（细胞生物学专业论文）大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究.pdf

大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究 大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究 髑要 大菱鲆是一种非常名贵的海洋鱼种，它生长迅速并且味道十分鲜美，从而深 受人们的喜爱。然而，目前鱼类的病害问题已成为限制海水鱼类养殖业可持续发 展的主要因素，其中哈维氏弧菌是海水养殖动物( 鱼、虾) 的重要致病菌，给海 水养殖业造成了巨大的经济损失。 为解决养殖鱼的病害问题，增强养殖种类的抗病力，必须对病原菌和鱼类免 疫系统之闻的相互作用关系有全面的了解。然而，鱼类的许多免疫抗病相关基 因尚不清楚。由于大多数免疫抗病相关基因并非组成型表达，而是受病原物感 染影响的诱导型表达，因此如能分析免疫细胞基因在病原物感染时的差异表达， 就有可能发现和鉴别新的免疫抗病相关基因，并在分子水平上阐明免疫细胞和 病原菌之间的相互作用关系。 抑制消减杂交( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s h ) 技术是d i m c h e n k o 等以m r n a 差别显示技术为基础建立起来的筛选未知的差异表达基因的新技术，它 主要基于抑制p c r ，并结合标准化( n o r m a l i z a t i o n ) 和消减杂交( s u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o n ，s h ) 技术。它克服了m r n a 差异显示技术的假阳性高和代表性差别 分析法的消减杂交轮次较多的缺点，十分适用予分析造成某种特殊表性的目的基 因及其功能，从而成为差异表达基因筛选最有潜力的新方法。 本文运用s s h 技术比较了经哈维氏弧菌感染的和未受感染的大菱鲆差异表达 基因。利用t r i z o l 试剂分别从对照组和实验组中提取肾组织和脾组织的总r n a ， 将同一组的总r n a 混合并分离、纯化m r n a ，构建双向s s h 差减文库，克隆差减片断， 对阳性克隆片断测序分析及g e n b a n k 同源性检索。共鉴定出4 9 个差异片段，通过 与g e n b a n k 数据库的比对，发现这些基因片段大部分为免疫相关基因，包括主要 组织相容性复合体基因、热激蛋白基因、信号蛋白基因等。其中，一个差异片段 被证实为主要组织相容性复合体m h cc l a s sia 基因( 登陆号e f 0 3 2 6 3 9 ) ，通过r a c e 技术获得其全长的c d n a ，测序并分析其编码产物的性质。该基因序列全长1 4 6 6 b p ，包含一个1 0 6 2b p 的开放阅读框，编码3 5 4 个氨基酸。5 u t r 长1 2 7b p ，3 u t r 长2 7 7b p ，并且在3 u t r 区p o l y - a 尾1 1 8 5b p 处含有一多聚腺苷酸信号序列 a t t a a a 。经比对后发现，m h cc l a s sl a 氨基酸序列与牙鲆、青鲻鱼、虹鳟、大 大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究 西洋真鳕、红鳍东方纯、鸡、鼠、和人的同源性分别为6 8 ，5 4 ，5 1 ，5 2 ，5 7 ， 3 3 7 6 ，2 9 ，2 9 。 荧光实时定量p e r 技术是指在p c r 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号 累积来检测p c r 产物。实时荧光定量p c r 技术通过检测p c r 产物中荧光讯号强度 来达到定量的目的，该技术不仅实现了p c r 从定性到定量的飞跃，而且与常规p c r 相比，它具有特异性更强、有效解决p c r 污染问题、自动化程度高等特点。本文 采用了s y b rg r e e ni 荧光染料，通过相对定量中的双标准曲线法，以大菱鲆看 家基因p - a c t i n 为内参进行校正，比较了经哈维氏弧菌感染的和未受感染的大菱 鲆中m h cc l a s si a 基因的表达量的差异。结果显示，大菱鲆的m h cc l a s si a 在受 到哈维氏弧菌感染后表达量有所上升，表达量上升为原来的4 倍，证明m h cc l a s s i a 在大菱鲆的免疫反应中发挥了作用。 关键词：大菱鲆；哈维氏弧菌；s s h 技术；r e a l - t i m ep c r ；r a c e l i 大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究 d i f f e r e n t i a t e de x p r e s s e dg e n e so ft u r b o tf o l l o w i n gc h a h e n g e w i t hv i b r i oh a r v e y i a b s t r a c t t l l r b o t ( s e n p h t h a l m u sm a x i m u s ) i sa l le c o n o m i c a l l yi m p o r t a n tm a r i n ef i s hs p e c i e s ， a n di sv a l u e df o ri t sr a p i dg r o w t ha n dg o o dt a s t e h o w e v e r , t h ei m p a c to fd i s e a s e si s s t i l lal i m i t i n gf a c t o rt oa q u a c u l t u r e i np a r t i c u l a r , t b r i oh a r v e y ii sab a c t e r i u l p a t h o g e nr e s p o n s i b l ef o rs e r i o u sd i s e a s eo u t b r e a k si nn u m e r o u ss p e c i e so f c u l t u r e d f i s hi n c l u d i n gt u r b o t i no r d e rt os o l v et h ed i s e a s ep r o b l e m si na q u a c u l t u r ea n dt oi m p r o v et h er e s i s t a n c e o ff i s ha g a i n s tv a r i e sp a t h o g e n s ，i ti si m p o r t a n tt oi l l u s t r a t et h ei m m u n e - r e l a t e dg e n e s o ft u r b o ta n di t sr e s i s t a n c et ob a c t e r i a l p a t h o g e n s h o w e v e r , m o s t o ft h e i m m u n e - r e l a t e dg e n e sa r en o tc o n s t i t u t i v e e x p r e s s e db u ti n d u c i b l ee x p r e s s e d t h e r e f o r e ，i fw ec a na n a l y s et h ed i f f e r e n c e si ng e n ee x p r e s s i o no ft u r b o tf o l l o w i n g c h a l l e n g ew i t hp a t h o g e n s w ec a ni d e n t i f yn e wi m m u n e - r e l a t e dg e n e sa n di l l u s t r a t e t h er e l a t i o n s h i pb g t w e e ni n n l l u n e r e l a t e dg e n e sa n dp a t h o g e n s s u p p r e s s i o ns u b t r a e t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s mt e c h n o l o g yw a se s t a b l i s h e do nt h e b a s i so fm r n ad i f f e r e n t i a l d i s p l a yt e c h n o l o g y , i no r d e rt o s e l e c td i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e dg e n e s i ti sm a i n l yb a s e do ns u p p r e s s i o np c ra n dc o n n e c t e dw i t h n o r m a l i z a t i o na n ds u b t r a e t i v eh y b r i d i z a t i o nt e c h n o l o g y i to v e r c o m e ss h o r t c o m i n g s o ft h et f i g hf a l s ep o s i t i v ei nm r n ad i f f e r e n t i a l d i s p l a ya n dm o r er o u n d s i n r e p r e s e n t a t i o n a ld i f f e r e n c ea n a l y s i s i ti sp a r t i c u l a ru s e dt oa n a l y s et h ed i f f e r e n c e si n g e n ee x p r e s s i o na n di th a sb e c o m et h em o s tp o t e n t i a lt e c h n i q u e sf o rs e l e c t i o no f d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e s i nt h i st h e s i s ，t h ed i f f e r e n c e si n g e n ee x p r e s s i o ni n t h eu n c h a l l e n g e da n di f h a r v e y ic h a l l e n g e dt u r b o tw e r ec o m p a r e db ys s h t r i z o lr e a g e n tw a su s e dt oe x t r a c t t o t a lr n af r o m k i d n e ya n ds p l e e no f e x p e r i m e n t a la n dc o n t r o lg r o u p a n dm r n a w a s t h e ns e p a r a t e da n dp u r i f i e d t h es s hl i b r a r yw a sc o n t r u c t e da n dd i f f e r e n t i a t e d e x p r e s s e dg e n e sw e r ec l o n e d at o t a lo f4 9e s t s ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ) w e r e o b t a i n e df r o ms u b t m e t i v el i b r a r i e s a n ds e q u e n c e d a f t e rb l a s t i n gi ng e n b a n k , i tw 嬲 i i i 大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究 f o u n dt h a tm o s to ft h ed i f f e r e n t i a t e de x p r e s s e dg e n e sw e r ei m m u n e - r e l a t e dg e n e s i n c l u d i n gm a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ( m h c ) c l a s si ag e n e ，h s p 7 0g e n ea n d s o m es i g n a l i n gm o l e c u l e sg e n e ss u c h 鹬s l c f a m i l yt y r o s i n ek i n a s es c k , s g k - i s e r i n e - t h r e o n i n ep r o t e i nl d n a s ea n da m y l o i dp r e c u r s o r - l i k ep r o t e i n2a n ds oo n o n e e s tw a si d e n t i f i e d 鹊m h cc l a s siag e n ea n dt h ef u l l l e n g t he d n aw e i co b t a i n e d b yr a c e t h eg e n ew a ss e q u e n c e da n dt h ec h a r a c t e ro fe n c o d i n gp r o t e i nw e r e a n a l y s e d t h ef u l l l e n g t he d n ac l o n eo ft h et u r b o tm h cc l a s si a ( 1 4 6 6b p ) c o n t a i n e das i n g l eo p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) o f1 0 6 2b p t h e5 u n t r a n s l a t e dr e g i o n ( u t r ) a n dt h el o n g e r3 u t rw e r e1 2 7b pa n d2 7 7b p ，r e s p e c t i v e l y s e q u e n c e a n a l y s i si d e n t i f i e d ap o s s i b l ep o l y a d e n y l a t i o ns i g n a lf a t t a a ) i nt h e3 u t r 毹 p o s i t i o n1 1 8 5b p t h e1 0 6 2b pe n c o d i n gr e g i o nw a sf o u n dt oc o d ef o rap r o t e i nw i t h 3 5 4a m i n oa c i dr e s i d u e s t h ep u t a d v ea m i n oa c i ds e q u e n c ee n c o d e db yt h et u r b o t m h cc l a s sl aw a sa l i g n e dw i t ha m i n oa c i ds e q u e n c e sf r o mh a m a n ( a c c e s s i o nn o u 2 1 0 5 3 ) ，m o u s e ( a c c e s s i o nn o x m 9 7 4 6 6 0 ) ，c h i c k e n ( a c c e s s i o nn o n m 0 0 1 0 3 1 3 3 8 ) ， r m n b o wt r o u t ( a c c e s s i o nn o a y 2 7 8 4 5 5 ) ，b a s t a r dh a l i b u t ( a c c e s s i o nn o a b l 2 6 9 2 1 ) ， m e d a k a ( a c c e s s i o nn o a b 0 2 6 9 7 8 ) ，a t l a n t i cc o d ( a c c e s s i o nn o a f 4 1 4 2 0 3 ) a n dt i g e r p u f f e r ( a c c e s s i o nn o a f 0 0 1 2 1 6 ) o v e r a l l ，t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eo f t u r b o m h cc l a s si ah a d6 8 ，5 4 ，5 1 ，5 2 ，5 7 ，3 3 ，2 9 a n d2 9 i d e n t i t i e sw i m t h o s eo fb a s t a r dh a l i b u t , m e d a k a , r a i n b o wt r o u t ，a t l a n t i cc o d ，t i g e rp u f f e r , c h i c k e n , m o u s ea n dh u m a n ，r e s p e c t i v e l y r e a l t i m ep c ri sat e c h n o l o g yt h a ta d d sf l u o r e s c e n c et op c rr e a c t i o ns y s t e m ， w h i c hi sb a s e do nt h ed e t e c t i o no faf l u o r e s c e n tr e p o r t e rm o l e c u l et h a ti n c r e a s e sa s p c r p r o d u c ta c c u m u l a t e sw i t he a c hc y c l eo fa m p l i f i c a t i o n i te x c e e d s t h el i m i t a t i o n s o ft r a d i t i o n a le n d p o i n tp c rm e t h o d sb ya l l o w i n ge i t h e ra b s o l u t eo rr e l a t i v e q u a n t i f i c a t i o no fp c rp r o d u c ta tt h ee n do fe a c hc y c l e ，a n da v o i d i n gt h ep o l l u t i o ni n t r a d i t i o n a lp c i li nt h i st h e s i s ，t h ed i f f e r e n c e si nm h cc l a s sl ag e n ee x p r e s s i o ni n t h eu n c h a l l e n g e da n d 矿h a r v e y ic h a l l e n g e dt u r b o tw e r ec o m p a r e db y2s t a n d a r d c u r v e sr e l a t i v eq u a n t i t a t i o n , a n dt h eh o u s k e e p i n gg e n e1 3 a c t i nw a su s e da sc o n t r 0 1 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo ft h em h cc l a s si ag e n ei n 矿h a r v e y i c h a l l e n g e dt u r b o ti n c r e a s e dt o4 - f o l do f t h ec o n t r o l s i td o m e n s t r a t e dt h a tm h c c l a s s l ag e n ep l a y sar o l ed u r i n gi m m u n er e s p o n s eo f t u r b o t k e yw o r d s ：t u r b o t ；v b r oh a r v e y i ：s s h ；r e a l - t i m ep c r ；r a c e l v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或 其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名丑渤钓 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名： 五健女目 签字日期：1 ) 年石月加日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签字； 、落趣 辩醐5 寸6 1 e l 签字日期：加降厶月f 9 9 霄勿 p 侈 话 编 电 邮 大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究 1 前言 我国的海水养殖起始于2 0 世纪5 0 年代，近2 0 年来得到了突飞猛进的发展，养 殖规模越来越大，产量逐年增加。随着海水养殖业的逐步发展病害问题也日益突 出，由细菌感染引起的鱼类细菌性疾病因为流行面广、发病率高、危害性大，一 直是研究的重点。鱼类的病害问题是限制海水鱼类养殖业可持续发展的主要因 素，为解决养殖鱼的病害问题，增强养殖品种的抗病力，必须对病原菌的致病因 子、鱼类的免疫能力以及病原菌和鱼类免疫器官之间的相互作用关系有全面地了 解。大菱鲆的弧菌病是一种危害性较大的细菌性疾病，国内外对大菱鲆的弧菌病 进行了初步的研究，但主要集中与病原菌的分离鉴定、形态描述、流行规律以及 发病鱼的症状描述、组织病理学观察等方面，但对病原菌和大菱鲆的免疫器官的 相互作用关系的实时研究较少，尤其是在分子的水平上的研究就更少，许多免疫 抗病相关基因尚不清楚。由于大多数免疫抗病相关基因并非组成型表达，而是受 病原物感染影响的诱导型表达，因此如能分析免疫细胞基因在病源物感染时的差 异表达，就有可能发现和鉴别新的免疫抗病相关基因，并在分子水平上阐明免疫 细胞和病原菌之间的相互作用关系。 抑制消减杂交( s u p p r e s s i o ns u b t r a e f i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s h ) 技术由d i a t e h e n k o 于1 9 9 6 年建立了一种新的c d n a 消减杂交法，它克服了m r n a 差异显示技术的假阳性 高和代表性差别分析法的消减杂交轮次较多的缺点，十分适用于克隆分析造成某 种特殊表型的基因，从而成为筛选差异表达基因最有潜力的新方法。s s h 在鉴定 未知序列的差异表达基因发面有独特的优势，经改进和优化后该技术已广泛应用 于分离在不同条件下差异表达的基因，因此也可用于鱼类在病原菌感染后的基因 差异表达分析。s s h 是以抑制p c r 为基础，将标准化检测子e d n a 的单链步骤和差减 步骤合为一体的技术。标准化的步骤均等了检测子中的e d n a 单链丰富度，差减杂 交步骤去除了检测子和驱动予之间的共同序列，使检测子和驱动子之间的不同序 列得到扩增，因此s s h 显著增加了获得低丰富度表达差异的e d n a 的概率，简化了 差减文库的分析。 自从d i a t c h e n k o 建立了s s h 以来，s s h 己被应用到许多的分子遗传学和定位克 隆的研究，即鉴别病理变化、生物体生长发育和组织分化的基因表达变化或其他 差异表达的基因。s s h 在鱼类基因克隆中的作用也取得了很多的成果，克隆了一 大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究 系列的新基因，为深入研究鱼类的发育的时空表达特征和免疫调节机理打下了良 好的基础。 1 1 抑制性消减杂交技术 1 1 1 抑制性消减杂交技术基本原理 s s h 技术是d i a t c h e n k o 等( 1 9 9 6 ) 以m r n a 差别显示技术为基础建立起来的筛选 未知的差异表达基因的新技术，它主要基于抑制p c r ，并结合标准化 ( n o r m a l i z a t i o n ) 和消减杂交( s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s h ) 。所谓抑制p c r ， 是通过利用含引物序列的双链接头( a d a p t o r ) 充当引物模板，使两端接上同一接 头的非目的双链片段具有反向末端重复序列，在退火时产生“锅一柄”结构， 无法与引物配对，从而选择性抑制非目标序列的扩增，从而达到抑制非目的片段 而选择性扩增目的片段的目的。a d a p t o r 设计特点：由一长链( 约4 0 个核苷酸) 和 一短链( 约l o 个核苷酸) 组成的一端是平端的双链d n a 片段；双链两个5 端均无磷 酸基团，使a d a p t o r 以唯一方向与e d n a 片段连接，即接头长链的3 端通过磷酸二 酯键与e d n a 双链5 端连接；接头长链外侧( 约2 0 个核苷酸) 序列与第一次p c r 弓i 物 序列相同，内侧序列与第二次p c r 引物序列相同；接头上含有限制性核酸内切酶 识别位点( 如n o t l 、s h i 、s i n a i 和x b a l ) ，为该片段插入克隆载体提供酶切位点。 该方法运用了杂交二级动力学原理，即丰度高的单链d n a 在退火时产生同源杂交 的速度快于丰度低的单链d n a ，标准化步骤平衡了目的基因群中e d n a 的丰度，从 而使原来在丰度上有差别的单链d n a 相对含量达到基本一致，即低丰度差异表达 的基因不会丢失，而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离。消减杂交( s h ) 则扣除了检测子( t e s t e r ) 与驱动子( d r i v e r ) 间的同源序列。使不同的序列得到扩 增。s s h 技术作为一种新的基因克隆分析技术，结合了消减杂交和抑$ | j p c r 两项技 术，具备两项技术的优点，如特异性高，高度灵敏性，效率高，操作简单等优点。 1 1 2 抑制消减杂交技术的操作过程 s s h 的具体操作过程是：抽提两种细胞的r n a ，反转录成e d n a ，用r s a l 或h a e l i i 酶切，以产生大小适当的平头末端的e d n a 片段，将t e s t e re d n a 分成均等的两份， 各自连接上两种接头，将过量的d r i v e re d n a 分别加入两份t e s t e rc d n a 中，变性 后退火杂交。第一次杂交有4 种产物：a 是单链t e s t e re d n a b 是自身退火的t e s t e r c d n a 双链，c 是t e s t e r 和d r i v e r 的异源双链，d 是= d r i v e rc d n a 。第一次杂交是使 2 大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究 t e s t e r 单链e d n a 均等化，即使原来有丰度差别的单链c d n a 的相对含量达到基本一 致。同时，由于t e s t e rc d n a 中和d r i v e rc d n a 序列的相似片段大都和d r i v e r 形成 异源双链分子c ，使t e s t e rc d n a 中的差异表达基因的目标c d n a 得到大量富集。第 一次杂交后合并两份杂交产物，另加上新的变性d r i v e r 单链再次杂交退火。在这 一次杂交( 第二次) 中只有第一次杂交后剩余的均等化和消减的单链t e s t e re d n a 能与d r i v e rc d n a 一起形成各种双链分子。这次杂交富集了差异表达基因的c d n a ， 并且产生了一种新的双链分子e ，这种分子的两个5 端有两个不同的接头，正是 由于这两个不同的接头，使其能在以后的p c r 中被有效地扩增。两次杂交后填平 粘性末端，利用巢式p c r 原理进行扩增。s s h 技术程序见图1 1 。 植舅子哪卧恤搬知) 过量的囊动子印m 植舅子哪翻嘲臣西 蝴曩- d l 蚺- i 廿i 呻瞳l ( k - j 盯c e i n 汹棚日_ 抽时霄c i i 峨w i t h - - 由蕾2 ；鲁擀一萼 口，e = ! ：! z l h r t 1 m 碰i 擅c i i 柚i j 自j = = = = 巴 h q +口七= 享钿 葬乎末if i l li n t h 口_ 一 b 口一_ _ _ _ 口c 口一_ - 目_ _ - 口口- _ - 一 4 ； 。 。昌= 昌 l p 器勰：黜 o 蛙扩增u 帕i _ 一l a a t i 埘 翱扩增l 再_ 吐沮l 皿i f 蛔出 图卜1s s h 技术程序示意图 f i g 1 1t h ef l o wc h a r to f s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n 1 1 3 抑制消减杂交技术的特点 s s h 具有快速、灵敏、高效、假阳性率低且所需m r n a 量较少等优点，适合差 异表达的新基因的检测和克隆。 1 1 - 3 1 在分离稀少基因方面具有优势 c d n a 消减杂交、代表性差异分析、m r n a 差异显示方法都不能分离到低丰度的 3 大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究 差异表达基因，而s s h 技术对高、低丰度的差异表达基因都能有效分离，这一重 要优点主要归功于其均等过程。在标准体系中，运用s s h 进行一轮消减杂交，可 富集稀有序列1 0 0 0 倍以上，使某些低丰度表达的m r n a 有望被检出。有实验证明经 过一轮消减可对稀少转录物富集达10 0 0 50 0 0 倍( w r i g h t 等，2 0 0 2 ) 。所需m r n a 5 0n g 1p g ，并可在m r n a 总量较少的情况下，通过预扩增而获得足够高质量的 e d n a ( d i a t c h e n k o 等，1 9 9 6 ) 。 1 1 3 2 效率高 一次s s h 反应可同时分离到几十到几百个差异表达的基因。消减的e d n a 混合 物可被用作杂交探针，并且消减过程不需e d n a 单、双链分离的物理过程。此外， 通过调整第一次差减杂交中d r i v e re d n a 的含量，并在第二次差减杂交中不加入 d r i v e rc d n a ，则有望反映出基因表达量的差异。 1 1 3 3 简便易行 抑制性消减杂交技术所采用的方法简单、成熟、易掌握、易操作。 1 1 3 4 假阳性率低 采用两次消减杂交和两次p c r ，保证该方法有较高特异性。 1 1 3 5 筛选周期短 采用该技术一般3 4d 即可获得差异表达基因的c d n a 片段，若在实验中应用 增强剂( 如p e g ) ，可使实验缩短至2 45 9 内。 1 1 3 6 缺点 但其不足的一面是更多依赖于p c r 技术，如预扩增可能导致一些序列的丢失 ( d i a t c h e n k o 等，1 9 9 6 ) 。此外，对材料要求较高，不能同时进行数个材料间或不 同处理材料间的比较，材料间不能存在过多差异，存在小片段缺失时不能有效检 测。并且利用s s h 技术筛选出来的克隆尚存在着一定的假阳性，需利用斑点杂交， n o r t h e r n 或r t - p c r 等技术进一步筛选验证。 1 2s s h 技术与其它差异显示技术的比较 除了s s h 技术，研究基因差异表达的其他技术还有差别杂交( d i f f e r e n t i a l h y b r i d i z a t i o n ) 、扣除( 消减) 杂交( s u b t r a e t i v eh y b r i d i z a t i o no f c d n a ，s h d ) 、 m r n a 差异显示技术( m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a y ，d d r t p c r ) 、代表性差异分析 ( r e p r e s e n t i a ld i s p l a ya n a l y s i s ，r d a ) 、交互扣除r n a 差别显示技术( r e c i p r o c a l 4 大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究 s u b t r a c t i o nd i f f e r e n t i a lr n a d i s p l a y ) 以及基因表达系列( s e r i a la n a l y s i so fg e n e e x p r e s s i o n ，s a g e ) 分析、限制性酶切片段差异显示( 7 d d p c r ) 、电子消减 ( e l e c t r o n i cs u b t r a c t i o n ) 和e d n a 微列阵分析( d n am i c r o a r r a y ) 等，现将主要的 几种分述如下： 1 2 1 限制性酶切片段差异显示技术( r f d d _ p c r ) r f d d p e r 不是直接扩增e d n a ，而是首先限制性酶切e d n a ，再在酶切后的e d n a 片段两边加上特殊接头进行扩增。正是因为特异性p c r 引物的使用和下游的p e r 反应使r f d d - - p c r 分析具有高度的重复性，解决了第一代差别显示系统的重复性问 题；因为r f d d - p c r 技术不使用以p o l y ( a ) 为引物的p e r 扩增，因而该系统对原核和 真核系统皆适用；在第一代的差异显示系统中，下游引物特异性结合p o l y ( a ) 尾， 因此与3 端未翻译区域相对应的差异表达序列大部分被鉴别出，而r f d d - p c r 采 用优先切割翻译序列的限制性内切酶( 如t a q i ) ，因此可以优先展示编码区，更 加适合于下游功能分析：使用r f d d p c r 获得差异显示基因后，与d i s p l o yf i t 网 络相连后，可以确定哪个基因是已经研究过的，哪些是未知基因，对下一步研究 有很好的指导意义。总之，r f d d p c r 中高度严谨的p e r 可以产生结果一致的基因 表达图谱，重点放大和展示编码区，对原核及真核r n a 都有用，大大消除假阳性。 原理见图1 - 2 。 5 大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究 图1 - 2r f d d p c r 原理图 f i g 1 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f r f d d - p c r 1 2 2 代表性差异分析( r e p r e s e n t a t i o n a ld i f f e r e n c ea n a l y s i s 。r d ) r d a 是将差减杂交与p c r 结合，利用双链d n a 为模板时p c r 呈指数扩增，而单链 d n a 为模板时则呈线性扩增的原理，首先提取处理组和对照组的总r n a 或m r n a ，反 转录成e d n a ，用识别四个碱基的内切酶，如d p ni i 或s a u 3 h ，充分消化，然后利用 p c r 技术使两组e d n a 片段得以富集，接着连续进行3 次差减杂交，以彻底去除两组 共有的基因，最后利用p c r 技术富集试验组中特异表达基因的c d n a 片段。原理见 图i - 3 。 6 大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究 图1 - 3r d a 原理图 1 2 3m r n a 差异显示技术( d d r t p c r ) 传统m r n a 差异显示技术( d d r t p c r ) 是根据绝大多数真核细胞m r n a 3 端具有 的多聚腺苷酸尾( p o l y a ) 结构，因此可用含o l i g o ( d t ) 的寡聚核苷酸为引物将 不同的m r n a 反转录成c d n a 。该方法的创始人l i a n gp 和p a r d e ea 根据p o l ya 序列 起点前2 个碱基除从外只有1 2 种可能性的特征，设计合成了1 2 种下游引物，称3 一 锚定引物，其通式为5 _ t 1 i m n ；同时为扩增出p o l y a 上游5 0 0 b p 以内所有可能性的 m r n a 序列，在5 端又设计了2 0 种l o b p 长的随机引物。这样构成的引物对进行p c r 扩增能产生出2 0 0 0 0 条左右的d n a 条带，其中每一条都代表一种特定m r n a 种，这一 数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部m r n a 。将差别表达 条带中的d n a 回收，扩增至所需含量，进行s o u t h e r n b l o t 或n o r t h e r n b l o t 或直接 7 大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究 测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。原理见图 1 4 。 图卜4 叻r t - p c r 原理图 f i g 1 - 4s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f m r n a d i f f e r e n t i a ld i s p l a y 1 2 4 基因表达系列分析( s e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n ，s a g e ) s a g e 法的建立基于两条理论。首先，一段来自某个转录予确定位置的核苷酸， 其长度只要有9 一1 0 个b p ，就能够特异地确认该转录子。第二，对短片段标签的链 接有利于在同一克隆中对多个标签测序。s a g e 也是用生物素标记的b i o - o l i g o ( d t ) 为引物合成双链c d n a ，然后以限制酶( 锚定酶) 进行酶切，捕获c d n a 3 端，在此 处产物被分为两部分，分别与包含有i i s 型内切酶( 标签酶) 位点的a 、b 连接予相 接，i i s 型内切酶的特点是作用位点处于识别位点之外，这样经过酶切，就有可 能得到只有9 一l o b p 的标签序列。每两个标签的钝端结合后成为p c r 的模板，以基 于a 、b 连接子的引物进行p c r 反应的结果是得到了大量每条包含两个不同来源标 签的序列，接下来再用锚定酶酶切、连接，就能将多个不同的标签链接在一起( 大 约为每条包含数十个不同来源的标签) ，克隆至质粒载体中后集中测序。 s a g e 的最终结果是通过计算机统计得到的，根据某个标签出现频率的高低来 8 大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究 判断并计算其所属基因表达的丰度。对于在数据库中找不到对应序列的标签，还 可以利用1 3 b p 的寡核苷酸探针( 9 b p 力i 上锚定酶识别位点的4 b p ) 对c d n a 文库进行 筛选，以寻找新基因。s a g e 可以检测不同细胞间已知基因表达的具体差异，精确 到每个细胞中大约有多少拷贝，可以建立较全面的基因表达谱，系统地分析基因 表达的差异。它的缺点在于工作量非常大，有大量的测序及计算机分析任务；而 且，对于寻找新基因而言，仅用长度为1 3 b p 的寡核苷酸探针筛选c d n a 文库是很不 严格的，往往是假阳性结果居多。s a g e 原理见图卜4 。 磊i i 黧r r t t r 白t t 珠t _ 囹溜；确一固。c ，a 鲳t o 广轴 j 标签醇酶协j 圆器麓翟慧裟圃裟嚣翟黧船 连接，p c r 扩增 困：锻篙麓鐾器嬲粼：兹霉五圈 j 苒用樯定董一甥分寓竞睦渊牟 图卜5 基因表达系列分析( 锚定酶为n i a i i i ，标签酶为f o l d ，x 和。代表来 自不同标签的核营酸) f i g1 - 5s c h e m a t i cr 印m s c a t a t i o no fs a g e ，( t h ea n c h o r i n ge n z y m ei sn i m i i ，a n d t a g g i n ge n z y m ei sf o l 【i xa n do i n d i c a t e st h en u c l e o t i d ef r o md i f f e r e n tt a g s ) 1 2 5c d n a 微阵列技术( c 删am i c r o a r r a y ) d n a 微阵列是一种全新的研究