（细胞生物学专业论文）等离子体诱变生产13丙二醇菌种的研究.pdf

摘要 聚对苯二甲酸丙二醇酯( p t r ) 是一种新型的合成聚酯，具有许多优良的 特性和很好的应用前景，而1 ，3 丙二醇( 1 ，3 - p d ) 是其合成的关键性材料。 近年来，1 ，3 - 丙二醇的研究受到了全球众多知名企业的重视，与化学合成法相 比，微生物发酵法生产1 ，3 丙二醇具有显著的优点，成为当前的研究热点。 产物抑制和副产物多造成微生物发酵法产1 ，3 - 丙二醇的产量低，另外，副产 物多也是甘油转化率低和产物分离困难的原因之一，选育既有1 ，3 - 丙二醇高 浓度耐受性，同时又具有副产物代谢途径突变的菌株，是提高1 ，3 - 丙二醇产 量和甘油转化率并简化后期提取工艺的一种尝试。 为提高克雷伯氏肺炎杆菌( 简称克雷伯氏菌) 转化甘油生产1 ，3 - 丙二醇 的能力，建立了三次浓缩后等离子体液体及单细胞诱变方法，获得可耐受高浓 度1 ，3 - 丙二醇并且副产物中乙醇含量较少的优良突变菌株2 株。通过对其进 行厌氧间歇发酵和微氧批式流加发酵，获得了厌氧发酵比对照提高了2 2 8 1 ， 产量达到1 9 3 0 9 l 的k 9 0 8 和微氧发酵3 6 小时产量达到7 0 5 2 e , l 的k 1 2 0 7 。 建立了2 4 孔微孔板的克雷伯氏菌高通量筛选方法，通过对6 5 4 株菌种的高通量 筛选，获得摇瓶发酵产1 ，3 - 丙二醇最高为9 + 5 7 9 l 的菌株。对该突变株在自动 发酵罐上的发酵研究表明，发酵3 2 h 获得4 3 6 3 9 l 的1 ，3 丙二醇产量，甘油 的摩尔转化率为5 3 6 6 。且三株菌都通过了遗传稳定性验证。由于我们采用的 等离子体是大气压冷等离子体，它与其他可以诱变的等离子体相比，其有操作 简便、安全、高效等特点。 近些年来，等离子体灭菌和诱变机制的研究引起国内外众多学者广泛关注， 但等离子体失活、诱变微生物的机制目前尚不清楚。本文从生物学的角度，对 大气压介质阻挡放电( d b d ) 等离子体与微生物相互作用的机理进行了初步研 究。通过大气压h e d b d 等离子体对细菌细胞膜系统的效应实验，证明了通过 等离子体处理，菌液的p h 迅速下降，微生物细胞膜混合液的酸性增强，等离 子体可以使微生物细胞膜上的大分子物质( 如蛋白质) 发生水解，变成氨基酸， 对膜产生穿透作用，为等离子体诱变和失活微生物提供了实验和理论依据。 关键词：克雷伯氏肺炎杆菌；1 ，3 一丙二醇；诱变育种；大气压介质阻挡放电 甘油发酵 a b s t r a c t p o l y t r i m e t h y l e n et e r e p h t h a l a t e ( p i e r ) h a sn u m e r o u sp r o m i s i n gp r o p e r t i e sa n d a p p l i c a t i o n s a sap i v o t a lm o n o m e rf o rt h es y n t h e s i so fp t r 1 , 3 一p r o p a n e d i o l ( 1 ，3 一p d ) h a sa t t r a c t e dp a r t i c u l a ra t t e n t i o no fm a n yf a m o u sc o r p o r a t i o n si nt h ew o r l d i nt h e s ey e a r s c o m p a r e dw i t hc h e m i c a ls y n t h e s i s ，m i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n so f1 , 3 - p d h a v em a n yo b v i o u sa d v a n t a g e s ，i n c l u d i n gt h ee n v i r o n m e n t a lf r i e n d s h i pa n dp r i c e a d v a n t a g ea n dt h u sb e c o m et h ef o c u s e so fr e s e a r c h t h ei n h i b i t i o no fp r o d u c t so n m i c r o o r g a n i s mc e l l sw i l l l i m i t t h e p r o d u c tt i t e r a n dt h ey i e l do f1 , 3 一p do n 9 1 y c e r o l ，a n dt h u sl e a dt h ep r o d u c tr e c o v e r ya n dp u r i f i c a t i o nt oat r o u b l e s o m et a s k t h e s ep r o b l e m sm a yb ee f f e c t i v e l ys o l v e di fs o m em u t a n t sw i t ht o l e r a n c et oh i g h c o n c e n t r a t i o no f1 , 3 一p da n dl e s sb y p r o d u c t sw e r eo b t a i n e db ys e l e c t i v eb r e e d i n g i nt h i ss t u d ya ni n d u c e dm u t a t i o nt e c h n o l o g yo fl i q u i dp h a s ea n ds o l i dp h a s eb y p l a s m ac o m b i n i n gt h r e et i m e sc o n c e n t r a t i n gi se s t a b l i s h e di no r d e rt oi n c r e a s et h e c o n v e r s i o na b i l i t yo fg l y c e r o li n t o1 , 3 一p db yk l e b s i e l l ap n e u m o n i a e u s i n gt h i s a p p r o a c h ，2 e x c e l l e n tm u t a n ts t r a i n s t o l e r a t i n g1 , 3 - p r o p a n e d i o l w i t hah i g h c o n c e n t r a t i o na n dp r o d u c i n gl e s sa l c o h o la r eo b t a i n e d a sar e s u l t ，1 , 3 一p d c o n c e n t r a t i o no fk 9 0 8y i e l dw a s1 9 3 0 9 lw i t ht h ea n e r o b i cb a t c hf e r m e n t a t i o na n d i n c r e a s e d b y 2 2 8 1 t h a nt h ec o n t r o l s t r a i n ，k 1 2 0 7s t r a i np r o d u c t i o nw a s 7 0 5 2 2 6 9 lb ym i c r o a e r o b i cf e d - b a t c hf e r m e n t a t i o n ah i g h t h r o u g h p u tc u l t i v a t i o n m e t h o df o rk l e b s i e l l ap n e u m o n i a ei s o l a t e si n2 4 一w e l lm i c r o t i t e r p l a t e s w a s e s t a b l i s h e d a m o n g6 5 4m u t a n t s ，t h eb e s tp r o d u c e rw a si d e n t i f i e d w i t hah i g h p r o d u c t i v i t yo f1 , 3 一p d ( 9 5 7 9 l ) i ns h a k ef l a s k s ，a b o u t3 2 5 9 i n c r e a s ec o m p a r e d w i t ht h ec o n t r 0 1 i nt h ef e d - b a t c hc u l t u r e so ft h i sm u t a n t ，a1 , 3 - p dc o n c e n t r a t i o no f 4 3 5 3 9 lw a so b t a i n e df o r3 2h o u r s ，t h em o l a rc o n v e r s i o ne f f i c i e n c yo fg l y c e r o lw a s 5 3 6 6 a l lt h e s et h r e es t r a i n sh a v eg e n e t i cs t a b i l i t y a sw eu s et h ec o l dp l a s m aa t a t m o s p h e r i cp r e s s u r e ，i ti sm o r es i m p l e ，s a f e ，a n dh i g h l ye f f e c t i v et h a no t h e rp l a s m a 1 nt h i sp a p e rw ee x a m i n et h em e c h a n i s mo fi n a c t i v a t i o no fb a c t e r i ab yd i e l e c t r i c b a r r i e rd i s c h a r g ep l a s m ai nh e l i u ma ta t m o s p h e r i cp r e s s u r e ( h ed b d ) h ed b d c a nl e dt ot h eh i g ha c i d i cb a c t e r i as u s p e n s i o n ，t h em a c r o m o l e c u l e si nt h ec e l lw a l l a n dm e m b r a n ec o u l db eh y d r o l y z e d ，s u c ha sp r o t e i nc a nb eh y d r o l y z e di n t oa m i n o a c i db yh ed b d p l a s m a k e y w o r d s ：k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ；1 , 3 - p r o p a n e d i o l ；h l d u c e dm u t a t i o n ； a t m o s p h e r i cd i e l e c t r i cb a r r i e rd i s c h a r g e ；g l y c e r o lf e r m e n t a t i o n 等离子体诱变生产1 , 3 一丙二醇菌种的研究 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导f 所取得的研究成果。论文中除 特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其 他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢 意。 学位论文作者签名：芡冯己 日期 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范火学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁 师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，司以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名 硅耙 指导教师签名：耄 曰期： 等离子体诱变生产1 , 3 一丙二醇菌种的研究 第一章文献综述 1 1 微生物法生产1 ，3 一丙二醇的研究进展 1 1 1 概述 1 ，3 一丙二酵( 简称1 ，3 p d ) ，英文名1 ，3 - p r o p a n e d i o l ，是一种无色、 无味液体，可溶于水、醇和醚。 1 ，3 - 丙二醇是重要的化工原料，除用作溶剂外，主要用作合成聚酯、聚氨 酯。以1 ，3 丙二醇为单体生产的聚对苯二甲酸二醇酯( p 1 t ) 是一种新型聚酯 材料【”，具有易染色、弹性好、低静电、可生物降解、优良的柔软性和悬垂性 等优点，主要用于生产纤维和纺织品，如地毯、袜裤、运动服等。另外，1 ，3 丙二醇还可以合成清洁剂用稳定剂、耐热容器、耐磨涂料、喷墨打印机墨水、 光稳定聚酯、含酚树脂等。 目前，工业上主要采用化学法合成1 ，3 丙二醇，包括丙烯醛水合法、环 氧乙烷法、环氧丙烷法等。化学合成法具有设备投资大、技术难度高、需要重 金属催化剂、污染环境等缺点。如壳牌公司以乙烯为原料，在高温( 2 8 0 ) 下 用银作催化剂氧化成环氧乙烷，然后加氢和一氧化碳转化为3 羟基丙醛，最后 氢化成产品1 ，3 一丙二醇；d e g u s s a 公司则以丙烯为原料，在3 5 0 ，0 2 m p a 下以钼作催化剂氧化为丙烯醛，再水化为3 羟基丙醛，然后氢化成1 ，3 丙二 醇。这两种方法都需要在高温和贵重催化剂作用下进行，产品除1 ，3 - 丙二醇 外还有1 ，2 丙二醇及其二聚体、三聚体等性质相近的副产物，致使产品分离 纯化较困难，生产成本相应较高1 2 j 。因此，各国都致力于开发生物发酵法生产 1 ，3 一丙二醇的技术。 早在1 8 8 1 年，a u h u s tf r e u n d 就发现c l o s t r i d i u mp a s t e u r i a n u m 能代谢甘油 生成1 ，3 丙二醇。2 0 世纪6 0 年代，由于甘油过剩及1 ，3 丙二醇的潜在用途， 人们致力于将甘油转化为1 ，3 丙二醇的研究，主要集中在其代谢机理及培养 工艺的研究。近年来，由于1 ，3 一丙二醇用于p 1 - r 合成的巨大市场需求，重新 激起了人们的研究兴趣，以德国生物工程研究中心( g b f ) 和美国d u p o n t 公司 为首的多家研究机构对生物法制取1 ，3 丙二醇进行了研究，研究重点在如何 提高其转化率及利用基因工程技术构建可转化其他廉价碳源为1 ，3 - 丙二醇的 工程菌方面。据报道，由d u p o n t ，t a t e & l y l e 和g c n e n c o r 联合建立的年产1 0 等离子体诱变生产1 ，3 一丙二醇菌种的研究 万磅的中试发酵装置已投入运转，该装置以湿磨玉米为原料，利用基因工程菌 生产1 ，3 丙二醇。 1 1 2 菌种的选择 现已发现几种能以甘油为底物发酵生产1 ，3 - 丙二醇的菌种，但还没有发 现可以利用其它有机物质为底物产生l ，3 丙二醇的自然菌。微生物发酵甘油 生产1 ，3 - 丙二醇的自然界菌种主要有肠道细菌的克雷伯氏肺炎杆菌( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 、产气克雷氏菌( k l e b s i e l l aa e r o g e n e s ) 、弗氏柠檬酸菌( c i t r o b a c t e r f r e u n d i i ) ，乳杆菌属的短乳杆菌( l a c t o b a c i l l ib r e v i s ) 和布氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l i b u c h n e r i ) ，梭菌属的丁酸梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i ab u t y r i c u m ) 和巴氏梭状芽 孢杆菌( c l o s t r i d i ap a s t e u i a n u ) ，其中克雷伯氏菌、丁酸梭状芽孢杆菌、弗氏 柠檬菌具有较高的1 ，3 丙二醇转化率及生产强度，是研究得比较多的三种菌 p “。甘油作为微生物发酵的唯一碳源和能源物质，经过微生物代谢后除产生目 的产物1 ，3 丙二醇外，还可能产生乙酸、乙醇、丁酸、2 ，3 丁二醇、乳酸等 副产物，副产物的量一般较少( 小于5 ) 。发酵的底物、目的产物及副产物 都是微生物生长的抑制剂，对目的产物的转化有重大影响。克雷伯氏菌、丁酸 梭状芽孢菌比弗氏柠檬菌具有较高的甘油耐受力，发酵速度较快。克雷伯氏菌 与弗氏柠檬菌属于兼性菌，而丁酸梭状芽孢杆菌要求严格的厌氧条件。 1 ，3 - 丙二醇的转化率、生产强度及最终发酵浓度是1 ，3 - 丙二醇生物转化 研究的重要参数。利用i h j 歇( 批式) 和批式流加发酵，克雷伯氏菌和丁酸梭状 芽孢杆菌使1 ，3 - 丙二醇的转化率可达每摩甘油得到o 5 5 o 6 5 摩的丙二醇，其 生产强度为1 2 5 9 l - h 1 6 - 7 1 ，最终浓度达到5 0 6 0 p n _ + 。p a p a n i k o l a o u 等【8 】新分离 的一株丁酸梭状芽孢杆菌，其生产强度可以达到5 5 9 l h ，有的丁酸梭状芽孢 杆菌突变株可以使1 ，3 丙二醇的最终浓度达到7 0 l 。1 ，3 - 丙二醇最终浓度 的大小主要取决于菌株对底物、产物及副产物的耐受程度及代谢的酶活性。连 续发酵可以提高生产强度到5 - 6 e , l - h ，但发酵液中1 ，3 - 丙二醇的浓度却不及批 式发酵的一半，对于同一株菌采用连续发酵和批式发酵，选择好发酵条件转化 率可以相差不大。 p f l u g m a c h e r 等1 9 j 用弗氏柠檬菌采用固定化细胞技术将生产强度提高到 8 2 l h ，但获得的1 ，3 一丙二醇的浓度较低，r e i m a n n 等l j 用梭状芽孢幸t 菌采 用连续发酵中空纤维膜错流过滤返回细胞的方法，将生产强度提高到2 1 l ，h ， 等离子体诱变生产1 , 3 一丙二醇菌种的研究 1 ，3 - 丙二醇的含量达到2 6 5 9 l ，但它的致命弱点是膜容易堵塞。m e n z e l 等【1 1 】 用肺炎杆菌采用连续发酵取得了较好效果，1 ，3 - 丙二醇的浓度为4 8 5 9 l ，生 产强度为8 8 9 l - h 。 1 1 3 微生物生产1 ，3 一丙二醇的代谢途径 ：苦n a d a m t p 。 3 掘基丙醛 ndhi 丁酰 = 羟基丙酮生物量 皆“南唆每愚l 3 磷酸甘嘉醛 乳酸 2 【h h2 乙酰乙酰 i 2 0 乙酰舞酸 丁醛 丁酸 正丁醇 n d h l 厶醛 l f 澡f =乙酸乙醇 图1 - i 微生物厌氧发酵甘油代谢图 f i g 1 - 1m e t a b o l i cp a t h w a y so fg l y c e r o lm e t a b o l i s m 甘油脱水酶( g d h t ) 甘油脱氢酶( g d h ) 丙酮酸脱氢酶系( p d h ) 铁蛋白氧化还原酶系 3 1 ，3 - p d 氧化还原酶( p d o r ) 二羟基丙酮激酶( d h a k ) 丙酮酸甲酸裂解酶( p f l ) 埘 二二 酬荨蓄盼 溉三一一 皇一基 p 等离子体诱变生产1 , 3 一丙二醇菌种的研究 图1 1 显示了克雷伯氏菌以甘油为底物厌氧发酵的代谢途倒4 1 。甘油作为 唯一的碳源和能源物质，除了一部分形成生物量外，其余沿着氧化和还原两个 平行路径代谢，产生目的产物和副产物。通过氧化途径，甘油被与n a d + 相连 的甘油脱氢酶( g d h ) 催化脱氢生成二羟基丙酮( d h a ) ，然后进一步代谢为 丙酮酸，生成能量a t p 和还原当量以及乙酸、乙醇等副产物，并伴随着微生物 细胞的生长；而通过与之平行的还原途径甘油则被与维生素b 1 2 相关联的甘油 脱水酶( g d h t ) 催化脱水生成3 羟基丙醛( 3 h p a ) ，再进一步由与n a d h 相 连的1 ，3 - 丙二醇氧化还原酶( p d o r ) 还原为产物1 ，3 - 丙二醇，同时消耗了氧 化途径上生成的过量的还原型辅酶i ( n a d h 2 ) 。氧化途径和还原途径通过还原 当量n a d + n a d h 2 相连接，使甘油歧化与细胞生长相藕联，因此不能单从氧化 途径孤立地分析1 ，3 - 丙二醇的形成，而应从甘油的整体代湔全面系统地分析产 物形成与菌体生长及副产物形成之问的关系。 1 1 4 发酵工艺 克雷伯氏菌是兼性菌，在有氧或厌氧条件下都可以生长，它存在两个调节 子g l p 和d h a ，分别在有氧、厌氧环境下起作用，使细胞生长代谢进入不同代 谢途径。已有研究表明：在有氧条件下克雷伯氏菌生长旺盛，因此文献报道的 用于1 ，3 - 丙二醇发酵的克雷伯氏菌种子培养过程大都在有氧条件下进行，但 氧的存在对还原当量的传递不利，导致1 ，3 - 丙二醇产生途径中的关键酶甘 油脱水酶失活，故而克雷伯氏菌发酵生产1 ，3 - 丙二醇过程大都在厌氧条件下 进行。考虑氮气制备的高成本，近年来有氧代谢条件下生产1 ，3 - 丙二醇的研 究逐渐增多。王剑锋等【1 2 】和h u a n g 等1 1 3 l 的研究表明，有氧条件下，1 ，3 - 丙二 醇合成途径并未完全阻截。通过比较克雷伯氏菌厌氧流加发酵和有氧流加发酵 结果，清华大学提出了前期厌氧后期有氧发酵工艺，通过5 l 及5 0 l 发酵罐上 的实验表明，该工艺可明显提高1 ，3 - 丙二醇浓度及生产强度。在5 l 发酵罐上 1 ，3 丙二醇可达6 9 6 9 l ，应用工业原料的5 0 l 发酵罐上l ，3 丙二醇浓度可 达5 8 8 l 。 1 1 5 基因工程菌的构造 1 1 5 1 去除产生无益副产物的基因 4 等离子体诱变生产1 , 3 一丙二醇菌种的研究 以克雷伯氏菌为例，乙酸、乙醇和乳酸是1 ，3 - 丙二醇发酵中的三种主要 副产物，副产物积累到一定程度对细胞生长产生抑制作用。减少发酵过程中的 副产物产生有可能提高1 ，3 - 丙二醇的产量和产率。杨光1 1 4 l 对克雷伯氏菌中产 乙酸、乙醇和乳酸代谢途径分别进行了去除。通过转座诱变结合自杀性底物筛 选的方法得到了两株产乙酸途径缺失的突变株，但从两个突变株的发酵结果来 看，其使代谢副产物中乙酸产量有很大程度的减少，但并不能有效提高1 ，3 丙二醇产量和底物转化率。通过同源重组构建的产乙醇和乳酸途径缺失的突变 株，根据酶活性测定结果可知其产乙醇突变株中乙醛脱氢酶活性和乙醇脱氢酶 活性都在亲株的1 0 以下，产乳酸突变株中乳酸脱氢酶活性在亲株的7 以下， 但对1 ，3 - 丙二醇的发酵过程有何影响还有待于将其应用到发酵中加以考察。 1 1 5 2 能利用葡萄糖直接产生1 ，3 一丙二醇的基因工程菌 能利用葡萄糖直接产生1 ，3 - 丙二醇的基因工程菌将葡萄糖转化为甘油和 甘油转化为1 ，3 丙二醇两个反应整合到同一微生物中无疑是利用廉价的底物 生产1 ，3 - 丙二醇最直接有效的方法。实现这一过程可以采用下列手段： ( 1 ) 在甘油产生菌中表达1 ，3 - 丙二醇产生途径的基因，如在酿酒酵母中表 达d h a b c e 和d h a t 基因。但原核生物和真核生物不同的表达系统要求对 d h a b c e 和d h a t 进行全新的构建。d h a t 基因是单个的开放阅读框，而d h a b c e 由四个开放阅读框组成。为了在酵母中表达，每个开放阅读框都必须由一个真 核生物启动子调控。l a f f e n d 等1 1 5 j 和c a m e r o n 等1 1 6 1 分别做了类似的工作，即在 s c e r e v i s i a e 中表达克雷伯氏菌中产1 ，3 丙二醇途径的基因，但他们测得的甘 油脱水酶和1 ，3 丙二醇氧化还原酶活性都非常低。l a f f e n d 等人得到1 ，3 - 丙 二醇浓度不到0 1g l ，c a m e r o n 等人得到的1 ，3 丙二醇浓度用高效液相色谱 几乎检测不到。 ( 2 ) 在1 ，3 - 丙二醇产生菌中表达甘油产生途径的基因。在甘油产生菌中， 3 磷酸甘油酯酶催化3 磷酸甘油转化为甘油，因为其底物l 3 磷酸甘油是微 生物脂类合成代谢的中间产物，在1 ，3 丙二醇产生菌中表达此酶可将葡萄糖 代谢和1 ，3 - 丙二醇合成途径联系起来。c a m e r o n 等人【1 6 】从一株地衣芽孢杆菌 中得到了甘油磷酸酶基因，但此酶是d 3 一磷酸甘油特异性的，对l - 3 磷酸甘油 没有催化活性。因为当时对d 3 磷酸甘油产生途径不清楚，故其对构建从葡萄 糖到1 ，3 - 丙二醇的重组菌株没有现实意义。n o r b e c k l l 7 】等人已从酿酒酵母中分 等离子体诱变生产l 。3 一丙二醇菌种的研究 离出了两个编码3 磷酸甘油酯酶同功酶的基因g p p l 和g p p 2 ，此酶已被应用 到上述基因改造工作中。 ( 3 ) 在既不产生甘油又不产生1 ，3 - 丙二醇的生物中表达上述两种基因。天 然大肠杆菌既不能产生甘油也不能产生1 ，3 - 丙二醇故不需克服甘油代谢途径 和1 ，3 丙二醇代谢途径中的调控机制。自1 9 9 5 年d u p o n t 与g e n e n c o r 公司 合作开展用生物法生产1 ，3 - 丙二醇以来，已在该领域申请了多项专利。其从 s a c c h a r o m yc e s c e r e v i s i a e 中获取甘油三磷酸脱氢酶和甘油三磷酸磷酸化酶基因； 在克雷伯氏菌中获取1 ，3 - 丙二醇脱水酶及其激活基因，在e c o l ik 1 2 ( 一种产 少量甘油但不产1 ，3 - 丙二醇菌) 中表达，结合e c o l i k l 2 自身的氧化还原酶， 来完成从葡萄糖到1 ，3 - 丙二醇的转化途径。在d u p o n t 公司2 0 0 1 年的专利中， 其在1 5 l 发酵罐中装6 l 发酵液，利用重组大肠杆菌k l p 2 3 p a h 4 8 p k p 3 2 ，并 在接种后3 h 流加维生素b 1 2 ( 浓度0 1 5 9 l ，流率1 6i n i _ h ) ，发酵4 8 h1 ，3 丙二醇浓度达1 1 2 9 l ，葡萄糖的质量转化率为0 2 6 ；利用重组大肠杆菌 r j 8 p a h 4 8 p k p 3 2 在同样条件下于发酵2 6h 和4 4h 时分别加入4 8 r a g 和 1 6 m g 维生素b 1 2 ，发酵7 4 h1 ，3 丙二醇浓度达1 2 9 9 l ，葡萄糖的质量转化率 为0 3 4 。在d u p o n t2 0 0 3 年的研究成果中，通过恢复磷酸丙糖异构酶和限量表 达甘油醛3 磷酸脱氢酶，可使1 ，3 一丙二醇浓度达1 3 5 9 l ，葡萄糖的质量转化 率为0 5 1 ，生产强度达3 5 l h 呻1 9 l ，目前，该技术正有待于进一步放大研究。 1 1 6 产物的分离 由于生物法生产的专一性，相对于化学合成法，微生物发酵的产物提取分 离相对而言简单得多。发酵液的组分大致为产物1 ，3 - 丙二醇、乙酸盐、乳酸 盐、2 ，3 丁二醇、乙醇及残余培养基等，不含有难分离的丙二醇同分异构体。 1 ，3 - 丙二醇作为胞外产物，发酵液的顸处理可以通过絮凝、板框过滤除去菌体 和蛋白，电渗析除去培养基离子及有机酸盐1 2 0 - 2 。 经过预处理后的发酵液可以通过蒸馏以除去低沸点副产物( 如乙醇) 和水， 再进行真空精馏得到产物，同时可副产另一种二醇一2 ，3 丁二醇。另外一种有 效方法是用反应萃取法从稀溶液中提取1 ，3 丙二醇，即采用醛( 如乙醛、苯 甲醛) 与l ，3 丙二醇反应生成2 位取代的1 ，3 - 二恶烷，该化合物可通过萃取 方法与水相分离，后用稀盐酸使其分解，除酸后蒸馏除去醛获得1 ，3 - 丙二醇。 由于发酵液中产物浓度较低，1 ，3 丙二醇沸点又很高( 2 1 4 ) ，传统蒸馏的 6 等离子体诱变生产1 ，3 一丙二酵菌种的研究 方法将会消耗大量的能量，致使下游回收所需费用在总成本中占很大比重，大 大增加1 ，3 - 丙二醇的生产成本。因此，若反应萃取方法可用来代替传统的蒸 馏方法，将有望在很大程度上减少能量的投入，对降低1 ，3 - 丙二醇的生产成 本具有十分重大的意义。 1 2 等离子体及其在诱变育种方面的应用 l 2 1 等离子体的概念 等离子体( p l a s m a ) 是指高度电离的气体云，是气体在加热或强电磁场作 用下电离而产生的，主要由电子、离子、原子、分子、活性自由基及射线等组 成。其中活性自由基及射线，如紫外线、丫射线等对微生物具有很强的杀灭作 用。等离子体被称为继“固、液、气”三态以外的新的物质聚集态，即物质第 四态，因其中的正电荷总数和负电荷总数在数值上总是相等的，故称其为等离 子体。除存在于自然界外等离子体也能通过人工方式获得。通常是对气体施加 电场，使荷电粒子加速。由于离子较重，所以被加速的都是电子。通过电子与 较重粒子碰撞而引起电离。最终形成等离子体。 1 2 2 低温等离子体的种类 国际上将等离子体分为热等离子体( h o tp l a s m a ) 和冷等离子体( c o l d p l a s m a ) 。热等离子体的电离率接近1 0 0 ，电子和离子温度相当，属于( 准) 热平衡等离子体。如等离子体弧、火箭发动机的等离子体射流，热核聚变等离 子体。冷等离子体的电离率很低( 1 0 - 41 0 一，电子温度远大于离子温度，属于 非热平衡等离子体) 。国内学者将等离子体划分为三类：高温等离子体( 热核 聚变等离子体) ；热等离子体( 等离子体弧、等离子体炬等) ；冷等离子体( 低 气压交直流、射频、微波等离子体以及高气压介质阻挡放电、电晕放电、r f 放电等) 。而把热等离子体和冷等离子体归纳到低温等离子体中。 低温等离子体的电离率较低，电子温度远高于离子温度，离子温度甚至可 与室温相当。这使得等离子体杀菌消毒具有更为普遍的意义。低温等离子体中 存在着大量的种类繁多的活性粒子。比通常的化学反应所产生的活性粒子种类 更多、活性更强，更易于和所接触的材料表面发生反应，因此它们被用来对材 料表面进行改性处理。与传统的方法相比，等离子体表面处理具有成本低，无 7 等离子体诱变生产l ，3 丙二醇菌种的研究 废弃物、无污染等显著的优点，同时可以得到传统的化学方法难以达到的处理 效果。2 0 世纪七八十年代起，等离子体在对金属、微电子、聚合物、生物功能 材料、低温灭菌及污染处理等诸多领域的应用研究开始蓬勃发展，形成向多学 科交叉的研究方向。现介绍几种产生低温等离子体的发生装置。 1 2 。2 。1 介质阻挡放电 介质阻挡放电( d b d ) 是有绝缘介质插入放电空间的一种非平衡态气体放 电又称介质阻挡电晕放电或无声放电。介质阻挡放电能够在高气压和很宽的频 率范围内工作，通常的工作气压为1 0 4 1 0 6 p a 。电源频率可从5 0 h z 1 m h z 。电极 结构的设计形式多种多样。在两个放电电极之间充满某种工作气体，并将其中 一个或两个电极用绝缘介质覆盖，也可以将介质直接悬挂在放电空间或采用颗 粒状的介质填充其中，当两电极| 日j 施加足够高的交流电压时，电极间的气体会 被击穿而产生放电，即产生了介质阻挡放电。介质阻挡放电其电子能量较高。 介质层既能引起限流作用又能阻止放电空间形成局部火花向弧光放电过渡，可 实现高气压放电。图1 - 2 是d b d 中常用的几种电极结构。 介质 “ 。墨槛 ，：? = j 龟极r ，钐形歹 。1 一 7 。介质 ) ”c b ) 一下魁榭 ，：一幄霉；栅， 麓 图1 - 2 介质阻挡放电典型电极结构 f i g 1 - 2c o n f i g u r a t i o no ft h ed i e l e c t r i cb a r r i e rd i s c h a r g e ( d b d ) 1 2 2 2 电晕放电 电晕放电( c o r o n a d i s c h a r g e ) 是指气体介质在不均匀电场中的局部自持放 电。是最常见的一种气体放电形式。在曲率半径很大的尖端电极附近，由于局 部电场强度超过气体的电离场强，使气体发生电离和激励，因而出现电晕放电。 发生电晕时在电极周围可以看到光亮，并伴有咝咝声。电晕放电可以是相对稳 定的放电形式，也可以是不均匀电场间隙击穿过程中的早期发展阶段。 等离子体诱变生产1 , 3 一丙二醇菌种的研究 1 2 2 3 电阻阻挡放电 电阻阻挡放电( t h er e s i s t i v e - b a r r i e rd i s c h a r g e ，r b d ) 是以介质阻挡放电为 基础的另一种放电形式。然而，不同于介质阻挡放电的是，至少有一个电极覆 盖的是高阻抗材料而不是介质。高阻抗的材料在电流分布中起到重要作用，它 限制了放电电流而因此防止了电弧放电。r b d 的优点就在于可以利用直流电源 或是低频交流电源放电。 1 2 2 4 大气压等离子体射流 大气压冷等离子体射流( a t m o s p h e r i c p r e s s u r e p l a s m a i e t ，a p p j ) 装置是由 一个圆柱体的金属射频电极和圆筒状的金属地电极构成，在圆柱体电极和圆筒 地电极之间有一个圆筒状的放电缝隙，在电极的一端用绝缘材料密封，另一端 设有一个喷口，当工作气体通过该电极之问的缝隙时被击穿电离形成等离子体， 在气体压力推动下，从喷口向外喷出。 1 2 3 等离子体在诱变育种方面的应用 1 2 3 1 等离子体诱变育种的技术优点 诱变技术是应用诱变剂处理生物有机体以获得所需突变体的一种生物手 段。当今发酵工业和其它生产单位所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变技术 来提高其生产性能的。诱变剂通常分为物理诱变剂和化学诱变剂两大类。物理 诱变剂主要是各种射线如x 、b 、竹中子、紫外线等。化学诱变剂包括能引起 细胞变异的各种化学药剂，常用的有甲基磺酸乙酯( e m s ) 、甲基磺酸甲酯 ( m m s ) 、叠氮化钠( n a n 2 ) 、乙烯亚胺( e 1 ) 、硫酸二乙酯( d e s ) 等。 ，无论是物理诱变所用的各种辐射源还是化学诱变药剂对人体基本上都有致 癌、致突变和致畸等远期效应1 2 5 1 ，因此这些传统的理化诱变剂在其制备、运输、 储存及实验操作等实际应用中存在诸多不便。因而寻找一种安全有效的诱变剂 对于诱变技术的应用将显得特别重要。而低温空气等离子体作为一种新型的物 理诱变剂具有设备简单且安全无污染的优点。低温等离子体是由电子、离子、 激发态的原子、分子和自由基等组成的集合体，一般可在大气压或稍低于大气 压下通过辉光放电产生。低温等离子体在密闭的放电室中产生，断电后消失， 无任何残留物，其发生装置简单，易于操作，因而具有安全、无污染等特点。 低温等离子体技术已广泛用于污染物的分析鉴别，废气、废液和废渣的处理等 9 等离子体诱变生产l ，3 一丙二醇菌种的研究 【2 6 1 。近几年来，有报道l ”氆1 认为低温等离子体对微生物具有杀灭作用，可以用 于特殊材料的消毒灭菌。目前对低温等离子体的生物学效应研究还处于探索阶 段。已有研究表明，低温等离子体处理之后，在周围环境不留任何放射性痕迹， 等离子体中的高能电场，活性粒子等联合产生集体生物学效应，从而产生较高 的突变频率和丰富的诱变图谱，因而其作用过程和作用内容比其它电离辐射更 复杂、丰富而广泛。 1 2 3 2 等离子体诱变育种机理的研究 有学者从物理学的角度对等离子体生物育种提出如下机理性解释： ( 1 ) 集体生物效应：能量沉积、动量传递、质量沉积以及电荷的中和与交换 四种作用的综合体现1 4 8 。”i ； ( 2 ) 直接作用：主要是动量传递于细胞表面产生溅射作用和沉积于细胞内部 产生蚀刻损伤，导致细胞形态变异1 5 。5 2 i ： ( 3 ) 间接作用：主要是能量沉积于细胞内部产生的自由基所导致的作用【5 3 4 4 1 。 也有学者从生物学角度对离子注入微生物细胞形成的“马鞍型”存活曲线 给出了一种可能的解释i ”j ：较短处理时问出现的高峰值可能是胞内酶活性被激 活的缘故，而较长处理时间出现的矮峰值可能是细胞自我修复的结果。 这些可能性的解释大多数没有得到实验验证，尤其是生物学方面的机理显 得缺乏实验依据。另方面微生物育种在常温常压下操作更为方便，而离子注 入通常需要在一定的真空条件下进行，微波又容易导致局部温度过高，因此大 气压冷等离子体在微生物诱变育种方面具有潜在的优势。目前国内外广泛开展 的在高压强场的条件下产生的大气压放电等离子体具有较高的放电强度、发光 强度和等离子体密度，等离子体化学过程比较丰富，各种强场效应比较显著， 如用介质阻挡放电( d b d ) 的方式产生的大气压辉光放电等离子体，用电晕增 强放电在空气条件下产生的辉光放电等离子体，用射频放电在大气压条件下产 生的冷等离子体炬，这些大气压条件下产生的冷等离子体为微生物的诱变与致 死研究提供了良好的技术手段。 国内外学者在大气压放电冷等离子体灭菌方面做了大量的研究和应用工 作，如s i e m e n s 第一个提出利用电晕放电产生的臭氧来净化水1 5 “，m e n a s h i 在 大气压下以射频电晕放电形式产生的等离子体来研究对微生物孢子的影响，发 现可以在不到1 秒钟使之减少4 个数量级。g a r a t e 57 l 等在j j i 人关于增强电晕放 1 0 等离子体诱变生产1 , 3 一丙二酵菌种的研究 电研究 2 6 l 的基础上，利用该方法在不到1 5 m i n 内就使e c o l i 细胞和且s t u b t i l i s 的孢子数减少1 0 个数量级。l a r o u s s i 利用大气压辉光放电研究等离子体对 p s e u d o m o n a s f l u o r e c e n s 细胞的破坏程度，发现在1 0 r a i n 内杀灭了4 个数量级陋 。k e h y 等研究了一种新的辉光放电等离子体( o a u g d p ) 空气灭菌器对物 体表面的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、嗜热脂肪杆菌和枯草杆菌的杀灭效果， 发现对聚丙烯表面的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌只需作用3 0 s ，就可使其减少6 个数量级；对枯草杆菌，等离子体只需暴露5 r a i n 就可使之减少5 个数量级； 对嗜热脂肪杆菌杀灭3 个数量级也只需7 m i n l 6 0 l 。h e r m a n n 等人使用大气压等离 子体炬( a p p j 6 1 】) 来研究等离子体对b a c i l l u s g l o b i g i i ( 作为炭疽热的替代物) 的影响，结果不到3 0 s 就可使7 个数量级的菌体失活1 6 2 1 。近年来，r i c h a r d s o n 6 3 1 和l a r o u s s i l 6 4 j 等人利用新型的阻挡放电( r b d ) 进行灭菌研究，大约1 0 r a i n 就 有4 个数量级的b s u b t i l i s 大量死亡。 研究者们对大气压放电冷等离子体灭菌的机理也进行了有益的探索，根据 实验现象提出了一些假说。在等离子体形成过程中，可产生紫外线，通常人们 认为紫外线能破坏d n a 的双螺旋结构1 6 5 1 ，使其丧失复制能力而起到杀菌的作 用，但是l a t o u s s i 对大气压冷等离子体和低压银蒸汽灯的紫外线的灭菌动力学 进行比较后发现，紫外线在等离子体灭菌中不起主要作用i 删，其他学者通过光 谱分析等试验方法也得到同样的结论【6 2 6 7 - 6 s 。这主要是因为大气压冷等离子体 产生的紫外线需要穿过液层、细胞壁，膜才能作用于d n a 或酶，紫外线强度不 足时对d n a 造成的损伤可以通过细胞s o s 修复系统或修复酶( 如光裂合酶【6 9 】) 使受损的d n a 复原，此时紫外线的作用就不明显了【椎7 。l a r o u s s i 等人通过电 子显微镜观察发现，经等离子体处理后的菌体细胞膜已破损，由此他们提出了 电荷作用在等离子体灭菌中起主要作用，并建立了数学模型，进行了相应的计 算1 7 2 j 。石兴民等人认为可能是“高速粒子流击穿了细菌的细胞壁”致使微生物 细胞失活1 7 3 1 ，王锡录等人1 7 4 】根据s a l e 和h a m i l t o n 的实验结果f 7 5 。7 6 j ，提出由于 电荷在细胞膜上的积累而使引力增强，最终导致细胞膜破损而死亡。另有一些 研究表明，空气和加入氧化性气体的等离子体灭菌效果更好，这是由于在等离 子体产生的过程中会产生活性自由基，它们易与细胞内的蛋白、酶和d n a 发 生化学反应，使其变性失活，从而增强了灭菌效果。如同等离子体诱变的机理 分析一样，上述大气压放电冷等离子体灭菌的机理分析也是推测多于实证。由 等离子体诱变生产1 , 3 一丙二醇菌种的研究 于等离子体包含电子、离子、原子、分子、活性自由基及射线等多种成分，因 此它对细胞的作用应该是几种作用的综合，这也是等离子体诱变育种能得到稳 定遗传的根本原因。上述研究成果无疑为大气压冷等离子体技术在微生物诱变 育种方面的研究奠