（特种经济动物饲养专业论文）蓖麻蚕和天蚕线粒体dna部分序列的测定和系统发生研究.pdf

摘要 动物线粒体是高度紧凑的环形基因组，编码2 个r r n a s ( 1 6 sa n d1 2 sr r n a ) 、2 2 t r n a 和1 3 个蛋白质( c o z - m ，c y t b ，n d l 6 ，n d 4 l ，a t p 6 ，a n da t p 8 ) 。因为容易分离和多拷贝，线粒体d n a 已经成为分子进化研究里一个广泛使用的分子标记。利用m t d n a 多态性来探讨昆虫类群、系 统发育关系是当前昆虫系统学研究的热点。但在国内，由于目前实验技术、数据分析及经费 等方面的限制，该方面的研究仍不多。在研究昆虫类群和系统发育关系时，昆虫线粒体基因 组为核序列的补充提供了丰富的材料。 除桑蚕以外，蓖麻蚕和天蚕都是鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) ，天蚕蛾科( s a t u m i i d a e ) 中具有较高 经济价值的绢丝昆虫。目前为止对他们进行的研究并不多，而将蓖麻蚕m t d n a 用于昆虫分子 系统学研究中的就更少，用天蚕m t d n a 作昆虫分子系统学的研究还未见报道。为此，我们分 别对蓖麻蚕和天蚕线粒体的c o l 、c o i l 、a t p 8 、a t p 6 等4 个蛋白编码基因进行了扩增、测序， 分析了它们的序列组成特点，同时结合己公布线粒体基因组全序列的昆虫进行了系统发生分 析，以形态学分类系统为基础对m t d n a 在昆虫分子系统学中应用的可能性进行了评价。 主要结果如下： i 序列分析 分别对蓖麻蚕和天蚕线粒体的c o i 、c o i l 、a t p 8 、a t p 6 等4 个蛋白编码基因进行了扩增、 测序、对其核苷酸频率和氨基酸组成进行了分析，并根据无脊椎动物线粒体d n a 密码子 ( c o d o n 5 ，t r a n s l a t e - t a b l e = 5 ) 进行了蛋白编码序列的翻译。结果为：蓖麻蚕c o i 基因全长1 5 5 8 b p ， c o i i 基因全长6 8 4b p ，a t p 8 基因全长1 5 6b 口，a t p 6 基因全长6 7 2b p ；天蚕c o l 基因全长 1 5 2 8 b p ，c o i i 基因全长6 8 1b p ，a t p 8 基因全长1 6 8 b p ，a r p 6 基因全长6 8 1b p 。4 个线粒体蛋白 编码基因偏好使用a 、t 碱基，而且a + t 平均含量都明显的高于g + c 平均含量；在氨基酸组成 上，偏好使用第三位是a 的密码子，而较少使用第三位是c 的密码子。 2 系统发生分析 用c l u s t a l x1 8 ( t h o m p s o n 等，1 9 9 7 ) 软件对蓖麻蚕、天蚕及4 4 个昆虫的c o l 、c o i i 、a t p 8 和a t p 6 等4 个线粒体蛋白编码基因的核酸和氨基酸序列进行比对，用m e g a2 0 ( k u m a r 等， 2 0 0 1 ) 软件包中的n j 法构建进化树。分析结果如下： 用c o i 基因全序列、密码子第1 、第2 位点及氨基酸序列构建进化树，以用密码子第1 、 第2 位点构建的树型图分辨率最高，优于氨基酸序列构建的树型图。以全序列构建树型图分 辨率最低，双翅目中的昆虫都没有聚类在一起，表明同一基因核酸序列和氨基酸序列的系统发 生效用不同；并且同一基因核酸序列的密码子第1 、第2 位点和密码子第1 、第2 、第3 位点 的系统发生效用也不相同。 i 西南农业大学硕士学位论文 四个蛋白编码基因中，以a t p 8 基因的系统发生效用最低，并且用c o l 、c o i i 和a t p 6 基因构建的进化树中，同翅目粉虱科内的昆虫都聚类在一起，但是用a t p 8 基因构建的树型图 中同翅目粉虱科内的昆虫却没有聚类在一起，表明不同基因问系统发生效用不同，并且同一 分类阶元内不同基因间的系统发生效用也不相同。说明在对物种进行分子系统学研究时，需 要根据物种问的亲缘关系，选择突变率与血统分化年代间匹配的分子标记；同时在检测一个 特定分类阶元水平上某个基因的系统发生效用时，正确评价基因内可变位点的分布是非常重 要的；另外在评价物种树或种群树时，尽量使用多个基因也是较好的选择。 4 个基因合并后的序列构建进化树的分辨率都比用单个a t p 8 或a t p 6 基因构建的树型图 的高，说明在同时使用几个基因分析物种间的系统发生关系时，合并序列数据进行分析是较 好的选择，这样不同数据组合里的各种水平上的同质性可能有助于一个全面、强大的信号。 同时我们对有线粒体基因组全序列的4 4 个昆虫里的c o h i 、c y t b 、n d l 、n d 2 、n d 3 、n d 4 、 n d 4 l 、n d 5 和n d 6 等9 个蛋白编码基因的核酸和氨基酸序列及全基因组序列进行了系统发 生分析，结果表明：全基因组序列构建的树型图分辨率没有9 个基因合并后的氨基酸序列或 者其它单个基因的分辨率高，说明在不确定任何物种的发展史是否正常的情况下，线粒体基 因组全序列并不是最好的选择。 在以上所述的所有的进化树中，能够分辨昆虫的系统发生关系，都只在双翅目、鳞翅目 或者同翅目粉虱科中，而其它昆虫的聚类方式都很乱，没有规律可言，说明：在用线粒体d n a 研究昆虫间的系统发生关系时，需要选择合适的分类阶元，同时排除发展史不寻常的物种， 才可能晟大程度的反映出m t d n a 的系统发生效用。 关键词：蓖麻蚕天蚕线粒体系统发生 a b s 仃a c t t h ea n i m a lm i t o c h o n d r i ai sh i g h l yc o m p a c ta m m l a rg e n o m e ，c o d i n g2r r n a s ( 1 6 s a n d 1 2 sr r n a ) ，2 2 t r n a ，a i d1 3p r o t e i n s ( c o i i i i ，c y t b ，n d l 6 ，n d 4 l ，a t p 6 ，a n d a t p 8 ) b e c a u s ee a s yt os e p a r a t i o na n dm u c hc o p y ，m i t o c h o n d f i md n ab e c o m eam a r k o fm o l e c u l ee v o l u t i o nr e s e a r c hw h i c hw a su s e de x t e n s i v e l y m a k eu s eo fm t d n a p o l y m o r p h i s mt op r o b ei n t oi n s e c tg r o u p ，p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p si st h ef o c u so f s y s t e m a t i c so fi n s e c t sa tp r e s e n t i ti sm o r et os t u d ya b r o a d ，b u ta th o m e ，b e c a u s eo ft h e l i m i t a t i o n so f s u c hr e s p e c t sa se x p e r i m e n t a lt e c h n i q u e ，d a t aa n a l y s i sa n df u n d s ，e t c a n d t h e r ei sn o ty e tm u c hr e s e a r c hi nt h i sf i e l da tp r e s e n t 。b e s i d e ss i l k w o r m ，s a m i ac y n t h i a r i c i n ia n da n t h e r a e a y a m a m a ia r ea l l l e p i d o p t e r a ，s a t u m i i d a ea n ds p u ns i l ki n s e c to f h i g h e re c o n o m i cw o r t h a c t u a l l yf e wt o r e s e a r c ht h a tt h e yc a n yo na tp r e s e n t ，u s es a m i ac y n t h i ar i c i n im t d n af o ri n s e c t m o l e c u l a rs y s t e m a t i c sl e s s ，a n dh a sn o ts e e ny e tw i t ha n t h e r a e ay a m a m a im t d n a f o r t h i sr e a s o n ，w eh a da m p l i f i e da n ds e q u e n c i n gr e s p e c t i v e l ys u c h4p r o t e i n - c o d i n gg e n e s a sc o i ，c o i i ，a t p 8 ，a t p 6o ft h es a m i ac y n t h i ar i c i n ia n da n t h e r a e ay a m a m a i m i t o c h o n d r i a lg e n o m e ，a n a l y s i z i n gs e q u e n c eo ft h e mm a k e u pc h a r a c t e r i s t i c s ，a n d c o m b i n i n gt h ef o r t y f o u r i n s e c t sw h i c hh a v e a l r e a d ya r m o u n c et h e m i t o c h o n d r i a g e n o m ew h o l es e q u e n c ef o rt h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s e ，a n da l s oa p p r a i s i n g t h e p h y l o g e n e t i cu t i l i t yo fm t d n a b a s e do nm o r p h o l o g i ct a x o l o g y 1 1 1 em a i nr e s u l t sa r ea s f o l l o w s ： 1t h es e q u e n c ea n a l y s i s n u c l e o t i d ea n da m i n oa c i df r e q u e n c i e so fc o i ，c o i i ，a t p 8 ，a t p 6g e n ew a s a n a l y s i z e d a c c o r d i n g t oi n v e r t e b r a t e sm i t o c h o n d r i md n ac o d o n ( c o d o n 5 ， t r a n s l a t e - t a b l e = 5 ) ，c a r r yo nt h et r a n s l a t i o no ft h es e q u e n c e t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e t o t a ll e n g t ho fc o ig e n ei s15 5 8 b pa n do fc o l g e n ei s6 8 4 b pa n do fa t p 8g e n ei s 1 5 6 b pa n do fa t p 6g e n ei s6 7 2 b pi ns a m i ac y n t h i ar i c i n i t h et o t s jl e n g 血o fc o l g e n ei s1 5 2 8 b pa n do f c o i ig e n e i s6 8 1 b pa n do f a t p 8g e n ei s1 6 8 b pa n do f a t p 6g e n e i s6 8 1 b pi na n t h e r a e ay a m a m a i n l en u c l e o t i d em a k e u po ff o u rp r o t e i n - c o d i n gg e n e s a r eb i a so faa n dt a n da+ta v e r a g ec o n t e n ti sh i g h e rt h a ng 十ca v e r a g ec o n t e n t o b v i o u s l y i nt e r m so f m a k e u po f t h ea i n i n oa c i d s ，t h e yf a v o r i t et h et h i r di sa nac o d o n s ， b u tu s et h et h i r dl e s si sacc o d o n s i i 西南农业大学硕士学位论文 2t h e p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s c o i ，c o i i ，a t p 8a n da i 甲6g e n eo fs a m i ac y n t h i ar i c i n ia n da n t h e r a e a y a m a m a ia n df o r t y - f o u ri n s e c t sw h i c hh a v ea l r e a d ya l n o u n c et h em i t o c h o n d r i ag e n o m e w h o l es e q u e n c ew e r gu s e df o rt h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s e 1 1 1 es e q u e n c e sw e r ea l i g n e d s e p a r a t e l ya n dc o m b i n eb yc l u s t a l x a n dm 匝g a 2 0s o f t w a r ew a su s e dt oc o n s t r u c tt h e c l a d o g r a m n l er e s u l t so f p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sa r ea sf o l l o w s ： t h ec o m p l e t es e q u e n c e ，t h ef i r s ta n ds e c o n ds i t e so fc o d o n sa n da m i n oa c i d s e q u e n c eo fc o lg e n ew e r eu s e dt oc o n s t r u c tc l a d o g r a ms e p a r a t e l y 1 1 l cr e s o l u t i o no f c l a d o g r a mw i t ht h ef i r s ta n ds e c o n ds i t e so fc o d o u sc o ig e n ei st h eb e s t ，a n dh i g h e r t h a nw i t ha n i l n oa c i ds e q u e n c e n l er e s o l u t i o no fc l a d o g r a mw i t hc o m p l e t es e q u e n c e o fc o ig e n ew a st h el o w e s ta n de v e nt h ei n s e c t so fi n t m - d i p t e r ac o u l d n tc l u s t e rt ob e t o g e t h e r t i l i ss h o wt h a tt h ep h y l o g e n e t i cu t i l i t yo fd n a a n da m i n oa c i ds e q u e n c eo fa s a m eg e n ei sd i f f e r e n t a n da l s ot h ef i r s t ，s e c o n ds i t e so fc o d o n sa n dt h ef i r s t ，s e c o n d a n dt h i r ds i t e so f c o d o n si sd i f f e r e n t a m o n gt h ef o u rp r o t e i n - c o d i n gg e n e s ，t h ep h y l o g e n e f i cu t i l i t yo fa t p 8g e n ei st h e l o w e s t 弧ei n s e c t so fa l e y r o d i d a ew e r ec l u s t e rt ob et o g e t h e ri nc l a d o g r a mo fc o i , c o i ia n da t p 6g e n e b u tt h e yc o u l d n tc l u s t e ri nc l a d o g r a mo fa t p 8g e n e 1 1 1 i ss h o w t h a tt h ep h y l o g e n e t i cu t i l i t yo fd i f f e r e n tg e n ei sd i f f e r e n ta n da l s oi ns a m et a x o nl e v e li s d i f f e r e n t 删ss u g g e s tt h a tw es h o u l ds e l e c tg e n ew t hm u t a t i o nr a t ew h i c hm a t c hw i t h t h ed i v e r g e n c et i m eo fl i n e a g ea sm o l e c u l a rm a r k e rw h e nw er e s e a r c ht h em o l e c u l a r s y s t e m a t i c so fs 0 1 t l es p e c i e s a tt h es a m et i m e ，e v a l u a t et h ed i s t r i b u t i o no fv a r i a b l e s i t e so ft h eg e n ea c c u r a t e l yi sv i t a lt od e t e c tt h ep h y l o g e n e f i cu t i l i t yo fg e n ei nag i v e n t a x o n i na d d i t i o n ，s e l e c ts e v e r a lg e n e sm a y b eb e t t e rac h o i c ew h e nw ee v a l u a t es p e c i e s t r e e s n er e s o l u t i o no fc l a d o g r a mo fc o m b i n e df o u rg e n e s s e q u e n c ea r eh i g h e rt h a n s i n g l ea t p 8g e n eo ra t p 6g e n e ，s h o wt h a tc o m b i n i n gs e q u e n c es e t si st h eb e a e rc h o i c e w h e nw eu s es e v e r a lg e n e sa tt h es a l l et i m et or e s e a r c ht h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p s o fs p e c i e s s ot h a tt h eh o m o g e n e i t yo fd i v e r s i f i e dl e v e lm a y b ec o n t r i b u t et oa c o m p r e h e n s i v ea n dp o w e r f u ls i g n a l a tt h e s a n 2 et i m e ，w eu s et h eo t h e rn i n e p r o t e i n c o d i n gg e n e si nm i t o c h o n d r i ag e n o m eo ff o r t y - f o u ri n s e c t sw h i c hh a v ea l r e a d y a n n o u n c et h em i t o c h o n d r i ag e n o m ew h o l es e q u e n c ef o rt h ep h ) l o g e n e t i ca n a l y s i s 1 1 1 e r e s u l ts h o wt h a t ：t h er e s o l u t i o no fc l a d o g r a mo fw h o l eg e n o m ei sl o w e rt h a na m i n oa c i d s e q u e n c eo fc o m b i n e dn i n eg e n e so ro t h e rs i n g l eg e n e s t h i ss u g g e s tt h a tn f i t o c h o n d r i a g e n o m ei sn o tt h eb e s tc h o i c ew h e nw ec o u l d n ta s c e r t a i nt h ep h y l o g e n yo fa n ys p e c i e s a b s t r a c t i nt h ea l lc l a d o g r a mo fa b o v e ，o r a yc a l lr e s o l v et h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po f i n s e c t so f d i p t e r a , l e p i d o p t e r ao ra l e y r o d o i d e a 删kt h ec l u s t e rm o d e so f o t h e ri n s e c t s a r ea l ld i s o r d e ra n dh a v e1 1 0a n yo r d e r t h i ss u g g e s tt h a ti ti sn e e dt os e l e c ta p p r o p r i a t e t a x o nw h e nm i t o c h o n d r i a ld n aw a su s e dt or e s e a r c ht h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p so f i n s e c t s a n da tt h es a m et i m e ，e x c l u d et h es p e c i e sw h i c hh a sa m b i g u o u sp h y l o g e n y o r a yt h r o u g ht h i sw a y ，c a ni tr e f l e c tf a r t h e s tt h ep h y l o g e n e t i cu t i l i t yo fm i t o c h o n d r i a l i ) n a k e yw o r d s ： s a m i ac y n t h h 2r i c i n ia n t h e r a e ay a m a m a im i t o c h o n d r i o n p h y l o g e n e s i s 奉研竞由以下覆目资助： t h i sw o r kw a ss u p p o r t e df i n a n c i a l l yb y ： 教育部博士点专项l 金( 一号：2 0 0 4 0 6 2 5 0 0 9 ) t h es p e c i a tf u n do fm i n i s t r yo fe d u c a t i o n ( n o 2 0 0 4 0 6 2 5 0 0 9 ) 英文缩写 m t d n a ：m i t o c h o n d r i a ld n a 线粒体脱氧核糖核酸 d n a s ehd e x y r i b o n u e l e a s ei 脱氧核糖核酸酶i r n a s eh ：r i b o n u c l e a s ei t 核糖核酸酶h a ：a d e n i n e 腺嘌呤 t ：1 1 1 y m i n e 胸腺嘧啶 c ：c y t o s i n e 胞嘧啶 g ：g u a n i n e 鸟嘌呤 n d l 6 ，4 l ：n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d ed e h y d r o g e n a s es u b u n i tl - 6a n d4 l 烟酰氨腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1 - 6 和4 l c o l - 1 i i ：c y t o c h r o m eo x i d a s es u b u n i t1 3 细胞色素氧化酶亚单位1 - 3 c y tb ：c y t c h r o m eb 细胞色素b l r r n a ：l a r g er i b o s o m a lr n a 大亚基核糖体，1 6 s 核糖体 s r r n a ：s m a l lr i b o s o m a lr n a 小亚基核糖体，1 2 s 核糖体 t r n a ：t r a n s f e rr n a 转移核糖核酸 n t ：n u c l e o f i d e核甘酸 b p ：b a s e p a i r 碱基对 a t p 8 ：a t ps y n t t l a s es u b u n k8a t p 合成酶亚基8 a t p 6 ：a t ps y n t h a s es u b u n i t 6 a t p 合成酶弧基6 b l a s t , b a s i cl o c a l a l i g n e m n ts e a r c ht o o l 基本的本地化排序查询工具包 n j ：n e i g h b o r - j o i nm e t h o d 邻接法 p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 多聚酶链式反应 1 t 分子系统学概述 第一章文献综述 分子系统学是检测、描述并解释生物在分子水平上的多样性及其演化规律的，- 1 7 综合 性的交叉学科。其理论基础来源于系统学、分类学、遗传学、比较生物学、分子生物学和进 化论：方法来源于免疫学、仪器分析、生物化学和分子生物学。 直接利用分子信息进行分类研究，有许多优点：1 ) 分子序列的信息代表了遗传本质，不受 环境影响，不受标本个体发育状态和环境条件的影响。2 ) 能够提供充分的可定量测度的进化 信息。3 ) 在不同类群间有较好的可比性，是一种理想的共同尺度。4 ) 能够反映生物的进化机 理( 程家安，2 0 0 1 ) 。 1 1 1 基本原理 分子系统学以下列些基本原理为基础： 1 ) 生命的生化一致性和多样性原理：生化一致性表现在所有生物都有相似的元素组成、 有相同的单体结构、相似的遗传、物质利用和能量转化功能等。生化多样性首先表现在组成 生物体的化合物种类繁多上，其次表现在分子组成和结构上。 2 ) 生物大分子进化速率恒定性原理：以年计时的生物大分子序列改变速率大致保持恒定， 大分子序列之间的差异程度与分歧后独立进化的时间成正比。也称为分子钟假说，是6 0 年代 初期研究蛋白质氨基酸序列差异与分化年代之间的关系提出的( z u c k e r k a n d l 和p a u l i n g ，1 9 6 5 ) ， 随后d n a 序列的研究也基本支持此假说。 3 ) 表信息分子的进化原理：表信息分子是进化的产物，它的进化与代谢途径的进化相 互关联。生物体内的一切反应由酶催化完成，因而一种新的表信息分子的产生常伴随着一种 新的酶促反应或代谢途径。从这一意义上讲，表信息分子是基因型( 酶座位) 在分子水平上 的表现。 4 ) 同源比较原理：只有同源分子之间的比较才能建立正确的系统发育关系。同源比较是 生物学领域的一个核心概念，是系统学研究的基础。分子性状的同源性比形态解剖性状的同 源性复杂得多，对于信息大分子，同源是指具有共同的祖先，而对于表信息分子，同源就意 味着具有相同的代谢途径或酶促反应。 因此分子系统学上的同源可以区分成三个不同的层次。首先是不同基因组之阊基因的同 源关系，其次是同源基因间不同核营酸对或同源肽链上不同氨基酸位置上的对应关系，第三 个层次是表信息分子之间的同源关系。遮三个层次中，不同基因组之间的基因( d n a 序列) 的同 源性是最基本也是晟复杂的，可以分成以下几类： ( 1 ) 直源( o r t h o l o g y ) ：是指由于物种形成事件而产生的同源关系，存在于不同种问，是物种 西南农业大学硕士学位论文 起源的证据，可用于构建种间系统发育关系。 ( 2 ) 并源( p a r a l o g y ) ：是指同于基因重复事件而产生的同源关系，存在于同一个体中，是基因 同一起源的证据，可用于构建基因间演化关系。 ( 3 ) 外源( x e n o l o g y ) ：由转染或不同支系间基因横向转移而引起的同源关系，常存在于亲缘 关系较远的类群之间，并不表明携带这些基因的类群间的真正关系。这种同源也只反应了基 因起源的历史，不能用于种间系统发育研究。 ( 4 ) 并外源( p a r a x e n o l o g y ) ：也称重复多卜源( d u p l i c a t e 或m u l t i p l e xe n o l o g y ) ，指一个基因组中出 现二个或多个外源基因拷贝，是外源基因重复引起的，存在于同一个体的基因组中。 ( 5 ) 复源( p l e r o l o g y ) ：按其意义也称嵌套同源或部分同源( p a n i a l ho m o l o g y ) ，是由于外显子改 组( e x o ns h u f l i n g ) g f 起的一个基因的外显子与另一个基因接台，产生了具有新功能的肽链，于 是这种新基因或其产物( 肽链) 与原来两种基因或肽链形成部分同源关系。这种重组基因或蛋白 质起初一定是起源于同一基因组内，但随着时间延长，杂交基因也可随物种形成事件而产生 趋异进化，成为部分直源( p a r t i a l o rt h o l o g y ) 基因。 如何判断分子之间的同源关系对分子系统学家来说是很重要的问题。对于表信息分子， 最根本的是要了解生物体内产生这种分子的生物合成顺序。表信息分子的同源是由仅具有共 同遗传基础的特定的生物合成顺序的概率决定的，没有遗传基础的表信息分子的系统学研究 可以看作是表征的( p h e n e t i c ) 分类研究。信息分子核酸和蛋白质的不同核苷酸或氨基酸位置上 的同源关系，在序列分析技术中成为统计学上的概率推断问题。 5 ) 样品同质性原理： 分子系统学研究所用的样品必须是同质性的。样品同质( h o m o g e n e i t y ) 或称样品均一性，是指一个样品应是纯的生物学单位( 如一个基因或其克隆产物，一个基因组 及所有产物即个体等) ，异质性( h e t e r o g e n e i t y ) 的样品。是由两种或多种生物学上不同的样品混 合组成。样品同质性是一个相对概念，随分子系统学研究水平而变化。进行种间研究时，比 较是在不同基因库之间进行，比较的单位应是基因库代表；进行种内研究时，比较的单位是不 同的基因组，个体应作为同质性样品；而在作个体水平的研究时，只有某一组织才看作是同质 性的。 1 1 2 分子系统学常用的研究方法 自从免疫沉淀反应用于动物亲缘关系试验以来，仪器分析、生化技术和分子生物学技术 的发展成为分子系统学的关键因素。到目前为止，应用于分子系统学上的分析方法包括各种 仪器分析方法f 如层析、气液相色谱、原子吸收和发射光谱等) 、血清学方法、各种电泳、蛋白 质测序和高级结构分析、各类核酸分析方法。这些方法按其所获得的分子数据的性质和特点， 可归纳为四大类。 1 ) 直接测序法 直接测定生物体内信息分子c d n a ，r n a ，蛋白质) 顺序的方法统称为直按测序法，主要用于 2 第一章文献综述 系统发育的分子进化的研究。这类方法产生的是性状数据( c h a r a c t e rd a t a ) ，即分子之间的差异 是由一系列不连续的变量( 1 l p 性状) 来表示的，每一个性状都有不同的性状状态，d n a 和r n a 的每一个核昔酸位点是一个性状，具有4 种不同的性状状态。因此直接测序法产生的数据信息 量最大，是最精确的分子系统学数据。 序列性状和形态性状一样，仅仅是另一类分类性状而且也受分子进化上的趋同、平行、 速率变异的影响。它们对系统发育的贡献仍然取决于对这类数据的分析方法。根据同源序列之 间相似程度建立系统发育树的方法就有三大类数十种，选择不同的方法对分析结果有影响。 从现有的资料看，序列分析在分子进化、分子系统发育及种系统发育研究方面是一类信息量 很大的性状。 2 ) 立体结构法 通过比较生物大分子的立体结构特征来推测分子之间和生物类群之间的系统发育关系的 方法。蛋白质和核酸的高级结构是由一级结构决定的，但高级结构的进化比一级结构要保守。 因此从高级结构数据建立的系统发育关系更可靠。但大分子高级结构的研究是在一级结构清 楚的情况下，需要纯化结晶分子并要求大型复杂仪器检测，难度大、要求高目前大分子立体 结构的研究主要集中在某些蛋白质和r n a 分子的结构上，其中细胞色素c 、免疫球蛋白、血红 蛋白、t r n a 和r r n a 等进行过结构比较和结构进化树的构建工作。 3 ) 间接测序法 用简便快速的方法测定信息分子的多态性，再根据一定的理论假设由统计学方法推断遗 传差异( 序列差异) 的方法。这类方法有酶电泳，r f l p ，d n a f b 等。间接测序法虽然只测定了信 息分子的部分变异，没有直接测序法精确，但由于适合于进行较大规模地比较研究。由间接 测序法获得的数据仍属于性状数据，这种性状数据可以看作是从直接测序数据中随机抽出的 一个样本，因而对这类数据的分析是在分子进化模型的指导下，采用统计学上的由样本变异 推断整体差异的方法。这类数据也可以转化成距离数据进行分析，如等位酶研究中的遗传距 离等。 4 ) 表型推断法 通过蛋白质、核酸总体相似性的研究或通过对表型信息分子的分析来推测遗传变异情况 的方法。这类方法包括蛋白质的血清学方法、d n a - d n a 杂交以及各类小分子化合物的仪器分 析方法，由这类方法产生的数据属距离数据，特点是不同分子之间的差异仅由单个变量来测 量，是一种总体相似性的估算方法，因此属于表型研究。这类数据的分析价值随分子类型在 不同类群中变化较大。一般地说，免疫学方法和d n a - d n a 杂交适合于属级到科级之间的系统 发育研究。而小分子化合物的仪器分析方法多用于属内种问比较和近缘种类鉴别上。 一般而言，对自然现象的认识过程是从人类感官所及的层次开始，逐步向微观和宏观两个方 向扩展。向微观领域的探索往往出于寻找“深层原因”的动机。对进化原因和进化机制的探 索，最终必然深入到分子水平。如今。科学家们发现，不同层次的现象遵循不同的规律和不 西南农业大学硕士学位论文 同的法则。低层次的规律并不完全适用于高层次，用商层次的规律解释低层次现象也往往行 不通。因此，分子进化规律和分子进化的理论墓本上只适用于分子进化。 1 1 3 系统树的构建方法 研究分子系统学的一个重要的内容就是构建分子进化树。进化树( e v o l u t i o n a r yt r e e ) 又名系 统树( p h y l o g e n e t i ct r e e ) ，是包括生命科学中的进化论、遗传学、分类学、分子生物学、生物化 学、生态学及数学中的概率论、图论、计算机科学和群论交叉形成的边缘领域。以不同物种 的分子数据( 如d n a ) 为依据构建的进化树称为分子进化树。通过d n a 序列分析研究生物的进 化过程，确立物种间的进化关系具有许多优越性。d n a 仅仅由4 种碱基基本结构单位组成， 其序列的异同是明确无误的，因而易于分析；d n a 序列含有丰富的进化信息，如有些物种含 有1 0 1 1 个碱基对；d n a 序列相对易于获得，特别是随着近年来p c r 技术的应用以及人类基 因组计划的实施，d n a 序列正以爆炸性的速度积累起来。因此，基于d n a 序列的分子进化 树的构建已成为生物系统研究中最重要的工具之一。分子系统进化树的构建方法一般有简约 法( p a r s i m o n y ) 、距离矩阵法( d i s t a n c em a t r i xm e t h o d s ) 和最大似然法( m a x i m u ml i k e l i h o o dm e t h o d s ) 几种不同建树方法。 用统计方法重建系统发育树分别独立地起始于形态学性状的数值分类法和分析基因频率 数据的群体遗传学。目前，己经有许多统计学方法可以用于分析分子数据来重建系统发育树。 通常使用的方法分为三大类：距离法、简约法和似然法。下面就这三类方法中主要的分析方法 进行介绍： 1 ) n r 法( 邻接法，n e i g h b o rj o i n i n gm e t h o d ) n j 法( s a i t o n aa n dn e i ，1 9 8 7 ) 是距离矩阵方法中一种推论叠加树的方法。该法中对距离的校 正比较关键，在成聚过程中连接的是分类单元之问的节点( n o d e ) 而不是分类单元本身。n j 法中 原始距离数据用于估算系统树上所有端结分类单元之间的距离矩阵，校正后的距离用于确定 结点间的连接顺序。n j 法的计算过程十分简单，算法中既包括了不同分枝形式树的比较，也 给出了分枝长度的值。 2 ) m e 法( 晟小进化法，m i n i m u m ev o l u t i o n ) m e 法也是距离矩阵方法中一种推论叠加树的方法。i 扫c a v a l l i - s f o r z a 和e d w a r d s ( 1 9 6 7 ) 提 出，后来由s a i t o u 和i m a n i s h i ( 1 9 8 9 ) 对算法进行了简化。该法不受平行和恢复突变的 影响，如果距离数据满足叠加性条件一般能给出正确的树。 3 ) n i p 法( 最大简约法，m a 虹m u m pa r s i m o n y ) m p 法( k l u g e aa n dp a r r i s 。1 9 6 9 ) 也称w a g n e r 简约法，是简约性性状数据分析中最简单的分析 方法之一，对允许的性状状态转换作很少的限制，允许性状状态之间的可逆性转换。形成最 简约树的两个主要问题是根据选定的性状进化模型计算所有分枝形式树上性状状态改变的最 小数及一发现具有晟小性状改变数的所有分枝形式的树。这种方法对性状进化的假设少，所 4 第一章文献综述 建成的树一般都具有最小的进化改变( 树长最短) 。该方法具有以下几个方面的优点：1 它直 接应用原始性状数据，并不需要将原始数据转换成距离数据，避免了不可逆转的信息丢失；2 简约性方法与其它性状分析方法相比，较少依靠关于序列进化的假说，或至少能依靠种更 符合实际的简单的进化假设；3 大多数简约法的计算机算法及程序比其它方法更熟。但是该方 法也有缺陷。主要表现在：1 只适用于亲缘关系密切的种类或序列之间的分析，对于进化时间 较长的物种或序列，由于平行和同复突变的干扰，会得出不正确的结果。2 当系统树上不同支 序在进化改变量上不等时也会引起误差。 4 ) m l 法( 极似然法，m a x i m u m l i k e l i h o o dm e t h o d ) m l 法( f i s h e r ，1 9 2 1 ) 是应用统计推断构建系统发育关系的似然性方法。只要建立一个关于 进化过程的模型和一组观测数据就可以进行统计推断。极似然法的标准是选择具有最大似然 值的树。m l 方法吸引人之处在于它充沛的数学与统计学基础，以及它可以处理所有可