的细菌b 甘露聚糖酶蛋白的特性 t a b l e4 c h a r a c t e r so f 1 3 m a n n a n a s e p r o t e i n s 来源 组分数分子量( k d a l ) 等电点参考文献 b a c i l l u ss u b t i l i sk 5 0 l 2 25 2 4 | 4 4 】 b a c i l l u ss u b t i l i sn m 3 9 1 3 84 8 4 6 】 b a c i l l u sl i c h e n o f o r m i sn k 2 7 l 2 65 0 【_ 7 】 5 5 b a c i l l u sp u m i l u s 2 【4 4 3 l 产1 3 一甘露低聚糖酶n k - 2 7 菌株基因文库的构建 硕士生毕业论文 b a c i l l u ss t e r o t h e r m o p h i l u s 1 1 6 2 4 5 】 5 l 4 3 b a c i l l u ss pn 1 6 - 53 3 82 5 4 3 1 3 4 7 2 5 5 85 9 b a c i l l u ss pa m 0 0 13 5 957 【4 1 】 4 2 】 4 25l c a l d o c e l l u ms a e c h r o l y t i c u m13 9 2 5 】 1 4 2 e n t e r o c o c c u sc a r s e l i f l a v i l $2 【5 0 1 3 7 134 d 甘露聚糖酶的应用 134 1 用于结构分析 国际上对b 甘露聚糖酶的研究始于7 0 年代，早期的研究注重于以其为工 具酶对天然多糖类物质糖链结构进行分析州。从8 0 年代开始，在多糖和复合多 糖的结构及功能方面的研究已逐渐引起学术界的重视【1 0 】。其中关于各种植物胶 复合多糖结构的研究非常活跃。 13 42 水解植物胶制取低聚甘露糖 前文己述及功能性低聚糖的各种优点及功能，因而制造出的产品在食品工 业中有广阔应用前景。甘露寡糖、乳果糖、大豆低聚糖及半乳糖基转移低聚糖 等均对双歧杆菌有增殖作用，而其中甘露寡糖的效果最为明显1 。 在人体肠道中栖息着4 0 0 多种共生细菌，其中以大肠杆菌、乳酸细菌、双 歧杆菌、粪链球菌为代表的有益菌占4 0 多种，约1 0 0 兆个，菌体重量1 k g 。它 们与人体共生形成肠内正常菌群。其中双歧杆菌是最有代表性的有益菌，其功 能包括：( 1 ) 抗衰老，微生物屏障。( 2 ) 通便、抑菌、防癌、抗癌。( 3 ) 合成 维生素及氨基酸，提高免疫力。( 4 ) 减轻肝脏负担，提高营养吸收率。( 5 ) 改 善乳制品中乳糖的消化性。( 6 ) 促进钙离子的吸收。( 7 ) 改善脂质代谢。由此 可见双歧杆菌与人体健康有着密切关系。然而随着年龄的增长，体内外因素的 变化，往往会造成机体肠道内双歧杆菌的含量大大下降，从而导致某些疾病的 产生。为解决人体肠道菌群失调的问题，目前一般有三种方法： ( 1 ) 直接服用双歧杆菌活菌制剂，即所谓“原生素”( p r o b i o t i c s ) 。 6 产口一甘露低聚糖酶n k - 2 7 菌株基因文库的构建 硕士生毕业论文 ( 2 ) 摄入双歧杆菌增殖因子，即所谓“益生索”( p r e b i o t i c s ) 。 ( 3 ) 食用活菌和双歧因子的混合物，即所谓“共生素”( s y n b i o t i c s ) 。 服用活菌制剂后，活菌体因受人体内环境的影响，如胃酸的p h 为1 2 ， 致使菌体存活期短，成活率低，在肠道内的驻留时间短等弊端，使体内双歧杆 菌增殖的效果不甚明显。而甘露低聚糖等功能性低聚糖既能为人体肠道内的双 歧杆菌所利用而使之增殖，同时又不能或很少为腐败菌所利用因此，是一种 较为理想的双歧因子。有鉴于此，低聚糖在国外早己作为商品大量进入市场， 近年来也逐渐为国内所认识和接受i ”】。b 甘露聚糖酶可用于酶法水解植物胶制 取甘露低聚糖。 1 3 4 , 3 处理半纤维索成份的工业废物 半纤维素是自然界中除纤维素外含量最丰富的多糖“4 1 ，其主要组分为异14 1 3 木聚糖和异- 14 p - 甘露聚糖。异木聚糖主要存在于草、谷物，阔叶材中，b 一甘露聚糖在针叶材中含量较多 x 5 - 1 6 】，某些细菌可以同时产生b 甘露聚糖酶，木 糖酶，1 3 - 木糖苷酶，乙酰酯酶】，这些细菌可以利用木聚糖，纤维素或者淀粉 作为唯一碳源i l ”，这几种酶之间通过混合协同作用完成对半纤维素的完全分解。 由此人们想到这类菌可以在针叶材化学浆的处理和造纸业中的纸浆酶法降解中 派上用场”，与使用基于氯气的化学试剂来处理相比，这种生物酶法处理可以 大大降低对环境的污染 2 0 - 2 1 】。 13 4 4 其它 9 一甘露聚糖酶在其他些工业过程中也十分有用，例如：它可以用来从豆 类作物中提取植物油伫2 1 ，还可以在制造速溶 n t l ；时用来降低抽提物的粘度。 1 4 p 一甘露聚糖酶的研究进展 从二十世纪七十年代至八十年代末，对b 甘露聚糖酶的研究主要集中在酶 的纯化，等电点，分子量，沉降系数的测定，最适底物分析，最适p h ，最适温 度等酶学性质方面。 1 9 8 9 年，日本的a k i n 0 继1 9 8 7 、1 9 8 8 年报道了一株嗜碱性芽孢杆菌 ( a l k a l o p h i l i cb a c i l l u ss p s t r a i na m - 0 0 1 ) 所产的b 甘露聚糖酶和p 甘露糖苷 酶的性质后，成功地从该菌株中克隆出b 甘露聚糖酶基因并在大肠杆菌中得到 了表达阱1 。对该基因进行测序发现它全长1 5 3 9 个碱基对，编码由4 8 7 个氨基酸 组成的一个成熟的口一甘露聚糖酶蛋白和一个由2 6 个氨基酸构成的信号肽，实 7 产b 一甘露低聚糖酶n k - 2 7 菌株基因文库的构建 硕士生毕业论文 际上，当a k i n o 在使用大细胞法( m a x i c e l ls y s t e m ) 检测一个携带着一段长2 0 k b 的x b a i p s t i 片段的p u c l 9 质粒所表达出的蛋白质时，同时得到了两种蛋白： 1 3 一m a n n a n a s e a 与1 3 m a n n a n a s e b ，前者为全长的肽段，而后者c o o h 端的最后 一个氨基酸v a l 位于全长肽段的第3 6 5 位。这说明这两种蛋白并非由一个前体 酶蛋白切割而来。酶a 与酶b 分子量分别为5 8 0 0 0 和4 3 0 0 0 道尔顿，由于一个 长仅为20 k b 的片段不足以同时为这两个蛋白编码，在其阅读框中可能存在重 叠基因。缺失突变测试显示，短于酶b 基因长度( 1 0 9 5 b p ) 的d n a 片段不能 编码出活性蛋白，但是一个长为1 0 9 8 个碱基对的d n a 片段编码的蛋白仍具有 1 3 甘露聚糖酶的活性。 1 9 9 1 年，e r n s tl u t h i 等人报道从c a l d o c e l l u ms a c c h a r o l y t i c u m 中克隆到一个 1 3 甘露聚糖酶基因。他们发现一个带有5 k b 长b a m i - ii 片段的 重组子能表达 出1 3 甘露聚糖酶活性。它能在含0 8 角豆胶的l b 平板上显示出暗淡的水解晕 环。将该基因克隆到p b r 3 2 2 中并进行缺失分析后，发现一个长约2 1 k b 的片段 包含着该菌的1 3 甘露聚糖酶基因。它的一个开放读码框可编码一个分子量为 3 8 9 0 4 道尔顿的蛋白质。被克隆到p u c l 8 的l a c z 启动子下游后，该基因得到了 超表达。值得注意的是，该基因下游的非编码区与从此菌中克隆到的纤维素酶 基因c e l b 有很强的同源性。这或许意味着t 3 甘露聚糖酶基因是通过同源重组 插入到该菌基因组中现在的位置的。由此通过对编码此菌产生的几种半纤维 素酶基因簇的研究可以了解它们之间的相互关系【2 6 】。 1 9 9 3 年，n o r m a n da f e a r d 等人从浅青紫链霉菌( s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s ) 中 克隆到1 3 - 甘露聚糖酶基因并进行了超表达及纯化和性质测定| 2 7 】。此前他们也曾 从该菌中克隆到木糖酶基因和纤维素酶基因。这说明在丝状菌中，分解纤维素 和半纤维素的酶具有一定相关性。从已构建的该菌的基因文库中分离到三株表 现出b - 甘露聚糖酶基因活性的转化子。所形成的菌落可以在含l 半乳甘露聚 糖的l b 固体平板上显示出水解圈。三株转化子内重组质粒所携带的d n a 片段 大小分别为4 3 k b ，1 0 k b 和4 1 k b ，在这三个片段中均存在一段1 7 k b 长的s p h i 片段。其中包含着1 3 一甘露聚糖酶基因。三株转化子产酶量均大于野生株，其中 含1 0 k b 片段的i a f 3 6 产酶量为野生株的6 0 倍。 s t e p h a np a t t u r a j a n 于1 9 9 4 年报道在曲霉( a s p e r g i l l u sa c u l i a t u s ) 中构建了 以酵母为载体的c d n a 文库，从中分离出5 7 个含有编码o 1 , 4 甘露聚糖酶的全 兰! ：笪壁堡壅蕉墼坠! ! 堕堡墨里塞壁塑塑堡堡主竺兰! ! 垒苎 长c d n a 的重组子，并在酵母中得到表达。该基因经亚克隆于米曲霉表达载体 后，转化到米曲霉中得到了超表达，重组酶分子量为4 5 k d a l ，等电点为4 5 ， 最适d h 和最适温度分别为5 0 和6 0 一7 0 。 1 9 9 6 年，f r a n c o i s em a r g a 等人用l a c 启动子代替一株浅青紫链霉菌的启动 子，从而得到了比野生株1 3 2 6 高3 5 0 倍，比克隆株i a f 3 6 高1 5 倍的表达。更 具意义的是，在穿梭质粒p l a f l 9 9 中使用l a c 启动子，使得宿主菌在不含甘露 聚糖的碳源，如木聚糖，乳清中合成这种酶，从而开辟了利用些农副产品为 原料工业生产1 3 甘露聚糖酶的可能性。 国内马延和等于1 9 9 1 年首次报道从内蒙古乌杜淖碱湖中分离到一株能产b 一甘露聚糖酶的嗜碱性芽孢杆菌( a l k a l i p h i l i cb a c i l l u ss p ) 该菌产生三种胞外碱 性b 一甘露聚糖酶，其分子量分别为5 1 0 0 0 ，3 8 0 0 0 和3 4 7 0 0 道尔顿，等电点分 别为4 3 ，2 5 ，2 5 ，最适反应温度为7 0 * c t a “圳。1 9 9 2 年又报道了该碱性1 3 甘露 聚糖酶1 6 升发酵罐的发酵工艺 3 2 】。 1 5 本人工作 本实验室筛选到一株地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) n k 2 7 ，可以 产b 一甘露聚糖酶，经诱变后产酶活力为1 5 0 2 0 0 u g m l ，酶分子置为2 6 0 0 0 道 尔顿，p i 为5 0 ，反应最适p h 7 0 ，最适温度为5 5 * ( 2 ，经测定，酶蛋白是含有糖 和脂的复合蛋白。 为了进一步深入分析该菌所产的b 甘露聚糖甘露酶，本实验室开始对为该 酶编码的基因进行研究，我的工作旨在确定产酶基因的位置( 质粒上或染色体 上) ，建立该菌的染色体文库，并对产酶基因进行筛选分离，以为将来构建工程 株，提高产酶活力以及对基因表达调控进行研究奠定基础。 2 材料与方法 2 1 材料 21 1 菌株及噬菌体株 ( 1 ) 地衣芽孢杆菌n k - 2 7 ：本实验室分离并保藏 ( 2 ) 大肠杆菌y 1 0 8 9 ：购于p r o m e g a 公司 ( 3 ) 大肠杆菌y 1 0 9 0 ：购于p r o m e g a 公司 ( 4 ) 大肠杆菌l e 3 9 2 ：购于p r o m e g a 公司 0 兰! ：苎壁堡窭堕堕! ! ：! ! 堕堡薹望奎壁塑塑垄 堡主兰曼! ! ! 鲨 ( 5 ) 噬菌体 g t l le c o r ia r m s ：购于p r o m e g a 公司 212 培养基 ( 1 ) l b 液体培养基( ) ( 纯化n k 。2 7 用) 酵母膏0 5 蛋白胨1 n a c l0 5 p h 72 一74 ( 2 ) l b 液体培养基( ) ( 培养大肠杆菌用) 聚胨o 5 酵母膏1 n a c l0 5 p h 7 5 ( 3 ) l b 固体培养基 l b 液体培养基加2 琼脂粉 ( 4 ) l b 上层琼脂培养基( ) ( 噬斑用) 聚胨0 5 n a c l0 5 琼脂0 8 m g s 0 4 ( 1 m ) ( 5 ) n z c y m 培养基 酪蛋白水解物 n a c l 酵母膏 m g s 0 4 7 h 2 0 p h 1 ( ) l 0 5 0 5 0 2 7 0 ( 6 ) 最低培养基+ + c h 2 8 】 1 最低盐培养基( g 几) k 2 i - i p 0 4 k h 2 p 0 4 ( n h ) 2 s 0 4 1 4 6 2 1 0 兰! ：笪墨堡窭塑壁! ! ：! ! 堕堡薹里奎壁塑塑垄堡主兰兰! ! ! ! 苎 m g s 0 4 。7 h 2 0 0 2 柠檬酸钠 1 p h 7 0 - 72 最低培养基 1 最低盐培养基1 0 0 m l 5 0 葡萄糖l m l 最低培养基+ y e + c h 最低培养基 1 0 0 m l 1 0 酵母提取物l m l 5 酪蛋白水解物l m l ( 7 ) 角豆胶培养基( ) 角豆胶 1 蛋白胨 o 5 酵母膏0 2 m g c l 2 o 0 2 k h 2 p o 。0 1 n a 2 c 0 3 o 3 琼脂 1 5 p h 8 5 ( 8 ) 摇瓶产酶发酵培养基( ) 魔芋粉 3 m g c l 2 6 h 2 0 0 0 6 骨胨 3 c a c l 2 0 3 玉米浆 1 5 f e s o 。7 h o o 0 0 1 ( n i l ) 2 s 0 4 o 5 n a 2 c o j o 5 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 0 4 豆油8 滴5 0 m l k h 2 p 0 4 0 0 3 p h 8 0 自来水配制 2 13 质粒检测用试剂( 质粒检测方法1 ) 2 1 31 溶菌酶 b i b 分装活性1 5 0 0 0 0 u m g ，溶解至5 0 m g m 1 分装保存 2 13 2 t e s 缓冲液 t r i s3 m m 1 1 主! ：蔓壁堡鍪塑堕竺! ! 堕堡墨里奎壁塑塑壅 堡主竺兰些! ! 兰 e d t a0 5 m m p h 8 0 2133r n a 酶a华美生物工程公司 213 4 蛋白酶kf r a c o 原装，溶解至2 0 m g m 1 分装一2 0 c 保存 213 51 0 s d s ( 十二烷基硫酸钠) 2136t b e ：5 0 贮存液 t r i s8 9 m m 硼酸8 9 m m e d t a p h 8025 m m 加蒸馏水至1 0 0 m l 214 质粒检测用试剂( 质粒检测方法2 ) 2 1 41 溶液i ：葡萄糖5 0 m m t r i s c i ( p h 8 0 ) 2 5 m m e d t a ( p h 8 o ) 1 0 m m 2 14 2 溶液：n a o ho 2 m 0 1 l s d s1 21 4 3 溶液i ：乙酸钾5 m o l l6 0 m l 冰乙酸1 1 5 m l 水2 8 5 m l 214 4t e 缓冲液t r i s c i 1 0 m m ( p h 7 6 ) ( p h 7 6 ) e d t a l m m ( p h 8 0 ) 2 1 5 质粒检测用试剂( 质粒检测方法3 ) 21 5 1t e s 缓冲液t r i s3 0 m m n a c i5 0 m m e d t a5 m m p h 8 0 2 1 5 2l 也( 5 0 ) 每1 0 0 m l 含t r i s2 4 2 9 冰醋酸5 7 1 m l0 5 m e d t a ( p h 8 o ) 1 0 m l 2 ，1 5 3 裂解液：s d s3 1 0 0 m l n a 0 h2 n7 m l 1 2 主! ：苎壁堡窭蕉堕! 竖! ! 堕堡墨里主壁塑塑壅 堡主兰兰! ! 垒墨 215 4 重蒸酚 216 质粒消除用试剂 2161s d s ( 十二烷基硫酸钠)b i b 分装 216 2 利福平四川制药厂 2 16 3 吖啶黄c h r o m a 分装 2165k h ：p 0 4 _ n a o h 缓冲液( p h 7 0 ) 0 2 m k h 2 p 0 4 02 nn a 0 h 加水稀释至2 0 m l 2 1 6 6 d n s 试剂 5 m l 2 9 6 3 m 1 6 3 克d n s 和2 6 2 m l2 n n a o h 溶液，加到含有1 8 2 克酒石酸钾钠的5 0 0 m l 热蒸馏水中，再加5 9 重蒸酚和5 9 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容 至1 0 0 0 m l 。 2 1 7 提取染色体用试剂 2 1 7 1t b 缓冲液t r i s c lo o l m o l l棚7 8 e d t ao 0 1 m o l l p h 8 0 2 1 72 溶菌酶同前 21 7 3 r n a 酶a 同前 2174 蛋白酶k 同前 217 5s s l 溶液 1 s s l 缓冲液0 1 5 m o l ln a c i + 0 0 1 5 m o l l 柠檬酸钠 217 69 5 乙醇 2 177 t e 缓冲液( p h 7 4 ) t r i s c l1 0 m m ( p h 74 ) e 1 ) t a l m m ( p h 8 o ) 21 8 部分酶切染色体d n a 及回收 2 18l i r i s 。c l1 0 m m p h 8 0 21 8 2e c o r i 限制酶缓冲液华美生物工程公司 2183 e c o r 限制性内切酶同上 2 18 4 正丁醇 21857 0 乙醇 】3 主! ：苎塑堡窭焦壁坠! ! 蔓堡苎里奎壁塑塑堡 堡主生兰些笙壅 21863 m 醋酸钠 219 连接及包装反应 219 1t 4 d n a 连接酶华美生物工程公司 2192 t 4 d n a 连接酶缓冲液华美生物工程公司 219 3p a c k a g el a m d ad n a p a c k i n gs y s t e mp r o m e g a 公司 2l9 4 噬菌体缓冲液 i r i s h c i2 0 m m p h 7 4 n a c l1 0 0 r a m m g s 0 4 1 0 r a m 2l9 5s 缓冲液白明胶2 ( w v ) t r i s h c i2 0 m m p h 7 4 n a c i1 0 0 r a m m g s 0 4 1 0 m m 2l96 二甲基亚砜 2 1 9 7 麦芽糖 2 198s m 缓冲液白明胶 t r i s h c l n a c l m g s 0 4 0 0 1 5 0 m m p h 7 5 1 0 0 r a m 8 m m 2 19 9i p t g 2 0 m g m l 贮存 21 9 1 0 x - g a l5 0 m g m l 贮存 21 1 0 主要仪器 台式高速离心机t g l - 1 6 2 型上海安亭科学仪器厂 紫外可见分光光度计 a i cu v 9 1 0 0 型 北京瑞利分析仪器公司 高速冷冻离心机h i t a c h i ( 2 0 p r - 5 0 ) 日本 光学显微镜x s z 1 0 7 中国 水平电泳槽d y y - i i i3 3 a 型 北京六一仪器厂 夹心式垂直电泳槽d y y - i i i2 8 a 型北京六一仪器厂 恒压恒流电泳仪d f c 型 东方特力科贸中心 4 0 0 升展示柜 青岛澳河玛 恒温摇床t a z - c 型 江苏太仓市实验设备厂 1 4 主! ：苎墨堡墨塑壁! 鳖! ! 堕堡苎里奎壁竺塑垄 堡主竺兰些! ! 墨 电热恒温水浴锅h h s 型 江苏省医疗器械厂 超声波破碎细胞仪 22 方法 研究路线： 地衣芽孢杆菌n k 2 7 土 质粒检测与质粒消除 、 目的基因位于染色体上 上 用鸟枪法筛选1 3 甘露聚糖酶基因 上 提取染色体 日的基因位于质粒上 上 确定产酶质粒 上 提取目的质粒 上 j 与 g t l l 载体连接 体夕阢装 上 j r 筛选溶? 重组子 2 21 质粒检测 2 21 1 地衣芽孢杆菌生长曲线的绘制 2 8 】： 将培养1 0 1 2 小时的地衣芽孢杆菌n k 2 7 培养液2 5 m l 接入盛有5 0 m l 液 体l b 培养基的三角瓶内，混合均匀，分装于1 6 支大试管中，每管3 m l 置于摇 1 5 产b 一甘露低聚糖酶n k - 2 7 菌株基因文库的构建 硕士生毕业论文 床3 7 。c 振荡培养( 转速2 2 0 r m i n ) ，分别培养0 ，1 5 ，3 ，4 ，6 ，8 ，1 0 ，1 2 ，1 4 ， 1 6 ，1 8 ，2 0 ，2 2 ，2 4 ，2 6 小时。以未接种的l b 液体培养基为空白对照，测定 o d 。，对培养液可进行适当稀释，使其光密度值在o ，1 o 6 5 之间。以培养时 间为横坐标，光密度值为纵坐标绘制生长曲线。 2 212 质粒检测方法1 1 6 0 ： 2 2 1 21 将地衣芽孢杆菌n k 2 7 接种于3 5 m l 液体培养基中，1 8 0 2 0 0 r m i n ， 3 7 c 振荡培养2 0 小时，取1 5 m l 菌液8 0 0 0 9 离心1 0 分钟，收集菌体。 2 212 2 用冷t e s 洗菌体一遍，加入07 m l 含溶菌酶的t e s 缓冲液，充分混匀， 于3 7 c 温育6 0 8 0 分钟，加入0 1 m lr n a 酶a ( 1 0 u g m 1 ) 温育1 0 分钟。 2 2 1 23 加入0 1 m l 蛋白酶溶液( 5 m g m 1 ) 温育2 0 分钟。 2 2 12 4 在每管的溶菌物中加入0 1 m l1 0 s d s ，温和地将离心管倒转5 次，3 7 保温5 1 0 分钟，置4 c 冰箱过夜。 2 21 2 5 用l m l 进样器将粘稠物吸出，剩余清液作为电泳样品，取6 0 u l 在0 6 5 琼脂糖凝胶中水平电泳检测，1 2 2 0 m a1 8 2 0 小时，在0 5 琼脂糖凝胶 中垂直电泳检测，先3 4 m a1 5 小时，然后8 1 0 m a2 小时，最后2 5 m a 2 3 小时。 2 213 质粒检测方法2 t 6 1 】： 2 21 3 1 将n k - 2 7 接种于3 5 m ll b 液体培养基中，1 8 0 2 0 0 r m i n3 7 c 振荡 培养2 0 小时。 2 2 1 32 将1 5 m l 培养物倒入微量离心管中，1 2 0 0 0 9 离心3 0 秒，将细菌沉淀重 悬于1 0 0 u l 用冰预冷的溶液i 中，剧烈振荡，加入l m l 新配制的溶菌酶溶 液，3 7 。c 温育3 0 分钟。 2 2133 加入2 0 0 u l 新配制的溶液，盖紧管口，快速颠倒离心管5 次，混合 内容物，将离心管放于冰上，加入1 5 0 u l 用冰预冷的溶液i ，盖紧管口， 将管倒置后温和振荡1 0 秒钟，使溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀， 之后将离心管置于冰上3 5 分钟。 2 21 34 1 2 0 0 0 9 离心2 分钟，将上清液转移到另一离心管中，向上清加入l o u l r n a s e 溶液，3 7 。c 温育2 0 分钟，再加入2 u l 蛋白酶k 溶液，3 t c 温育1 5 分钟。 221 3 5 加入2 倍体积冷无水乙醇，振荡混合，2