（遗传学专业论文）斑马鱼外分泌胰腺特异性转录因子mist1的克隆、表达和功能研究.pdf

复旦大学硕士论文斑马鱼外分泌胰腺特异性转录因子m i s t l 的克隆、表达和功能研究 英文缩略词 3 u t r * 3 u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，3 末端非翻译区； 5 u t r ：5 u n t r a n s l a t e d 坤西彻，5 末端非翻译区； b h l h ：b a s i ch e l i x - l o o p h e h x ，碱性螺旋一环一螺旋； b l a s t ：b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l ，同源性检索工具； c d d ：c o n s e r v e dd o m a i nd a t a b a s e ，蛋白保守结构域数据库； c n s ：c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ，中枢神经系统； d e p c ：d i e t h y p y r o c a r b o n a t e ，焦碳酸二乙酯； d p f ：d a y sp o s tf e r t i l i z a t i o n ，受精后天数； e g f p ：e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，增强型绿色荧光蛋白； h p f ：h o u r sp o s tf e r t i l i z a t i o n ，受精后小时数； m i s t l ：m u s c l e ，i n t e s t i n ea n ds t o m a c he x p r e s s i o n1 ，肌肉、小肠和胃表达因子1 ； m o ：m o r p h o l i n om o d i f i e da n t i s e n s eo l i g o n u c l c o t i d e ，吗啉修饰的反义寡核苷酸； n c b hn a t i o n a lc e n t e rf o rb i o m e d i c a li n f o r m a t i o n ，美国国立生物医学信息中心； o r f ：o p e nr e a d i n gf r a m e ，开放阅读框； p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，多聚酶链式反应； r a c e ：r a p i d 锄p n f i c a t i o no f c d n a e n d s ，c d n a 末端的快速扩增； r t - p c r ：r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，逆转录多聚酶链式反应。 3 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文巾除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对奉研究的肩发和所做的贞献均已在论文r r | 作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名： f = _ 1 期 论文使用授权声明 本人完全了解复日大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，叮以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名导师签名：日期 复且大学硕士论文 斑马鱼外分泌胰腺特异性转录崩子m i s t l 的克隆、表达和功能研究 摘要 目前已有很多调控内分泌胰腺发育的转录因子被发现，相比之下，已知的参 与外分泌胰腺发育的转录因子则很少。m i s t l 是一个在腺泡细胞表达的重要的外 分泌胰腺特异性转录因子，属于型b h l h 蛋白，已在小鼠、大鼠和人类中发 现。在本研究中，我们在斑马鱼中克隆了m i s t l 基因，并对其表达谱和功能进行 了分析鉴定。 m i s t l 基因的c d n a 全长为1 0 6 9b p ，编码一个含1 8 4 个氨基酸残基的预测 蛋白。序列比对分析表明，斑马鱼m i s t l 编码的蛋白产物与其小鼠、大鼠和人类 的同源物在典型的b h l h 功能域享有很高的同源性。r t - p c r 和原位杂交的结果 显示，m i s t l 在胚胎发育的起始期有明显的母源转录活性，而内源m i s t l 依次表 达于原脊索盘、孵化腺、后脑，并在7 2 h p f 以后局限在胰腺特异性表达。通过采 用吗啉修饰的反义r n a 特异性抑制基因表达的方法，我们发现，当注射了高浓 度的m i s t l m o 后，有将近一半的胚胎表现出包括头部偏小低垂、后脑水肿等形 态异常，并伴随有一定程度的发育延迟。同时，标记基因表达谱的变化显示， m o 注射胚胎的中后脑分界线完全缺失，外分泌胰腺细胞显著减少且组织形态受 损，而内分泌胰腺则不受影响。当注射低浓度的m i s t l m o 后，表型异常和标记 基因表达谱变化的程度均有所降低，说明m i s t l m o 的抑制作用存在剂量依赖效 应。此外，m i s t lm r n a 可以特异性的拯救m o 对于外分泌胰腺的抑制作用。 根据以上结果可以得出结论，m i s h 作为转录因子，以一种进化保守的方式 特异性调控斑马鱼外分泌胰腺的发育；另外，它还在斑马鱼胚胎早期发育过程中 参与了中枢神经系统的发育，以及更早的发育起始过程。 关键词：m i s t l ，b a s i ch e l i x - l o o p - h e l i x ( b h l h ) ，外分泌胰腺，发育，斑马鱼 复旦大学硕士论文 斑马鱼外分泌胰腺特异性转录因子m i s t l 的克睡、表达和功能研究 a b s t r a c t a l t h o u g hm a n yo ft h eg e n e st h a tr e g u l a t ed e v e l o p m e n to ft h ee n d o c r i n ep a n c r e a s h a v e b e e ni d e n t i f i e d , f e w e rt r a n s c r i p t i f a c t o r si n v o l v e di nt h ee x o c r i n ed e v e l o p m e n t a r ek n o w n m i s t l ，ac l a s s hb a s i ch e l i x - l o o p - h e l i x ( 咖h ) p r o t e i nw h i c hh a sb e e n i d e n t i f i e di nm o u s e ，r a ta n dh u m a n ，i sa ni m p o r t a n te x o c r i n ep a n c r e a st r a n s c r i p t i o n a l f a c t o re x p r e s s e di nt h ea c i n a rc e l l s i nt h ep r e s e n ts t u d y , w ec l o n e dt h eh o m o l o g o u s m i s hg e n ei nz e b r a f i s h ，e x a m i n e di t se x p r e s s i o np a t t e r na n de x p l o r e di t si nv i v o f u n c t i o n t h ef u l l l e n g t hz e b r a f i s hm i s t le d n ac o n t a i n s1 0 6 9b p ，c o d i n gf o rap r e d i c t e d p r o t e i no f1 8 4 赳n j 硇oa c i d s t h et y p i c a lb h i a - id o m a i ns h a r e sh i g hi d e n t i t yw i t ht h a t o fi t so r t h o l o g si nm o n s c r a ta n dh u m a n r e s u l t so fr t - i c ra n dw h o l e - m o u n t ns i t u h y b r i d i z a t i o nr e v e a l e dt h a tm i s hm a t e r n a lt r a n s c r i p t sa r ed i s t i n c t i nt h ev e r y b e g i n n i n go f e m b r y o g e n e s i sa n de n d o g e n o u sm i s t li sc h r o n o l o g i c a l l ye x p r e s s e di n p o l s t e r ，h a t c h i n gg l a n d , h i n d b r a i na n da p p e a r se x c l u s i v e l yi nt h ep a n c r e a sf r o m7 2 h p f o n w a r d t h r o u g hm o r p h o l i n o ( m o ) g e n e - s p e c i f i ck n o c k d o w na p p r o a c h ，n e a r l yh a l f o ft h e e m b r y o si n j e c t e d w i t h h i g hd o s a g e o fm od e v e l o pm o r p h o l o g i c a l a b n o r m a l i t i e s ，s u c ha ss m a l l e rb o w i n gh e a da n dd r o p s yi nt h eh i n d b r a i n , a c c o m p a n i e d b ym o d e r a t el e v e l so fd e v e l o p m e n t a ld e l a y m e a n w h i l e , i nt h em o t r e a t e de m b r y o s ， s h o w nb ye x p r e s s i o no fs p e c i f i cm a r k e r s , m i d b r a i n - h i n d b r a i nb o u n d a r yi sm i s s i n ga n d e x o c r i n ep a n c r e a si ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e da n dd i s o r g a n i z e d , w h i l et h ee n d o c r i n e p a n c r e a sr e m a i n sn o r m a lw h e nl o w e rd o s a g e s o fm oa a p p l i e d , m i l d e r m o r p h o l o g i c a l d e f e c t sa n de x p r e s s i o nc h a n g eo fm a r k e rg e n e sa r eo b s e r v e d , s u g g e s t i n gad o s e - d e p e n d e n tk n o c k d o w ne f f e c to fm i s t l m o i na d d i t i o n ，m i s t m r n ac a l ls p e c i f i c a l l yr e s c u et h em ok n o c k d o w ne f f e c to ne x o c r i n ep a n c r e a si n v i v o b a s e do nt h ea b o v er e s u l t s ，w ec a nc o n c l u d et h a tm i s t lf u n c t i o n si na ne v o l u t i o n a r y c o n s e r v e dw a ya sak e yt r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o rs p e c j 丘ef o re x o c r i n ep a n c r e a s d e v e l o p m e n ti n z c b r a f i s h i na d d i t i o n , i ti si n v o l v e di nt h ee m b r y o n i cc n s d e v e l o p m e n t ，a n de v e ne a r l i e ri n i t i a lp e r i o do fd e v e l o p m e n t k e y w o r d s ：m i s t l ；b a s i ch e l i x - l o o p - h e l i x0 , h l r i ) ；e x o c r i n ep a n c r e a s ；d e v e l o p m e n t ； z e b r a t i s h 2 复旦大学硕士论文 斑马鱼外分泌胰腺特异性转录凶子m i s t l 的克建、表达和功能研究 前言 胰腺的发育与维持依赖于一张由各种诱导性细胞相互作用、信号通路和转录 调控机制组成的复杂网络( s l a c k , 1 9 9 5 ；e d l u n d ，2 0 0 2 ；k i l na n dm a c d o n a l d , 2 0 0 2 ； w i l s o ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。为保证这些分子和细胞反应的正常运转，需要多种转录因子 表达和活性的参与和协调作用。在已经发现的与胰腺发育相关的重要转录因子 中，大多数都是特异性调控内分泌组织发育的，对内分泌组织分化和维持的分子 机制和信号通路的阐述也相对较为详尽。而相比之下，对外分泌胰腺发育相关的 基因则研究较少。 m i s t l 是为数不多的对外分泌胰腺发育具有关键作用的一种转录因子，它属 于n 型b h l h 蛋白，已经在小鼠、大鼠和人类中发现并得到了鉴定( l e m e r c i e re t a 1 ，1 9 9 7 ，2 0 0 0 ；p i ne ta 1 ，1 9 9 9 ，2 0 0 1 ；m c l e l l a ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。研究发现，m i s t l 广 泛表达于多种组织的分泌上皮细胞中，包括胰腺、唾液腺、胃腺主细胞、精囊、 泪腺以及乳腺( p i ne ta 1 ，2 0 0 0 ；z h a oe ta 1 ，2 0 0 6 ) 。虽然m i s t l 和其它型b h l h 因子一样可以与i 型b h l h 因子形成异源二聚体，但是它优先形成的d n a 结合 复合物是m i s t l 同源二聚体( l e m e r c i e re ta 1 ，1 9 9 8 ；r u k s t a l i se ta 1 ，2 0 0 3 ；z h ue ta 1 ， 2 0 0 4 ) 。m i s t l 与d n a 发生相互作用后可以根据细胞环境的不同而激活或者抑制 目标基因的转录( l e m e r c i e re ta 1 ，1 9 9 8 ；r u k s t a l i se ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在小鼠的胰腺发 育过程中，m i s t l 最初在胚胎期1 0 5 天( e 1 0 5 ) 时表达于后来发育为外分泌胰 腺前体的原始前肠细胞，而后特异性的局限在腺泡细胞中高水平表达( l e m e r c i e r e ta t ，1 9 9 7 ；p i ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。另一个重要的外分泌胰腺特异转录因子p t f a 被认为 对于腺泡细胞的命运决定是必需的，而m i s t l 则在腺泡细胞的完全成熟和细胞特 性的维持中发挥关键作用( k r a p p e ta 1 ，1 9 9 6 , 1 9 9 8 ；p i ne ta 1 ，2 0 0 1 ；j o h n s o n ac ta 1 。 2 0 0 4 ；z e c c h t ne ta 1 ，2 0 0 4 ；z h uc ta 1 ，2 0 0 4 ) 。m i s t l 被敲除的小鼠表观形态和外分 泌胰腺细胞的分化均正常，但是腺泡细胞表现出广泛的组织形态受损和细胞极性 丧失，并伴随有胰腺损伤典型的分子变化和累进损害。m i s t l 转录活性抑制后还 会导致原腺泡细胞中出现导管特异性基因( c y t o k e r a t i n1 9 ，c y t o k e r a t i n2 0 ) 的激 活，从而表现出腺泡细胞向导管细胞的表型转变。此外，分析还表明，m i s t l 缺 失小鼠中控制外分泌反应的信号通路也出现了功能缺陷( p i ne ta 1 ，2 0 0 1 ； r u k s t a l i se t 柚，2 0 0 3 ；j o h n s o n ac ta 1 ，2 0 0 4 ；z h ue ta l ，2 0 0 4 ；l u oe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。发生 的变化包括：缩胆囊素( c c k ) 信号通路中1 ，4 5 - 肌醇三磷酸受体3 ( i p 3 r 3 ) 的表达缺失和c c k 受体a 的表达上调，c o n n e x i n 3 2 表达显著降低而导致细胞间 隙连接无法形成，c a 2 + 信号通路异常而引起变形的拮抗剂激起的c a 2 + 振荡和c a = h 波等，均源于m i s t l 缺失后引起的腺泡细胞外及细胞问组织形态的受损。针对 4 复旦大学硕士论文斑马鱼外分泌胰腺特异性转录凶子m i s t l 的克隆，表达和功能研究 m i s t l 敲除和显性失活突变体小鼠模型的研究还在进行中，以求发现更多的m i s t l 目标基因，来详细阐明外分泌胰腺分化和维持的调控通路。 斑马鱼( b r a c h y d a n i or e r i o ) 是原产于印度的一种小型鲤科热带鱼，由于其 在遗传和发育生物学研究中具有独特的优势，近年来逐渐成为一种理想的模式生 物。与传统的模式生物相比，它的优势在于：体形较小，长3 c m ，因此养殖不需 要太大的空问，而且节约了费用；容易饲养，繁殖速度很快，每3 个月就可以繁 殖一代，在短时间内就可以观察到突变个体的发育情况，实验周期相对较短；产 卵量大，雌性个体在1 个星期内可以产下几百个卵，而且行体外受精，这使得对 受精卵的操作非常方便；还有一个非常重要的特点是卵呈透明，并且体外发育， 因此在显微镜下可以观察受精卵发育的整个过程，从细胞分裂一直到形成身体的 不同部分，也可以了解各器官系统是怎样形成的。尤其对于胰腺来说，斑马鱼中 的形态发生模式与哺乳动物不同( f i e l dc ta 1 ，2 0 0 3 ；y e ee ta 1 ，2 0 0 5 ) 。哺乳动物的 胰腺原基是由可发育为各种胰腺细胞的未分化祖细胞组成的，它们排列形成单层 折叠的上皮，与肠管相邻，被一层厚的间充质细胞所包围，内外分泌细胞是由导 管上皮在分支时延伸产生。而在斑马鱼中，外分泌胰腺原基中的祖细胞则排列成 分层的上皮，周围也没有间充质细胞层的包围。此外，斑马鱼外分泌胰腺祖细胞 在胰腺分支时，在胰腺上皮中就已经形成三种细胞类型了，而并不是先形成导管 后由导管末端再延伸生出内分泌和外分泌细胞。因此，在斑马鱼中研究胰腺发育 可能会发现某些小鼠中缺乏的机制，从而加深和拓宽我们对脊椎动物胰腺发育的 了解。 在本论文中，我们报道了对斑马鱼m i s t l 基因的克隆及相关序列的分析，通 过：p c r 和原位杂交检测了m i s t l 在胚胎发育过程中的表达谱，并采用吗啉修 饰的反义r n a 抑制胚胎中m i s t l 的表达，研究了m i s t l 表达抑制对于胚胎发育 的影响。 。 5 复旦大学硕士论文斑马鱼外分泌胰腺特异性转录因子m i s t l 的克窿、表达和功能研究 实验设计 6 复旦人学硕士论文斑马鱼外分泌胰腺特异性转录因子m i s t l 的克隆、表达和功能研究 材料与方法 主要仪器和设备 1 冷冻台式离心机( 5 8 1 0 r ，5 8 0 4 r ) ，德国e p p e n d o f f 公司产品； 2 台式离心机( c e n t r i f u g e5 4 1 5 d ，m i n i s p i n ) ，德国e p p c n d o f f 公司产品； 3 p c r 扩增仪( 2 2 3 3 1 ) ，德国e p p c n d o f f 公司产品； 4 电泳仪和电泳槽( j y 6 ) ，上海辉煌科学仪器公司产品； 5 凝胶成像系统( f r 2 0 0 a ) ，上海复日科技有限公司产品； 6 四孔双列恒温水浴锅( s b 9 9 ) ，浙江海宁新华医疗器械厂产品； 7 电子天平( j a l 0 0 3 ) ，上海精科天平厂产品； 8 电热恒温培养箱( 1 埘b 4 2 0 ) ，上海跃进医疗器械厂产品； 9 冰箱( b c d 2 4 5 ) ，容事达中美合资公司产品； 1 0 超低温冰箱( s a n y om d f - u s o v ) ，日本s a n y o 公司产品； 1 1 控温可调速摇床( t h 厶c ) ，江苏太仓实验设备厂产品； 1 2 显微注射用解剖镜( s m z l 4 3 - n 2 t g ) ，m o t i c 公司产品； 1 3 显微注射仪，包括持针器( 硼每1 ) 、进针器( m n - 1 5 1 ) 、支架( g j 1 ) ，日 本n a r i s h i g e 公司产品； 1 4 显微注射用针，由d r u m m o n d 公司1 0 i d 毛细玻璃管拉制而成； 1 5 拉针仪( 如i k a p 5 ) ，日本h e k a 公司产品； 1 6 荧光解剖镜( s ) 乙1 2 ) ，日本o l y m p u s 公司产品； 1 7 数码相机( e 9 9 5 ) ，日本n 】匝【0 n 公司产品； 1 8 倒置荧光显微镜( 7 1 ) ，日本o l y m p u s 公司产品； 1 9 c c d 成像系统( d 胛o ) ，日本o l y m p u s 公司产品。 主要试剂、试剂盒、酶、载体和菌株 1 p c r 引物使用相关软件p r i m e r p r e m i e r 5 0 自行设计，由上海赛百盛基因技术 有限公司和上海生工生物工程有限公司合成； 乞各种限制性内切酶、t 4 - d n a 连接酶、k l e n o w 片段，均购自n e we n g l a n d b i o l a b s 公司： 3 p c r 扩增试剂盒：一管便捷式2 x t a qp c rm a s t e r m i x 和2 x p f up c r m a s t e r m i x ， 购自天根生化科技( 北京) 有限公司； 4 一步法总r n a 提取试剂t r i z o l 购自i n v i t r o g e n 公司； 7 复_ 日| 大学硕士论文斑马鱼外分泌胰腺特异性转录因子m i s t l 的克隆、表达和功能研究 5 逆转录酶( r e v e r t r a a c e ，含5 反应缓冲液) 和r n a 酶抑制剂( r n a s ei n h i b i t o r ) 购自1 d y o b o 公司； 6 5 r a c e 试剂盒( 5 f u l l r a c e c o r e s e t ) 购自t a k a r a 公司，3 r a c e 试 剂盒( f i r s t c h o i c er i m 一凡蛇e “t ) 购自a m b i o n 公司； 7 p c r 产物及胶回收试剂盒购自r o c h e 公司； 8 p g e m - te a s yv e c t o r 购自p r o m e g a 公司，用于克隆p c r 片段； 9 。p e g f p - n 2 质粒购自c l o n t e c h 公司，由本实验室扩增保存； 1 0 p x t 7 质粒由清华大学孟安明教授惠赠，由本实验室扩增保存； 1 1 用于制备探针p 班4 的p c r i i - p t j t a 质粒由意大利p a d u a 大学f m c c s c o a r g e n t o n 教授惠赠( g e c c h i ne ta 1 ，2 0 0 4 ) ； 1 2 用于制备探针t r y p s n 的p c r i i - t r y p s n 质粒由德国f r e m u r g 大学w o l f g a n g d r i e v e r 教授惠赠( b i c m a xe ta 1 。2 0 0 1 ) ； 1 3 r n a 合成反应相关试剂：s p 6 r n a 聚合酶( 含5 x 反应缓冲液和1 0 0 m m 瑚r r 溶液) 、t 7r n a 聚合酶( 含5 x 反应缓冲液和1 0 0 m md t t 溶液) 、t 3r n a 聚合酶( 含5 反应缓冲液和1 0 0 m md t r 溶液) 、r or n a s e - f r e ed n a s e ( 含 反应缓冲液及终止缓冲液) 等均购自p r o m e g a 公司： 1 4 r n a 纯化试剂盒( r n e a s ym i n e l u t ec l e a n u pk i t ) 购自q i a g e n 公司： 1 5 吗啉修饰的反义寡核苷酸( m o r p h o l i n o ) 由g e n et o o l s 公司化学合成； 1 6 原位杂交相关试剂：地高辛标记的核糖核苷酸混合物( d i gr n al a b e l i n g m i x ) 、封闭试剂( b l o c k i n gr e a g e n t ) 、耦联碱性磷酸酶的抗地高辛抗体 ( a n t i d i g o x i g e n i n - a pf a bf r a g m e n t s ) 、显色试剂( b mp u r p l ea ps u b s t r a t e ) 等均购自r o c h e 公司；色素抑制剂苯脲胺n - p h e n y l t h i o u r e a ( p t u ) 、肝素 ( h e p a r i n ) 、酵母t r n a 、蛋白酶k 、马来酸( m a l e i ca c i d ) 、小羊斑清、d e p c 、 左旋咪唑、多聚甲醛( p f a ) 、甲酰胺等均购自s i g m a 公司； 1 7 溴化乙锭( 髓) 购自f u l k a a g c h 公司； 1 8 酚、氯仿、异戊醇等各类有机试剂和n a c l 等无机试剂均购自上海试剂厂； 1 9 质粒转化受体菌d h s c t 由本实验室提供。 实验方法 1 斑马鱼品系及繁育 本实验室所用的斑马鱼( d a n i or e r i o ) 均为a b 品系，由清华大学生物技术系 孟安明教授惠赠，本实验室繁殖培育。 斑马鱼胚胎、幼鱼及成鱼一般都在2 8 c 左右养殖水中培养，p h 7 0 ，饲养室 8 复旦大学硕士论文斑马鱼外分泌胰牖特异性转录凼子胁叫的克隆、表达和功能研究 设定1 4 j 、时光照，1 0 小时黑暗的模拟日夜循环，每天分早、中、晚三次投喂饵料。 胚胎在9 c m 培养皿中用h o l f r e t e r 液培养。4 - 5 天时将从绒毛膜中孵化出的幼鱼转入 稍大的器皿，喂以草履虫( p a r a m e c i u m ) ，每天两次，平均每次每条鱼喂0 5 1 m l 。 大约6 天后，加喂丰年虫( b r i n es h r i m p ) ，当所有幼鱼都开始吃丰年虫时，可停 喂草履虫。三周后幼鱼可转入循环水系统，并继续喂以丰年虫。六周后幼鱼可开 始加喂剪碎的红血虫，并逐步过渡至完全以红血虫为食。胚胎所处的发育时期按 照特定的形态特征和受精后的时间来确定( k i m m e le ta 1 1 9 9 5 ) 。 h o l f r e t e r 液的配制：k c l 0 1 9 c a t 0 3 0 2 3 5 9 n a h c o ；0 4 9 n a c i 7 9 溶于8 0 0 m l 去离子水中，浓盐酸调p h 值到6 5 7 0 ，补充去离子水至1 l 。 2 斑马鱼基因组n n a 的制各 将一条成鱼用手术剪刀尽可能的剪碎，直至稀泥状。 在5 0 m l 塑料管里准备好抽提缓冲液( e x t r a c t i o nb u f f e r ) 。大约1 9 材料1 0 m l 或者每体积剪碎的鱼1 0 体积的抽提缓冲液。 缓慢的将泥状物加入抽提缓冲液中，摇动淹没材料。5 0 温育过夜。 冷却至室温，用等体积的平衡酚抽提两次。轻柔混合直至产生乳液状， 3 0 0 0 - 5 0 0 0 9 离心1 0 分钟。小心用粗口移液管移出水相。 第三次用酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提，离心，将水相移到一个新管 子中，加入n a c i 至终浓度为2 0 0 m m 。慢慢延管壁加入2 体积的乙醇。轻柔 涡旋管子直至溶液充分混合。d n a 立刻形成肉眼可见沉淀。 用吸管移出沉淀d n a 并移至装有7 0 乙醇的管中。让d n a 在7 0 乙醇中 停留5 分钟。偶尔用吸管轻轻晃动。 离心管子5 0 0 0 9 x 5 分钟沉淀d n a 。然后尽量多的移出乙醇。使d n a 空气干 燥5 分钟，至可见的乙醇痕迹挥发。 在合适体积的含1 0 r a mt r i s ( p h 8 ) ，5 m me d t a 和1 0 0 u g m l r n a s e a ( d n a s e f j e e ) 的缓冲液中重悬d n a ( 每克起始材料5 - 1 0 m 1 ) 。基因组d n a 很难重悬， 需要几个小时，将溶液放入3 7 中并不时涡旋。 用酚：氯仿：异戊醇抽提一次d n a 溶液，并将水相转入一个新管中。 加入0 1 体积的7 5 m 氯化铵并覆盖2 体积乙醇。缓慢地颠倒管子沉淀d n a 直至混合充分。重复步骤6 和7 。在7 0 乙醇中冲洗两次。 9 复旦大学硕士论文斑马鱼外分泌胰腺特异性转录因子觚蚵的克隆、表达和功能研究 用d h 2 0 重悬d n a ，通常每g 起始材料1 - 2 m l 比较好。可以将d n a 溶液加 热到5 0 c 帮助重悬。 在分光光度计上测定2 6 0 n m o d 值以确定浓度。 3 斑马鱼胚胎总r n a 的抽提和e d n a 的合成 ( 1 ) 胚胎总r n a 的抽提：将不同时期的胚胎用镊子剥除卵膜，按每管约7 0 8 0 枚胚胎装入1 5 m l 离心管中，加入l m lt r i z o l ，用i m l 注射器剧烈抽打至溶液透明 后，室温静置5 r a i n 。加a 2 0 0 u l 氯仿，剧烈振荡混匀3 0 s ，室温离，g , 1 2 0 0 0 r p m ，5 r a i n 。 将上清液小心转入d e p c 处理过的r n a s e - f r e e1 5 m l 离心管中( 不要吸取任何中间 层物质，否则会出现基因组d n a 污染) ，加入等体积异丙醇混匀，室温放置5 m i n 后，离，l ) , 1 2 0 0 0 r p m ，5 m i n 。小心移去上清液，防止沉淀丢失。用7 0 乙醇洗两次， 每次l m l ，室温离, g 1 2 0 0 0 r p m ，2 m i n 。尽可能彻底吸去上清，防止丢失沉淀。室 温下将乙醇空气干燥，加3 m 5 0 u ld e p cn 2 0 溶解。取2 u l 电泳检测r n a 员量，分 光光度计测定r n a 浓度，- 7 0 保存。 ( 2 ) c d n a 的合成：取l u g 总r n a 作为模板逆转录产生第一链c d n a ( 2 5 m 体 系) 。 鲥r n a m g o l i g od t1 皿 + 7 2 c 变性5 - 1 0 r a i n ，置冰上骤冷 r n a s e - f r e eh 2 0 补足至2 5 m 1j r 5 h 断 驯 加入id n t p ，1 0 m ml m 4 2 ，l h9 9 ，5 m i n 卜1 r n a s ei n h i b i t o r , 4 0 u 0 s i l l c d 量弧链延伸逆转录酶失活 ，_。_。一 l a c 岛1 0 0 l u 埘 + 2 0 保存 4 斑马d _ m s t ic d n a 的全长克隆 将小鼠的m i s t lc d n a 序列在斑马鱼全基因组序列数据库中进行比对 ( h t t p ：w w w e n s e m b l o r g d a a i or e r i o f o l a s t v i e w ) 一，选择一段包含完整编码区的序 列作为预定模板，设计一对跨越整个o r f 的引物，其中上游引物为 5 椰a g t c aag ，i a r g a a g t c c a a a g g - 3 ， 下游引物为 5 - c a t g a g c g l a a g t 从g 1 r g a a c a g 一3 。以成体斑马鱼的基因组d n a 为模 板，用以上引物进行p c r 反应。扩增采用递减( t o u c h d o w n ) p c r 的方法，条件 为：9 6 变性2m i n ，接着进入一个包含3 5 个循环的递减程序，其中第一个循环 为9 4 3 0s ，6 4 3 0s ，7 2 4 5 s ，以后每个循环的退火温度依次降低o 5 ， 1 0 复旦人学硕七论文 斑马鱼外分泌胰腺特异性转录因子m i s t l 的克隆、表达和功能研究 最后7 2 延伸8m i n 。 为得到完整的m i s t le d n a 序列，以2 4 h p f 的斑马鱼胚胎的总r n a 为模板， 进行5 r a c e 和3 r a c e 反应。5 r a c e 使用试剂盒5 f u l lr a c ec o r es e t ，根据 之前产物测序结果，分别设计引物r t 鲥m c r ：5 - ( p ) g t r c i t r a g t g t r g c - 3 ， s 1： 5 - g c r c a g a g g c g t c c g t c a g - 3 ，a 1： 5 - a g c g t a a a g t c t g g g t c g t c c - 3 ，s2： 5 - g g a g a a c a c t g a g a g g c g a g g 3 ， a 2 ： 5 - i b a c c ( 、c t l 卫。c n l i g g a c 耵3 。p c r 反应条件：第一轮为9 4 3 0 s ，5 6 3 0 s ，6 8 l m i n ，3 0 个循环；第二轮为9 4 3 0 s ，5 8 1 23 0 s ，6 8 l m i n ， 3 5 个循环。3 r a c e 使用试剂盒f i r s t c h o i c er i m - r a c ek i t ，根据之前产物测序 结果，分别设计引物o u t e r p r i m e r ：5 - g c t c t t a a a g g g t g a g t r g a a t g c - 3 ， i n n e rp r i m e r ：5 - g g a a t r c g 玎c i b r c a l ac 】r r a c 兀a c g - 3 。两轮p c r 反应 条件相同：9 4 3 0 s ，5 8 3 0 s ，6 8 l m i n ，3 5 个循环。 最后，设计上游引物5 - a c a a a m 叮i ：a 盹a 珂c 兀c g a 诅g g - 3 和下游引 物5 一阳6 g 1 r r 兀a g a 阳w c a c c c c r g 3 ，克隆m i s t l 的全长e d n a 。p c r 反应条件：9 4 3 0 s ，6 4 3 0 s ，7 2 2 m i n ，3 5 个循环。所有p c r 产物均克隆 到p g e m te a s yv e c t o r 上进行测序。 5 测序和生物信息学分析 d n a 测序由英骏( h v i t r o g e n ) ( 中国) 生物技术有限公司和上海生工生物 工程有限公司完成。 m i s t l 基因o r f 的鉴定和蛋白质翻译由n c b i 的在线分析软件o r ff i n d e r 完成 ( h t t v ：w w w n e b i n l m n i h g o v g o r f g o r f h t n f l ) 蛋白结构域分析由n c b i 在线分析软件c d dv 2 1 0 完成 ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v s t r u c t u r e e d d c d d s h t m l ) 。并参考在线蛋白预测分析 站点分析结果( h t t p ：c u b i e b i o e c o l u m b i a e d u p r e d i e t p r o t e i n ) 。 多序列比对和进化树构建及相应图示采用在线软件c h s t a l w v e r s i o n1 8 3 ( h t t p ：w w w e b i a c u k c l u s t a l w ) 完成。 m i s t l 基因的物理位置、外显子和内含子组成形式等相关信息，是通过将 e d n a 序列在斑马鱼全基因组序列数据库中进行比对获得的 ( h t t p ：a v w w e n s e m b l o r g d a n i or e d o b l a s t v i e w ) 。 6 r t - p c r ( v 析 收集发育分别处于单细胞、8 细胞、1 2 8 细胞、1 k 细胞、半球、3 0 外包、5 0 1 1 复旦大学硕士论文 斑马鱼外分泌胰腺特异性转录因子m i s t l 的克隆、表达和功能研究 外包、盾状、7 5 外包、9 0 外包、尾芽、6 体节、1 4 体节、2 1 体节、2 4 h # 、 3 0 h p f 、3 6 h p f 、4 8 h p f 、7 2 h p f 、4 d p f 、5 d p f l 对期的斑马鱼胚胎，抽提总r n a ，然 后逆转录产生第一链e d n a ( 方法参见本部分3 中所述) 。 设计一对在m i s t l 基因组序列上跨越内含子的引物，上游引物为 5 - a t c g c 】陀兀g a 蚺g g c 】f c r r a t 3 ，下 游引物为 5 - a g g c a t r g t r g a g t r t g t g c a t c c - 3 ，用来扩增一段3 8 4b p 的m i s t l 转录物。 p c r 反应条件为：9 5 变性3 r a i n ；9 4 3 0 s ，6 4 3 0 s ，7 2 l m i n ，3 5 个循环； 最后7 2 c 延伸8 m i n 。同时平行扩增一段4 7 5b p 自够a c t i n 序列作为内源参照( i - 游 引 物5 - a t g g a t g a t g a a a l l 略c c g c a c - 3 ， 下游引物 5 叫蛇c a t c a c c a g a g ，i c a l a c g 3 ，) 7 吗啉修饰的反义寡核苷酸( m o r p h o l i n o ( m o ) ) ( 1 ) m i s t l m o 的序列为：5 - t r g a c c c c t t r c c l q t g g a c i t c a t - 3 ，作为 标准对照的o l i g o 的序列为：5 c c t c i t a c c t c a g ，兀a c a a m ：a t a 3 。m o 根据碱基配对原则，与目的基因的特异性序列结合，一般位于翻译起始位点的 7 5 叶2 5 。由g o n et o o l s 公司提供的合成好的寡核苷酸是定量、无菌、无盐的冻 干固体。在其中加入r n a s e f r e eh 2 0 配制成l m m 的储存液，分成