孕产妇及其所生儿童艾滋病检测技术要点介绍PPT课件.ppt

1,孕产妇及其所生儿童艾滋病检测技术要点介绍,.,2,规范化检测及管理管理：检测工作管理办法检测：检测技术规范质控：质控指南信息实验室网络通讯,3,3,HIV(-)HIV急性感染HIV长期感染艾滋病期抗体检测核酸检测核酸检测抗原检测抗原检测CD4细胞抗原检测病毒分离病毒分离病毒载量病毒分离耐药监测耐药检测耐药检测CD4细胞CD4细胞新感染检测,4,5,内容,孕产妇艾滋病检测技术要点HIV暴露婴儿早期诊断技术要点,6,一、孕产妇艾滋病检测,参照全国艾滋病检测技术规范（2014年修订版）中临床诊断相关的检测策略进行孕产妇艾滋病检测。,7,全国艾滋病检测技术规范（2014年修订版）中的变化,2009年版,2014年版,8,检测流程,孕产妇初次接受孕产期保健时，首先进行艾滋病抗体筛查试验。筛查试验结果有反应者，使用原有试剂和另外一种筛查试剂进行复检，也可使用原有试剂双份进行复检。根据复检结果，确定是否进行补充试验。依据补充试验结果，判定感染状况（详见图2）。临产时才寻求助产服务的孕产妇，需同时应用两种不同的快速检测试剂进行筛查，根据筛查检测结果，及时提供后续服务（详见图3）。,9,图2：孕期艾滋病检测及服务流程,10,图3.产时艾滋病抗体检测及服务流程（适用于孕期未接受HIV检测的产妇）,11,补充试验（核酸）,12,感染HIV后各种标志物消长变化,13,检测方法,孕产妇艾滋病检测方法包括抗体筛查试验和补充试验。抗体筛查试验包括快速检测（RT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光免疫试验（CLIA）、明胶颗粒凝集试验（PA）等。补充试验包括抗体补充试验和核酸补充试验等。建议首选抗体补充试验，如蛋白免疫印迹试验（WB，原确证试验）、条带/线性免疫试验（RIBA/LIA）。,14,1.快速检测试验（RT）原理*,免疫层析（IF）/免疫渗滤（FT）颗粒凝集（PA）*最新快速HIV试剂检测HIV抗体比第三代EIA晚28天,15,无反应,有反应,16,16,快速检测结果判定,17,（2）明胶颗粒凝集试验（PA）,样品稀释，分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒，混匀后保温（室温）。血清中有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应；根据凝集情况判读结果。,18,PA定性试验,C对照颗粒S致敏颗粒,19,20,20,快速检测试验的特点,HIV抗体快速检测方法有以下一些主要特点：（1）HIV抗体快速检测试剂大部分均为一步法，一般在1530分钟可获得结果。（2）HIV抗体快速检测判定结果一般采用目测，而且操作方便，不需要特殊仪器设备。,21,21,（3）HIV抗体快速检测技术本身对检测技术人员要求不高，适用于各级实验室。（4）产前未接受过HIV抗体检测的急产、临产的产妇进行快速检测，可及时得到结果，便于采取措施，有效阻断母婴传播。（5）在发生职业暴露后，为了做好暴露后预防，如果不明确暴露源是否是HIV感染者，应立即进行抗体快速检测，阳性者再进行病毒载量测定。,22,不同厂家的试剂操作要求,23,2化学发光试验,试剂和原理化学发光免疫分析（ChemiluminescenceImmunoassay，CLIA）是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种：（1）化学发光标记免疫分析法：其化学反应简单、快速、无须催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。.（2）化学发光酶免疫分析法：从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析（ChemiluminescentEnzymeImmunoassay，CLEIA）应属酶免疫分析，只是反应的底物是发光剂，操作步骤与ELISA分析完全相同。以酶标记生物活性物质（如酶标记的抗原或抗体）进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。,24,24,25,抗体检测中的问题,初筛实验中的假阳性血液恶性病变自身免疫性疾病多发性胆汁型肝硬化酒精性肝炎疫苗接种（流感，乙肝）多发性骨髓瘤肾移植或慢性肾衰竭疟疾或丝虫病其他,26,抗体检测中的问题,初筛实验中的假阴性窗口期免疫移植换血输血恶性肿瘤免疫功能丧失（B细胞功能缺损）其他（试剂或操作原因）,27,20112013年HIV抗体检测试剂临床质量评估结果汇总表,28,20112013年HIV抗体检测试剂临床质量评估结果汇总表,29,20112013年HIV抗体检测试剂临床质量评估结果汇总表,30,三、孕产妇抗病毒治疗的相关检测,用药前，进行CD4+T淋巴细胞计数、病毒载量检测及其他相关检测（包括血常规、尿常规、肝功能、肾功能、血脂、血糖等）。用药过程中，每三个月进行1次CD4+T淋巴细胞计数及其他相关检测（同前）。孕晚期，进行1次病毒载量检测，并在分娩前获得检测结果。,31,应用复方新诺明预防机会性感染,应用对象包括：CD4+T淋巴细胞计数200个细胞/mm3的艾滋病感染孕产妇和CD4+T淋巴细胞百分比15%的艾滋病感染儿童。复方新诺明用药方法、停药指征及注意事项等详见预防艾滋病母婴传播技术指导手册。,32,32,32,32,治疗的首要直接目的是抑制病毒的复制。病毒载量主要用于衡量治疗药物的效力达到此目的程度病毒载量通过定量测定HIVRNA的含量来确定每毫升血浆中病毒的粒子数每毫升血浆中能够检测到的HIV拷贝数的范围在50到100万之间（取决于含量测定）,病毒载量,33,33,33,在HIV/AIDS中进行病毒载量检测的意义,一、早期诊断和辅助诊断二、病程监控、预测疾病进程三、开始进行抗病毒治疗的指针四、评价药物的疗效（无效、耐药）,34,34,34,评价药物的疗效,检测的频度应在基线后每3-4月进行1次新药应在2-4周进行。病毒载量下降50%(0.3log10)才有意义治疗理想的反应：第4周病毒载量下降1.5-2log10,12-16周小于500cp/ml,16-24周小于50cp/ml,35,35,36,36,36,CD4细胞计数,CD4细胞计数检查系一项对每立方毫米血液中的CD4细胞进行计数的检测，可直接测定患者免疫系统的状态。因此，CD4细胞计数既是HIV感染治疗需要的测定，也是治疗工作成功与否的衡量标准因此，CD4细胞计数既是治疗需要的测定，也是治疗成功与否的衡量标准检测时，对细胞表面带有CD4分子的T淋巴细胞进行标记并计数,37,37,37,CD4+T细胞绝对数的临床意义,评价免疫功能减退的程度和AIDS进程指导治疗策略的制订确定预防机会感染的最佳时机监控抗逆转录病毒（ARV）治疗、细胞因子治疗和保护治疗性疫苗的疗效,38,检测HIV/AIDS中CD4/CD8的意义,确定抗HIV的治疗时间药物疗效的重要判断指标（治疗8周后CD4+T淋巴细胞数量增加50/ul）,）,39,内容,孕产妇艾滋病检测技术要点HIV暴露婴儿早期诊断技术要点,40,及早诊断对个体的必要性,1、对于感染儿童：及早干预与治疗，功能性治愈2、对于阴性结果：,41,7.4%7.1%,7.4,7.1,7.4,7.1,42,感染儿童的高死亡率,43,母亲HIV抗体经胎盘进入胎儿，出生时新生儿和婴儿早期抗体阳性，不一定是感染出生时母亲的抗体，8090%在生后912个月消失，出生后18个月基本上全部消失18个月后儿童HIV仍然阳性，视为自身感染产生的抗体,18个月以下婴幼儿的HIV诊断,44,18个月以下婴幼儿的HIV诊断,检测HIVDNA或RNA但推荐检测HIVDNA,因为HIV前病毒DNA以细胞内前病毒感染状态存在，所以它不受母亲围产期抗病毒治疗的影响和婴幼儿预防性抗病毒治疗的影响.不得使用脐带血.,45,婴儿艾滋病感染早期诊断工作方案,对HIV阳性产妇所生儿童于出生后6周和3个月时，分别采集血标本，进行婴儿感染早期诊断。详见图6婴儿艾滋病感染早期诊断检测及服务流程。未进行婴儿早期诊断检测或婴儿早期诊断检测结果为阴性的儿童，应于12、18月龄进行艾滋病抗体筛查及必要的补充试验，以明确艾滋病感染状态。儿童抗体检测及服务流程见图7。,46,艾滋病感染孕产妇所生儿童艾滋病抗体检测及服务流程（图7）,47,图6.艾滋病感染孕产妇所生儿童艾滋病感染早期诊断检测及服务流程,48,WS293-2008_艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准,49,检测方法(定性）,1）COBASAmplicor/COBASTaqManHIV-1QualTest2)雅培HIV-1婴儿核酸诊断试剂盒3）IN-HOUSE（国内开展，2014年检测技术规范）,50,HIV复制周期,51,雅培HIV-1婴儿核酸诊断试剂盒,同时扩增检测HIV-1RNA和DNAWHO推荐同时检测HIV-1RNA和DNA样本类型:干血斑和血浆(0.2mL)靶区域:INT/pol荧光探针设计:独特的部分双链探针设计保证对各种不同亚型HIV-1的准确检测仪器平台：全自动m2000系统(m2000sp和m2000rt),52,使用打孔器打下2个血斑,雅培RealTimeHIV-1检测试剂盒样本准备:干血斑,将干血斑置于含1.4mL雅培裂解缓冲液中,常温孵育20分钟，间断混匀,将上清液转移至样本管准备上机检测,7.m2000仪器自动化完成核酸处理和检测,53,雅培RealTimeHIV-1检测试剂盒,54,IN-HOUSE方法：,样品类型：外周淋巴细胞、全血、滤纸片干血斑、血浆检测HIV-1DNA三个区gag区的引物F2、e2（外测）B1、b2（内侧）pol区的引物RT1、RT2（外测）RT3、RT4（内侧）env区的引物ED5、ED12（外测）ENV7、ENV8（内侧）,55,56,干血斑在HIV-1感染检测中的应用,HIV-1DNA,wash,Chelex100,release,DNA,DBS,57,实验结果判定,1、2球蛋白的基因扩增2、阳性对照3、阴性对照4、空白对照,58,检测方法（定量检测）,59,样本类型,末梢血制备DBS,抗凝静脉血制备DBS,60,60,HIV-1滤纸片干血斑样品检测技术（DriedBloodSpot，DBS）,61,滤纸片类型及其特性,*903滤纸上的样本可在-20长期保存，蛋白的保存时间依据特异蛋白特性，见后。,62,62,滤纸片干血斑用于婴儿HIV诊断,样本量非常小，(20lto200l)特别适宜采集婴儿样本。容易收集:指尖血、后跟血