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分子生物学课件 引物：是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 Ct值：是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数基因诊断：应用分子生物学技术,从DNA/RNA 达状态从而对疾病作出诊断的技术水平检测分析致病基因的存在,变异和表 RFLP：利用特定限制性识别位点进行基因分析的方法 基因诊断常用的技术有哪些？ 1.核酸分子杂交技术（hybridization） 2.等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide,ASO) 3.DNA限制性长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析 4.PCR-PCR/单链构象多态性分析（PCR-Single-strandconformationpolymorphism，PCR-SSCP） 5.DNA测序（DNAsequence） .6DNA芯片技术（DNAchip） 基因治疗：将外源性正常基因导入到病变细胞或体细胞中，以置换或增补缺陷基因的功能，从而达到治疗遗传性疾病或获得性疾病的目的。 基因治疗的策略有哪些? 一、针对致病基因而言： （1）基因修正（genecorrection） 对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能； （2）基因替代（genereplacement） 用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态； （3）基因增强（geneaugmentation） 将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能，但致病基因未去除； （4）基因表达调节（modulation） 指将特定的反义核酸、RNA干扰或核酶等技术抑制目的基因表达从而消除致病基因的作用。 二、针对非致病基因而言： （1）自杀基因 这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因”。自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。 （2）免疫基因治疗 将某些细胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。 （3）耐药基因治疗 在肿瘤化疗过程中，把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受 更大剂量的化疗。 （4）More? 基因治疗的基本程序： 1.目的基因的选择和获取 2.目的基因与转运载体结合 3.靶细胞的确认 4.载体携带外源基因进入细胞 5.外源基因的整合 6.外源基因的表达及检测 7.治疗作用及稳定性、安全性评价 克隆：一种无性繁殖技术。指一个亲本细胞产生成千上万个相同细胞组成的群体的过程。DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(rebinantDNA)。基因工程(geicengineering)：有目的的通过基因克隆技术，人为的操作改造基因，以改变生物的遗传性状的系列过程。 基因克隆的技术路线： 1.分：分离制备目的DNA片段和载体 2.切：目的DNA与载体的剪切 3.接：目的DNA与载体的连接 4.转：重组DNA分子转化宿主细胞 5.筛：筛选阳性克隆，大量扩增 基因克隆的基本原理： 1.目的基因的获取 2.载体的选择和构建 3.外源基因与载体的连接 4.DNA导入受体菌 5.重组体的筛选 6.克隆基因的表达 限制性核酸内切酶（限制酶）：限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 目的基因的分离： 1、直接从染色体DNA中分离 2、人工合成 3、通过mRNA反转录合成cDNA 4、从基因组DNA文库获取目的基因 5、从cDNA文库获取目的基因 6、PCR扩增目的基因 7、索取 载体：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。 质粒：是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1-3个抗药性基因，以利于筛选。 质粒的特性： 存在于细菌等细胞质中 双链环状DNA分子 大约310Kb 具有自主复制和转录能力 不能独立存活 在子细胞中保持恒定的拷贝数， 并表达其遗传信息 转化（transformation）：质粒或以其为载体的重组子导入细菌并得到表达的过程。转染（transfection）：重组噬菌体或病毒导入宿主细胞的过程。 转导（transduction）：重组DNA经过外壳蛋白包装后转入宿主细胞的过程。 基因：生物体内有功能的核酸片段，是遗传信息储存的物质基础，决定个体/细胞的表型。基因表达：基因经过转录或/和翻译过程，产生具有特定生物学功能的产物的过程。真核基因表达调控特点 （一）活性染色体结构变化 （二）正性调节占主导 （三）转录与翻译分隔进行 （四）转录后修饰、加工 反式作用因子(trans-actingfactor)：直接或间接识别或结合顺式作用元件，参与靶基因转录效率调控的一组蛋白质。 基因表达调控相关技术: 1.电泳迁移率阻滞实验（EMSA） 2.报告基因分析 3.DnaseI足迹法 4.甲基化干扰足迹法 5.Run-on分析 6.染色质免疫共沉淀（CHIP） 报告基因（reportergene）:又称选择标记基因，编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物很容易被鉴定。 报告基因的标准： 1.已被克隆和全序列已测定 2.表达产物在受体细胞中不存在 3.表达产物可进行快速的定量测定 4.稳定、可靠 报告基因分析的基本流程： 1.重组载体的构建 2.细胞的培养（原核、真核） 3.导入细胞（转化、转染） 4.细胞提取物的制备 5.CAT活性测定 染色质免疫共沉淀（ChIP）:是基于体内分析发展起来的研究体内DNA和蛋白质相互作用的一种新方法，也称结合位点分析法。 可用来研究： 1.体内反式作用因子与顺式作用元件的相互作用 2.RNA聚合酶与DNA的相互作用 3.一些外源性的结合蛋白与DNA的相互作用 4.组蛋白修饰与基因表达的关系 核酸分子杂交：具有同源性的两条核酸单链在一定条件下,按碱基互补配对原则形成完整或局部互补双链的过程。 核酸的一级结构：核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。 DNA变性：某些理化因素导致DNA双链互补碱基对之间的氢键发生断裂，DNA双链解离为单链的过程。本质是双链间氢键的断裂。 变性DNA分子理化性质的变化： （1）黏度降低 （2）密度增加 （3）沉降系数增加 （4）A260吸光度值增加 （5）细菌转化能力消失 DNA复性:当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补链可重新配对，恢复原来的双螺 旋结构，这一现象称为DNA复性。 退火(annealing):热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。Tm的影响因素： DNA分子的碱基组成 溶液的离子强度 pH 变性剂 影响复性的因素： （1）核酸分子的浓度和长度 （2）温度 （3）离子强度：0.15-1.0M盐溶液 （4）核酸分子的复杂性 （5）非特异性杂交反应 印迹技术：待测的核酸分子转移到固相支持物上的过程。 固相支持物应具备的条件： 1.结合核酸的能力强（大于10g/cm2) 2.不能干扰分子杂交的进行 3.结合牢固，能耐受杂交和洗膜 4.非特异性吸附少（对蛋白等吸附少） 5.具有良好的机械性能和韧性 两种印迹杂交法的不同点: 探针（probe）：用于检测的带标记的已知核酸片段。 基因芯片(genechip)：将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术也被称为DNA微阵列(DNAmicroarray)。 基因芯片应用： 1.分析基因表达时空特征 2.基因差异表达检测 3.发现新基因 分子生物学 一.内容与课时安排(54课时) 二、基本要求 熟知核酸的基本生物化学特性，熟知生物信息的储存与表达过程，掌握DNA、RNA和蛋白质的基本代谢过程，特别是基因的一般结构与生物功能，基因活性的 修饰与调节，掌握分子克隆与DNA重组的基本技术与原理，了解现代分子生物学基本研究方法，了解基因治疗与基因组学的新成果，新进展。 三、后援 1朱玉贤：生物楼218，电话62751193（O），62754096（L） 2网址：/zhubmb/index.htm 3参考书： BenjaminLewin-GenesV.(1994)朱玉贤、李毅现代分子生物学（1997） Brown-Genomes(1999)Lehninger-PrinciplesofBiochemistry(2000) 第一讲序论 一、二十一世纪是现代生物科学的世纪 生物科学是当代自然科学中发展最迅速、对人类的生存和自身发展影响最大的学科领域之一。统计美国科学引文索引（SCI）收录的4500余种学术刊物，发 现有2350种左右为生物科学相关杂志！统计全世界引用指数（Impactfactor）在10以上的超一流学术刊物，也发现80%左右（97年48种刊物中有38种）是生物科学相关刊物。 表1.引用指数在10以上的自然科学刊物分科比较 分析97年SCI收录的4500种期刊的影响因子发现： Cell（细胞）48.0Nature（自然）28.4Science（科学）24.1 随着DNA重组技术、基因遗传转化技术及植物组织培养技术的兴起，人们发现根癌土壤农杆菌（Agrobaoteriumtumefaciens）侵染植物细胞后能将其Ti（tumorinducing）质粒上的一段DNA（T-DNA）插入到被侵染细胞的基因组，并能稳定 地遗传给后代，植物的遗传转化技术随之得到迅速发展，为植物基因工程的发展创造了条件。植物的组织培养技术如原生质体的培养和成株、细胞融合等技术的迅速发展进一步促进了植物基因工程的发展。如今，植物基因工程已取得重大成就，据1999年统计，获得第一株转基因植物到现在15年左右的时间里，已经有200多种植物相继被转化，内容涉及到植物的抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆和作物的高产优质、果蔬贮藏、谷物或其它作物的固氮能力、药物生产及环境美化等方面。 生物学不仅是目前自然科学中进展最迅速、最具活力和生气的领域，也将是下一世纪的带头学科。愿有志于生命科学研究的莘莘学子及广大青年朋友们，早日掌握分子生物学这把金钥匙，为祖国的繁荣富强，为人类的文明和进步做出新贡献！ 二、现代分子生物学中的主要里程碑 分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。当人们意识到同一生物不同世代之间的连续性是由生物体自身所携带的遗传物质所决定的，科学 1、广义分子生物学：在分子水平上研究生命本质的科学，其研究对象是生物大分子的结构和功能。2 2、狭义分子生物学：即核酸（基因）的分子生物学，研究基因的结构和功能、复制、转录、翻译、表达调控、重组、修复等过程，以及其中涉及到与过程相关的蛋白质和酶的结构与功能 3、基因：遗传信息的基本单位。编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列(对以RNA作为遗传信息载体的RNA病毒而言则是RNA序列)。 4、基因：基因是含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，包含产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。 5、功能基因组学：是依附于对DNA序列的了解，应用基因组学的知识和工具去了解影响发育和整个生物体的特定序列表达谱。 6、蛋白质组学：是以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学。 7、生物信息学：对DNA和蛋白质序列资料中各种类型信息进行识别、存储、分析、模拟和转输 8、蛋白质组：指的是由一个基因组表达的全部蛋白质 9、功能蛋白质组学：是指研究在特定时间、特定环境和实验条件下细胞内表达的全部蛋白质。 10、单细胞蛋白：也叫微生物蛋白，它是用许多工农业废料及石油废料人工培养的微生物菌体。因而，单细胞蛋白不是一种纯蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。11、基因组：指生物体或细胞一套完整单倍体的遗传物质总和。 12、C值：指生物单倍体基因组的全部DNA的含量，单位以pg或Mb表示。13、C值矛盾：C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象。14、重叠基因：共有同一段DNA序列的两个或多个基因。15、基因重叠：同一段核酸序列参与了不同基因编码的现象。 16、单拷贝序列：单拷贝顺序在单倍体基因组中只出现一次，因而复性速度很慢。单拷贝顺序中储存了巨大的遗传信息，编码各种不同功能的蛋白质。 17、低度重复序列：低度重复序列是指在基因组中含有210个拷贝的序列 18、中度重复序列：中度重复序列大致指在真核基因组中重复数十至数万（105）次的重复顺序。其复性速度快于单拷贝顺序，但慢于高度重复顺序。 19、高度重复序列：基因组中有数千个到几百万个拷贝的DNA序列。这些重复序列的长度为6200碱基对。 20、基因家族：真核生物基因组中相同、结构相似、功能相关的一组基因，可能由某一共同祖先基因经重复和突变产生。21、基因簇：基因家族的各成员紧密成簇排列成大段的串联重复单位，定位于染色体的特殊区域。 22、超基因家族：由基因家族和单基因组成的大基因家族，各成员序列同源性低，但编码的产物功能相似。如免疫球蛋白家族。 23、假基因：一种类似于基因序列，其核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同、但却不能合成功能蛋白的失活基因。 24、复制：是指以原来DNA（母链）为模板合成新DNA（子链）的过程。或生物体以DNA/RNA为模板合成DNA/RNA的过程。 25、半保留复制：DNA复制过程中，新合成的子代DNA分子中，一条链是新合成的，另外一条链亲代，这种复制方式称为半保留复制。 26、复制子：基因组上能够独立进行复制的单位，包括复制起点和复制终点。所有的原核生物的染色体、噬菌体仅有一个复制子；真核生物的染色体有多个复制子27、复制起始点：DNA分子上起始复制并控制复制起始频率的特定位置28、复制终点：终止复制的位点。 29、复制叉：又称生长点，复制开始时，起始点处的DNA双螺旋要解链，松开的两股链和未松开的双螺旋形状象一把叉子，称为复制叉，是复制有关的酶和蛋白质组装成新的复合物和新链合成的部位。 30、引物：是人工合成的与模板DNA互补的寡核苷酸序列 31、简并引物：是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。 32、相向复制：从两个起点开始两条链的复制，形成两个复制叉，各以一条链为模板单一方向复制出一条新链。 33、单向复制：复制从一个起始点开始，只有一个复制叉，以同一方向生长出两条链。34、双向复制：从一个起始点开始，沿着两个相反的方向形成两个复制叉，一方向移动，两条DNA链都被作为模板，各生长出两条新链，形成一个复制泡，用电子显微镜可以观察到复制泡的存在。这是原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式 35、D环复制：又称取代环复制，是线粒体DNA的复制形式。复制中呈字母D形状而得名。 36、DNA的半不连续复制:DNA在复制过程中，一条链合成是连续的，而另一条链合成是不连续的，这样的复制过程称为半不连续合成。 37、冈崎片段：DNA复制时，以53方向的母链作为模板，子链沿53最初合成长短不一、不连续核苷酸小片段，最后连接成为完整子链，这些小片段称之为岗崎片段。38、前导链：以35方向DNA链为模板链，子代DNA以53方向连续合成，称为前导链。 39、后随链：以53方向DNA链为模板链，子代DNA以53方向不连续合成，形成许多不连续的冈崎片段，最后连接成一条完整的DNA链，称为后随链，又称后滞链。40、引物酶：又称引发酶，合成起始引物，引物长度为10-60个核苷酸，E.coli中是DnaG蛋白。 41、RNA聚合酶：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5-三磷酸合成RNA的酶。促进DnaA活性，促进复制起始。 42、端粒：真核生物线性染色体DNA的两端是一种特殊结构称为端粒功能：稳定染色体末端结构，防止染色体末端融合、重组、降解；补偿5末端在切除RNA引物后留下的空缺 43、DNA的损伤：生物体生命过程中DNA双螺旋结构发生的任何改变都称之为DNA损伤。44、DNA修复：是细胞对DNA受损伤后的一种反应。主要包括：直接修复、切除修复、错配修复、重组修复、易错修复和SOS应急反应 45、光修复：光裂合酶能特异地和嘧啶二聚体结合，在可见光下催化光化合反应，使环丁烷环回复到两个独立的嘧啶，这一过程叫光复活作用。 46、应急反应（SOS反应）：许多能造成DNA损伤或抑制DNA复制的过程能引起一系列复杂的诱导效应，这种效应称为应急反应（SOS反应） 47、同义突变：指突变改变了密码子的组成，但由于密码子的简并性没有改变所编码的氨基酸序列的突变48、错义突变：指基因突变改变了所编码氨基酸的序列，不同程度地影响蛋白质和酶的活性。49、无义突变：指基因改变使代表某种氨基酸的密码子变为终止密码子，导致肽链合成过早终止。 50、致死突变:有些错义突变和无义突变严重影响到蛋白质活性甚至完全无活性,从而影响了表现型。 51、渗漏突变:有些错义的产物仍然有部分活性,使表现型介于完全的突变型和野生型之间的中间类型。 52、中性突变:有些错义突变不影响或基本上不影响蛋白质活性,不表现出明显的性状变化。53、电泳:带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。54、迁移率:是指带电颗粒在单位电场下泳动的速度。影响迁移率的内在因素： （1）样品所带静电荷的多少（2）样品颗粒大小（3）样品分子空间构象影响迁移率的外界因素：电场强度、电泳缓冲液的离子强度、电泳缓冲液的pH值、支持物及其浓度的影响、插入染料的影响、温度的影响、电渗 55、DNA重组：又称遗传重组，指DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，重组产物叫重组DNA 56、同源重组:又称一般性重组，指发生在两条同源DNA分子之间，通过配对、链断裂和再连接，而产生片段交换过程。重组产物称为重组体 57、Holliday中间体:同源重组中，两条同源的DNA分子经过配对、断裂和再连接，形成的连接分子，称为Holliday中间体 58、Chi位点：它是刺激重组的位点。这一位点是由8个碱基组成的非对称序列59、特异位点重组:指发生在一个特定的短DNA序列内，由特异的酶和辅助因子识别和作用的重组。 60、单链同化：单链DNA与同源双链DNA分子发生链的交换，从而使重组过程中DNA配对、Holliday中间体的形成、分支移动等步骤得以实现的过程。 61、转座子：基因组上中可以移动的DNA片段。转座子由基因组的一个位置转移到另一个位置的过程叫转座62、反转座子：又称反转录转座子或反转录子，是一类在转座过程中需要以RNA为中间体，经过反转录过程再分散到基因组中的转座子。生物学意义：对基因表达的影响；反转座子介导基因的重排；反转座子在进化中的作用 63、转录：生物体以DNA为模板合成RNA的过程。64、反转录：生物体以RNA为模板合成DNA的过程。 65、剪接：真核生物RNA前体去除内含子，连接外显子的过程。 66、剪接体：在mRNA前体内含子的剪接过程中，由多个核内小分子核糖核酸 （snRNA）和蛋白质组装形成催化剪接反应的复合体。67、模板链：“链”、“反义链”，指用于转录的DNA单链，是合成RNA的模板68、编码链：“链”、“有义链”、“非模板链”，指模板链的对应DNA链，碱基序列与mRNA一致（DNA：T，RNA：U） 69、编码序列：