（发育生物学专业论文）过量表达cdpk9对拟南芥耐逆性的影响.pdf

山东师范大学硕士学位论文 中文摘要 c d p k ( c a l c i u md e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ) 是在植物中首先发现的一种钙 依赖型蛋白激酶，属于s e r t h r 型蛋白激酶，分子量4 0 9 0 k d a ，m g ”是该酶的重 要辅因子。该蛋白质在其氨基端有一个激酶活性域，在其羧基端有一个类似c a m 的结构区域，在两者之间还有一个自我抑制域。当类似c a m 的结构域上的钙离子 结合位点与c a 2 + 结合后，抑制被解除，酶即被活化。钙离子是细胞信号转导中重 要的第二信使，c d p k 作为钙离子的受体蛋白和效应蛋白在信号转导过程中起着关 键的作用。 c d p k 家族在调节信号转导中具有多样性和可选择性。近年来通过对拟南芥、 水稻等植物研究表明c d p k 家族有多个成员，其中拟南芥含有1 2 个亚家族3 4 个成 员，水稻有2 7 个成员( h a r p e re ta 1 ；2 0 0 4 ) ，而且它们大多与逆境信号转导有 关。已经证实，拟南芥a t c d p k l 基因和a t c d p k 2 基因在于旱和盐诱导条件下，表 达量增强( u r a oe ta 1 ，1 9 9 4 ) ；另外，s h e e n ( 1 9 9 6 ) 证实拟南芥a t c p k i o 和 a t c p k 3 0 参与了对a b a 和非生物胁迫的信号转导。 盐芥是一种与拟南芥近缘的十字花科植物，具有很多与拟南芥相同的优点： 如类似的形态、小的基因组、短的生活史、丰富的种子和易于被转化等。但是， 盐芥对多种胁迫的耐受能力远远高于拟南芥，它在短时间内能耐受高达 5 0 0 m 删a c l 的冲击，在盐适应前后既不产生盐腺也没有复杂的形态上的变化，因 此，对盐芥钙依赖的蛋白激酶的功能研究对于阐明植物的抗逆生理机制，揭示植 物的耐逆机理都具有重要意义。 本实验在盐芥e s t 库中得到c d p k 9 套戥虱通过构建过量表达载体，并用农杆 菌介导的花序侵染法侵染拟南芥，得到5 个转基因的纯合株系。c d p k 基因家族 蛋白成员主要存在于植物细胞质膜、叶绿体中，不同的定位与其相应的功能相关。 为了解c d p k 9 的生物学功能，我们首先构建了c d p k g - g f p 融合基因表达载体，并 用农杆菌介导的花序侵染法侵染拟南芥，通过共聚焦显微镜检测对c d p k 9 进行了 初步的亚细胞定位。同时构建了c d p k g - g s t 原核表达载体，在d e 3 大肠杆菌中表 达融合蛋白，通过s d s p a g e 确知该蛋白以包涵体的形式存在另外，分别利用拟 南芥c d p k 9 的全长及n 端特异性较强部分为探针，对得到的纯合的转基因株系 n o r t h e r nb l o t i n g ，可能是由于杂交条件或者提取的r n a 纯度不高的原因，没有 得到理想的杂交条带。 中文关键词：钙离子依赖的蛋白激酶过量表达亚细胞定位原核表达 山东i f f i 范大学碗士学位论文 a b s t r a c t c d p ki sak i n do fc a l c i u m - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e sw h i c hi sf i r s tf o u n di n p l a n t s i tb e l o n g s t os e r t 1 1 rp r o t e i nk i n a s e sf a m i l y ，c d p kh a sam o l e c u l a rw e i g h to f 4 0 9 0 k d a ，m f + w o r k sa si t s a s s i s tm e m b e r 。c d p k sa r cd e f i n e db ya c a r b o x y l - t e r m i n a lc a l m o d u l i n - l i k ed o m a i mm u t a t i o n a la n a l y s i si n d i c a t e st h a tt h e j u n c t i o nd o m a i n , w h i c hj o i n st h ek i n a s ea n dc a l m o d u t i n - l i k ed o m a i n s ，c o n t a i n s 。a n a u t o i n h i b i t o r 1 1 l ec d p kf a m i l yr e p r e s e n t s d i v e r s i t ya n dc h o o s a b l ed u r i n g i t s s i g n a l t r a n s d u c t i o ng m e w a y r e n e e n t l yl o t so fi n v e s t i g a t i o 璐i n t or i c ea n da r a b i d o p s i s r 印r c mt h a tt h ec d p kf a m i l yi sc o m p r i s e do fm u l t i p t e g e n ef a m i l y a r a b i d o p s i s i n c l u d e s1 2s u b f a m i l i e sc o n s i s t e do f3 4m e m b e r s a st or i c e ，2 7m e m b e r s f u r t h e r m o r em o s to f t h e mi n v o l v ei na d v e r s i t ys i g n a lt r a n s d u c t i o n w eh a v ev a l i d a t e d t h ee x p r e s s i o no fa r a b i d o p s i sg e n e sa c d p k la n da t c d p k 2a 托t o n e du pi nd r o u g h t a n ds a l tc o n d i t i o n s ( u r a oc ta 1 ，1 9 9 4 ) i na d d i t i o n , s h e e n ( 1 9 9 6 ) m a k es u l et h a tt h e a r a b i d o p s i sg e n e sa t c p k l 0a n da t c p k 3 0i n v o l v ei na b aa n da b i o l o g i c a ls i 弘a l t r a n s d u e t i o n t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ai sc l o s er e l a t i v et oa r a b i d o p s i sw h i c hi sa l s ob e l o n gt o c r u c i f e m ea n dh a sg o o dg e n e t i cf e a t u r e ss u c h 舔s i m i l a rm o r p h o l o g y , s m a l lg e n o m e s i z e ，s h o r tl i f ec y c l e ，h i 曲s e e dn u m b e ra n da ne f f i c i e n tt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d h o w e v 骶, t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ai sa b l et ow i t h s t a n dd i a n a t i cs a l i n i t ys h o c k 叩t o 5 0 0 r a mn a c i 础sp l a n td o e sn o tp r o d u c es a l t 酉a n d so ro t h e rc o m p l e x m o r p h o l o g i c a la l t e r a t i o n se i t h e rb e f o r eo ra f t e rs a l ta d a p m t i o mt h e r e f o r e ，t h es t u d yo f f u n c t i o no ft h i o r e d o x i n f r o m t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a i s q u i t es i g n i f i c a n t f o r e x p a t i a t i n gp l a n tr e s p o n s e m e c h a n i s mo fo x i d a t i v es l r e s s ，u n d e r s t a n d i n gt h e m e t a b o l i s ma l t e r a t i o na n da d j u s t m e n to fp l a n tu n d e rs t r e s s e sa n de x p o u n d i n gt h e s t r e s st o l e r a n c em e t a b o l i s m n 壕c d p k 9g e n ew a so b t a i n e df r o me s t s ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ) a c q u i r e d 丘o ml z a p - e d n al i b r a r yo ft h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ai no u rl a b t h r o u g ht h ee x p r e s s i o n i nv i t r oa n da c t i v i t ye x p e r i m e n tw et r yt op r o v et h a tc d p k 9d i dh a v ek i n a s e sa c t i v i t y t h ef a m i l ym e m b e r so fc d p k 9e x i s tn o to n l yi nc y t o p l a s mm e m b r a n eb u ta l s oi l l c h l o r o p l a s t , a n dd i f f e r e ml o c a l i z a t i o n sa f f e c tt h e i rp o t e n t i a lf u n c t i o n s b yc o n s t r u c t i n g t h eg f pe x p r e s s i o nv e c t o ro fc d p k 9a n dl a a n s f o r m i n gi ti n t ot h ea r a b i d o p s i s a n t h o t a x y , c d p k 9i sm o s t l yl o c a l i z e di nc y t o p l a s mm e m b r a n eb yl a s e rs c a n n i n g c o n f o c a lm i c r o s c o p e o n l yaf e wf r a c t i o ni sl o c a l i z e di nc h l o r o p l a s t t h es u b c e l l u l a r l o e a 【i z a t i o nr e s u l t sw e r ei na c c o r d a n c ew i t ht h er e 鲫眦o fi p s o r ts o f t w a r e a tt h e s s l n et i m e , t h ec d p k 9 乇对v e c t o rw a sc o n s w a c t e d , a m a l g a m a t i o np r o t e i nw a s e x p r e s s e di nd e 3e c o l ，o u rr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea m a l g a m a t i o np r o t e i nf o r m s i n c l u s i o nd u r i n gi t se x p r e s s i o n b e s i d e s ，b yc o n s t r u c t i n gt h eo v e r - e x p r e s s i o nv e c t o ro f 山东师范大学硕士学位论文 c d p k 9 。w ea t t a i n e d ，l i n e so ft r a n s g e n ea r a b i d o p s i s a n dt h e p h o w p e o f t h e5l i n e sw a s a m l y z 缸b e s i d e s ，w e a l s od i dt h e n o r t h e r n n o t i n g e x p e r i m e n t ，f a l l a c i o u s l y , w ed i dn o tg e tt h eh y b r i d i z es i g n a l so nt h eh y b r i d i z e m e m b r a n e k e yw o r d s ：c d p ko v a e x p r e s s i o n s u b c e l l u l m l o c a l i z a t i o ng s t c a t e g o r y ：q 7 8 1 1 1 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：孝么投t 导师签字： 学位论文版权使用授权书 | 咚j 乏 - 一， 本学位论文作者完全了解堂控有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂控可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：易么瓜t 签字帆唧年6 月7 日 一字：罗z 签字日期：口7 年i 月7 日 山东师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 1 细胞信号转导 植物体的新陈代谢和生长发育主要受遗传及环境变化信息的调节控制。一方 面遗传信息决定着植物体代谢和生长发育的基本模式，另一方面这些基因的表达 及其所控制的生命代谢活动的实现，在很大程度上受控于其所生活的外界环境。 人们将这些复杂的过程称之为细胞信号转导( s i g n a lt r a n s d u c t i o n ) ，包括细胞感 受、转导各种环境刺激( 如干旱、。高盐、养分亏缺等) 、引起相应生理反应的过 程。 近年来，随着植物生理学、细胞生物学、遗传学、发育生物学、分子生物学 等的交叉渗透，在细胞及分子水平阐明各种内外源刺激信号调控细胞生理生化活 动的分子作用机制( 即细胞信号转导机制) 的研究已成为植物科学基础理论研究 的前沿领域。 1 1 信号 信号( s i g n a l ) 简单说来就是细胞外界刺激，又称为第一信使( f i r s t m e s s e n g e r ) 或初级信使( p r i m a r ym e s s e n g e r ) ，包括胞外环境信号和胞阿信号( i n t e r c e l l u l a r s i g n a l ) 。细胞外环境信号和胞间信号与胞内信号分子在功能上是密切合作的。人 们通常把整个细胞外信号( 包括胞外环境刺激信号和胞间信号) 称为第一信使或 初级信使，而把胞内信号分子统称为第二信使( s e c o n dm e s s c n g 盯) 或次级信使， c 2 + 一般被公认为第二信使。 1 2 植物细胞信号转导过程及胞内信使系统 当存在刺激信号时，植物细胞必须能够感受并接受这些刺激，主要由受体来 完成。植物对许多外界刺激作出的反应是通过胞质中游离c a 2 + 浓度变化来传递 的。一系列广泛的信号诸如光、激素、重力、触摸、风、冷、早、氧化胁迫和真 菌都能引起细胞内游离c a 寸浓度的变化。胞质游离钙( 【c a l c y o 的瞬间变化，。是 细胞响应各种刺激信号的初始事态，由此丽诱发以后一系列信号转导的下游事 件。这种钙信号通过钙靶蛋白进行信号转导，钙靶蛋白又通过和其他靶蛋白分子 ( 如各种蛋白激酶等) 结合而启动基因表达，引起植物的应激反应，从而构成钙信 号转导的复杂体系1 川本实验主要以钙离子作为第二信使的钙信使系统为研究 山东师范大学硕士学位论文 对象。 1 3 钙离子与胁迫信号转导 大量研究表明c a 2 + 在众多的植物刺激一反应中作为第二信使，几乎所有不同 的胞外刺激信号，如光、触摸、重力、植物激素、病原菌等，都能引起胞内游离 钙离子浓度( c a ；2 + c ) 短暂的、明显升高，或在细胞内的梯度和区域分布发生变 化。采用c a 2 + 荧光探针o 1 ，l y n c h 等i s 证实，盐胁迫诱导玉米原生质体胞质 中c a 2 + 水平提高，并持续几分钟，这与高温胁迫相似。触摸和冷激在1 5 s 内引起 植物细胞质c a 2 + 水平一个尖峰，缺氧诱导胞质c a 2 + 平的提高达几小时f 9 】。因此， 钙离子在胁迫条件下大多作为一种保护剂而起作用，至于在胁迫条件下，对于引 起胞内钙离子浓度升高的机制，目前有些推测。 c a ) w a n 等【1 0 l 的研究表明，盐胁迫初期，由于细胞失永而使膨压降低，导致 a b a 的分布发生改变，即胞p q a b a , k 平降低和质外体a b a * 平升高。已有的研 究结果指出，质膜外侧和细胞内均有可能存在a b a 受体 i l l 2 。若a b a 作用于质 膜表面的a b a 受体，则被激活的受体可能迸一步作用于结合在质膜上的g 蛋白， 并经后者激活磷脂酶c ，通过肌醇三磷酸系统，刺激胞内c a 2 + 库释放c a 2 + 1 3 。也 有实验结果显示，a b a 可以直接作用于质膜上的非选择性阳离子通道，促进胞 夕b c a z + 流入胞内。而胞内a b a 的可能作用机制是直接影响质膜i - i + - - a t p a s e ( 它在 质膜内侧) 活性，从而一方面直接影响了跨膜质子电化学梯度另一方面通过影 响胞质p h 而使胞内游离c a 2 + 浓度发生变化。如有报道指出，当胞质p h 下降时， 液泡膜上的c a 2 + 通道被打开，向胞质释放c a 2 + 。郝鲁宁和余叔文( 14 1 报道，大麦 幼苗根细胞在盐胁迫初期，其质膜c _ _ , a 2 + - - a t p a s e 对c a 2 的亲和力减小，受c a m 激 活的能力迅速降低，这可能也是提高细胞质c a 2 + 浓度的机银l 之一。 1 , 4 钙靶蛋白 钙信号产生后通过下游相应的钙受体蛋白即靶蛋白产生不同的生理效应。 c a 2 + 信号通过钙靶蛋白进行信号转导。钙靶蛋白通常拥有e 卜- h a n d 结构域，是一 种螺旋一环一螺旋的结构。在拟南芥中估计有大约2 5 0 个推测的e f - _ h a n d 结构域 蛋白。目前，按照e f _ _ h a n d 结构域的数目和组成以及氨基酸序列的同源性，e f b a n d 结构域的钙离子受体在植物中主要分为三类：钙调蛋白( c a l m o d u l i n ， c a m ) 、钙调磷酸酶b 类蛋白( c a i c i i l “r i n - l i k ep r o t e i n s ，c b l ) 、钙离子依赖型蛋 2 山东师范大学硕士学位论文 白质激酶( c a d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a ，c d p k ) l 嘲。在拟南芥中，c a m 、c b l 、 c d p k 这3 类钙离子受体的每一类都被多基因家族注释：1 1 种c a m ，9 种c b l 、 3 4 种c d p k 。为了迸一步检测这些钙离子受体的关系，在氨基酸序列同源性的基 础上建立了一个系统发生的聚类树，结果表明这些钙离子受体形成3 个簇，并且 相比予c b l ，c a m 与c d p k 存在着更密切的联系，这种联系支持了最初c d p k 基 因起源于蛋白质激酶与c a m 的融合的推论【阚。 1 4 1 钙调蛋白( c a m ) c a m 是迄今已证明的分布最广、功能最多、分子结构高度保守的钙靶蛋白。 美籍华入张槐耀等发现了一类能结合钙离子的磷酸二酯酶激活蛋白，进一步研究 发现，这类蛋白具有促进蛋白磷酸化、调控许多酶的活性、微管解聚、神经递质 释放、c a 2 + 的运输等多种功能，而且普遍存在于真核生物中。他将这类蛋白因 子命名为“钙调蛋白”。c a m 氨基酸序列的对比表明了动物和植物存在高度的 保守性( 7 0 一致性) ，植物c a m 有4 个结合c a 2 + 的功能区，从n 一端到c 一端依次 为i 、h 、区。这4 个e f - 咄a n d 结构域分别在n 一和c 一束端区域成对内 伸，形成两个独立的球形区域，中间被一个易变形的中央螺旋隔开，形成哑铃形 结构。c a m 本身无活性，一旦与c a 2 + 结合形成c a m c a 2 + 后，便发生构象变化， 暴露出疏水区，能和依赖于c a m 的靶酶相互作用而调节该靶酶的活性。不同c a ：胂 浓度使钙调蛋白有不同的位点与c a 2 + 结合，产生不同的构象，这种构象发生了变 化的c a m 具有激活能力1 1 7 1 埘。植物和动物的c a m 介导信号传导有许多类似之处。 然而，植物拥有多样的c a m 基因和许多c a m 靶蛋白，近年来，拟南芥基因组课 题的完成和功能基因组学的发展有助于确认和特征化大量的植物c a m 及c a m 靶 蛋白。相对动物而言，在植物系统发育中，c a m 是一种最保守的c a 2 + 结合蛋白， 但每一种植物拥有编码几个c a m 异型的钙调蛋白基因家族。编码c a m 的基因已 从几种植物中分离出来，包括苹果、拟南芥、马铃薯、水稻、小麦及莱因哈德衣 藻等。植物c a m 可以分为3 类，即典型的c a m 、c a m 类似蛋白、c a m 相关蛋白。 拟南芥中7 个典型的c a m ( c a m1 刀，与动物的c a m 高度同源并且相互之间氨 基酸序列有9 5 的同源性【lo - 2 2 1 。 1 4 2 钙调磷酸酶b 类蛋f l ( c b l ) c b l 是植物与动物中钙调磷酸酶的调控b 区同源的一类新的植物特殊钙离 山东师范人学硕士学位论文 子受体家族，钙调磷酸酶作为动物中c a 2 + 信号途径的最初感受因子已经被证实。 在拟南芥中发现的s o s 3 基因所编码的蛋白与酵母钙调磷酸酶b 亚单位同源， s o s 3 可能是盐、水胁迫信号传导途径中c a 2 + 的最初感受因子田- 2 4 ，c b l 在植物中 的作用进一步被确定。每个c b l 通常拥有3 个e f 结构域。最近k u d l a 等从拟南芥 中得到了一种类似钙调磷酸酶b 亚基的蛋白质( a t c b l i ) ，它d q 2 1 3 个氨基酸残基 组成，分子量为2 2 5k d ，与c a m 的相关序列相似性较低。a t c b l i 与来自小鼠 的钙调磷酸酶b 亚基有3 2 一致、5 6 相似，也有c a 2 + 结合域。通过酵母双杂交 系统证明，a t c b l i 与小鼠的钙调磷酸菌a 亚基能相互作用，并能够恢复酵母钙调 磷酸酶b 亚基突变体的盐耐受性。在拟南芥盐胁迫反应中，a t c b l i 表达量增加， 提高了拟南芥的抗逆性，表明a t c b l l 在植物胁迫反应中充当了调节亚基的作用。 a t c b u 与酵母钙调磷酸菌b 亚基相似，n 端也有一段保守的豆蔻酰化位点，通过 豆蔻酰转移酶可使钙调磷酸酶附着在膜上，进一步说明c b l 具有与钙调磷酸酶相 似的功能：即通过位子质膜上的通道调节内向k + n a + 的流动。同时c a m 由附在 质膜上，它可能对钙调磷酸酶起着辅助作用阴。 1 4 3 钙和钙调素依赖的蛋白激酶( c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e 。c d p k ) 蛋白激酶是指能够将y 一磷酸基因从磷酸供体分子上转移至底物 蛋白的氨基酸受体上的一大类酶。磷酸供体可以是a t p ，也可以是其它 类三磷酸核苷酸。根据底物中氮基酸残基的特异性可将蛋白激酶分为蛋 白丝氨酸苏氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶、蛋白组赖精氨酸激酶、 蛋白半胱氨酸激酶、蛋白天冬氨酸谷氨酸激酶。钙依赖型蛋白激酶 ( c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ，c d p k ) 即属于s e t t h r 型蛋白激酶。 c d p k 最初是由h a r m o n 等人从大豆中分离出来，部分纯化的激酶能被徼摩尔 浓度的c a 2 + 激活，但不依赖c a m 和磷脂，在植物和包括疟原虫，寄生虫在内的原 生动物中都有发现【2 坷。随后在苜蓿、苹果和绿藻中也发现了这种蛋白激酶。研 究表明c d p k 广泛存在于各种植物体内，是植物体最大的c a 2 + 调( c a 2 s e n s i t i v e ) 蛋白激酶家族，仅在拟南芥基因组中就有超过4 0 个的家族成员。 1 4 3 ，1 c d p k 结构特点 c d p k 具有三个功能区：n 端的s e r t h r 激酶催化区，能使底物特定部位 的s e r 1 1 l r 磷酸化；c 端是类似于c a m 的调节区，此区与c a m 有约4 0 的同 4 山东师范大学硕士学位论文 源性，有四个e f 手型结构，能与四个c a 2 + 进行结合；中间为自主抑制区由大约 3 0 个左右氨基酸残基组成。当c a 2 + 与c d p k 的c a m 相似区结合后，其分子穴发 生了的构象变化，c a m 相似区折叠过来与上游的自主抑制区相结合，从而压抑 自主抑制，激活c d p k 。 n 催化区连接区调控区 c 罔l典型的c d p k 的结构网 1 4 - 3 2 理化特性及调控 目前c d p k 是植物中研究最多的蛋白激酶。经纯化的c d p k 为单体酶，分子 量4 0 9 0 k d a ，m 9 2 + 是该酶的重要辅助因子鲫。c a 2 + 激活c d p k 是通过与其直接 结合起作用的，组蛋白s 是绝大部分c d p k 的最适外源底物。在植物中已鉴定 出含1 个或多个e f - - h a n d 结构域的c d p k 。生化研究表明，不同的c d p k 同系物有 不同的底物特异性。除此之外，不同的c d p k 同系物受活化时所需的c a 2 + 浓度也 不同，使不同的c d p k 同系物可能转导不同的c a 2 + 信号。此外通过体外检测，鉴 定出的c d p k 下游目的物越来越多，包括保卫细胞的c l - 和k + 通道、豌豆根瘤中 的结瘤素2 6 通道、蔗糖磷酸合成酶、e f 卜a j h 磷脂酰肌醇4 一激酶、质膜质子 泵、硝酸还原酶及b z 口一型转录因子等 糍磷。另外，c d p k 在钙信号过程中生 物功能的发挥，在多层次上受到许多生物大分子的调控。 1 4 3 2 1 磷酸化及去磷酸化的调控 c d p k 家族主要是通过一系列的磷酸化和去磷酸化作用来调节c d p k 底物的 活性完成钙信号的传递过程。另外，还发现有c d p k 的自我磷酸化现象，但往往 自我磷酸化不能实现某些c d p k 的激活。c d p k 的活化也受其他的蛋白激酶所调 控，如烟草n t c d p k 2 的活化既需要钙离子还需要磷酸化，即通过其上游的蛋白 激酶直接磷酸化 3 0 j 。去磷酸化也调控信号通路，一种豆类的磷酸酯酶能够使钝 化的、自我磷酸化形式的w b c d p k l 3 1 l 去磷酸化，由此推测这属于一种失活形式 的激活，或者一种调节方式的反馈。 5 山东师范大学硕士学位论文 1 4 3 2 2 磷脂的调控 生化证据表明，在钙离子存在条件下，某些磷脂可使c d p k 的底物磷酸化 增强2 3 0 倍。对每- - 手 t c d p k 来讲，磷脂所发挥的作用是特异的。一些磷脂在 信号转导中扮演着第二信使的角色，猜测是通过c d p k 发挥作用的。有证据表 明，动物细胞中的蛋白激酶c ( p k c ) 通过d e c p k l 可间接地被磷脂酰丝氨酸所激 活，这在一定程度上说明了在植物细胞中c d p k 与p k c 反应具有一定的相关性 【3 2 1 。 1 4 3 2 31 4 3 - 3 蛋白的调控 在钙离子存在条件下，3 种不同的1 4 3 - 3 蛋白可在体外特异的结合并激活 a t c p k l ，l 禾3 3 蛋白通过结合特异的磷酸化位点调节酶活，在这一过程中自我 磷酸化是需要的，但a t c p k l 的自我磷酸化位点还不是很清楚。在a t c p k i 的n 端发现有一位点，与1 4 3 - 3 蛋白保守的结合序列相似。利用拟南芥信息资源搜 索，只发现a t c p k 2 4 和a t c p k 2 8 在其n 端具有纯化的1 4 3 3 蛋白结合位点1 3 3 1 。 这些结果说明在拟南芥中1 4 _ 3 3 蛋白或许作为c d p k 的调节子发挥作用。 1 4 3 3 生物学功能 c d p k s 作为许多信号通路的调节予，这一结论已经在生化上得以证实，但 具体的每种c d p k 如何作为钙离子感受器而起作用仍然不是很清楚。尽管如此， 针对拟南芥和许多其它植物种类，对其c d p k 生理作用的理解已经得到长足的 进步。 1 4 3 3 1 激素 激素引起的信号反应可带来胞质钙离子浓度的改变，而c d p k s 作为钙信号 感受器发挥作用。c d p km r n a 的积累能够为g a 、a b a 、细胞分裂素【3 4 】、吲哚 3 乙酸p 5 】、油菜素内酯【3 6 1 所诱导。例如，用乙烯和s a 处理能够增加l e c r k i 在番茄叶中的表达。在赤霉素处理过的水稻种子 3 7 1 ，以及经油菜素内酯处理过的 水稻年幼的叶片薄层t 3 均可发现其c d p k 活性的增加。重要的是c d p k s 也能 够在体外激活一些激索应答基因。例如，以大麦为实验对象，在只有a b a 这一 胁迫信号条件下，组成性活化a t c p k l 0 或者a t c p k 3 0 的表达可直接激活启动子 口s 】。 1 4 3 3 2 生长和发育 6 山东师范大学硕士学位论文 植物生命周期内的许多生长发育过程都受钙离子调控。例如c d p k s 参与花 粉管的生长过程。在玉米中，花粉管所特异的c d p k 基因的表达被限定在花粉 发育的晚期阶段p 9 】，钙调素拮抗剂、c d p k 抑制子的增加能够明显阻碍花粉的萌 发和花粉管的延长。有资料表明，矮牵牛中的c d p k 在调控花粉管的生长包括 调控它的极性方面有明显的作用。p i c d p k l 和p i c d p k 2 是在花粉期所表达的两 种蛋白激酶，过表或催化修饰p i c d p k i 能影响花粉管的生长极性，而p i c d p k 2 的表达则抑制了花粉管的伸长并不能影响其生长极性1 4 0 1 。 1 4 3 3 3 保卫细胞和气孔运动 应对于环境刺激，通过钙离子的变化调控保卫细胞离子流出从而达到驱使气 孔运动的目的【4 i 】。在a b a 所诱导的气孔关闭过程中，钙离子通过直接抑制位于 质膜上的前导钾通道提高钾离子的流出。在气孔开放过程中，钾离子内流，阴离 子进入液泡从而实现与钾离子的平衡。蚕豆( g i c i a f a b a ) 保卫细胞质膜上的一 种氯离子通道在钙离子存在条件下可以被a t c p k l 高度激活。a t c p k l 还可引起 苹果酸盐进入蚕豆保卫细胞液泡以及氯离子内流入甜菜根液泡中【4 2 1 。 1 4 3 3 4 非生物胁迫 c d p k 与胁迫信号的传导也逐渐的被得到证实，。许多胁迫信号j 例如机械 创伤、，拎害、高盐、干旱都能够引起胞质钙离子水平的波动和某些蛋白磷酸化形 式的改变。u r a o 4 3 1 等人在拟南芥中分离了编码c d p k 的两个e d n a 克隆 ( c a t c d p k l 和c a l d p k 2 ) ，n o r t h e r nb l o t 分析表明，在干旱和高盐胁迫下， 这两个基因的m r n a 被迅速诱导。中国农业大学武维华教授研究结果表明，在 拟南芥的3 4 个c d p k 成员中，至少有1 0 个c p k 基因分别参与了花粉萌发及花 粉管生长调控和植物应答干旱、高盐等胁迫的信号转导。冷处理能够明显地增强 水稻中一种c d p k 的活性m ，过量表达水稻o s c d p k 7 ，可增强转基因组织的抗 盐及抗冷能力【4 5 】。利用原生质体瞬时表达系统，发现a t c p k l 0 和a t c p k 3 0 可激 活胁迫和a b a 诱导性启动子，这一结果说明c d p k 与特定信号通路有关【3 司。 1 4 3 3 5 病原微生物侵害 广泛研究表明胞质钙离子的流入是激活病原微生物所诱导的信号通路中至 关重要的一步【舶】。病原体所编码的引发蛋白( 如a v r 9 ) 与相应的植物所编码的某种 感受蛋白( 如c f - 9 ) 间发生相互作用，从而引发由病原菌所诱导的信号通路。最近 7 山东师范大学硕。p 学位论文 发现，除了c f - 9 a v r 9 相互作用可诱发这种病原菌反应，在c f - 9 转基因烟草中 发现c d p k 也可诱发这种反应，说明了诱导性抵御反应中c d p k 是重要的钙信 号感受器 3 0 l 。使用病毒诱导的基因沉默系统，沉默烟草中的n t c d p k 2 和 n t c d p k 3 ，发现c d p k 对于介导植物中由c f - 9 - a v r 9 所诱导的超敏反应起着重 要作用f 4 7 】。 1 4 3 4c d p k 超家族及在拟南芥中的研究 根据c 端调控区结构上的差异，目前已发现c d p k s 超家族存在7 种类型的蛋 白激酶：( 1 ) c d p k s 是一类钙依赖蛋白激酶，也称钙调素类似物结构区域的蛋白 激酶；( 2 ) c r k s 是一类与c d 唰( s 相关的激酶，c r k s 的c 端区与c d p k s 的调控区 有相似氨基酸序列，但不与c a 2 + 结合；( 3 ) p p c 妇一类磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 ( p e p c ) 激酶，只包含1 个催化区；( 4 ) p e p r k s 是与p p c 恐相关的激酶，其c 端区与家族中的其他成员没有相似性；( 5 ) c c a m k s 是受c 矿和c a m 同时调节的 激酶，与c a ，及c a 2 + 和c a m 复合体都能结合；( 6 ) c a m k s 是c a m 依赖的蛋白激 酶，与c a 2 + 和c a m 复合体结合，( 7 ) s n r k s l 4 s 。在这些超家族里面，又具体分化 出一些亚家族，根据对拟南芥基因组的分析，目前已经鉴定趋c d p k 有3 4 个成员， c r k s 8 个成员，p p c k s 2 个成员，p e p r k s 2 个成员，s n r k s 有3 8 个成员f 4 9 1 。 在拟南芥中，c d p i c s 由多基因家族编码，成员数为3 4 个。除了在钙调素类似 区缩短了的c p k 2 5 ，所有c d p k s 在钙调素类似区都有四个e f 手型结构。根据这 些蛋白激酶催化区的序列相似性至少可以划分出四个亚型冈。中国农业大学吴 维华教授研究结果表明，在拟南芥的3 4 个c d p k 成员中，至少有1 0 + a 噬基因分 别参与了花粉葫发及花粉管生长调控和植物应答干旱、高盐等胁迫的信号转导。 组织特异性分析表明，大部分a 噬基因在植物的各个部位均有表达，部分基因整 体上表达较弱，部分基因在某些组织特异表达。其中有8 种a ，量基因在保卫细胞 中表达较强，有1 6 种a 基因在成熟花粉或花粉萌发过程中有表达，其中8 种c p k 基因表达较强。 1 4 3 5 研究方法及展望 伴随着我们进入拟南芥后基因组时代，对每一种拟南芥c d p k 生理功能的 认识显得愈发重要，生化、分子、细胞、以及基因方法的综合运用将有助于阐释 每一种c d p k 的生物功能，而每一种c d p k 的时空表达可以通过启动子 便告基 8 山东师范大学硕士学位论文 因相融和的方法在转基因植物中加以定性，还可以通过特异性探针原位杂交的方 法确定其定位。另外，在瞬时表达系统或者是转基因植物中表达带有抗原决定基 标签的c d p k 也可以提供其亚细胞定位的有关信息【5 1 铡。利用细菌表达、噬菌 体展示、酵母双杂交等方法可确定一些新的与c d p k 相互作用的蛋白及作用底 物瞄侧。通过在原核细胞中表达带有抗原决定基标签的c d p k ，并且对该种c d p k 进行激酶活性分析，可以确定其底物特异性【5 卯。在基因组尺度上，通过在微振 列( m i c r o a r r a y ) 表面上使用固定底物( 蛋白、多肽等) ，可以更加深入地阐明 各种c d p ki s o f o r m 的底物特异性【5 7 1 。最后，通过基因破坏和沉默技术，例如 插入突变、r n a 干涉、病毒诱导的基因沉默等均可以研究改变以后的表型【5 蹦o 】。 由于c d p k 的功能冗余【6 1 1 ，高度同源的c d p k 往往具有相似的表达模式、相似 的细胞定位、形似的底物特异性，而这些同源的c d p k 往往具有同步钝化作用， 基于此，有必要鉴别出某一种c d p k 突变体的表型和生理功能。这些分子方法 以及生物信息学方法的综合运用应该可以比较清晰地阐明各种c d p k 在整个信 号网络中的作用由于各种c d p k 可以特异的调控某信号通路 6 1 j ，有选择性地 激活某一胁迫通路以增强其抗旱、盐等胁迫能力1 6 2 】，因此，增加对各种c d p k 在植物生物体中所起作用的理解将有助于生物技术在生产生活中的更加广泛的 应用一 2 盐芥作为耐盐的模式植物 到目前为止，拟南芥一直是研究植物分子生物学途径的最好模式材料f 8 5 】。 拟南芥的生命特征和遗传特征决定了它可以作为模式植物：生命特征如个体较 小，生命周期较短，严格自花受粉并且具有非常多的种子数目；遗传特征如基因 组较小，易于转化和易于突变发生。尤其是基因组全序列的测定完成使得拟南芥 模式系统更具潜力和吸引力，d n a 微阵列和基因芯片作为一种必要的工具，可 以在多种突变体背景下，通过表达作图来寻找转录级联和靶调控。 大量研究表明拟南芥包含了大多数的耐盐基因，而且对于拟南芥的研究，已 经获得了关于植物耐盐性的基础理解。但拟南芥是典型的甜土植物，即使在中度 盐环境下( 大约1 0 0 m mn a c i ) 也不能完成整个生活史，因此，使用拟南芥将只 能揭露关于植物耐盐性较少的信息，但对于胁迫研究仍有很多方面急需了解。 9 山东师苑大学硕士学位论文 自然界存在着许多天然的耐盐植物，它们在长期的进化过程中积累了丰富的 耐盐基因，形成了完善的耐盐机制，从中挑选模式植物将是划时代的革命。几种 盐生植物如冰叶日中花和s u a e d a 属的种类虽已广泛用于生理及分子生物学的研 究，但这些植物中没有一种符合作为遗传模式材料的要求【6 3 1 。例如冰叶日中花 的耐盐性是同叶肉质化和c a m 途径紧密相连的，所以难以将其耐盐机制转移到 没有这两方面特点的作物中。 2 0 0 0 年，山东师范大学张慧教授首次提议将盐生植物盐芥( t h e l l u n g i e l l a h a l o p h i l a ) 作为研究植物耐盐性的又模式系统。 盐芥与拟南芥近缘，历史上盐芥曾属于拟南芥属，1 8 5 7 年0 e s c h u l z 把盐 芥( a r a b i d o p s i s s a l s u g i n e a ) 从拟南属a r a b i d o p s 括中独立出来建立叮盐芥属 t h e u u n g i e l l a ，定名为t h e l l u n g i e l l a s a l s u g i n e a , 同属的植物还有小盐芥( z h a l o p h i t a )