（果树学专业论文）番木瓜β胡萝卜素生物合成途径部分酶基因的克隆与分析.pdf

福建农林大学硕士学位论文 摘要 摘要 类胡萝b 素是植物中重要的色素之一，具有广泛的生物功能。它是组 成光合系统的重要部分，能够保护光合系统免受强光氧化破坏，同时使植 物的果实、根、叶和花呈现丰富多彩的颜色，提高了植物的观赏价值。天 然类胡萝h 素对人体健康起着重要作用，其中d 一胡萝h 素是强抗氧化剂， 能够增强免疫力降低感染性疾病的发病率和死亡率，有效抑制肿瘤、癌 症的等疾病发生，还能维持正常生殖能力。此外，d 胡萝l 素还是v 。的 重要来源。因此，寻求富含b 一胡萝b 素的天然食品或用科学技术开发富 含b 一胡萝b 素的食品越来越受人们的重视。 番木瓜果实营养丰富，含有多种类胡萝b 素，是一种上等的保健果品， 同时还在工业、食品、医药等方面具有广泛的用途。本试验以红肉番木瓜 “漳红”品种为材料，进行8 一胡萝b 素合成途径相关基因的克隆研究，以期 为研究番木瓜和其它果树b 胡萝b 素生物合成途径打下基础。主要试验结 果如下： ( 1 ) 建立了较为完善的番木瓜样品总r n a 提取和纯化方法。通过比 较t r i z o l 、改良t r i z o l 、c t a b 、异硫氰酸胍四种r n a 提取方法，总结出 适应番木瓜样品r n a 提取的方法改良t r i z o l 法。并通过此方法获得了 较为纯净的、完整的总r n a ，可以直接用于后续的r t - p c r 和r a c e 反应。 ( 2 ) 采用p c r 扩增获得6 胡萝b 素合成途径系列酶基因的保守序 列。以番木瓜果皮总r n a 逆转录的e d n a 为模板，用扩增同源序列的简 并引物，p c r 扩增出p s y 、p d s 、z d s3 个系列酶基因的保守序列长度 分别为4 2 2b p 、5 9 9b p 、7 9 7 b p 。 ( 3 ) 采用e d n a 末端快速扩增( r a c e ) 技术获得了p s y c d n a 序 列。p s ye d n a 全长1 7 4 4b p ，包含一个1 3 2 0b p 的开放阅读框编码4 3 8 个氨基酸残基。其推导的氨基酸序列与拟南芥、葡萄柚、番茄、力i 寿菊等 植物的氨基酸序列同源性分别达8 5 、7 6 、7 3 、7 9 。 ( 4 ) 采用r a c e 技术获得z d s3 序列。将该3 序列与先前获得的保 福建农林大学硕士学位论文 摘璺 守区序列拼接，得到长约1 6 8 0b pz d s 片段，编码4 7 0 个氨基酸残基。该 片段推导的氨基酸序列与温州蜜柑、胡萝b 、番茄、苹果、拟南芥等植物 完整的氨基酸序列的同源性分别为9 0 、8 7 、8 7 、8 7 、8 7 。 关键词：番木瓜；1 3 - 胡萝b 素：基因克隆；八氢番茄红素合成酶、八 氢番茄红素脱氢酶、一胡萝b 素合成酶 福建农林大学顾十学位论文 i d 录 2 4 番木瓜z d s 基因片段的获得与分析 3 9 3 本章小结 4 3 第四章讨论 4 4 1 番木瓜样品的采集 4 4 2 番木瓜样品总r n a 提取与纯化 4 4 3r t - p c r 与r a c e 技术的应用 4 6 参考文献 4 8 附录 5 4 致谢 5 8 附表与附图清单： 图1 1 高等植物中b 胡萝b 素生物合成途径简图 4 图2 1 不同方法提取番木瓜果皮和果肉总r n a 电泳检测 2 2 图2 2 番木瓜p s y 保守序列电泳、核酸与推导氨基酸序列同源性检索图 2 4 图2 3 番木瓜p s y 保守序列及其编码的氨基酸序列 2 4 图2 - 4 番木瓜p d s 保守序列电泳、核酸与推导氨基酸序列同源性检索图 2 5 图2 5 番木瓜p d s 保守序列及其编码的氮基酸序列 2 6 图2 - 6 番木瓜z d s 保守序列电泳、核酸与推导氨基酸序列同源性检索图 2 6 图2 7 番木瓜z d s 保守序列及其编码的氨基酸序列 2 7 图3 1 番木瓜p s y 3 端序列电泳、核酸和推导氨基酸序列同源性检索图 3 2 图3 2 番木瓜p s y 5 端序列电泳、核酸和推导氨基酸序列同源性检索图 3 3 图3 3 番木瓜p s y 全长e d n a 及其推测氨基酸序列同源性检索图3 3 图3 - 4 番木瓜p s y e d n a 全长及其推导的氨基酸序列3 5 图3 - 5 番木瓜髂r 氨基酸与部分植物p s y 氨基酸的系统进化树 3 6 图3 6 番木瓜朋r 基因蛋白二级结构预测 3 7 图3 7 番木瓜p s y 的c d d 搜索结果 3 9 图3 8 番木瓜z d s 3 端序列电泳、核酸与推导氨基酸同源性检索图 4 0 图3 - 9 番木瓜z d s 所得片段及其推导氨基酸序列 4 1 图3 1 0 番木瓜z d s 片段核酸与推导的氨基酸同源性检索图4 2 图3 1 1 番木瓜z d s 的c d d 搜索结果4 2 表2 1 常用p c r 体系1 9 表2 2 四种方法提取的r n a 的o d 值与得率比较 2 3 表3 - 1 番木瓜p s y 基因推导的氨基酸序列与数据库中已报道的序列相似性比较 的部分结果3 5 表3 - 2 番木瓜p s y 基因编码的氨基酸组成3 7 表3 - 3 番木瓜朋y 蛋白的氨基酸序列功能结构域分析3 8 - i i 福建农林大学硕1 ：学位论文 暗语表 英文缩写 d m a p p g g p p g p p i p p f p p p s y p d s z d s l y c b p s y p d s z d s y c 口 b p c t a b d e p c e b e d t a g t c s l s a m p i p t g x 噜a l o r f p c r r a c e s d s b c h i r i s 缩略语表 英文全称 d i m e t h y l a l l y ld i p h o s p h a t e g e r a n y l g e r a n y lp y r o p h o s p h a t e g e r a n y lp y r o p h o s p h a t e i s o p e n t e n y ld i p h o s p h a t e f a m e s y lp h r o p h o s p h a t e p h y t o e n es y n t h a s e p h y t o e n ed e s a t u r a s e t - c a r o t e n ed e s a m r a s e l y c o p e n e - p c y c l a s e p h y t o e n es y n t h a s e p h y t o e n ed e s a t u r a s e - c a r o t e n ed e s a t u r a s e l y c o p e n e b - c y c l a s e b a s ep a i r c e t y lt r i m e t h yl a m m o n i u mb r o m i d e d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r e e c e t i ca c i d g u a n i d i n ei s o t h i o c y a n a t e n - l a u r o y ls a r c o s i n es o d i u m a m p i c i l i n i s o p m p y l 一1 - t h i o b - d g a l a c t o s i d e 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o 3 - i n d o l y l - b - d g a l a c t o s i d e o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n a e n d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 3 - c a r o t e n eh y d r o x y l a s e ir i sh y d r o c h l o r i d e 中文名称 二甲基丙烯基一二磷酸 栊牛儿基糍牛儿焦磷酸 栊牛儿焦磷酸 异戊烯焦磷酸 法尼基二磷酸 八氢番茄红素合成酶 八氢番茄红素脱氢酶 ( 胡萝h 素脱氢酶 番茄红素b 一环化酶 八氢番茄红素合成酶基因 八氢番茄红素脱氢酶基因 ( - 胡萝h 紊脱氢酶罐隧i 番茄红素b 一环化酶接凶 碱基对 十六烷基三甲摹溴化胺 焦碳酸二乙脂 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 异硫氰酸胍 十二烷基肌氨酸钠 氨苄青霉素 异丙基6 。d 一半乳糖苷 5 溴4 一氯3 吲哚一d 半乳糖苷 开放阅读框 聚合酶链式反应 c d n a 末端快速扩增 十二脘基磺酸钠 b 胡萝h 索羟化酶 三羟甲基氨基甲烷 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 羼奴叼 论文使用授权的说明 扫期：p p 二。# 。t 口 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：雳敏，电婶 指导教师亲笔签名；f 事德辫ld ”j 日期：弘一z ，占1 1 9 日期：ap 口z 多。，p 祸建农林大学硕士学位论文 第一章前舀 第一章前言 类胡萝 素主要是c 4 0 类萜化合物，是普遍存在于植物和微生物中的 脂溶性色素。通常将类胡萝h 素分为胡萝h 素和它们的氧化衍生物两大 类，也有具体分为四个亚族：胡萝h 素如a 一胡萝i 素、p 胡萝f 素、y 胡 萝f 素、番茄红素；胡萝h 素醇如叶黄素、玉米黄质、虾青素：胡萝h 素 醇的酯类如8 阿朴_ 8 胡萝h 酸酯；胡萝h 酸如藏红素、胭脂树橙( 张晓 斌2 0 0 3 ) 。 自1 9 1 0 年在胡萝h 中发现了b 胡萝h 素，1 9 3 7 年秋天落叶中的色素 又被鉴定为叶黄素( b a r t l e y ，s c o l n i k ，1 9 9 5 ) 以来，在自然界中己发现6 0 0 多种类胡萝h 素，除八氢番茄红素、六氢番茄红素等几种类胡萝h 素无色 外，绝大多数类胡萝h 素呈黄色、橙色或红色( g o o d w i n b r i t t o n ，1 9 8 8 ) 。 1p 胡萝i 、素的一般性质 p 一胡萝h 素是类胡萝f 素的重要一员，其分子式为c 4 0 h ，。，分子量为 5 3 6 8 8 ，深红紫或暗红色有光泽的斜6 面体或板状微结晶的晶体或结晶性 粉末，有轻微异味，遇氧、热及光不稳定，在弱碱条件下较稳定，不溶于 水、丙二醇、甘油、酸和碱，溶于二硫化碳、氯仿、己烷及植物油，几乎 不溶于甲醇和乙醇( 李全顺，2 0 0 2 ；高建峰，2 0 0 1 ) 。 2b 胡萝i 、素的功能 2 1p 一胡萝i - t 的抗氧化作用与疾病的预防 p 一胡萝1 - 素是强抗氧化剂，它可直接抑制单线态氧，阻止自由基的链 锁反应，从而能清除体内自由基，增强细胞间交流，保护机体免受自由基 和脂质过氧化的损伤( 范晓岚，2 0 0 3 ；s i e s ，1 9 9 5 ；b u r t u n ，1 9 8 9 ) 。国内外大多 流行病学研究和体外试验均表明，p 胡萝卜素可抑制某些肿瘤细胞的发生 和发展；通过避免l d l ( 低密度脂蛋白) 受氧化，从而在一定程度上预防 或降低动脉粥样硬化、心盘管疾病发生( k o h l m e i e r ，1 9 9 5 ；b u b 2 0 0 0 ；r o m a n 福建农林大学硕士学位论文 第。章前晶 c h i k ，1 9 9 7 ；潘天红等，2 0 0 0 ) 。近年来的研究还表明，p - 胡萝b 素可减少紫外 光对皮肤的损伤，通过口服口胡萝h 素的增补物可防止光敏性红斑的形 成，并可降低皮肤对紫外光的敏感性，对白斑症、白化症也有一定的预防 作用( s t a h l ，e ta l ，2 0 0 0 ) 。另外，b 胡萝h 素还具有拮抗镍所致的细胞毒性 作用( 张敬等，2 0 0 2 ) ，还能预防由吸烟引起的肺组织损伤及老年白内障的 发生等( 范晓岚等，2 0 0 3 ) 。因此，b 一胡萝h 素作为抗氧剂在体内发挥着重 要作用。 2 2 肛一胡萝卜素的营养作用 在自然界6 0 0 多种类胡萝h 素中大约有5 0 种具有v a 原活性，其中b 一胡萝卜素是最具活性的v 一前体。在人和动物的肠粘膜及肝脏中，b 一胡 萝h 素可根据需要转化为v 。转化的生物过程主要是通过中心裂解途径。 该途径是利用细胞质b 胡萝h 素15 ，1 5 双加氧酶，使一份子的d 胡萝h 素 从中间断裂为两分子视黄醛，再被氧化为视黄酸或者还原为视黄醇，视黄 醇即v a ( 汪之顼等，2 0 0 3 ) 。而其它含d 环的胡萝p 素如a 一胡萝p 素和 6 一隐黄质裂解只能产生一份子的v a 。 v a 缺乏容易引起视力下降，皮肤表面发干，抵抗力下降。如果人体直 接摄入大量的v “，容易引起骨瘤、皮肤粘膜改变、颅内压升高等急性或慢 性中毒( 周建烈，2 0 0 0 ) 。而通过摄取d - 胡萝h 素则是补充v a 较为安全的方 法，这主要是因为b 胡萝卜素本身无毒性，人体内又可根据需要束适当调 节p 胡萝h 素转换为v a 的速率。当摄取较多的类胡萝h 素时，身体将它 转换为v a 的速度将大幅下降。所以可以通过补充b 胡萝卜素来治疗各种 v a 缺乏所引起的如夜盲症、于眼病、上皮细胞角化过度等疾病( 高建 峰。2 0 0 1 ) 。 目前尚未发现摄入大量的b 一胡萝h 素会引起类似v 。过量所致的中毒 现象，据资料所述摄取过量会引起胡萝h 素血症，但只要停止食用即可消 除此症状( 李高阳，2 0 0 4 ) 。另外，人类所需v a 是通过食物中摄取，主要是 动物性食物和植物性化合物。特别是亚洲地区人群从植物性食物中获取的 v a 约占8 5 ( 迈博网，2 0 0 6 ) 。因此，富含1 3 胡萝h 素的天然食品及以b 福建农林大学硕，l 学位论文 第一市前高 胡萝b 素为主要成分的营养保健品也越来越受到人们的重视。 2 31 3 - 胡萝i - 5 的其它功能 2 3 1 作为食品添加剂 b 胡萝b 素作为食品添加剂和营养增补剂己被联合国粮农组织和世界 卫生组织食品添加剂联合专家委员会推荐，被认定为a 类优秀营养色素， 并在世晃5 2 个国家和地区获准应用。主要批准用b 一胡萝b 素作为黄色色 素加入食品中，大量用于带色人造黄油、饮料、烘焙食品等方面。在制药 上，类胡萝h 素也可用于糖农药片的染色( 李和生，2 0 0 0 ；朱秀灵，2 0 0 4 ) 。 2 3 2 饲料添加剂 据国外一些资料报道，b 胡萝b 素是奶牛维持正常生理功能及繁殖性 能不可缺少的营养素( 李恭贺，2 0 0 3 ) 。另外，在家禽饲料中添加类胡萝h 素可确保家禽健康生长与繁殖，还可使家禽达到最佳及一致的蛋黄着色 ( b l a b e h 2 0 0 1 ) 。 d 一胡萝b 素用途广泛，不仅可以治疗v a 缺乏症，防老、防癌及舫治 心血管等疾病，还可作为食品和化妆品的天然色素及饲料添加剂。由于其 在人体及动物等多方面的广泛用途，市场前景十分看好。目前全球b 胡萝 b 素的年需求量约1 2 0 0 1 5 0 0 吨，国际和国内市场对天然1 3 一胡萝b 素的 年需求额分别约达9 5 和1 6 亿人民币，市场潜力巨大( h t t p ) 。 3 p 一胡萝b 素的生物合成研究 3 1b 一胡萝l - 5 的生物合成途径 高等植物类胡萝b 素大多分布在叶绿体的光合膜上，以及成熟果实和 花瓣有色体的膜、油体或间质内的其它结构上。类胡萝b 素在叶绿体的光 合作用中起着至关重要的作用。它们担当叶绿体光合天线的辅助色素，帮 助叶绿素接收光能，并保护叶绿素免受破坏。 植物类异戊二烯类物质的合成是一个十分庞大的次生物质代谢途径， 福建农林大学硕士学位论文笫一帝前言 主要通过两条途径来完成：一是定位于细胞质中的二羟甲基戊酸合成途径 ( 简称m v a 途径) ，该途径主要合成固醇、倍半萜、泛醌和多萜等。二是 甲基苏糖醇磷酸酯途径即m e p 途径或称r o h m e r 途径，存在于质体中， 此途径主要合成单萜，特定的倍半萜、二萜、类胡萝h 素、叶绿素和质体 醌，还合成赤霉素( g a ) ，脱落酸( a b a ) 和细胞分裂素等重要的植物激素( 邢 书凡) 。这两条途径的共同特点就是都以5 个碳的异戊二烯焦磷酸( i p p ) 为合成前体。 异戊r 磷酸p 9 割撼辨儿篱( p s y 嚣) = 孤 j r 八躺瓶糟脯 以l 0 八芎叠慧笋素脱氢酶 4 - 胡萝h 索脱氢酶 审( z d s 、 1 l 哩嚣脱氢酶 番茄红素肛环化目香茄红索环化酶 ( l y c b ( l y c - e ) ， d 胡萝h 素 玉甚质 0 叶黄质 山 图1 - 1 高等植物中争胡萝h 素生物合成途径简图 f i g 1 ，1p - e a r o t e n eb i o s y n t h e s i sp a t h w a yi nh i g h e l p l a n t s 4 - 福建农林丈学硕士学位论文 筘一章前_ 南 高等植物中的类胡萝h 素合成始终发生在质体中( 其合成途径见简图 1 ，1 ) 。i p p 首先在i p p 异构酶( i p l ) 作用下，异构化生成二甲基丙烯基二磷酸 f d m p ) 。然后d m a p p 在g g p s 催化下，先后再与3 个i p p 分子缩合而依 次生成g p p 、f p p 及含有2 0 个碳的g g p p 即栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸 ( k u n t z , e ，口，1 9 9 2 ；z h u e la l 。2 0 0 2 ) 。g g p p 是类胡萝h 素生物合成的直接 前体物质，2 分子g g p p 在p s y 的作用下形成了第一个无色的类胡萝b 素 一一八氢番茄红素。接着八氢番茄红素在各种酶作用下经过一系列的脱氢 反应，产生了具有发色团功能的共轭双键，从而逐步生成各色的类胡萝h 素( 徐昌杰，2 0 0 0 ) 。 从八氢番茄红素到合成途经中第一类具环的类胡萝h 索分子一一和 b 一胡萝b 素，这些分子中均不含氧原子，我们将其统称为胡萝b 素。大多 数植物器官中的旺和b 一胡萝h 素将被继续引入羟基、酮基、甲氧基及酯键， 转化为结构更为复杂的含氧衍生物，这些含氧的类胡萝h 素统称为叶黄素 ( x a n t h o p h y l l s ) 。其中绝大多数叶黄素如6 - 隐黄质、玉米黄质、新黄质、 虾青素、辣椒红素等都是由b 胡萝h 索转化而来，由a 胡萝h 素转化而来 的主要有叶黄质( 1 u t e i n ) ( 朱长甫，2 0 0 4 ) 。 3 2p 胡萝l 、紊生物合成酶及相关基因的研究 类胡萝b 素合成酶类是由细胞核基因编码的，编码翻译成蛋白质后转 运至于质体中，从而参与类胡萝b 素的生物合成( c u n n i n g h a m ， g a n t t ，1 9 9 8 ) 。由于1 3 胡萝b 素的合成处于整个类胡萝h 素代谢途径的上 游，因此，研究参与b 胡萝b 素合成过程的酶及其编码的基因对整个合成 途径有着举足轻重的作用。 3 2 1 异戊烯焦磷酸同分异构酶( i p i ) b l a n c 等1 9 9 5 年就从仙女扇( c l a r k i ab r e w e r i ) 中克隆到编码该酶的 e d n a ，随后在拟南芥( z h u ，e ta l ，1 9 9 7 ) 、玉米( a f 3 3 0 0 3 4 ) 等植物中也克 隆到该基因。在拟南芥基因组中还发现有两个p i 基因，m i c h a e lc ( 1 9 9 8 ) 将它们分别命名为i p p l 和i p p 2 。i p p l 所编码的肽链由2 3 3 个氨基酸基团 福建农林大学硕士学位论文 第一章前吉 组成，伊| p 2 编码的肽链有2 8 4 个氨基酸。通过软件分析发现：胪j p ，和1 p p 2 具有相似的结构，但i p p 2 在n 端比i p p t 多出5 0 氨基酸的疏水结构域， 且伊p 2 的前5 0 个氨基酸具有叶绿体导肽的作用( 邢书儿) 。 目前，对i p p 异构酶在类胡萝h 素合成过程中发挥的作用仍有争议， 推测该酶也可能是合成途径中的限制因素( k a j i w a r a ，19 9 7 ；s u n ，1 9 9 8 ) 。 3 2 2 糖牛儿基犍牛儿基焦磷酸合成酶( g g p s ) g g p s 催化i p p 与d m p 合成g g p p 。d o g b o 等1 9 8 7 年从辣椒中纯化 出该酶，19 9 2 年k u n t z 从辣椒中分离到该酶的c d n a 。在随后的研究中发 现，g g p s 基因由多基因家族编码，在拟南芥的不同组织中，已发现至少 5 个该家族的成员，并且不同成员可能负责不同支流的类异戊二烯产物合 成( o k a d ak ，e ta l ，2 0 0 0 ) 。通过大肠杆菌功能互补试验，其中两个c d n a ( g g p s t 和g g p s 5 ) 的产物已证明具有g g p s 活性( c u n n i n g h a m 1 9 9 8 ) 。 一般认为，g g p s 是i p p 向g g p p 转化的限速酶，其活性高低不仅影 响类胡萝h 素的合成，也影响类异戊二烯途径中其它产物的合成( b a r t l e y ， s c o l n i k ，1 9 9 4 ) 。目前还从白羽扇豆( u 1 5 7 7 8 ) 、长春花( x 9 2 8 9 3 ) 和白芥 ( x 9 8 7 9 5 ) 中分离到该基因，它们的c d n a 长度在1 1 1 4 k b 之间，编 码3 1 6 3 6 6 个氨基酸。 3 2 2 八氢番茄红素合成酶( p s y ) 1 9 8 7 年r a y 等获得一个功能未知的番茄果实成熟期间专一表达的 c d n a 克隆p t o m 5 ，其编码的氨基酸序列与细菌中的八氢番茄红素合成酶 基因( c r t b ) 的氨基酸序列同源性很高。后来经过b i r d ( 1 9 9 1 ) 和b r a m l e y ( 1 9 9 2 ) 等研究才证实p t o m 5 就是番茄中的p s y l 基因。目前己分离出 p s y 基因的植物有甘薯( 陈选阳，2 0 0 5 ) 、温州蜜柑( a f 2 2 0 2 18 ) 、葡萄柚 ( a f l 5 2 8 9 2 ) 、枸杞( a y 9 2 0 9 18 ) 、黄水仙( x 7 8 8 1 4 ) 、甜瓜( z 3 7 5 4 3 ) 、 辣椒( x 6 8 0 1 7 ) 、黄花龙胆草( a b 0 1 1 0 1 1 ) 、拟南芥( l 2 5 8 1 2 ) 等。这些p s y c d n a 长1 3 1 6k b ，编码4 0 9 4 2 3 个氨基酸，基因全长3 2 - - 6 0k b ，有 5 7 个内含子。 福建农林大学硕士学位论文 箱一章前吉 在玉米( p a l a i s a ，e ta l ，2 0 0 3 ) 和番茄( b a r t l e y ，e ta l ，l9 9 2 ；19 9 3 ；f r a s e r ，e t 口，1 9 9 9 ) 等植物中还发现另一个尸s ”基因，特别是在龙胆草中已克隆出 四个p s y 基因( p s y i 、p s y 2 、p s ，p s y 4 ) ，其基因登陆号分别为a b 0 1 1 0 1 l 、 a b 0 1 10 1 2 、a b 0 1 1 0 13 、a b 0 1 1 0 1 4 。番茄中p s y i 和p s y 2 两个基因编码 的氨基酸序列具有9 5 的同源性，番茄尸s 基因长3 6k b ，有5 个内含 子和6 个外显子，控制番茄果实成熟过程中的八氢番茄红素合成酶。番茄 尸s 瑚基因控制绿色组织( 包括成熟后仍表现为绿色的番茄果实) 中的八氢 番茄红素合成酶，该基因主要在叶片中起作用( f r a s e r ，e la l ，1 9 9 9 ) 。 由于p s y 是许多植物类胡萝h 素生物合成途径中关键的调节酶 ( s h e w m a k e r ，e ta l ，1 9 9 9 ) ，所以由g g p p 生成八氢番茄红素这一步骤已成 为类胡萝h 索代谢途径的“瓶颈”，而其编码的基因也成为应用基因工程技 术改善植物类胡萝h 素含量的首选目的基因( 朱长甫，2 0 0 4 ) 。 3 2 3 八氢番茄红素脱氨酶( p d s ) p d s 催化八氢番茄红素连续两次脱氢生成( 一胡萝h 素。c h a m o v i t z 等 于1 9 9 1 年从抗达草灭的组囊藻突变体中分离到发生点突变的p d s 基因， 随后以正常p d s 基因为探针分离到大豆( b a r t l e y ，e ta l ，1 9 9 1 ) 和番茄 ( p e c k e r ，e ta l ，1 9 9 2 ) 的p d s 基因。如今从杏( a y 8 2 2 0 6 5 ) 、温州蜜柑( a b 0 4 6 9 9 2 ) 、万寿菊( a f 2 5 1 0 1 4 ) 、辣椒( x 6 8 0 l7 ) 、黄花龙胆草( a b 0 2 8 6 6 6 ) 、 甘薯( 陈选阳，2 0 0 5 ；王飞，2 0 0 5 ) 等植物中都已分离到该基因，这些基因的 c d n a 长1 9 2 _ 3k b ，编码5 6 6 5 8 2 个氨基酸。其中番茄p d s 基因转录 区包括1 5 个外显子和1 4 个内含子，长7 7k b ( b a r t l e y ，s c o l n i k 1 9 9 4 ) ，以 单拷贝形式存在( c o r o n a ，e ta l ，1 9 9 6 ) 。 在高等植物的光合组织中，通过抑制八氢番茄红素的去饱和反应( 即 抑制p d s 或z d s 活性) 可导致组织失去颜色，最终导致植物体死亡。达 草灭( n o r f l u r a z o n ) 就是通过抑制p d s 活性从而抑制有色类胡萝h 素合成 而导致植株白化死亡的一种除草剂。 3 2 4 胡萝h 素脱氢酶( z d s ) 福建农林大学硕士学位论文第一市前高 ( 胡萝h 素在z d s 催化下，脱氢生成整个类胡萝h 素合成途径中第一 个有色( 淡黄色) 分子一一链孢红素。z d s 基因现已从苹果( a f 4 2 9 9 8 3 ) 、 温州蜜柑( d q 3 0 9 8 6 9 ) 、葡萄柚( a f 3 7 2 6 17 ) 、番茄( a f l 9 5 5 0 7 ) 、辣椒 ( x 8 9 8 9 7 ) 、黄水仙( a j 2 2 4 6 8 3 ) 、甘薯( 陈选阳，2 0 0 5 ) 、龙胆草( 季静等，2 0 0 4 ) 等植物中分离出来，其c d n a 长1 8 2 1k b ，编码5 5 8 5 7 4 个氨基酸。 人们曾认为植物体内八氢番茄红素合成番茄红素只由p d s 和z d s 催 化完成，直到2 0 0 2 年，i s a a c s o n 和p a r k 分别从番茄和拟南芥中分离和鉴 定了类胡萝h 素异构酶( c r t i s o ) 基因，才确认该反应是由p d s 、z d s 和 c r t i s o3 个酶共同作用的结果。而在细菌中只需八氢番茄红素脱氢酶( c r t i ) 即可催化八氢番茄红素生成番茄红素( m i s a w a ，e ta l ，1 9 9 0 ) ，并且c r t l 基 因编码的氨基酸序列与高等植物p d s 基因编码的氨基酸序列仅有约3 0 的同源性，所以在植物基因工程中，可以用一个细菌c r t i 基因替代植物中 的p d s ，z d s 和c r t i s o 这三个基因，减少在转基因植物中经常出现的共 抑制现象( 朱长甫，2 0 0 4 ) 。 3 2 5 番茄红素合成酶( l y c ) 番茄红素环化是植物体内类胡萝h 素生物合成途径的一个重要分支 点。植物体中存在番茄红素和b 两种环化酶，这两种环的差异仅是环己 烷环双键的位置不同( c u n n i n g h a m ，e ta l ，2 0 0 i ) 。所以番茄红素的环化反应 通常有两条途径，一条环化途径是：l y c b 催化番茄红素生成两个术端对 称的p 环，即p 胡萝h 素。另一条途径是：番茄红素先后在l y c e 和l y c b 作用下生成具有一个环和一个8 环的胡萝h 素。a 一胡萝h 素经过进一 步的转化，便形成植物体中大量存在的叶黄素。此外，在莴苣中还存在一 种功能特殊的番茄红素，环化酶，它催化番茄红素两端均形成环，即生 成一胡萝n 素( c u n n i n g h a m ，g a n t t ，2 0 0 1 ) 。在自然界中仅在莴苣等极少数 几种植物中含有两个环的胡萝h 索和莴苣黄素。 目前，己从微生物和植物中分离出15 0 多个类胡萝h 素合成酶基因， 它们分别编码2 0 多种类胡萝h 素合成酶( h i r s c h e r g ，e la l ，1 9 9 7 ) 。在已克隆 出的基因中编码p 一胡萝h 素生物合成的酶基因占总体的一半以上，这为后 福建农林大学硕士学位论文 第一章前南 续基因工程奠定了基础。 3 3 植物类胡萝i 、素生物合成相关基因在生物工程中的应用 近几十年来，人们对类胡萝h 素种类和产量的需求逐步增大，虽然有 少数几种如b 胡萝b 素、虾青素、角黄素等能通过化学合成进入商业生产， 但有试验证明化学合成的o 胡萝h 素对人体防病抗癌没有效果 ( r o c k ，1 9 9 7 ) ，还有可能有副作用( 韩雅珊，1 9 9 9 ；郑金贵，2 0 0 0 ) 。因此，天 然类胡萝h 素受到极大的重视，而通过基因工程提高植物某些胡萝h 素岔 量也成为研究热点。目前类胡萝h 素合成的基因工程在番茄、水稻、烟草、 油菜等植物上取得了重大突破。 由于番茄果实中含有丰富的番茄红素和6 胡萝h 素，在成熟阶段色泽 变化明显，且含有大量不同颜色的突变体，因而成为研究园艺植物类胡萝 h 素发育的模式植物( 刘仲齐，2 0 0 5 ；陶俊，2 0 0 3 ) 。起初f r a y 等( 1 9 9 5 ) 将 番茄的用y 基因正义导入番茄，导致转化植株表现出矮化、类胡萝1 - 素异 常合成等多种不良效应。之后f r a s e r 等( 2 0 0 2 ) 用人工构建的启动子和番 茄结合，将噬夏孢欧文氏菌的八氢番茄红素合成酶( c r t b ) 基因在番茄果实 特异性启动子驱动下导入番茄，转基因番茄植株中的类胡萝h 素含量较野 生型番茄增加了2 4 倍，其中番茄红素、b 胡萝1 - 素和叶黄素含量分别提 高了1 8 、2 2 、1 6 倍。玉米黄素是人视网膜黄斑中的主要色素，具有清除 单线态氧和防止老年性弱视等功能，但在食物中含量却很低。d h a r m a p u r i 等( 2 0 0 2 ) 为提高番茄果实中的玉米黄质含量，将番茄果实特异性启动子驱 动下的番茄l y c b 和辣椒b c h 基因( 3 - 胡萝 索羟化酶基因) 导入番茄， 使转基因番茄果实中玉米黄质和p - 隐黄质含量增加1 0 0 多倍，d 一胡萝h 素 含量和总类胡萝b 素含量均增加近1 0 倍，番茄红素含量则减少一半。 水稻种子胚乳可合成g g p p ，但不能合成类胡萝h 素，因此常规育种 技术不可能育成在水稻种子胚乳中具有类胡萝b 素的水稻品种。经过科学 家的不懈努力，分别将黄水仙的p s y 、l y c b 基因连接到胚乳特异表达的 谷蛋白启动子上，将细菌的c r t l 连接到花椰菜斑点病毒3 5 s 启动子上，然 后一起构建表达载体转入一个日本水稻品种中，结果获得了胚乳呈黄色的 福建农林大学硕士学位论文 鹕一章前击 “金大米”。1 9 9 9 年4 月，这种新型的转基因水稻开始结实，转基因水稻 胚乳中b 胡萝b 素含量最高达1 6 9 9 gd w ( 种子干重) ，而且还意外发现含 有大量玉米黄质和叶黄质( y ex ，e ta l ，2 0 0 0 ) 。 将欧氏杆菌c r t b 与油菜种子特异启动子构建种子特异表达载体转入 油菜，结果使转基因油菜种子中类胡萝b 素含量比野生型增加了5 0 倍， 主要类胡萝b 素为伍胡萝b 素和b 胡萝b 素( s h e w m a k e r ，e ta 1 1 9 9 9 ) 。如 今这种“金色油菜”已被孟山多公司和印度t a n a 能源研究所合作丌发( 陶 俊，2 0 0 2 ) 。 m i s a w a 等( 1 9 9 3 ) 将细菌八氢番茄红素基因正义导入烟草，p - 胡萝b 素 合成增强，同时对除草剂的抗性增强。k u m a g a i 等( 1 9 9 5 ) 将辣椒红辣椒 玉红素合成酶基因正义导入野生烟草，植株呈橙色，叶片中积累辣椒红素， 含量占类胡萝 素总量的3 6 。 人们对植物、微生物类胡萝b 素生物合成途径及类胡萝h 素在各器官 中的代谢和调控进行了大量的研究，取得了许多重要进展的同时，还存在 不少问题。比如目前对植物体内类胡萝b 素生物合成的调控机制及其合成 基因的表达调控机制了解有限，利用基因工程来调控其生物合成带有一定 的盲目性。而且通过基因工程改变类胡萝b 素的合成途径有可能会干扰其 它萜类化合物如植物激素等的合成，引起代谢紊乱，从而影响植株的正常 生长。今后的研究中，除了要先弄清植物体内类胡萝b 素积累的特点、代 谢的生理机制、基因的分子调控机制以及外部环境对其合成影响外，还要 进一步研究认清导入的外源基因对植物体内类胡萝b 素合成基因表达及 其它萜类化合物的影响，为进一步开展类胡萝b 素基因工程提供坚实的理 论基础。 4 本研究意义、内容和技术路线 4 1 本研究的意义、内容 番木瓜( c a r i c ap a p a y a ) 原产热带美洲及非洲，我国两广、云南、 福建、台湾等地均有栽培。 番木瓜果实营养丰富，药食兼用，且有广泛 福建农林大学硕士学位论文销一章前言 的化工用途，经济价值极高( 夏杏洲，2 0 0 2 ；支0 昌芬，1 9 9 9 ) 。同时番木瓜栽 培容易，从播种到采收只需一年时间，产量高( 邓春梅等，1 9 9 6 ) ，故合理 开发及综合利用番木瓜资源具有很大的经济意义和广阔的发展前景。 类胡萝h 素既是决定水果、蔬菜内在营养品质的重要指标，也是影响 果实外观和花卉观赏价值的重要因素，因此了解植物类胡萝t - 索积累特点 和代谢机制，对于进一步改善园艺植物的食用和观赏品质具有重要意义。 番木瓜果实中含有丰富的类胡萝h 素，主要有b 一胡萝1 - 素、隐黄质( c r y p t o x a n t h i n ) 、番茄红素、隐性黄素环氧物( c y p t o x a n t h i nm o n o e p o x i d e ) 、一胡萝 h 素等( h o l d e n ，e la l , 1 9 9 9 ；c h a n d r i k a ，e ta l ，2 0 0 3 ) 。其中成熟的黄肉番木瓜 果实中d - 胡萝h 素和p 一隐黄质占总类胡萝h 素的一半，有充足的v 。来源 ( p h i l i p ，1 9 8 8 ) 。红肉果实中则含有大量的番茄红素，占总类胡萝卜囊的 6 3 5 ( y a m a m o t o ，1 9 6 4 ) ，番茄红素虽不具有v a 源活性，却也是非常有 效的单线态氧清除剂，能很好的预防心脏病和癌症的发生。由此可以看出 番木瓜是天然类胡萝h 素的重要植物资源。 目前国内外番木瓜的研究主要集中在三个方面：一是利用生物技术进 行抗病番木瓜的育种( 尤其是抗环斑病) ；二是针对番木瓜性别的多态性 而进行番木瓜性别决定机制和分子标记的研究；三是如何延长番木瓜贮藏 期的研究。近些年来，本实验室亦以番木瓜为材料，在胚胎发育、染色体 核型及性别决定、组织培养、生理生化等方面进行一系列的研究，基本弄 清了番木瓜坯胎和胚囊发育过程。并通过染色体微分离和微克隆技术建立 了番木瓜单染色体d n a 文库，组织培养也日趋成熟。鉴于目前对改善番 木瓜果实品质方面的研究还主要集中在抗软化方面，对番木瓜类胡萝h 素 的研究还处于初级阶段。因此，本试验以红肉番木瓜“漳红”品种为试验材 料，克隆p 胡萝h 紊合成途径中的p s y p d s 、z d s 三个基因。以期为番 木瓜和其它园艺产品p - 胡萝卜素合成途径研究以及利用基因工程提高b 胡萝h 素含量，改善果实品质打下基础。 福建农林大学硕士学位论文笫一帝前爿 4 2 本研究的技术路线 t r i z o l 试剂盒改良t r i z o l 法c t a b 法异硫氰酸胍法 上 不同成熟时期番木瓜样品总r n a 的提取 上 j r 眦扩增 i 获得基因保守序列 ，从影m 旺i 队旺 r p s y c d n 乏a 列获得z 上d s 片段全长序列 获得片段 福建农林人学硕士学位论文第二章番木瓜且一胡萝h 索台成途径中部分酶基保守序列的兜降。分析 第二章番木瓜b 一胡萝i 、素合成途径中部分酶基因 保守序列的克隆与分析 番木瓜果肉中多糖含量较高，严重干扰r n a 的提取质量以及后续逆 转录反应和p c r 扩增，因此，能否有效的去除多糖等次生物质是总r n a 提取的关键。本试验通过比较改良t r i z o l 、c t a b 、异硫氰酸胍等方法， 建立了番木瓜果皮、果肉总r n a 提取和纯化方法，获得较为纯净、完整 的总r n a ，并逆转录成e d n a 。同时，根据登陆在g e n e b a n k 中的其它植 物b 一胡萝h 素合成途径中八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、 胡萝h 素合成酶三个基因序列，分别设计合成这些基因保守序列的简并引 物，进行后续的p c r 扩增。 1 实验材料 1 1 植物材料 实验材料是由漳州农科所提供的红肉番木瓜“漳红”品种。用于r n a 提取的材料，取自花后生长处于膨大期的一系列果实，擦沈晾干后取外果 皮和果肉，迅速分装入干净的2 m l 离心管中，放入液氮中速冻后于8 0 。c 保存备用。 1 2 实验试剂和酶 t r i z o lr e a g e n t 购自i n v i t r o g e n 公司； d e p c 、十二烷基肌氨酸钠、异硫氰酸胍等购自上海博亚公司； 异丙醇、无水乙醇、氯仿、异戊醇、c t a b 、柠檬酸钠、醋酸钠、i p t g 、 x g a l 、a m p 等均为国产或进口分析纯试剂： 普通c d n a 第一链合成试剂盒( r e v e r t a i d t mm f i r s ts t r a n dc d n a s y n t h e s i s k i t ) 购自m b i 公司； l a t a q t m 、p m d l 8 。tv e c t o r 、m a r k e rd l 2 0 0 0 均购于t a k a r a 公司： p g e m te a s yv e c t o r 购自美国p r o m e g a 公司； 凝胶d n a 回收试剂盒购于博大泰克公司； 福建农林大学硕士学位论文第二章番木瓜1 3 一胡萝h 素合成途径中部分酶幕l 利保守序刘的克降1 分析 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) d h 5 a 菌株由本实验室保存。 所有用于提取r n a 的溶液都用d e p c 处理的水配置，离心管等塑料 制品均用0 1 d e p c 浸泡过夜，高压灭菌后待用。异丙醇、无水乙醇、 氯仿、异戊醇均为新开封试剂。 1 3 常用试剂配制 1 3 1 琼脂糖凝胶电泳试剂 ( 1 ) e b 贮存液( 1 0 m g m l ) ：1 0 0 m ge b 溶于1 0 m l 双蒸水，窀温 下避光保存。 ( 2 ) 5 0 x t a e ( 1 0 0 0 m l ) ：2 4 2gt r i s 、5 7 1 m l 冰醋酸、3 7 2g n a 2 e d t a 1 2 h 2 0 ，加水定容到1 0 0 0 m l 。 1 3 2r n a 提取用试剂 ( 1 ) 0 1 d e p c 溶液：在经高温烘烤4 h 除r n a 酶的试剂瓶中用 双蒸水配制成0 1 d e p c 溶液，3 7 * ( 2 放置1 2 h 以上，1 2 1 高压灭菌 3 0 m i n 。 ( 2 ) 异硫氰酸胍提取液：各种成分的浓度分别