（动物学专业论文）催产素对乌鳢、草鱼、鲫鱼腺垂体内分泌细胞影响的研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t t h e gr o w t h , d e v e l o p m e n t a n d r e p r o d u c t i o n o f t h e t e l e o s t e a n a r e r e g u l a t e d妙 e n d o c r i n e h o r m o n e . t h e t e l e o s t e a n p i t u i t a ry i s a n i m p o r t a n t e n d o c r i n e o r g a n . i t p l a y s a v e ry s i g n i fi c a n t r o l e in s e c r e t i n g h o r m o n e . t h e p u r p o s e o f t h e a r t i f i c i a l m a t u r a t i o n i s t o p r o m o t e s o m e t y p e s o f t e l e o s t e a n , t o b e m a t u r e a n d o v u l a t e o r e j a c u l a t e i n a l i m i t e d t i m e u n d e r a n a r t i fi c i a l c o n d i t i o n , im p r o v i n g t h e e ff i c i e n c y o f t h e a r ti fi c i a l m a t u r a t i o n . c y p r i n o i d p i t u i t a ry , l u t e o t r o p i n r e l e a s i n g h o r m o n e d - a l a a n a l o g ( l r h - a ) , d o m p e r i d o n e ( d o m) a n d h u m a n c h o r i o n i c g o n a c l o t r o p i n ( h c g ) a r e fr e q u e n t l y u s e d . i t i s s t u d i e d t h a t t h e e ff e c t s o n t h e d i s t r i b u t i o n o f e n d o c r i n e c e l l s i n m u l l e t , g r a s s c a r p a n d c r u c i a n p i t u i t a r i e s , w h i c h w e r e i n j e c t e d o x y t o c i t h o r m o n e i n b r e e d i n g s e a s o n a n d n o n b r e e d i n g s e a s o n . mu l l e t , gr a s s c a r p a n d c r u c i a n , e a c h 4 0 f i s h e s ( m a l e s a n d f e m a l e s ) , w e r e c a u g h t i n t h e ma y a n d n o v e m b e r o f a y e a r . f o u r gr o u p s w e r e d i v i d e d : t h e c o n t r o l e x p e r i m e n t gr o u p i n b r e e d i n g s e a s o n , t h e c o n t r o l e x p e r i m e n t gr o u p i n n o n b r e e d i n g s e a s o n ; t h e a d m i n i s t r a t i o n gr o u p i n b r e e d i n g s e a s o n , t h e a d m in i s t r a t i o n gr o u p i n n o n b r e e d i n g s e a s o n . i n t h e f i r s t t w o gr o u p s , m u l l e t , gr a s s c a r p a n d c r u c i a n , r e s p e c t i v e 1 0 fi s h e s , w e r e i n j e c t e d n o r m a l s a l i n e s o l u t i o n p h y s i o l o g i c a l s a l i n e o f t h e fr e s h w a t e r f i s h t o t h e t h o r a c ic c a v i t y . w h i l e i n t h e l a s t t w o gr o u p s , m u ll e t , gr as s c a r p a n d c r u c i a n , a l s o 1 0 fi s h e s r e s p e c t i v e l y , w e r e i n j e c t e d l r h - a + d o m.t h e s l i c e s o f t h e p i t u i t a ry w a s s t a i n e d b y h e s t a in i n g , m a l l o ry - h e i d e n h a i n - a z a n s t a i n i n g a n d h i s t o c h e m i s t ry . a f t e r b e i n g i n j e c t e d i n d i ff e r e n t b r e e d i n g s e as o n s a n d n o n b r e e d i n g s e a s o n s , v o l u m e d e n s i t y a n d n u m e r i c a l d e n s i t y o f e n d o c r i n e c e l l s i n t h e d i ff e r e n t d e p a r t m e n t s o f p i t u i t a r i e s w e r e a c q u i r e d b y t h e s t e r e o l o g y . c o m p a r i n g t h e d i s t r i b u t i o n o f e n d o c r i n e c e l l s i n t h e d i ff e r e n t d e p a r tm e n t s o f p i t u i t a r i e s t o t e l l w h e t h e r t h e r e i s a d i v e r s i t y . b e s i d e s , c o m p a r i n g t h e d i v e r s i t y o f e n z y m a t i c a c t i v i t y , a l k a l i n e p h o s p h a t as e ( a k p as e ) , a c i d i c p h o s p h a t a s e ( a c p as e ) a n d a d e n o s i n e t r i c p h o s p h a t a s e ( a t p ase ) . t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t : a f t e r b e i n g i n j e c t e d in n o n b r e e d i n g s e as o n , t h e r e w as n o d i ff e r e n c e a m o n g m o s t e n d o c r i n e c e l l s v o l u m e d e n s i t y a n d n u m e r i c a l d e n s i ty o f t h e p i t u i t a r i e s , c o m p a r i n g w i t h t h e c o n t r o l e x p e r i m e n t gr o u p . wh i l e i n t h e b r e e d i n g s e as o n , t h e r e w as a d r a m a t i c d i ff e r e n c e a m o n g t h e m , e s p e c i a l l y v o l u m e d e n s i t y a n d a b s t r a c t n u m e r i c a l d e n s i t y o f b a s o p h i li a c e l l s ( g o n a d o t r o p i n s e c r e t o ry c e l l s ) w e r e m o r e t h a n t h e s a m e i n t h e c o n t r o l e x p e r i m e n t i n t h e b r e e d i n g s e a s o n a n d t h e e n z y m e t i c a c t i v i t i e s o f a k p a s e , a c p a s e a n d a t p a s e i n t h e p i t u i t a ry w a s m o re t h a n t h e s a m e i n t h e c o n t r o l e x p e r i m e n t i n t h e b r e e d i n g s e a s o n , e v e n h a v i n g d r a m a t i c d i ff e r e n c e .i t s u g g e s t e d t h a t t h e e n z y m a t i c a c t i v i t i e s o f a k p a s e , a c p a s e a n d a t p a s e i n p i t u i t a ry a r e i n c r e a s e d 妙 山e o x y t o c i n . k e y w o r d s : o x y t o c i c h o r m o n e ; mu l l e t ; g r a s s c a r p ; 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。 据我所知， 除了 文中 特别加以 标注和致谢的地方外， 论文中不包含其 他 人已 经发 表或 撰 写 过的 研究 成 果， 也 不包 含 为 获 得 南昌大母 或 其他 教 育 机 构的 学位或 证书而使用过的材料。 与我一同 工作的同 志对本 研究所做的任何贡献 均已 在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学 位 论 文 作 者 签 名 (手 写 ) : 葡 *4 签 字 日 期 :， 二年 月*日 学位论文版权使用授权书 本学 位论文作者完全了 解.南昌大李有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅 和 借阅. 本人授权南昌大李可以将学位论文的 全部或部分内 容编入有关数据 库进 行检索， 可以 采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学 位 论 文 作 者 签 名 手 写 : 含 w *ie0fi!rl-8 一 f ct 签 字日 期: 2 0 习 年 月 y 日 签 字 日 期 :z 0 7 年 犷月 ir日 学位论文作 者毕业后去向: 工作单位: 通讯地址 : 电话: 邮编: i 引言 1引言 1 . 1 概述 鱼类的生长、 发育和生殖受体内各种内分泌激素的调控， 鱼类脑垂体是鱼类 重要的内分泌器官， 脑垂体在这些激素的分泌活动中起着重要的作用。 有关鱼类 脑垂体的 研究开始于二十世纪二、 三十年代， 早期多采用光镜观察来描述垂体细 胞的形态、 结构、 分布， 对各种细胞的分泌机能多为推测， 早期关于鱼类脑垂体 结构的研究主要集中在形态学和组织学方面。 随着各种硬骨鱼类脑垂体的组织学 研究大 量开 展起来， 学者对 脑垂体细胞结构 也 进行了 研究。 - 12 1 。 上世纪7 0 年代初 免疫组织化学技术的问世， 推动了脑垂体组织生理学的发展。 学者们对鱼类脑垂 体的大量免疫细胞化学研究， 再结合组织学和组织化学对鱼类脑垂体细胞的种类 进行了 细 致的 分类， 基本 弄清了 鱼类脑垂体细胞的 种 类和功能 ( 17 - 19 . 硬骨 鱼类脑 垂体由 神 经垂体( n e u r o - h y p o p h s i s ) 和腺垂 体 ( a d e n o - h y p o 灿s i s ) 二部分 组成。 由于腺垂体中不同类型分泌细胞在形态解剖学上的不均匀分布， 腺垂体又可区分 为: 前 外 侧部( r o s t r a l p a r s d i s t a i l s , r p d ) 、 中 外侧部( p r o x i m a l p a r s d i s t a i l s , p p d ) 和垂体中 间 部( p a r s i n t e r m e d i a , p d . 腺垂体中 有不同 类型的内 分泌细胞， 由 于其 分泌物的 化学性质的不同， 用m a l l o ry - h e i d e n h a i n - a z a n 可以 划分为嗜酸性细胞、 嗜碱性细胞和嫌色细胞。在r p d和p p d中的细胞为嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和 嫌色细胞， 在p i 中的细胞为嗜碱性细胞和嫌色细胞f9 7 1 . 2脑垂体与鱼类生殖生理的研究 鱼类的生殖受到环境的影响。感觉器官把外界环境的刺激 ( 如温度、光照、 降雨等) 传送到脑， 使下丘脑分泌促性腺激素释放激素， 激发脑垂体分泌促性腺 激素作用于性腺并促进性腺分泌性类固醇激素， 以 促使性腺发育成熟与排出 精子 和互 日 子。 促性腺激素( g o n a d o t r o p i n , g t h ) 是硬骨鱼类脑垂体分泌的 在其生殖周期调节 中 起中心作用的激素。 有关g t h种类， 结构功能及分泌调节的 研究较多， 特别是 近十 年 来 ， 随 着分 子生 物学的 发 展 和新的生 化 技术的 应用 ， 这方面 研究 进展很 快国。 g th有两种类型。在早期研究中硬骨鱼类 g t h细胞是否也像喃乳动物一样 具有两种类型， 看法还不一致， 有些学者认为只有一种， 但也有认为存在两种类 型g t h细胞(2 1- 22 7 ， 但七十年代以来的研究， 发现鱼类有两种g t h ， 分别在大麻 哈鱼、鲤鱼、拟庸蝶和美洲拟鲤、欧洲鳗鲡、 太平洋蛙鱼、鱼 m 鱼等观察到两种类 型的g th细胞。日 本s u z u k i 等和k a w a n c h i 等在大麻哈鱼， 美国s w a n s o n 等在 银大麻哈鱼， 加拿大v a n d o r k r o a k 等在鲤鱼，日本t a n a k a 等在红鳃 ， 美国l i n 等在 底鳅， 日 本k a w a n c h i 等 和k o i d e 等在东方狐鲤, o k a d a 等在 金枪鱼和m o b e n g 等在鳃鱼先后分离出两种g t h ， 并定名为g t h i 和g t h i i ， 通过提纯， 测定化学 结构证明 g t h i 和 g t h 1 1 分别和促卵泡成熟激素( f s h ) 和促黄体生成激素( l h ) 相 似 【二 一 周 . g t h与卵黄发生、卵母细胞成熟、 排卵等活动有关(s 7 硬骨鱼类卵母细胞内的卵黄除少部分自 身合成外， 大部分来自 肝脏。 肝脏中 卵黄蛋白 原合成受卵巢卵母细胞外的滤泡层( 包括外层的鞘膜层和贴近卵母细胞 的 颗粒层) 合成的1 7 0 一雌二醇的刺激， 1 7 0 一雌二醇的合成遵循“ 两细胞模式” 。 在 g t h作用下，雌鱼卵巢卵母细胞外的鞘膜层细胞将胆固醇合成为雄激素，然 后雄激素被转移到颗粒层细胞，芳香化为 1 7 0 一雌二醇。1 7 0 一雌二醇随血液 循环到达肝脏， 与肝细胞中特定受体结合， 形成激素受体复合物与核内d n a作 用， 促进肝细胞卵黄蛋白原的合成。 合成的卵黄蛋白原随血液循环到达卵巢， 在 g t h i 的作用下，通过微胞饮作用进入卵母细胞。 卵母细胞成熟主要依赖 1 7 a, 2 0 0 一二轻黄体酮等多种成熟启动和诱导因 子， 这些因 子是在g t h的 作用下 产生的 ( 主要是g t h 1 1 ) 。 例如 1 7 a ， 2 0 0 一二 t . 黄体酮的产生就是由g t h作用于卵母细胞的鞘膜层细胞，通过膜受体激活腺 昔酸环化酶-c a m p系统，使细胞产生 1 7 a 一轻基黄体酮，并转移到颗粒层。 颗粒层细胞在g t h作用 下， 通过受体 传导及c a m p , g -蛋白 和c a z + 的 作用， 使 2 0 0 一轻类固醇脱氢酶活性升高，将 1 7 。 一经基黄体酮转变为1 7 a ，2 0 0 一二 经黄体酮。 已有大量证据表明，硬骨鱼类排卵前 g t h的大量分泌是必要的。草鱼等四 大家鱼在池养条件下不产卵， 就是缺少排卵前的g t h高峰。 但g t h通过什么途 径诱导排卵尚不十分明了。 现有资料表明， 1 7 a , 2 0 0 一二经黄体酮、 前列腺素 及儿茶酚胺是导致排卵的主要因子。 g t h分泌除受视前区和下丘脑多种因子如单胺类物质调节外， 还受性类固醇 激素的反馈调节。 单胺类包括多巴 n ( d a ) 和5 -f l 色r( 5 -h t ) 等。 d a是 硬骨鱼类g t h释放 的主要内 源性抑制因 子， 它通过特异性的多巴胺d 2 型受体， 在脑垂体水平抑制 g t h的 释放， 在某些鱼类还能抑制促性腺激素释放激素 ( g o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o m r m o n e , g n r h ) 的 释 放 0 5 - h t 可 通 过5 - h t 2 型 受 体， 刺 激脑 垂 体。 t h 的释放;其刺激作用在某些鱼类如金鱼存在于整个生殖周期， 而在细须石首鱼， 5 -h t 对性腺退化期的鱼无作用s t 引言 性类固醇激素是在脑垂体分泌的g t h刺激下产生的产生后又对脑垂体g t h 分泌起正、 负反馈调节作用。 性类固醇激素的正反馈调节作用主要是通过增加脑 垂体对g n r h的反应性; 通过各种因子增加下丘脑、 视前区g n r h的m r n a含量 及脑垂体g t h的m r n a含量， 促进g t h的合成和分泌。 随着性类固醇激素含量 的增加到一定程度，激活了d a神经原和 d a脑一脑垂体通路，分泌d a抑制 g tii的分泌，d a的降解率也同时下降; 性类固醇激素还能降低 y 一 氨基乙酸 ( g a b a ) 浓度， 阻断g a b a对g th分泌的刺激作用， 从而起负反馈调节作用。 在性未成熟鱼以正反馈调节为主， 在性成熟鱼以负反馈调节为主， 正、 负反馈相 互平衡，维持g t b分泌的稳定，保证性腺正常的发育6 . “ 2 7 3 1 . 3鱼类催产素的研究 对鱼类生殖内分泌的研究结果揭示， 性类固醇激素在调节下丘脑一脑垂体一 性 腺 轴 ( h y p o th a la m i c - p i t u it a ry - g o n a d a l ,h p g ) 功能 的 发 育 和成熟中 起着十 分 重要 的 作用 i ze - n 7 ， 用外 源类固 醇激素可 加速h p g轴的 启动和发育3 0 - 3 1) 。 一 些学者研究 发 现， 雌激素 ( 1 7 0 一雌二醇) 和雄激素 ( 1 7 a 一甲 基皋 酮) 能够刺激硬骨 鱼类提早 性腺发 育3 3 ， 但 性激素这 种作用机制， 仍然不完全明了 3 3 3 5 ) 。 有些学者 对性激素 诱导硬骨鱼类提早性腺发育的机制作过研究， 如g i e l e n 等和h u r k 等分别报道了 性激素能 够刺激幼 体硬头鲜( s a i m o g a i r d n e r i ) 脑垂体g t h 细胞的 成熟 和在其胞质 中累 积分泌颗粒 3 6 - 3 7) 。 方永强等曾 在 1 7 a 一 甲 基翠酮刺 激鳍鱼精子发生的 机制研 究中， 发现辜酮除直接刺激精巢的精子发生外， 还间接使脑垂体g t h 细胞分泌促 性腺激素， 调控性腺的发育3 8 ) 在实际生产中并不直接用性激素对硬骨鱼类进行人工催产， 而常用的人工催 产素 有: 鲤鱼脑 垂体 ( p g ) 、 促黄体素 释放 激素类似物( l r h - a ) 、 多巴 胺抑制剂 地 欧 酮 ( d o m ) , 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 ( h c g ) 等 s o) 。 人 工 注 射 催 产 素 的目 的 是 促使 某 些在人工条件下不能自 行成熟的鱼类 ( 如缝、 鲡、 草、 青鱼) 发育成熟， 也可促 使能在人工条件能够产卵排精的鱼类在一个时间段内 集中产卵排精， 以 提高鱼类 人工繁殖效率。 由于鱼类脑垂体促性腺激素分泌细胞的分泌活动受下 g n r h和促性腺激素 释 放 激素 抑 制因 子 ( g o n a d o tr o p i n - r e l e a s in g in h ib it in g f a c t o r , g r i f ) 的 双 重 调 控40) 由 下丘脑神经分泌细胞产生的多巴胺起着g r i f 的作用 ， 它既能 直接抑制g t h 细 胞的分泌活动，也能抑制g n r h对脑垂体g t h 细胞分泌的促进作用。 我国学者林浩然与外国学者 p e t e r经过一系列的理论研究和生产实验，在 1 9 8 7 年提出了 一 种用 g n r h类似物 ( l h r h - a或 s g n r h - a ) 和多巴 胺拮抗物 ( d o m) 作为高活性的新型鱼类催产剂， 这种方法在国际上命名为“ 林彼方法” 。 “ 林彼方法” 与传统使用的鱼类催产剂 ( 鱼脑垂体匀浆液和绒毛膜促性腺激素) 相比 较的优点有: 催产效果好而稳定; 药物是人工合成的， 成本低， 来源不限制， 效价能长期保持稳定;排卵和产卵的效应时间短而有规律性，有利于安排生产; 操作简便， 只需一次注射， 大大减少劳动力; 没有副作用， 亲鱼催产后的 死亡率 显著下降低(e 7 另外国内外学者还在用药方式及剂量和给药途径两个方面对鱼类人工催产 素进行研究: 用药方式及剂量的研究即比 较单独用一种催产素和联合两种催产素用药及 高低剂量对鱼类催产效果。国外学者对绷鱼的 研究中， 注射剂量为6 毫克/ 千克 体重的脑垂体与注射剂量为2 0 毫克/ 千克体重m c m r h 一联合1 0 毫克/ 千克体重 多巴胺拮抗物 ( d o m)相比，两种方式催产效果相似，但后者联合用药的效果 稍好一点。另外单独注射低剂量3 毫克/ 千克体重脑垂体，绷鱼只有部分排卵; 单独注射2 0 毫克/ 千克体重mg n r h - a不排卵， 作者在其他鲤科鱼中也发现有相 似现象4 11 。 在水温2 0 c ，单独注射d o m 不能显著刺激雌雄贴鱼血清g t h水平提 高， 单独注射l h r h - a能使血清g t h水平有一定 程度提高; 而l h r h - a和d o m 联合注射时，处理1 2 h 血清g t h水平开始上升并达到峰值4 21 对鱼类直接注射或投喂外源性类固醇激素， 会很快被代谢清除， 如反复注射 或投喂， 对鱼刺激大， 也浪费药品。若用性类固醇激素的缓释制剂， 则可在加快鱼 性腺发育的同时， 减少操作次数， 减轻对鱼的刺激， 节约药品， 在生产上是很有意 义的。 含类固醇激素的微囊或微球制剂用于鱼类催熟， 既能达到激素缓释的目的， 又可减轻操作上对鱼的刺激。 在鱼类催熟方面， 微囊制剂研究还比较少。有一些 学者 在 研究 用微球制剂来 催熟、 催 产鱼类， 如m y l o n a s 等4 6 用 含促黄体激素 释放 激 素 类 似 物 的 脂 质 体 微 球 来 催 熟 条 纹 狼 妒 、 红 海 明 ， m o r o n e s a x a t i l is , c l a ire 等 44 - 4 6 用含 辜酮的 聚乳酸微球促进条纹 狼妒幼鱼性腺的发育. 但他们所 用的 微球制 备工艺 存在比 较复杂的缺点 ， 限 制了 应用。 我国学 者邓岳松， 林 浩然等4 6 1 以日 本鳗 鲡为实验对象， 研制一种含类固醇激素的微囊， 以 达到减少操作次数、 减轻操作麻 烦( 将埋植改为注射， 减少对鱼的刺激) 、减少药品用量的目 的。 为此本试验使用l r h - a 与多巴 胺抑制剂地欧酮( d o m p e r i d o n e , d o m ) 进行 混合注射消除或抑制多巴 肢对脑垂体g t h细胞分泌活动的抑制， 进而增强g n r h 促进g t h 细胞分泌促性腺激素，诱导卵母细胞成熟和排卵。 1 . 4鱼类卵巢发育程度的判断 鱼类卵巢成熟度的划分有目 测法、 组织学测定法、 成熟系数测定法和卵径测 定法等不同方法。 多数硬骨鱼卵巢发育过程， 依据卵巢的体积、 色泽、卵子的成 熟与否等标准， 一般可以 分为六个时期， 在不同种间， 划分的标准稍有差别。 各 种鱼类卵巢发育分期的标准不完全一样，我国沿用前苏联学者提出的分期标准， 习 惯把鱼类卵巢的 发育 划分为 六个时 期4 7 - 4 9 第1 期: 为卵原细胞向初级卵母细胞过渡的阶段， 核很大， 占细胞体积的一 半;核内染色质细线状，核仁数少。 第ii期:为初级卵母细胞的小生长期阶段;核仍占很大比例，核仁数增加， 靠近核膜内侧分布;细胞外具单层滤泡膜。 第m期:为初级卵母细胞进入大生长期阶段; 在质膜外有二层滤泡膜， 细胞 外周起先出现一层小型卵黄囊，其数目 和大小以后随着卵母细胞的生长而增加。 核膜变得凹凸不平， 借以 增加核质和卵质的接触面。 大部分核仁仁分布在核膜的 边缘，少数分散在核中央. 第w期: 为初级卵母细胞卵黄颗粒积累并完成卵黄生成的阶段。 许多学者主 张将第n期卵巢分为n i v 2 ,w。 等三个小期， 这在人工繁殖工作中是非常重要 的。w; 期卵母细胞上的油滴细小分散于卵质内的卵黄粒之间; w: 期卵母细胞油 滴变大，并向核周围集中;w: 期核开始由中央直接移向动物极，核偏移说明卵 母细胞已经进入成熟期。 核仁向核的中央移动， 并逐渐溶解在核浆中， 表明细胞 核由 胚泡状态过渡到成熟状态。 卵黄膜增厚， 并发生辐射纹。 许多实验证明， 卵 母细胞处于w， 期时， 用人工催产不能得到成熟的卵粒， 只有在ny -n7 期， 细胞 核处 于偏心时， 人工 催产 才能 够获得成熟的卵粒， 从 而使 催产成功【洲11 。 第v期: 为初级卵母细胞经过成熟分裂向次级卵母细胞过渡的阶段细胞质中 充满粗大的卵黄颗粒， 在卵质的边缘仁有液泡. 细胞核位置偏移， 出现卵黄与原 生质的极化。 第v i 期: 为产卵 后不久的卵巢; 卵巢组织中有排空的滤泡囊壁; 未排出的成 熟卵粒逐渐被分解和吸收。 1 . 5本实验的研究方法和意义 本实 验选用 h e , m a l l o ry - h e i d e n h a i n - a z a n 、 组织化 学等染色方法和体视学 方法研究乌鳄、草鱼、卿鱼脑垂体的形态结构和内分泌细胞的分布，其中h e , m a ll o ry - h e i d e n h a i n - a z a n 两 种方法采用 石蜡切片， 组 织化 学方法 采用 冰冻切片. 通过这些方法， 我们在繁殖期和非繁殖期对乌够、 草鱼、 鲤鱼注射促性腺激素释 放激素类似物 ( l h r h - a)和多巴胺拮抗物 ( d o m)后，取出脑垂体制作切片。 1 引言 取出 性腺制作切片， 观察性腺发育阶段以检验注射催产素的效果。 用体视学方法 对脑垂体不同部位的内分泌细胞的体积密度和数密度进行测算， 比 较不同时期注 射催产素后脑垂体不同 部位的内分泌细胞的分布是否存在差异尤其是促性腺激 素释放细胞。 另外还比 较脑垂体内碱性磷酸酶( a k p a s e ) ， 酸性磷酸酶( a c p a s e ) 和腺昔三磷酸酶 ( a t p a s e ) 活性的差异。 应 用h e . m a l l o ry - h e id e n h a i n - a z a n 等 各 种组 织 学染 色 方法、 组织化 学、 免 疫组织化学和电镜研究各种性外源激素对鱼类性腺发育的影响， 对鱼类促性腺激 素释放的作用， 以及对鱼类脑垂体促性腺激素释放细胞超微结构的影响的实验性 研究较为常见。 对注射性外源激素后鱼类脑垂体的形态学变化及脑垂体不同部位 的内 分泌细胞分布的影响的研究较少。 另外还未发现用体视学方法研究鱼类脑垂 体内分泌细胞的分布的研究。 因此本实验在催产素对腺垂体内 分泌细胞的影响方 面具有一定的意义， 还为用体视学定量研究脑垂体内内分泌细胞提供了借鉴。 同 时也为鱼类人工繁殖提供了理论依据。 2 材料与方法 2 材料与方法 2 . 1 2 。 1 。 实验材料 1实验动物 乌鲤、草鱼、卿鱼同年5 月和1 1 月两次采自 江西省南昌市周边水域，雌雄 均有。 5 月采集乌鳗2 0 尾， 其中 雄鱼2 尾、 雌鱼1 8 尾， 体长3 9 . 4 士1 . 6 7 厘米， 体重6 0 8 士7 4 . 2 9 克; 草鱼2 0 尾， 其中雄鱼1 尾、 ， 雌鱼1 9 尾， 体长4 7 . 7 6 土5 . 1 8 厘米， 体重8 1 7 士7 2 . 4 2 克; 卿鱼2 0 尾， 全为雌鱼， 体长2 7 . 4 8 土1 . 6 1 厘米， 体重 4 1 4 士 2 2 . 2 4 克。 1 1 月采集乌鲍2 0 尾，其中雄鱼3 尾、雌鱼 1 7 尾，体长3 3 . 3 5 士 5 . 2 3 c m, 体重5 4 3 . 3 9 15 8 . 6 3 g : 草鱼2 0 尾， 其中雄鱼2 尾、 雌鱼1 8 尾， 体长3 5 . 6 9 16 . 8 5 c m ， 体重7 5 6 . 4 4 1 8 4 . 5 6 g ; 螂鱼2 0 尾， 其中雄鱼1 尾、 雌鱼1 9 尾， 体长2 5 . 4 6 士3 . 8 1 c m ，体重3 0 4 . 9 2 士2 7 . 2 7 g . 2 . 1 . 2主要仪器设备 石蜡切片 机、 恒冷箱 切片机、 恒温水浴锅、 o l y m p u s 光学显微镜、 数码显微 摄影装置、形态分析软件 ( 江苏捷达科技有限公司) . 2 .1 . 3主要药品与试剂 0 . 6 5 %生理盐水、 酒精， 福尔马林固定液、 h a rr i s 苏木精、 复制曙红、 o c t 包埋剂、 液氮、 甘油明胶、中性树胶、 2 %巴比 妥钠、 3 %d 一 甘油磷酸钠、 2 %无 水氯化钙、 醋酸一巴比 妥缓冲液、 a t p 钠盐、 0 .2 m t r i s - 马来酸缓冲液、 2 % 硝酸 铅、抓化硝基四氮哇兰 ( n b t ) . 0 . 1 m p b s磷酸缓冲液、o . 1 m唬拍酸钠、盐酸 色胺、 促黄体激素释放激素类似物 ( l r h - a ) ( 宁波市激素制品有限公司) 、 多巴 胺拮抗物d o m ( 宁波市激素制品有限公司) 。 2 . 2实验方法 2 .2 .1动物分组及给药 动物随机分为四个组: 非繁殖期对照组、萦殖期对照组、非繁殖期给药组和 2 材料与方法 繁殖期给药组。非繁殖期对照组:乌嫂、草鱼、卿鱼各 1 0 条，每条鱼胸腔注射 鱼类生理盐水 ( 0 . 6 5 %) 1 . 5 m l 。 在给药组中按照林彼方法进行给药。非繁殖期 给药组:乌鲍、草鱼、 细鱼各1 0 条，每条雌鱼胸腔注射0 . 5 m l 鱼类生理盐水含 有l r h - a 5 0 微克 斤克 体重十 l m l d o m溶剂含有d o m 5 毫克 汗克体 重(6 ) ， 雄 鱼l r h - a和 d o m的量减半。繁殖期对照组:乌鳗、草鱼、卿鱼各 1 0 条，每 条鱼胸腔注射鱼类生理盐水 ( 0 . 6 5 %)1 . 5 m 1 .繁殖期给药组:乌组、草鱼、卿 鱼各1 0 条，每条雌鱼胸腔注射0 . 5 m 1 鱼类生理盐水含有l r h - a 5 0 微克/ 千克体 重+i m l d o m 溶剂含有d o m 5 毫克/ 千克体重， 雄鱼l r h - a和 d o m的量减 半。 2 .2 .2取材 在注射1 2 小时后， 活体开颅， 小心快速取出完整的脑垂体。 另外雌鱼的性腺 也完整取出。 2 . 2 . 3 h e 染色 脑垂体用h e l l y 氏 液固定 2 4 h ， 流水冲洗2 4 h , 脱水， 透明， 石蜡包埋， 切片 厚度6 l ( m ， 裱片。 切片脱 蜡， 复水 至7 0 % 酒精， 进入碘酒脱汞， 再进入 硫代硫酸 钠脱碘，经过蒸馏水后，入h a r r i s 苏木精染3 0 - 4 0 分钟，自 来水洗，盐酸酒精分 色，自 来水蓝化， 梯度酒精脱水至9 5 %酒精， 进入复制曙红染1 0 - 1 5 分钟， 无水 酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。 雌鱼的性腺用b o u i n 氏液固定1 2 小时后用7 0 酒精冲洗，脱水，透明后石蜡 包埋， 切片厚度6 a m , 裱片。 切片脱蜡，复 水至7 0 % 酒精， 蒸馏水后， 入h a r ri s 苏木精染3 0 - 4 0 分钟，自 来水洗， 盐酸酒精分色，自 来水蓝化， 梯度酒精脱水至 9 5 %酒精， 进入复制曙红染1 0 - 1 5 分钟， 无水酒精脱水， 二甲 苯透明， 中性树胶 封片。 2 . 2 . 4 m a l l o r y - h e i d e n h a i n - a z a n 染色法染色 脑垂体用h e l l y 氏 液固定2 4 h ， 流水冲洗2 4 h ， 脱水， 透明， 石蜡包埋， 切片 厚度6 g m ， 裱片。 切片 脱蜡， 复 水 至7 0 9 /6 酒精， 进入碘酒脱汞， 再进入 硫代硫酸 钠脱碘，入蒸馏水后，进入偶氮洋红在5 6 下染3 -5 分钟，蒸馏水速洗，用1 % 苯胺酒精分色，经9 5 %, 9 0 %, 7 0 %酒精复水至蒸馏水， 浸入5 % 磷钨酸水溶液 中媒染2 0 分钟， 蒸馏水速洗， 再进入苯胺蓝、 桔黄g 染液5 -8 分钟， 蒸馏水速洗， 9 5 酒精分色后，无水酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。 z 材料与方法 2 . 2 . 5 a k p a s s 新 鲜脑垂体加 o c t 包埋剂， 液氮骤冷， 冷箱 切片， 切片厚度l o p m 。 用钙钻法 显示a k p a s e 。 切片经4 冷福尔马林一钙溶液固定5 分钟，蒸馏水冲洗， 入2 %巴 比 妥钠、 3 %a 一 甘油磷酸钠、 2 % 无水氛化 钙、 5 % m g s 认. 7 h 2 0 配制的 作用液在 3 7 下作用3 5 分钟，流水洗， 2 %硝酸钻5 分钟，蒸馏水冲洗，2 %硫化胺显色， 蒸馏水冲洗，甘油明胶封固。 2. 2 . 6 a c p a s e 新鲜脑垂体加 o c t 包埋剂， 液氮骤冷， 冷箱切片， 切片厚度i o p m 。 用 硫化铅 法显示a c p a s e 。 切片经4 冷福尔马林一 钙溶液固定， 蒸馏水冲洗， 入醋酸一巴 比 妥 缓冲液、 3 .3 % 硝酸铅、 3 .2 % 甘油磷酸钠、 0 .6 % m g s o 4 配制的 作用液 在 3 7 0c 下作用5 0 分钟，蒸馏水洗，1 %冰醋酸3 0 秒，蒸馏水洗， 2 %硫化胺显色， 蒸馏水 五分钟， 甘油明胶封固。 2 . 2 . 7魄r 激活的a t p a s e 新鲜脑垂体加o c t 包埋剂，液氮骤冷， 冷箱切片，切片厚度l o g m . 用硫化 铅法显示m g z 激活的a t p a s e 。 切片直接入a t p 钠盐、 0 .2 m t r i s 一 马来酸缓冲液、 2 % 硝酸 铅、 2 . 5 % m g s o 4 -7 h 2 0作用液在3 7 下作用6 0 分钟， 蒸 馏水 洗， 2 % 硫 化胺显色，蒸馏水洗，甘油明胶封固。 2 . 2 . 8 统计分析 每尾鱼 各取5 张 用m a ll o ry - h e i d e n h a i n - a z a n 染色法染色的 切片， 每张 切片在 1 0 0 倍光镜下用显微摄影装置拍下r p d , p p d 和p i 完整的照片。 用j d 8 0 1 形态分 析系统测量出每张照片上r p d , p p d 和p i 各自 的面积( a ,j ,嗜酸性细胞和嗜碱性 细胞在r p d , p p d 和p i 各自 的总面积( a , ) 、形态因子 ( f , ) 和平均截距( 1 ) 。根 据体视学公式: v .( 体积密度) v( 平均体积) n ， ( 数密度) = a x / a r， f . x (1) v ,/v 计算出嗜酸性细胞和嗜碱性细胞在繁殖期或非繁殖期不同部位的体积密度、 平均体积和数密度. 所得数据用s p s s 1 3 . 0 统计软件在对不同组同种鱼嗜酸( 碱) 2 材料与方法 性细胞脑垂体前外侧部、 中外侧部和垂体中间部中的体积密度、 数密度进行配对 t 检验以 及在对同一组不同鱼种的嗜酸 ( 碱) 性细胞在r p d . p p d 和p i 中的体积 密度、 数密度进行配对t 检验。 每尾鱼各取5 张用组织化学方法处理的脑垂体切片， 每张切片在1 0 0 倍光镜下 用显微摄影装置拍下脑垂体完整的照片。用j d 8 0 1 形态分析系统测量出每张照片 上脑垂体酶活性部位的灰度值。 所得数据用s p s s 1 3 . 0 统计软件对每种鱼在四 组 中脑垂体酶活性部位的灰度值进行配对t 检验。 3 实验结果 3实验结果 3 . 1乌 鳗、 草鱼、 卿鱼脑垂体的组织学观察 3 . 1 . 1神经垂体 三种鱼的神经垂体均由神经纤维束、神经纤维束间的垂体细胞和微血管组 成。 神经纤 维经m a l l o ry - h e i d e n h a i n - a z a n 染色呈淡 蓝色。 神经纤维之间稀疏夹杂 着垂体细胞，垂体细胞经a z a n 染色呈浅蓝色，分布于神经垂体的各部 ( 图1 ) e h e 和m a l l o ry - h e i d e n h a in - a z a n 染色的 切片 可见乌鲤的 神经垂体 位于垂体的 背侧呈扁平状并占 据大部分位置， 镜下可见神经垂体与下丘脑有神经相连， 还可 见两者之间有第三脑室。 从神经垂体发出的许多神经纤维束插入腺垂体， 然后分 出神经纤维末梢伸入到腺垂体的各部分甚至可到达分泌细胞之间， 另外有粗大的 神经纤维束一直伸入到垂体中间部 ( 图2 ，图3 ) : 草鱼、 铆鱼从下丘脑发出粗大 的神经纤维束从腺垂体的背后端插入， 发出的神经纤维将腺垂体成许多小叶， 最 后终止于垂体中间部 ( 图4 一图7 ) e 3 . 1 . 2 .腺垂体 根据h .e . 染色结果， 我们观察到乌鲍的垂体r p d位于垂体的背部偏于吻侧， p p d位于垂体的中部的区域， p i 位于垂体腹面;草鱼的r p d位于垂体的尾端， p p d位于垂体的中部区域和腹面的中部， p i 位于垂体吻端: 铆鱼的r p d位于垂 体背侧的中间部位而p p d位于垂体的尾端和腹面， p i 位于垂体吻端和腹面。 根 据以 上结果表明: 乌醋脑垂体的形态结构为前后型， 草鱼、 铆鱼脑垂体的形态 结构为背腹型. 乌鲤、 草鱼和卿 鱼脑垂体r p d中。 嗜酸性细胞被m a l l o ry - h e i d e n h a i n - a z a n 染为 红色， 嗜碱性细胞被m a l l o ry - h e i d e n h a i n - a z a n 染为 蓝色 ( 图8 ) ， 嫌色细胞 分散在这三种鱼脑垂体 r p d中的嗜酸性细胞和嗜碱性细胞之间，整个细胞都不 着色，数量极少。 在这三种鱼脑垂体p p d中 嗜酸性细胞和嗜碱性细胞围 绕神经纤维成簇排列， 细胞排列紧密，嗜酸性细胞紧密地聚集成群夹杂在嗜碱性细胞之间 ( 图 9 ) 。在 这三种鱼p p d中的 这两种细胞染色较腺垂体其他部 位更深，另外在三种鱼脑垂 体p p d中都观察到了少量未染上色的嫌色细胞 ( 图1 0 ) . 在三种鱼的p i 都只观察到两种内分泌细胞。一种为弱嗜碱性细胞，呈浅蓝 色， 细胞密集成堆主要分布在神经纤维边( 图1 1 ) 。 另一种为嫌色细胞未染上色， 数量极少。 3实验结果 3 . 2乌绘、草鱼、螂鱼脑垂体的组织化学观察 3 . 2 . 3 a k p a s s 碱性磷酸酶广泛存在于机体组织，