（凝聚态物理专业论文）蛋白质晶体学中的直接法研究.pdf

摘要 摘要 o a s i s 程序将直接法与常用的蛋白质晶体学方法相结合，用于推演蛋白质晶体的衍射 相位，已经证明非常有效。本文吏进一步从理论、应用和自动化三个方面，发展了0 a s i s 的方法和程序。 1 o a s i s 程序破解单波长反常衍射( s a d ) 相位模糊问题的一个关键，在于：将s a d 相 位的双峰概率分布表示为中心值存”+ i 纸i 和仇”一i 饩l 的两个高斯概率分布之和。利用 直接法中的c o c h r a n 概率可以求出仇取正号时的概率p + 。因此s a d 相位模糊可以通过p + 乘以中心在”+ l 纨i 的高斯分布以及p 一( = l p 十) 乘以中心在纯”一| 仇j 的高斯分布来破解。 这种破解相位模糊的方法已经证明是行之有效的，特别是存反常散射信号微弱的情况下。 但是将相位概率分布表达为两个高斯分布的和会带来一些不可忽略的误差。本文利用v o r l m i s e s 分布代替高斯分布来拟合s a d 相位的双峰概率分布，使拟合的精度大为提高，从而显 著地增强了o a s i s 推演s a d 相位的能力。 2 本文提出了一种新的、结合s a d s i r 迭代与m r 迭代的结构模型完善化方案。在o a s i s 程序中含有两种利用双空间迭代以扩展部分结构的功能。第一种是利用单波长反常衍射 ( s a d ) 或单对同晶置换( s i r ) 信息和部分结构模型的迭代；另一种是只利用部分结构模 型的“分子置换法模型”迭代( m r 迭代) 。一般来说，s a d s i r 迭代更为有效，因为它利用 的实验信息吏多。因此，若衍射数据中含有s a d s i r 信息，就会使用s a d s i r 迭代；若衍 射数据中4 i 含s a d s i r 信息，则使用m r 迭代。本文将展示，对于含有s a d s i r 信息的数据， 一个结合s a d s i r 迭代和m r 迭代的方案相比于单纯的s a d s i r 迭代可以得到更好的结果。 3 我们开发了一个用于设定和实时监控自动化迭代过程的用户图形界面( g u i ) 本文将 详细介绍这个图形界面的功能。 关键字：直接法、大分子晶体学蛋白质晶体学、双空间部分结构扩展、o a s i s a b s t r a c t a b s t r a c t t h e p r o g r a m o a s i sw h i c hc o n b i n e sd i r e c tm e t h o d sw i t hc o n v e n t i o n a l p r o t e i n c r y s t a l l o g r a p h i cm e t h o d s h a sb e e np r o v e dv e r ys u c c e s s f u lf o rp h a s i n go fp o r t e i nd i f f r a c t i o nd a t a i n t h i sp a p e lw ed e v e l o pt h em e t h o d sa n dt h ep r o g r a mf r o mt h e o r y , a p p l i c a t i o na n da u t o m a t i o n ， w h i c ha r ei n c l u d e di nt h i sp a p e r 1 ，o n eo ft h ee s s e n t i a lp o i n t so ft h ed i r e c t m e t h o ds a dp h a s i n gf o rp r o t e i n si st oe x p r e s st h e b i m o d a ls a dp h a s ed i s t r i b u t i o nb yt h es u mo ft w og a u s s i a nf u n c t i o n sp e a k e dr e s p e c t i v e l ya t 纸”+ i 仇ia n d 仇”一i 纬1 t h ep r o b a b i l i t yf o r 纯b e i n gp o s i t i v e ( p + ) c a nb ed e r i v e db a s e d o nt h ec o c h r a nd i s t r i b u t i o ni nd i r e c tm e t h o d s h e n c et h es a dp h a s ea m b i g u i t yc a nb er e s o l v e d b ym u l t i p l y i n gt h eg a u s s i a nf u n c t i o np e a k e da t 仇”+ i 仇jw i t hp + a n dm u l t i p l y i n gt h eg a u s s i a n f u n c t i o np e a k e d a t 纸”一i 仇 w i t hp ( ip + ) d i r e c t m e t h o ds a dp h a s i n g h a sb e e np r o v e d p o w e r f u li nb r e a k i n gs a dp h a s ea m b i g u i t i e s ，i np a r t i c u l a rw h e na n o m a l o u s s c a t t e r i n gs i g n a l sa r e w e a k h o w e v e r ，t h ea p p r o x i m a t i o no fb i m o d a lp h a s ed i s t r i b u t i o n sb yt h es u mo ft w og a u s s i a n f u n c t i o n si n t r o d u c e sc o n s i d e r a b l ee r r o r s i nt h i sp a p e rw es h o wt h a tam u c hb e t t e ra p p r o x i m a t i o n c a nb ea c h i e v e db yr e p l a c i n gt h et w og a u s s i a nf u n c t i o n sw i t ht w ov o nm i s e sd i s t r i b u t i o n s t h i s n e wm e t h o dl e a d st os i g n i f i c a n ti m p r o v e m e n to ft h ee f f i c i e n c yo fd i r e c t m e t h o ds a d p h a s i n g 2 ，i nt h i sp a p e r , w ec r e a t ean e wm o d et oc o m b i n es a d s i ri t e r a t i o na n dm ri t e r a t i o ni n p a r t i a l m o d e le x t e n s i o no fp r o t e i n s t h e r ea r et w ok i n d so fd u a l - s p a c ep a r t i a l m o d e le x t e n s i o n w h i c hi n v o l v et h ed i r e c t m e t h o dp r o g r a mo a s i s t h ef i r s tk i n d ，n a m e ds a d s i ri t e r a t i o nu s e s s a d s i ri n f o r m a t i o n ，w h i l et h es e c o n dk i n d ，n a m e dm ri t e r a t i o nd o e sn o tu s et h a ti n f o r m a t i o n i ng e n e r a l ，s a d s i ri t e r a t i o ni sm o r ep o w e r f u ls i n c em o r ee x p e r i m e n t a li n f o r m a t i o ni su s e d h o w e v e r , i nm o s tc a s e sw h e np r o t e i ns t r u c t u r e sa r es o l v e dw i t ht h em o l e c u l a rr e p l a c e m e n t m e t h o d ，s a d s i ri n f o r m a t i o ni sn o ta v a i l a b l e t h u st h em r i t e r a t i o ni sp a r t i c u l a r l yu s e f u lf o r t h e c o m p l e t i o no fm o d e l sf r o mm o l e c u l a rr e p l a c e m e n t t h es a d s i ri t e r a t i o nw i l lb ea u t o m a t i c a l l y u s e di no a s isf o rd a t as e t sc o n t a i n i n gs a d s i rs i g n a l s ，w h i l et h em ri t e r a t i o nw i l lb ed e d i c a t e d t od a t as e t sw i t h o u ts a d s i rs i g n a l s t h ep r e s e n tp a p e rs h o w st h a tf o rd a t ac o n t a i n i n gs a d s i r s i g n a l s ，ac o m b i n a t i o no fs a d s i ri t e r a t i o na n dm ri t e r a t i o nc o u l dl e a dt os i g n i f i c a n t l yb e t t e r r e s u l t st h a nt h a to b t a i n e df r o mt h es a d s i ri t e r a t i o na l o n e 1 i a b s t r a c t 3 ，an e w g u ii sp r o v i d e df o rc o n t r o l l i n ga n dr e a l t i m em o n i t o r i n gt h ed u a l - s p a c ei t e r a t i v e p r o c e s sw i t ho a s i s 4 0 ，w h i c hw i l lb ed i s c u s s e di nd e t a i li nt h ep r e s e n tp a p e r k e y w o r d s - d i r e c tm e t h o d s 、m a c r o m o l e c u l a rc r y s t a l l o g r a p h y p r o t e i nc r y s t a l l o g r a p h y 、d u a l s p a c e f r a g m e n te x t e n s i o n 、o a s i s 第。章引言 第一章引言 1 9 世纪末，德囝物理学家伦琴在研究阴极射线的时候无意中发现了x 射线，伦琴因此 得到了首届诺贝尔物理学奖，从而也揭开2 0 世纪物理学革命的序幕。在随后的一百多年里， x 射线被应用在广阔的领域里。1 9 1 2 年，德国物理学家劳厄发现了x 射线通过晶体之后产 生的衍射现象，即x 射线衍射。老布拉格则使用布拉格定律对衍射关系进行了定量的描述。 这一发现证实了x 射线是一种波长很短的电磁波，从而使人们可以利用x 射线晶体衍射效 应来研究晶体的结构，根据衍射方向确定晶胞的形式和大小，根据衍射强度可确定晶胞的 内容，包括原子、离子、分子的分布位置，这就导致了一种在原子分子水平上研究化学物 质结构的重要实验方法- x 射线晶体学( 也称为x 射线结构分析) 的诞生。这门新科学 后来对于化学的各分支以及材料学、生物学等都产生了深远的影响。 蛋白质晶体学的历史 2 0 世纪3 0 年代，x 射线衍射法被用于测定生物物质和蛋白质的晶体结构，从而诞生 了门新兴的学科蛋白质晶体学( m a c r o m o l e c u l a rc r y s t a l l o g r a p h y ) 。第一张蛋白质晶体 的x 射线衍射图是1 9 3 4 年b e m a l 和c r o w f o o t 拍摄的胃蛋白酶的晶体衍射副1 1 。虽然当年x 射线衍射照片已经得到，但当时要解决蛋白质大分子晶体的衍射相位问题尚没有可行的方 法。直到五十年代初，p e r u t z 和他的同事将解小分子晶体结构中不常使用的同晶置换法加以 发展提出了多对同晶置换法( m i r ) ”用以解决大分子晶体结构测定中的相位问题【2 1 ，至 此，蛋白质晶体学才得到了飞速的发剧3 1 。1 9 5 9 年和1 9 6 0 年k e n d r e w 和p e r u t z 分别利用这 一方法得到了鲸肌红蛋白和马血红蛋白的低分辨率( 6 a 和5 a ) 晶体结构，并胃k e n d r e w 一 更于1 9 6 0 年得到可以从原子细节上来分析的肌红蛋白的高分辨率晶体结构( 2 a ) 1 4 】。原子 细节上的空间排列模型，成为阐明蛋白质生物活动过程的结构基础，从而创立了分子生物 l 第章引言 学( m o l e c u l a rb i o l o g y ) 。两人也因此获得1 9 6 2 年的诺贝尔化学奖。p e r u t z 和k e n d r e w 的工 作奠定了蛋白质晶体学的发展摹础。第一个测定出晶体结构的酶是溶菌酶1 5 , 6 】。从溶菌酶的 晶体结构数据，已经详细地阐述了酶的作用机理。不久又测定了羧肽酶的结构以及阐明了 其催化作用机理【7 ，8 】。第一个给出三维x 射线分析结果的核酸是转移核糖核酸( t r n a ) 1 9 】。 第一个测定膜蛋白三维结构的是绿色红假单胞菌光合作用反应中心膜蛋白的晶体1 1 1 。许多 基础的生物大分子的晶体结构测定工作使晶体的x 射线衍射和生物化学、分子生物学和基 因工程等许多学科紧密地联系在一起。 在2 0 世纪最后2 0 年和本世纪初，蛋白质晶体学得到了飞速的发展，这也要归功于实 验设备的快速发展。比如同步辐射( s y n c h r o t r o nr a d i a t i o n ) x 射线源的应用，可为很小的 晶体( 如线度为0 0 3 m m 的晶体) 和不稳定的晶体收集衍射数据。高强度同步辐射的利用， 已影响到x 射线晶体学及晶体的散射领域的研究工作，就像激光之影响光学领域一样。面 探测器( a r e ad e t e c t o r ) 的发展，可同时记录许多衍射数据，缩短收集衍射强度的时间。还 有计算机的功能也越来越强大，这些都极大地促进了蛋白质晶体学的发展。 1 2 蛋白质x 射线晶体结构测定的基本过程 近年来，由于仪器技术和方法的彳i 断改进，蛋白质晶体结构测定的水平有了极大地提 高。以前测定一个蛋白质结构需要花费数年的时间，而现存可能只需要几天就可以了。但 尽管这样，整个晶体结构测定的过程却基本没有什么大的变化，分为以下几个步骤。 1 2 1 蛋白质结晶和晶体生长( s a m p l ep r e p a r a t i o nt h r o u g hc r y s t a l l i z a t i o n ) 利用x 射线晶体学测定蛋白质的三维结构，首先需要得到适合于结构分析的蛋白质晶 体，其需要满足两个条件：( 1 ) 晶体内部结构要具有有序性，只能是单晶，不能是孪晶， 因为孪晶的两个晶体的衍射图样间的干涉和重叠而无法得到具有结构本身特点的衍射图 2 第幸引三 样。( 2 ) 晶体要有一定的大小和形状，因为晶体衍射线的强度大体上正比于晶体的体积， 而反比于相对分子质量的大小。 在蛋白质晶体学的早期，培养蛋白质晶体并不是个主要的问题，当时主要的瓶颈在于 破解相位问题；待到后来分析方法突破后，晶体培养才慢慢成为了最难点。到目前为止， 蛋白质结晶和晶体生长的过程非常依赖于实验者的个人经验。一般来说，需要通过大量的 条件筛选和优化以使蛋白质分子间的微弱的相互作用促使蛋白质分子形成高度有序的晶 体，而不是随机聚合形成的沉淀。这就要求溶液中的蛋白质处于过饱和状态，并只有少数 的成核中心，使晶体能持续地慢慢地生长成大单晶。 1 2 2 衍射数据的收集( d i f f r a c t i o nd a t ac o l l e c t i o n ) 收集衍射数据通常是利用单波长的x 射线光束照射在一定角度范围内旋转的蛋白质晶 体，同时记录晶体对x 射线散射的强度。这些强度可转换为结构测定中的结构因子的振幅 ( i f h k l f ) 。一套好的衍射数据是晶体结构分析的基础，衍射数据的好坏直接涉及结果的精密。 而一套好的衍射数据又与晶体的好坏、x 射线源的强度以及收集数据的仪器和方法有关。 目前通常采用的x 射线源也有两类，一类是阳极靶式( 包括封闭管式和旋转阳极靶式) ， 另一类是前面提到过的同步辐射x 射线源。无论哪种形式，都要求x 射线源的辐射密度尽 量大，即单位面积的光强大。对同一晶体来说，只要蛋白质对辐射有定的耐受力( 否则 在收数据的过程中需要更换晶体) ，x 射线源的强度越高，晶体的衍射强度也就越大，数据 的误差也就越小。各种x 射线源的光强大小关系是：x 射线源封闭管的光强最弱，转靶x 射线源的强度约为封闭管的4 1 2 倍，同步辐射光强约为封闭管的1 0 0 1 0 0 0 0 倍。除此 之外，还要求射线的发散度尽量小，这一点上同步辐射同样优于阳极靶式的x 衍射仪。x 射线源出来的x 射线经过单色器( 滤波片) 和准直器后，就可以得到单波长的x 射线直线 光束。 3 第章引言 有了准备好的蛋白质晶体和单波长的x 射线直线光束，就可以记录衍射数据了，目前 主要采用的是面探测器和回摆法来记录衍射数据。回摆法的特点是可以同时收集衍射空间 的三维数据，因而同时记录更多的衍射数据，并缩短收集衍射强度的时间。目前影像板、 衍射仪这样的收集数据的装置自动化程度已经相当高了，都是由计算机程序自动控制来完 成，因此效率也越来越高。不过为了满足结构基因组学研究的要求，研究人员还在研制衍 射数据收集的全自动化装置，主要是为了解决晶体的人工安装等比较繁琐的问题，使得整 个收集数据的过程都完全由仪器自动完成。 1 2 3 相位测定( p h a s i n g ) 相位测定是x 射线晶体结构分析的核心问题。由于相位不能由实验技术探测到，因而 只能通过一些问接的方法推导出来。这个问题将是本论文讨论的主要问题之一，具体细节 将在以后的章节里面讨论。 1 2 4 电子密度修饰( d e n s i t ym o d i f i c a t i o n ) 从实验数据中得到了结构因子的振幅( 强度) ，然后通过各种方法得到了结构因子的相 位，有了振幅和相位就可以通过f o u r i e r 变化计算出电子密度图。 电子密度图是晶体结构分析的直接结果，它包含了结构的全部信息。但是实验的每一 步都会有误差，所有误差都会体现在电子密度图上，在分析电子密度图之前我们可以用一 些方法和原则来改善电子密度图，称为电子密度修饰( d e n s i t ym o d i f i c a t i o n ，简称d m ) 。 d m 的主要方法是溶剂平滑法( s o l v e n tf l a t t e r i n g ) 【1 2 1 ，它是基于误差扰动产生的蛋白质“溶 4 ll 历 d + 觚 砂 母 触 件 ，i ) 加 匆 乃 + 卜 缸 p 万 黼 一 h j 1 d ，唧 。叫。弘 采珲弋。赛 第章引。言 剂 区应该到处都一样的原理。使用这个方法的关键是要找出蛋白质和“溶剂”区的交界 面，需要预先告知程序晶体的含水量，这样d m 等相关程序会自动抹- i f “溶剂”区。这一 步骤可通过程序反复多次，直到计算电子密度图的相位收敛为止。 除了溶剂甲滑法之外，一些原则被用于电子密度修饰，比如物质结构的电子密度不能 为负、电子密度的连接性、蛋白质结构的一些已知特性等等。现在最为常用的电子密度修 饰修饰软件是k e v i nc o w t a n 开发的d m 1 3 】、t e r w i l l i g e r 开发的r e s o l v e 1 4 $ 1 ：1 s o l o m o n 等。 1 2 5 建模与修正( m o d e lb u i l d i n ga n dr e f i n e m e n t ) 电子密度图包含了结构的全部信息，但如何从一套电子密度图分析出这些信息，这就 是本节的主要内容建模和修正 当我们得到了一张可以追踪解释的电子密度图后，就可以根据其来建模了。建模的精 度与电子密度图的分辨率有直接关系，以前建模基本上是人工利用蛋白质结构、立体化学 等知识和自己的经验来做，现在随着计算机程序的发展，已经有4 i 少计算机程序可以用来 自动建模。 电子密度的解释和模型的建立是一个反复的过程，实质是4 i 断地改善每个衍射的相位。 由初始结构模型的原子坐标可计算出每个衍射点的相位，应用此相位和实验测得的结构振 幅( 1 硫i ) 可再计算出电子密度图。再通过进一步解释该电子密度图，调整模型中不够准 确的部分，得到新的模型，由该模型的原子坐标再计算出新的、改善后的相位，又可计算 出新的电子密度图，再解释，再调整模型。如此反复，最终建立起更符合实际的结构模型。 有了通过电子密度图分析狭得的结构模型，但由于实验误差影响，结构模型可能存在 某些潜在的错误和问题。因此还要对原子坐标、温度因子、占有率等进行修正。 修正的基本思想是通过彳i 断地调整模型的原子坐标、温度因子等参数，并根据结构因 第。章引古 子公式，计算出每个衍射点的理论结构因子只，并逐步地使理论值f 与实验值昂之间最 大可能地趋于一致，即把模型对x 射线衍射数据进行修正。 反映结构精确性的一个重要参数是r 因子，在修正过程中，通常用r 因子作为判断和监 控修正是否正确的指标。 r = 1 t _ , i p 丽o - p c ( 1 2 ) 修正的一般方法有限制性最小二乘修正、分子动力学修正( s i m u l a t e da n n e a l i n g ) 1 5 , 1 6 】、 最大似然法修正( m a x i m u ml i k e l i h o o d ) 【17 】等等。这些都可以由相应的计算程序来自动完成， 现在较为常用的程序有r e f m a c 1 8 1 、c n s 1 9 1 、p h e n i x r e f i n e 2 0 】等。 1 3 常用蛋白质晶体学结构分析方法介绍 1 3 1 从头推定法 同解决小分子的相位问题一样，人们希望仅仅从衍射点之间的相位关系以及电子密度 图的性质出发推定出各个衍射点的相位，进而解出大分子的结构。这种方法由于彳需要衍 射振幅之外的其他信息，因此在蛋白质x 射线晶体学方法研究中很有诱惑力，从上世纪9 0 年代以来，许多科学家存这方面做了大量的工作，也取得了一定的成果。基于这种思想的 代表程序有：s n b 8 2 1 、a c o r n 8 3 1 、s i r 2 0 0 4 洲。但是生物大分子晶体学与小分子相比有自 己的特点，那就是衍射点数量很大，且衍射分辨率却没有小分子那么高，使得这些程序虽 然在方法和技巧上都有很大的提高，但任然无法突破分辨率的限制，一般分辨率低于1 3a 的数据就很难用这种方法解出来了。而绝大多数蛋白质衍射分辨率都达刁 到这么高的要求， 使得这种从头推定的方法在实际中应用并彳广泛。 6 第幸引南 1 3 2 同晶置换法( i s o m o r p h o u sr e p l a c e m e n t ) 同晶置换法是i 主t p e r u t z 于2 0 世纪5 0 年代发现的可以用于求解蛋白质相位信息的方法。 当蛋白质晶体中引入了适当的重原子后，就造成该晶体衍射线强度的差别，从而衍射强度 的差别就可能推导出相位信息。 在蛋白质晶体中包含大约3 0 一5 0 的水，蛋白质大分子在晶体中作有规则的周期排 列，大分子之间存在不少通道，通常在这些通道中填满着水分子或结晶母液中的其他溶剂 分子。因此，如果把蛋白质晶体浸泡在某种金属离子或含有重原子的小分子的溶液中，重 原子有可能通过这些通道进入蛋白质晶体内，并置换晶胞中某些位置上的溶剂分子。这种 置换一般不会引起大分子结构以及整个晶体结构的明显变化，从而形成较好的同晶置换体。 要使用同品置换法测定蛋白质结构，首先要制备重原子衍生物，如果只有一种同晶重 原子衍生物，叫做单对同晶置换( s i r s i n g l ei s o m o r p h o u sr e p l a c e m e n t ) ；有一种以上的 同晶莺原子衍生物，叫做多对同晶置换( m i r m u l t i p l ei s o m o r p h o u sr e p l a c e m e n t ) 。s i r 只能给出相位的双解，并不能给出正确的相位，同晶重原子衍生物越多，越有可能消除相 位双解和实验误差。 设蛋白质晶体为p ，一般称为母体，重原子同晶置换衍生物记为p m ，m 代表重原子。 假定重原子除了置换母体中的一个溶剂分子外，对晶体结构不产生其他影响。由于母体中 的溶剂分子对x 射线的衍射效应可以忽略不计( 只对很低角度的衍射点稍有贡献) ，因此对 于衍射点h 从结构因子存在下面的关系式： = 耳+ k ( 1 3 ) 和分别代表母体和衍生物的结构因子，它们的振幅f 尸和f 南可以从衍射强度实 验数据中获得，但相位纬和不能直接测得。为重原子对该结构因子的贡献。如果已 经获得重原子在晶胞中的位最和占有率，便可以从理论上计算，包括振幅和相位。 第章 在非f 一心列称的情况f 单对同晶置换法只能得到相位的两种u r 能解，但不能判断箕 p 哪个是正确的，这就是所谓的“相位双解”问艘。其原理如图11 所示。 以o 点为圆心t 对j 衍射点h 川以耳为半径作一个嘲，从o 点 j 发作向量一r ，再 咀此向量的端点为圆心，以e 。为半径作另外一个删这两个喇 h 交于两个点r 由此求得相 位可能的两个解为外和仍 如果采厨两对或两对咀上的同晶霓原子衍生物即多对h 晶 置换法则可以唯一地确定相位。例如，存图11 中，讳i = 8 2 。，辨，= 3 0 c 而衍牛物p 胁 给出结果为舟= 7 4 。，野2 = 1 9 3 。综合这两种结果，可得知该衍射的相位大约在7 8 。左右， 如图12 所示。 图11 ：单对同晶置换法测定利位的原理图 图12 ：多对犀晶置换法 受i 定毒 i 位的原理图 第。幸引古 1 3 3 反常散射法( a n o m a l o u sd i s p e r s i o n ) 我们已经知道了x 射线入射晶体后会产生散射，其本质上是入射x 射线与原子中电子发 生相互作用。当x 射线入射到晶体时，晶体的电子由于x 射线激发而产生受迫振动并在并发 射球面电磁波。这是因为电子受到x 射线电磁场所迫，在原子核周围振动，形成了发射电磁 波的次波源。当入射光子的能量低于电子的跃迁能级时，由于不能激发电子跃迁至高能级， 所以晶体中的所有电子以与入射波相同的频率振动，这些次级波源便向不同方向发出和入 射光频率相同的散射波。这样，等同于光子只会被散射，而不会被吸收，散射光子就不存 在相位延迟。此时的原子散射因子只包含正常散射部分尸，衍射点h 。j 的结构因子墨。划) 表 示为： ) = z 。e x p l 2 ，r i ( h x , + 铣+ f z ，) = f , o e x p ( 2 z r i h ( h k ，1 ) ) = o l o m s ，0 c o s ( 2 z i h ( h a j ) r , ) + j 艺rs i n ( 2 删j ) i ) = i 坩i c 。s 毁，+ i l 鼻，l s i n 缎 ) 我们再来看看衍射点h 厅，f ，f 的结构因子气i ，f ，7 _ ) ： = o 善l o m 肛。s ( 2 删 盯，) + ，善小i n 旧h 。唧i ) = f oc o s - 2 z i i - i ( h ，k ，1 ) l ：) + ，f os i n - 2 z i h ( h 圳) = f oc o s ( 2 删( h i ) 一i f t 。s i n ( 2 删( h 圳) 5 i _ 蚶 ) i o s 吼似，) 一i 蛳棚l s i n 铣，f ) 9 ( 1 4 ) ( 1 5 ) 第章弓i 。吉 图1 3 ：e n ) 和气厅，f ，r ) 在复半面上的关系 谂灸虚牝i 一 ，j 一 ； 、 r ，一j l l l v7 ；实都净 i v h 弓一， ； 乡磕募邓 。女f 。= l f i “小矿矗，i 拈 j ，= 一i f l 、i n ，i i i “ 由式1 4 和式1 5 可知l j i 。列) = 砾刘) ，可得衍射强度之间关系为： i ( h j c j ) = & h k j ) f ；：u v ) = & 哪) 陆t ) 2 1 ( - ，耵) ( 1 6 ) 即衍射强度在倒易空间内是中心对称的，这就是f r i e d e l 定律。我们也可以从复平面图上发 现这一规律，如图1 3 所示。 当入射的光子的能量足够高的时候，尤其是x 射线的波长接近原子的吸收限时，x 射线 的入射光子会激发电子到激发态，这部分受激电子跃迁回低能态时将释放光子，这部分荧 光的相位比原来的相位有所延迟，这种现象称为反常散射( 或异常散射) ，这时原子散射 因子可用复数表示： f = f o + 厂+ 矿” ( 1 7 ) 式1 7 中，f 和矿”称为反常散射校正的实部和虚部，他们的数值除了与原子序数有关外， 还与入射x 射线的波长有关，当入射的波长接近原子的吸收限时，反常散射效应最显著。厂 可取正值或负值，多数情况下为负值：任何情况下厂”为正值。c 、n 、o 等轻原子的反常散 射效应非常微弱，相比于重原子，其反常散射校正可以忽略。 在忽略反常散射的情况。- f ，根据f r i e d e l 定律，z 。, - 。i 与。h ，和h 石，f ，7 - 具有相同的强度。 那么当存在重原子( 原子序数大于等于1 6 ) 时反常散射不能忽略，对于衍射点h ，考虑反 常散射后，其结构因子& 。刖) 表示为： l n 第章引言 岵 i ) = ，。+ ，+ 矿”) e x p 2 万f ( 虹+ 机+ _ ) 2 善，。x e x p 2 万f ( 虹+ 饥+ 历，) + y 川y , e x p 2 万f ( 红+ 饥+ 匆) ( 1 8 ) + f , x e x p 2 7 r i ( h x , + 铣+ z ，) 2 川+ f ，h 川+ 坼川 如图1 4 所示，对于同一种原子，呓七，) 与f ，h 川j 共线，而川) 发生_ t 9 0 。的相移。 图1 4 ：f ：h 州) 发生了9 0 。的相移 0 五。， 此相移则破坏了衍射强度的f r i e d e l 定律，设品胞中有p 个忽略反常散射的轻原子和m 个 具有反常散射能力的重原子，则： ( 办，k ，) = ( 办，k ，) + k ( 办，k ，i ) ( 矗，k ，) = ( 厅，k ，) + 翳( 办，k ，) 同理可得 ( 万，k - ，7 ) = b ( 万，k - ，f ) + ( 万，云，7 ) 耽( 万，k - ，7 - ) = 巧( f i , 云，厂) + 磁( f i , k - ，7 - ) ( 1 9 a ) ( 1 9 a ) ( 1 1 0 a ) ( 1 1 0 a ) 一般情况下，非中心对称结构的f p ( 厅，k ，) 和( 万，万，7 - ) 并不共线，所以振幅( 办，k ，) 和( 万，i ，7 - ) 并不相等，f r i e d e i 定律也不再成立，如图1 5 所示。 第章0 【二 闭15 ：f ( ，t ，) 和e 。( f i , i ，_ 1 在复平面上的关系 这样，中心对称点h s * j 和h ifr 的衍射强度不再相等，它们被称为b o v o e t 对，平l j m b i j v o e t 对的衍射强度差值可以获得丰h 位的信息还可以测定于性分f 的绝刘构型。 具体来说，要利用反常散射效应来求解相位，需要有足够强的反常散射信号，这就要 求蛋白质中除了c 、h 、n 、o 等原子序数较小的轻原子外还必须包含一个或多个重原子，并 且耍选择合适波长的x 射线同时做x 射线衍射实验时能够同时收集到h ”，和h ifr 的衍射 强度，其衍射强度的差值应远大于实验谋筹。这就对收集衍射强度数据的仪器提出了很高 的要求，利用反常散射来求解丰h 位的方法也正是随着实验仪器的不断进步而变的越来越常 用。p e p i n s k y o k a y a 【2 1 。垌、r a m a c h a n d r a n r a m a n 2 。3 0 、c a t i c h ae l l i s p l 。删等人对此 做r 大量的工作，使得反常散射浊已经取代了同晶置换法成为求解未知蛋白质晶体结构的 主流方法。 利用反常散射法解析蛋白质晶体结构的原理和同晶置换泣很相似，首先要确定反常散 射的重原子位置，通常是利用直接浊或p a t t e r s o n 解析法来求解。不过这两种方法都不能直 接判断出于性重原子的绝剥构型是甭正确，只能古试验判断或利用a b s ”蜘断。 有了正确的重原子位置，我们可以计算j h 坼- ) 和坼，ir ) 来结构因子5 ) 和9 佤f _ ) 的 关系可由图16 来表示， 第章引古 圈16 ：e j 矿f i j n 与晖川存复平面上的三角关系 e a o q q 中，q q 的相位由重原子的位置确定下来( 唯川一f ；f _ l = 2 坼j 一，而 另外两条边o q 和o q 刚只能确定长度，因此对于此三角形有两种可能地形式，如图17 所示。 图17 ：单波长反常散射中的相位双解问题 所以单波长反常散射( s a d 、s i n g l e a n o m a l o u sd i s p e r s i o n ) 和单对同品置换一样，面 l 临“相位职解”的难题要想得到唯一的 i 位解，理论上电需要多波长反常散射( m a d m u l t i p l e a n o m a l o u sd i s p e r s i o n ) 。其原理类似于多对同晶置换 1 3 4 分子置换法( m o l e c u l a rr e p l a c e m e n t ) 我们知道= ；i = ：同的分子结构会导致币同的衍射图样，或者说衍射强度的分布特点。换句 话说。在分子捧列以及分子结构上完全相同或类似的晶体在衍射圈样上也必然出现相同或 第章引言 类似的特征，这种衍射图样上的共同或类似的特征同样会反映在他们的p a t t e r s o n l 向量图上。 因此，假如有两个分子结构上相同或相似，但具有不同晶型的晶体，而其中一个晶体结构 已经测定，那么根据上述原理从原则上可以设法由已知晶体结构来推引出末知晶体结构或 类似分子在不同品胞中的取向和位置，从而得到分子结构的初始模型。解决这一类结构问 题的方法称为分子置换法( m o l e c u l a rr e p l a c e m e n t ，简称m r ) 。 分子置换法首先计算已知的模型分子和待测分子的自身p a t t e r s o n 函数，然后把两者放 到模型品胞中通过旋转操作，确定待测分子的取向。第二步是通过比较模型晶体与待测晶 体分子间的交叉p a t t e r s o n 向量，得到有关平移向量的信息，然后进行平移操作确定待测分 子在晶胞中的正确位置。最后根据部分或全部结构模型提取相位信息。如果待测分子不但 与已知晶体结构在三维结构上类似，而且两者是同晶型，则可应用差值傅里叶( d i f f e r e n c e f o u r i e r ) 合成方式测定晶体结构。 由于需要有已知的同源蛋白结构，分子置换法并不适用于解析很新的蛋白质结构，分 子置换法的主要应用为： ( 1 ) 测定非晶体学对称性。 ( 2 ) 利用已知分子结构测定多晶型蛋白质分子的结构。 ( 3 ) 利用已知分子结构测定同源蛋白质分子的结构。 ( 4 ) 研究酶和抑制剂的复合物中酶和抑制剂之间的相互作用。 下面来介绍分子置换法的具体原理： 假如已知结构的分子m ( 具有一个或一个以上的业基) 与待测晶体的未知结构分子m 有基本相似的三级结构，可以把分子w 作为m ，的模型分子，采用该模型分子按一定的原则构 建建模晶胞。设分子m 中各个原子在模型晶胞中的位置向量为i ：，j = l ，2 ，3 ，n ，为w 分 子中的原子数，未知分子m 中相应原子在待测晶体的晶胞中的位置向量为( ，则： c = r 0 + d ( 1 11 ) 1 4 第一。章引吉 上式中r 是一个旋转矩阵，d 为平移矢量。通过r 矩阵的旋转操作，可以使模型分子m 在晶胞中的取向与m 分子一致，然后通过平移矢量d 把分子m 移到晶胞中的正确位置，从而 得到未知晶体的初步模型。在对取向角和甲移矢量做进一步修正之后，就可以采取加权的 傅里叶合成法和差值傅里叶合成法计算出待测分- 了的电子密度图，然后对电子密度图进行 解释，构建结构模型。 应用分子置换法时，需要具有与未知分子结构相似的已知结构，用以正确求出尺和d 。 现在较为广泛应用的是通过比较模型晶体和未知结构晶体的p a t t e r s o n 函数来求解r 和d 。 ( 1 ) 旋转函数 假如把已知结构的模型分子按任意取向和位置安放在模型晶胞中，见图1 8 ( a ) 。假 定待测晶体的晶胞如图1 9 ( a ) 所示。为了方便起见，假设两种晶体均属p 1 空间群，并分 别计算两个晶体的p a t t e r s o n 函数，图1 8 ( b ) 和图1 9 ( b ) 分别给出了模型晶体和待测晶 体的自身向量图，即分子内部各原子间的向量图。自身向量的取向直接与分子在晶胞中的 取向有关。仔细观察和比较两个晶体的自身向量图就会发现，这两套图中的相应向量峰， 例如( o ，1 ) 与( o ，1 ) 间相差的角度，恰好等于模型分子与待测分子取向相差的角度。 如果将模型分子沿顺时针方向旋转一定角度，它的取向便和待测分子在晶胞中的取向相同， 此时，模型分子和待测分子的向量峰取向也相同。通过以上讨论可以看出，通过模型分子 和待测分子的自身向量图比较，可以求出两个分子取向间的相对角度差，通过某种旋转操 作，可以使模型分子在模型晶胞中的取向与待测分子晶胞中的取向一致。 r o s s m a n n ，m g 和b l o w ，d m 【3 5 】等人根据上述基本原理提出了一种旋转函数r ，来 确定两分子取向间的角度差 r ( 岛，砬，岛) = 工( x 7 ) e ( x ) 出 ( 1 1 2 ) 上式中尸1 ( x ) 和p 2 ( ) 分别代表模型晶体和待测晶体的p a t t e r s o n 函数，u 为积分体积；鼋，幺，岛 1 5 鼐毕引吉 是三摊空间q j 旋转操作的兰个欧扣角，如罔11 0 所示 假如p 1 ( x ) 和p 2 ( ) 分别为套模型分子和待测分子的自身p a 仕e f s o n 向量，则称尺为交叉 旋转甬敬。当小断改变旋转角( b ，睦，b ) 致使两个分子的取向逐步这剿一致时，r 函数应当 脱最人证。这时的欧拉角，就是待测分予相对十已知分子取向的 f f 度差。根据已求得的 如鹰茬【b ，岛，b 1 对己知分子进行旋转操作使它的取向与待测分子的取向完全一致，这时 u 知分子的取向就是待测分子在品胞中的绝对取向。如果r ( x ) 和 ( x ) 均为待测分子的自身 p a t t e r s o n r 皋t 则称r 为自身旋转晒数，当小断改变旋转角( q ，b ，引致使两个待测分子中 的等同部分，例如，业基取向完全一致时，r 函数亦虚当出现极大值，由丰爿应的旋转角就可 以推测出待测分子的非晶体学刘称悱。 幽18 ：模型分子稿濮型分子的自身向量