（遗传学专业论文）人类部分新基因的克隆及功能初步分析.pdf

塞呈查堂堕主芏堡堡奎一 摘要 人类基因组计划( h u m a r lg e n o m ep r o j e c t ，h g p ) 是当今生命科学领域内的头号工程，其 主要目的是测定人类基因组d n a3 x 1 0 9 核苷酸的序列，并确定全部的7 0 ，0 0 0 至1 0 0 ，0 0 0 个 基因。从类基因组序列的测定即将完成但基因的鉴定及功能阐明仍然是一个巨大的挑战矽 、 全长c d n a 的克隆和测序将直接导致基因的发现，并有助于基因功能的研究。 富含全长c d n a 的高质量e d n a 文库的构建对于全长c d n a 的克隆至关重要。从本实 验室构建的高质量e d n a 文库中，通过高效差减杂交及大规模e d n a 测序，筛选到一批全 长新基因，部分新基因已登录到g e n b a n k 。 将从c d n a 文库中克隆到的部分新基因和已知功能基因制各成基因芯片，运用基因芯 一，一 片对正常人肝和肝癌组织基园表达差异进行了研究。 细含有1 2 。8 0 0 个基因的芯片对6 例肝 、 癌标本与正常肝进行了差异表达谱分析，发现1 9 9 个基因在肝癌中表达上调，1 , 6 3 3 个基 因在肝癌中表达下调。在表达上调或下调的总共1 , 8 3 2 条基因中，9 7 的基因在3 例或3 例以上的病例中均表现为上调或下调。这些在不同病例标本中表达上下调变化高度一致的 基因包括编码蛋白在过氧化物酶体、血清调控、多环芳香烃( p a l - i ) 的致癌效应、细胞生 长分化、转移、免疫系统功能、凋亡以及细胞骨架重建等中起作用的基因，这些在基因组 水平上鉴定出来的在肝癌组织中特异性差异表达的基因，对于肝癌分子基础的研究、诊断 和预防起积极的指导作用。一l i 本文还对从c d n a 文库中克隆到的两条全长新基因进行了鉴定和初步的功能分析。其 中一条为全新的人类p k i 基因，它编码的蛋白与人的p k i c c 和p k 坤基因编码蛋白氨基酸同 源性分别为3 0 和2 3 ，与小鼠p k i l 3 基因编码蛋白氨基酸同源性高达7 4 。该基因编码 一一 、 蛋白具有p k i 蛋白共有的两个保守氨基酸序列一即抑制p k ac 亚基活性有关的底物类似 物位点及出核信号。将该基因克隆到原核表达载体，在大肠杆菌中得到高表达。原核表达 蛋白活性测定表明，该蛋白对p k ac 亚基磷酸转移酶活性有较强的抑制作用。因此将该基 因命名为人的p n b 基因。n o r t h e r n 杂交显示，该基因有0 7 k b 、i 4 k b 和1 s k b 三种不同 长度的转录本，在不同组织中，转录本的种类和表达量有较大差异。应用r h 方法，将该 基因定位在人6 号染色体6 q 2 1 q 2 2 区段的d 6 s 3 0 4 和d 6 s 1 7 1 2m a r k e r 之间。、) 另一条新基因为人的环胞菌素a 亲合素( c y c l o p h i l i n ，c y p ) 蛋白家族的一个新成员， 经国际命名委员会同意，该基因命名为c y c l o p h i l i n 1 i k eg e n e ( p p i l 3 ) 。p p i l 3 基因有两种可 变剪切体( p p i l 3 a 和p p i l 3 b ) ，两种剪切体编码蛋白与线虫的c y p 1 0 蛋白同源性分别为5 2 和7 2 。p p i l 3 基因由8 个外显子组成，在基因组上的跨度达1 8 k b 以上，位于染色体2 q 3 3 的s t s m a r k e rs t s g 2 7 6 2 和s h g c 3 0 7 4 之间。n o r t h e r n 杂交只在气管中检测到一条长约1 7 k b 的条带，r t p c r 发现p p l l 3 在所有检测的组织中广泛表达，在不同组织中，其两种剪 切体表达各不相同。p p l l 3 b 表达的重组蛋白经活性鉴定表明，与其他c y p 蛋白相似，它也 具有依赖于c a 2 + m g z 的核酸酶活性，其核酸酶活性可被一定浓度的k * n a + 抑制，推测 p p i l 3 b 在细胞凋亡过程中起着一定的作用。寸 ， 2 堡呈盔兰堡主芏垡堡兰 a b s t r a c t t h eh u m a ng e n o m ep r o j e c t ( h g p ) i st h ef i r s t b i g b i o l o g yp r o j e c tt h a t h a se v e rb e e n u n d e r t a k e n ，i ta i m st os e q u e n c et h e3 x 1 0 9b pn u c l e o t i d es e q u e n c eo f h u m a ng e n o m e a n di d e n t i f y a 1 1t h ee s t i m a t e d7 0 ，0 0 0 10 0 ，0 0 0g e n e s a l t h o u g hs e q u e n c i n go f t h eh u m a ng e n o m ew i l ls o o nb e c o m p l e t e d ，g e n ei d e n t i f i c a t i o n a n da n n o t a t i o nr e m a i n sac h a l l e n g e i d e n t i f y i n ga n ds e q u e n c i n ga s e to ff u l l 1 e n g t hc d n a st h a tr e p r e s e n ta l lh u m a ng e n e sw o u l dh e l pi nb o t hg e n ed i s c o v e r ya n d f u n c t i o n a la n a l y s i s c o n s t r u c t i n gah i g h - q u a l i t ye d n al i b r a r yw i t hg o o dr e p r e s e n t a t i o no ff u l l l e n g t hc d n a s i s v e r yi m p o r t a n tf o rf u l l l e n g t he d n ac l o n i n g f r o mah i g h q u a l i t ye d n al i b r a r yc o n s t r u c t e db y o u rl a b o r a t o r y , w eh a v eo b t a i n e dt h o u s a n d so fh u m a nn e wf u l l - l e n g t hc d n a sb yh i g h e f f i c i e n c ys u b t r a c t i o na n dl a r g e - s c a l ec d n as e q u e n c i n g s o m e o ft h en e w f u l l l e n g t hc d n a s h a v eb e e ns u b m i t t e dt ot h eg e n b a n k p a r to f t h ef u l l l e n g t ha n dp a r t i a le d n a s r e p r e s e n t i n gk n o w n ，n o v e la n d c o n t r o lg e n e sc l o n e d f r m nt h ee d n al i b r a r yw a su s e dt oc o n s t r u c te d n am i c r o a r r a y s m i c r o a r r a ya n a l y s i so na g e n o m i cs c a l e w a su s e dt o p r o f i l ec h a n g e si ng e n ee x p r e s s i o na c c o m p a n y i n gh e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a s i xp a t i e n t sw e r es c r e e n e df o re x p r e s s i o no f1 2 ，8 0 0h u m a ng e n e s ，l e a d i n gt ot h e i d e n t i f i c a t i o no f1 9 9g e n e sw i t he l e v a t e de x p r e s s i o na n d1 , 6 3 3g e n e sw i t hr e d u c e de x p r e s s i o ni n t h ec a n c e r o u st i s s u e s g r e a t e rt h a n9 7 o f t h e1 , 8 3 2g e n e sw i t ha l t e r e de x p r e s s i o nw e r ei d e n t i f i e d i nt h r e eo rm o r eo ft h ep a t i e n t se x a m i n e d t h i sh i g h l yc o n c o r d a n te x p r e s s i o np r o f i l ei n c l u d e d h u m a n g e n e se n c o d i n gp r o t e i n si n v o l v e di nt h ef u n c t i o no f p e r o x i s o m e s ，s e r u mc o n t r o l ，p o l y c y c l i c a r o m a t i ch y d r o c a r b o n ( p a h ) c a r c i n o g e n e s i s ，c e l lg r o w t ha n dd i f f e r e n t i a t i o n ，m e t a s t a s i s ，t h e f u n c t i o no ft h ei m m u n es y s t e m ，a p o p t o s i s ，a n dr e m o d e l i n go ft h ec y t o s k e l e t o n t h e n e w l y i d e n t i f i e dg e n e sa f f o r daq u a n t i t a t i v ev i e wo ft h ec h a n g e st h a ta c c o m p a n yl i v e rc a n c e ra tt h e g e n o m i cl e v e l ，e n a b l ed e e p e ri n s i g h t si n t ot h em o l e c u l a r b a s i so f d i s e a s e ，a n dp r o v i d ea ne x t e n s i v e l i s to f p o t e n t i a le a r l y - o n s e t m o l e c u l a rm a r k e r sf o ri m p r o v e d d i a g n o s i s t w on o v e lg e n ec l o n e df r o mt h ee d n al i b r a r yw e r ei d e n t i f i e da n dp r e l i m i n a r i l ya n a l y s i s o n ei sp k l l 3 ( t h epf o r mo ft h ec a m p d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ei n h i b i t o r ) g e n e t h ed e d u c e d a m i n oa c i ds e q u e n c eo ft h eh u m a n p r d l 3s h o w e d3 0 i d e n t i t yt oh u m a np k i c 2 3 i d e n t i t y t oh u m a n p k i ya n d7 4 i d e n t i t yt om u r i n ep p r e s i d u e si m p o r t a n tf o rt h eh i9 1 1a f f i n i t yo f p k l sa sw e l la sf o rn u c l e a re x p o r to ft h ec a t a l y t i c ( c ) s u b u n i to fc a m p - d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s e ( p k a ) w e r e f o u n dt ob ec o n s e r v e di nh u m a n p k i l 3 u s i n g ab a c t e r i a e x p r e s s i o nv e c t o r 3 复旦大学博士学位论文 c o n s t r u c t e dt os y n t h e s i z et h ec o m p l e t es e q u e n c eo ft h eh u m a np k i f 3h a sp r o d u c e dh u m a n p k i l 3p r o t e i nw i t hh i g hp u r i t y , w h i c hi n h i b i tp h o s p h o t r a n s f e r a s ea c t i v i t yo fcs u b u n i ti nv i t r o n o r t h e r nb l o ta n a l y s i ss h o w e dt h a tt h r e es i z e so fh u m a np r h f lm e s s a g e sw e r ed e t e c t e d ：0 7 一 k b ，1 4 - k ba n d1 8 一k b t h e i re x p r e s s i o nl e v e l sv a r i e di nd i f f e r e n tt i s s u e s b yr a d i a t i o n 埘b r i d p a n e lm a p p i n g ，t h eh u m a np 酗8g e n ew a sl o c a l i z e d t oc h r o m o s o m e6 q 2 1 - q 2 2b e t w e e n m a r k e r sd 6 s 3 0 4a n dd 6 s 1 7 1 2 t h eo t h e rn o v e l g e n ei d e n t i f i e d i san e wn u m b e ro ft h eh u m a nc y c l o p h i l i n f a m i l y i n a g r e e m e n tw i t ht h eh u m a ng e n o m eo r g a n i z a t i o n ( h u g o ) n o m e n c l a t u r ec o m m i t t e e ，t h e g e n eh a sb e e n n a m e d p e p t i d y l p r o l y li s o m e r a s e ( c y c l o p h i l i n ) - l i k e3 ( a p p r o v e ds y m b o l ，p p i l 3 ) p p i l 3g e n eh a v et w os p l i c i n gv a r i a n t s ( p p i l 3 aa n dp p i l 3 b ) e n c o d i n gt w op r o t e i n sw h i c h s h o w5 2 a n d7 2 i d e n t i t yt ot h ec y c l o p h i l i ni s o f o r m10o fc e l g a n s ，r e s p e c t i v e l y t h e p p i l 3g e n ew a si d e n t i f i e do nac o m p l e t e l ys e q u e n c e db a c ( g e n b a n ka c c e s s i o na c 0 0 5 0 3 7 ) f r o mc l r o m o s o m e2 q 3 3b e t w e e ns t sm a r k e rs t s g 2 7 6 2 ( p r o x i m a l ) a n ds h g c ，3 0 7 4 ( d i s t a l ) ， o r i e n t e dt o w a r dt h et e l o m e r e p p i l 3g e n ec o n s i s t e do f8e x o n ss p a n n i n gm o r et h a n18k bo f g e n o m i cd n a r t - p c ra n a l y s i si n d i c a t e dt h a tp p i l 3w a su b i q u i t o u s l ye x p r e s s e di na d u l t h u m a nt i s s u e s a c t i v i t y a n a l y s i s o ft h er e c o m b i n a n tp p i l 3 bp r o t e i ns h o w st h a tp p i l 3 b p r o t e i nh a sn u c l e a s ea c t i v i t y t h en u c l e a s ea c t i v i t yo fp p i l 3 bp r o t e i ni ss t i m u l a t e db yc a 2 + a n d o rm g ”a n di n h i b i t e db yk + n a * ，t h e s ed a t as u g g e s tt h a tp p i l 3 bm a yb ei n v o l v e di n d e g r a d a t i o no f t h eg e n o m ed u r i n ga p o p t o s i s 4 、；蠢，l 重星盔兰堕：! ：堂堡垒奎一 第一章人类新基因的克隆和筛选 摘要 人类基因组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ，h g p ) 是当今生命科学领域内的头号工程，其 主要目的是测定人类基因组d n a3 x 1 0 9 核苷酸的序列，并确定全部的7 0 ，0 0 0 至1 0 0 ，0 0 0 个 基因。全长c d n a 的克隆和测序将直接导致基因的发现，并有助于基囚功能的研究。 富含全长c d n a 的高质量e d n a 文库的构建对于全长e d n a 的克隆至关重要。从本实 验室构建的高质量e d n a 文库中，通过高效差减杂交及大规模e d n a 测序，筛选到一批全 k 新基因，部分新基因已登录到g e n b a n k 。为进一步的基因功能研究和基因表达谱芯片制 备打下了良好基础。 a b s t r a c t t h eh u m a ng e n o m ep r o j e c t ( h g p ) i st h e f i r s t b i g b i o l o g yp r o j e c tt h a th a se v e rb e e n u n d e r t a k e n ，i ta i m st os e q u e n c et h e3 x i 0 9 b pn u c l e o t i d es e q u e n c eo f h u m a ng e n o m ea n di d e n t i f y a 1 1t h ee s t i m a t e d7 0 ，0 0 0 - 1 0 0 ，0 0 0g e n e s i d e n t i f y i n ga n ds e q u e n c i n gas e to f f u l l 1 e n g t hc d n a s t h a tr e p r e s e n ta 1 1h u m a n g e n e sw o u l dh e l pi nb o t hg e n ed i s c o v e r ya n df u n c t i o n a la n a l y s i s c o n s t r u c t i n gah i g h - q u a l i t ye d n al i b r a r yw i t hg o o dr e p r e s e n t a t i o no f m 1 1 1 e n g t hc d n a s i s v e r yi m p o r t a n tf o rf u l l - l e n g t he d n a c l o n i n g f r o mah i g h - q u a l i t ye d n a l i b r a r yc o n s t r u c t e db y o u r l a b o r a t o r y , w eh a v eo b t a i n e dt h o u s a n d so fh u m a nn e wf u l l - l e n g t hc d n a sb yh i g h e f f i c i e n c ys u b t r a c t i o na n dl a r g e - s c a l ee d n a s e q u e n c i n g s o m eo f t h en e wf u l l 1 e n g t he d n a s h a v eb e e ns u b m i t t e dt ot h eg e n b a n kt h i sw o r kl a i d as o l i df o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e r f u n c t i o n a lg e n o m i c sr e s e a r c ha n d e x p r e s s i o nc d n am i c r o a r r a yc o n s t r u c t i o n 5 堑兰查兰堕主兰垡堡羔一 前言 人类基因组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ，h g p ) 是继阿波罗登月计划之后的又一项伟大 科学计划，其主要目的是阐明人类基因绢d n a3 1 0 9 核苷酸的序列，发现所有人类基因并 阐明其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息 】1 。自1 9 9 0 年启动以来，h g p 已取得了 巨大进展1 2 1 ，目前人类基因组计划的“工作草图”已绘制完成，它涵盖了人类基因组9 7 的d n a 序列，其中8 5 已经正确排序，人类基因组计划将比预期提前完成。 与此同时，大规模c d n a 克隆和测序也已经广泛开展。m r n a 是生物基因组中基因表 达的信使，通过它可翻泽出基因编码的蛋白质而执行基因的生物功能。m r n a 经逆转录酶 可复制出与其完全互补的d n a 链，即e d n a 。c d n a 代表了人类基因组中最有用的信息， 而其碱基数总量只有人类基因组的约1 1 1 5 ，因而e d n a 序列的测定不失为种快速而有效 的寻找新基因的方法。目前e d n a 计划在技术上主要有两大线路：一是e s t 策略：二是全 长= e d n a 的克隆和测序。 e s t 策略是1 9 9 1 年由v e n t e r 等人提出来的。e s t ( e x p r e s s i o ns e q u e n c et a g ) 是从随机挑 取的e d n a 克隆的末端测得的序列，由于每个克隆只测末端，因而易于实行自动化和大规 模测序。近儿年来，公共数据库中的e s t 数量急剧增长。目前g e n b a n k 中人的e s t 数已 超过2 0 0 万。犬量的e s t 对于发现新基因、确定基因的功能、差异和定量表达谱分析、构 建转录图等都有重要价值1 ”】。但由于e s t 只是全长e d n a 的部分片段，要准确预测基因 产物的结构和功能或是要得到蛋白产物都需要全长e d n a 。 当前c d n a 测序的总趋势，由对部分片段( 即e s t ) 的随机测序，转向全长c d n a 的 克隆和测序。人的总共大约十万条基因中，目前公开库中只有几千条基因的全长e d n a 。 随着人类基因组计划的进展，全长e d n a 的克隆越来越受到重视。n i h 前不久刚提出一项 新的克隆雨i 测定哺乳动物全长e d n a 的计划一t h em a m m a l i a ng e n ec o l l e c t i o n ( m g c ) p r o j e c t l 8 1 。其主要技术路线为：c e l l l i n eo rt i s s u e - - h i g hq u a l i t ym r n a - - - e d n al i b r a r y c o n s t r u c t i o n - - t5 a n d3 r e a d so f4 x 9 6c l o n e s - - + e v a l u a t ef o rf u l ll e n g t ha n dc o m p l e x t y - - a r r a yl i b r a r y - - + 5 a n d 3 r e a d so f5 0 0 0c l o n e s _ f u l l l e n g t hc a n d i d a t e s - - + c l o n y p u r l f y - + c o n f i r m a t o r y5 r e a d - f u l l - i n s e r ts e q u e n c i n g 。 全长e d n a 策略的一个关键问题是全长e d n a 文库的构建问题。经典的构建e d n a 文 库的方法有很多，但最大的缺点是文库中克隆片段长度一般较小，不易得到完整的e d n a ， 特别是对于有些较长的基因更是如此卜”】。为了建立富含全长e d n a 的文库，人们发明了 很多利用m r n a 5 末端的“帽子”结构来构建全长e d n a 文库的方法。 1 9 9 4 年，m a r u y a m a 利用m r n a 5 末端“帽子”结构的特点发明了o l i g o - c a p p i n g 技 6 基、i ；簸纛 型型堡壁箜婆一 荆一。设方法首尤利h j 细曲碱性磷酸酶( b a p ) 处理m k n a ，非全长m r n a 在b a p 作用 f ，5 ，磷酸基团被去除，而含幅结构的全长m r n a 的5 端结构保持完好，然后，再加以焦 磷酸酶( t a p ) 处理，使全长m r n a 5 端帽结构处的焦磷酸水解，仅保留一个磷酸基团， 1 是，原先带有帽结构的m r n a 分子其5 端保留有磷酸基团，而原先部分降解的m r n a 则其5 端为羟基。通过合成段r n a - - o l i g o ，用t 4 连接酶连接到去除5 磷酸的o h 一上， 继而利用锚定的o l i g o ( d t ) 作逆转录引物，并进行p c r 反应，然后克隆到载体上。k a t o 等 人首先采用o l i g o c a p p i n g 方法，结合o k a y a m a 与b e r g 的v e c t o r - p r i m e 及e d n a 第二链的 置换合成法构建c d n a 文库，得到的文库平均长度12k b 左右 1 4 ) 。o l i g o c a p p i n g 方法理论 上只有那些带帽结构的m r n a 才能被合成出双链c d n a 来。但实际操作中，m r n a 须经 过多次酶处理，雉以保证不发生降解，同时，r n a 酶的连接效率也难以保证。 1 9 9 4 ，c l o n t e c h 公司推出一种构建高比例全长c d n a 文库的方法c a p f i n d e r c d n a l i b r a r yc o n s t iu c t i o n ，又称为s m a r t ( s w i t c hm e c h a n i s ma tt h e 5 e n do fr n a i e m p l a t e s ) c d n a l i b r a r yc o n s t r u c t i o n 方法j 。该方法也是利用m r n a5 帽子结构特征，合成一段在3 端带连续三个鸟嘌呤g 的o l i g o 作为c a ps w i t c h ( s m a r t 引物) ，当c d n a 第一链合成到 帽子结构处时，由于逆转录酶的末端转移酶活性，在其末端加上3 个连续的胞嘧啶c ，这 3 个c 可与s m a r t 引物3 端的3 个鸟嘌呤g 配对并延伸到s m a r t 引物的5 端。c d n a 第二链利用基于s m a r t 寡核营酸的引物和逆转录引物p c r 合成。由于c d n a 第一链加c 的效率依赖于m r n a 的5 帽结构，而在非全长的m r n a5 端加c 的效率大大降低，因而， 理论上能保证文库中全长基因大大富集。该方法还具备利用极其少量的m r n a 建库的优 点，操作相对o r i g o c a p p i n g 技术简单重复性好，但无论是o l i g o c a p p i n g 技术还是s m a r t 文库技术，都利用了p c r 扩增技术，理论上会产生由于p c r 或其它原因导致的表达谱的 偏移( b i a s ) 或冗余性( r e d u n d a n c y ) 。 1 9 9 5 年，e d e r y 等人利用“帽结合蛋白”专门结合含有完整帽子结构的m r n a ，称为 c a p t u r e ，辟jr n a s e a 消化未被c a p 结合蛋白结合的“部分降解”的不完整的m r n a ，然 后建库，获得的克隆全长比例较高6 1 。该方法缺点是需大量的m r n a ，另外，c a p 结合蛋 白结合的5 端约1 0 - 5 0 b p 被丢失。 1 9 9 7 年，c a m i c ip 等又报道c a pt r a p p e r 的方法【” ，其原理是用碘酸盐标记5 的末端 甲基化的g ，然后用免疫磁珠法分离出并富集逆转录后全长的c d n a 进行建库。标记的方 法是根据5 末端帽结构上的甲基化的g 有2 、3 两位邻近、o h 基团，可被生物素酰胼作用 并标记上生物索，而进一步被富集分离，作几次连接及扩增即可克隆入载体，结果可以得 到相当长度的c d n a ，并且由于不作p c r 反应，可减少理论上的偏移( b i a s ) 和兀余性 ( r e d u n d a n c y ) 。但该法中m r n a 模板在化学试剂及酶反应体系暴露的时间较民，造成效率 7 蘸疆滤；盛 复黾大学博士学位论文 的降低，另外娟t r n a 封闭吸附用的柱子，也可造成一些非特异的污染。 m r n a 复杂的二级结构是构建富含全氏e d n a 的文库的一个障碍。复杂的二级结构常 导致逆转录反应的提前终止。变性m r n a 模板、提高逆转录反应温度是两个可能的解决方 案。曾经有人尝试用热变性和加入氢氧化甲基汞先打开m r n a 二级结构然后逆转录来建 库，但效果并不理想。提高逆转录反应温度以降低m r n a 二级结构，提高全kc d n a 的合 成效率，是人们努力的一个方向。但常规的逆转录酶如m m 0 v 和a m v 等的最适反应温 度都在3 7 4 2 。c 之间，无法耐受解开m r n a 二级结构的高温条件。有人_ 肆；lt t h 耐热d n a 聚合酶的耐热性乖1 部分逆转录酶活性，在7 0 c 的高温下进行逆转录反应，效果不是太理想， 原因是t t hd n a 聚合酶的逆转录酶活性比m m l v 和a m v 等逆转录酶的逆转录活眭低， 且n hd n a 聚合酶的逆转录酶活性是在m n 2 + 离子存在条件下才具有，但在此条件下m r n a 易降解。 1 9 9 8 年，c a r n i n c i 等报道，一种二糖海藻糖( t r e h a l o s e ) n 以提高某些酶的热稳定性f 热 稳定性，t h e r m o s t a b i l i z a t i o n ) ，对某些酶还可在适当高温下增加酶的活性( 热激活性， t h e r m o a c t i v a t i o n ) 。0 6m 的海藻糖使常刚逆转录酶s u p e r s c r i p ti i 的反应温度从4 2 提高到 6 0 c ，在此温度下可以降低逆转录过程中m r n a 的二级结构，增加全长e d n a ( 尤其对较 长基因) 第链的合成比例m j 。为全长c d n a 文库的构建提供了新的方法。 c d n a 克隆中的技术难点除构建c d n a 文库中全长比例问题外，c d n a 的丰度差异非 常大，造成大量的重复测序。克服和解决这两个难点，将大大加快全民c d n a 的克隆进展。 本实验室从9 7 年底开始进行全ke d n a 的克隆和测序，综合运用了国际上许多先进 的全长c d n a 文库构建技术、基因差减技术和本实验室发明的一些专利技术，构建了胎脑 及其他细织的高质量e d n a 文库，并从这些e d n a 文库中进行新基因的筛选和测序，取得 了较大进展，克隆了几万条u n i g e n e ，其中有几千条为全鹾新基因，为以后的基因功能研究 及基圆芯片的开发和研究打下了良好基础。 l 鑫引漱纛 复旦人学_ 肆上学值论文 1 材料和方法 1 1 材料和试剂 1 11实验材料： 人c d n a 文库：本实验室自行构建。 c d n a 文库印迹用尼龙膜：德国s c h l e i c h e r & s c h u e | i 公司产品。 主要试剂、酶类 p r o t e i n a s ek ，美国s i g m a 公司产品 十二烷基磺酸钠，美国s i g m a 公司产品 各种限制性内切酶，美国b i o l a b s 公司产品 t a q 酶，本实验室产品 b i g - d y ep r i m e r 和b i g - d y et e r m i n a t o r 测序试剂盒，美国p e r k i ne l m e r 公司产品 r e a l t m p r e p9 6s y s t e m 质粒抽提试剂盒，德国q i a g e n 公司产品 m e g a p r i m e r d n a l a b e l l i n gs y s t e m 试剂盒，a m e r s h a m p h a r m a c i a b i m e c h 公司产品 q i a q u i c k p c rp u r i f i c a t i o nk i t ，德国q i a g e n 公司产品 m i c r o s p i ng - 5 0c o l u m n s ，a m e r s h a mp h a r m a c i a b i o t e c h 公司产品 t r i s ：分析纯，德国b o e b r i n g e rm a n n b e i m 公司产品 引物由上海生工生物工程公司合成 a 一”p d c t p ：a m e r s h a m 公司或北京亚辉生物工程有限公司产品。 其他试剂均为国产分析纯 1 1 3 菌株和质粒： 大肠杆菌d h 5 c t ：基因型s u p e 4 4 a l a c u l 6 9 ( ( d 8 0 1 a c z a m l 5 ) h s d r l 7 r e c a l e n d a l g y r a 9 6 t 1 1 i 一1r e l a l 克隆载体：p b l u e s c r i p ts k ( + ) ( s t r a t a g e n e ) 1 1 4 常用试剂： 5 0 t a e ：t r i s 碱2 4 2g 加d d h 2 06 0 0m l 充分溶解，加冰乙酸5 7 1m l 、0 5 m e d t a ( p h = 8 o ) 1 0 0m l ，定容至1l ，分装灭菌。 2 0 x s s c ：在8 0 0m l 水中溶解1 7 53 克氯化钠和8 8 2 克柠檬酸三钠，加入5m o l l n a o h 调节p h = 70 ，加水定容至i 升后高压灭菌。 9 蔼，ii 复旦大学博士学位论文 2 0 s d s ：在9 0 m l 水中溶解2 0 克s d s ，加热至6 8 。c 助溶，加水定容至1 0 0 m 1 。 1m o l lt r i s ( p h 7 5 1 ：在8 0m i 水中溶解1 22 1 克t r i s 碱，冷至室温后加入浓盐酸 调节d h = 75 ，加水定容至1 0 0m l 后高压灭菌。 1 0 0 d e n h a r d t s 溶液：称取1 0 克聚乙烯毗咯烷酮，1 0 克水溶性聚蔗糖，1 0 克小 牛血清白蛋白，加水溶解定容至5 0 0 毫升，过滤除菌，分装于离心管2 0 。c 备用。 预杂交液：2 0 s s c3m l ；1 0 0 d e n h a r d t so 5m h2 0 s d so 2 5m l ；1 01 1 1 9 m l 经 变性并打断的鲑精d n a01m h 1 m o l l t r i s h c i ( p h = 75 ) ：水5 0 5m l 。 主要仪器设备： a b l 3 7 7 型d n a 自动序列分析仪，美国p e r k i ne l m e r 公司产品 g e n e a m p9 6 0 0p c r 仪，美国p e r k y ne l m e r 公司产品 s i g m a9 6 孔板离，心机，f r 2 0 0 ，美国s i g m a 公司产品 e p p e n d o r f5 4 1 5 c 台式高速离心机，德国e p p e n d o k f 公司产品 h i t a c h ih i m a cc r 2 1 型高速冷冻离心机，日本h i t a c h i 公司产品 g e n e q u a n t1 1 型紫外分光光度计，p h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 u l t r o s p e c4 0 0u v v i s i b l es p e c t r o p h o t o m e t e r ，p h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 m i l l i - qa c a d e m i c 超纯水仪，美国m i l l i p o r e 公司产品 s c s 2 4 型温控摇床，上海市离心机械研究所产品 s d j 超净工作台，上海淀山湖净化设备厂产品 f r 一2 0 0 型凝胶成像装置，上海复日生物实验技术研制所 r o b b i n ss c i e n t i f i cm o d e l1 0 0 0 杂交炉，美国r o b b i n s 公司产品 c y c l o n es t o r a g ep h o s p h o rs y s t e m ，美国p a c k a r d 公司产品 d z f 一1 真空干燥箱，上海医用恒温设备厂 同位素检测仪，英国m i n i i n s t r u m e n t sl t d 公司产品 1 1 6 使用的主要生物信息分析工具 g d b 数据库( g e n o m e d a t a b a s e ) ：h t t p ：w w w g d b o r g n c b i ( g e n b a n k ，d b e s t