（分析化学专业论文）流动注射化学发光法在药物、食品以及dna杂交分析中的应用研究.pdf

学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工 作及取得的研究成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表 示谢意 作者签名：一年堕盈巫日期：奎! 车上上 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学 位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出 版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名：1 酗* 强 日期：迎：! ! 导师签名： 日期： 彳可己 坚= 翌 - ：! 华东师范大学申请硕十学何论文 摘要 化学发光( c l ) 是指在没有任何光、电、热的作用下，只是吸收化学反应放出 的化学能而激发，产生光的辐射的发光现象。化学发光检测系统光路简单，无需 外加光源，不存在荧光分析中瑞利散射和拉曼散射以及溶剂荧光杂质产生的背景 信号，具有较高的信噪比，可获得与激光诱导荧光相媲美的灵敏度。化学发光反 应多是快速的动力学反应，较易受环境因素的影响，因此反应过程难于控制，重 现性和选择性较差，使其在定量分析中受到一定限制。 流动注射分析技术( f i a ) 是一种在非平衡状态下，溶液自动处理及分析技术， 将f i a 与c l 联用，在很大程度上克服了化学发光分析重现性差操作费时、不 便于实现自动化等缺点，从而使化学发光作为一种灵敏高效的痕量分析方法在分 析化学领域得到了迅速发展。 纳米粒子因其独特的化学和物理性质，为生物医学研究提供了新的研究途 径，同时也推动了化学和生物传感器的应用。纳米粒子独特性质与生物分子杂交 反应的特异性和流动注射化学发光的高灵敏性、重现性相结合，使其应用范围更 广泛。 本论文基于化学发光的高灵敏度检测特性结合流动注射技术研究化学发光 在药物、食品有益成分的测定以及结合纳米粒子分离、标记探索了化学发光在传 感器方面的应用。论文主要研究内容如下： 第一章：绪论 简单介绍了化学发光的原理、几种常用的反应体系、化学发光在蛋白质、 d n a 片断分析、食品分析以及药物分析中的应用，最后介绍了化学发光法与流 动注射技术、高效分离技术以及微全分析技术的联用及其应用，最后阐述了本论 文的目的和意义。 第二章：流动注射一化学发光法选择性测定复方滴鼻液中的磺胺嘧啶 本文基于在酸性条件下磺胺嘧啶、k m n 0 4 、h c h o 的化学发光反应建立了 一种简单灵敏的流动注射化学发光分析方法选择性测定了复方滴鼻液中磺胺嘧 华东师范大学申请硕十学位论文 啶。在所选择的最佳实验条件下，磺胺嘧啶的浓度与化学发光强度在8 0 x 1 0 峰0 2 o 1 0 4m o l l 范围内呈线性关系，按照i u p a c 组织的规定，以空白值的标准偏 差的3 倍，计算方法的检测限为：2 0 x 1 0 7 m o l l ( 3 0 ) 。对5 0 x 1 0 5m o l l 的磺胺 嘧啶标准溶液平行测定“次，计算测量的相对标准偏差为2 5 3 。共存的盐酸 麻黄碱等不干扰测定，因此本方法成功地用于处方药复方滴鼻液中磺胺嘧啶的测 定，结果令人满意。 第三章：基于固相萃取的流动注射化学发光测定红酒中的白藜芦醇 本文基于酸性条件下k m n 0 4 、h c h o 和自藜芦醇之间的化学发光反应建 立了一种灵敏的测定红酒中的白藜芦醇的流动注射化学发光法。红酒在分 析前用c 1 8 固相萃取小柱处理。在优化条件下，相对化学发光强度与白藜芦 醇的浓度在1 3 2 1 0 罐到1 3 2 x 1 0 巧m o l l 范围内呈现良好的线性关系。根据 砌p a c 规定，以空白值的标准偏差的3 倍为标准，计算方法的检测限为 3 3 0 x 1 0 母m o l l ，平行测定1 1 次得到的相对标准偏差为3 8 。将该法成功地 应用于红酒中自藜芦醇的含量测定，同时进行标准加入回收试验，结果令人 满意。并对化学发光反应机理做了简单探讨。 第四章：基于磁性纳米粒子的流动注射化学发光d n a 传感器 本文拟建立了一种用于d n a 杂交检测的光学传感器。该方法涉及到纳米磁 性粒子用于单链d n a 的固定、纳米c u s 颗粒用于d n a 标记以及快速灵敏的流动注 射化学发光用于定量检测。磁性纳米粒子是一种新型的固相载体，具有易于制备， 表面改性等优点。在e d a c 存在下，靶寡聚核苷酸通过5 端的氨基共价结合到 羧基化的磁性纳米粒子表面。固定在磁性纳米粒子表面的目标d n a 与溶液中硫 化铜纳米粒子标记的寡聚核苷酸探针杂交后，然后将含有d s d n a c u s 的磁性纳米 粒子溶解于硝酸溶液中，最后在流动注射化学发光仪上通过释放出来的铜离子对 碱性l u m i n 0 1 h 2 0 2 的催化作用，间接的检测d n a 杂交。该方法将有效的磁分离和 化学发光法的高灵敏度相结合，为d n a 杂交的测定提供了大有希望的应用前景， 为进一步的实验奠定了基础。 关键词流动注射化学发光分析药物分析d n a 片断 华东师范大学申请硕七学位论文 a b s t r a c t c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) i sd e f i n e d 嬲t h ee m i s s i o no fe l e c t r o m a g e n e t i e r a d i a t i o np r o d u c e db yac h e m i c a lr e a c t i o n t h er e a c t i o nc a l lt a k ep l a c ei ng a s ，l i g u i d ， a n ds o l i dp h a s e c la n a l y s i si sc h a r a c t e r i z e db ys e n s i t i v i t y , s i m p l i c i t ya n dl o w - c o s t i t r e q u i r e sn ol i g h ts o u r c e sa n dt h u sv o i d st h ee f f e c t so fs t r a yl i g h ta n dt h ei n s t a b i l i t yo f l i g h ts o u r c e m o s tc lr e a c t i o n sc a l lf i n i s hi ns e v e r a ls e c o n d sa n da l ep r o n et ot h e e n v i r o n m e n t a le f f e c t t h u s ，t h eu s eo fc la s s a yi nq u a n t i t a t i v ea n a l y s i si sl i m i t e d t h ef l o wi n j e c t i o na n a l y s i si sas o l u t i o nt r e a t m e n tm e t h o di nn o ne q u a t i o n a l s t a t e i t sc o m b i n a t i o nw i f hc h e m i l u m i n e s c e n c ep r o v i d e sh i 曲e f f i c i e n c ya n da c c u r a c y f l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c eb e c o m e sm o r ea n dm o r ei m p o r t a n ti nm a n yf i e l d s t h ee m e r g e n c eo fn a n o t e c h n o l o g yi so p e n i n gn e wh o r i z o nf o r t h ea p p l i c a t i o no f n a n o p a r t i c l e si na n a l y t i c a lc h e m i s t r y t h eu n i q u ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so f n a n o p a r t i c l e so f f e re x c e l l e n tp r o s p e c t sf o rc h e m i c a la n db i o l o g i c a ls e n s o r c o u p l i n g s u c hu n i q u ep r o p e r t i e s a n dt h eh i g hs e n s i t i v i t yo f f e r sg r e a tp o t e n t i a lf o r t h e a p p l i c a t i o no fc la n a l y s i s i nt h i s d i s s e r t a t i o n ，w ec o u p l e dt h ef l o w 两e c t i o na n a l y s i sw i t hs e n s i t i v e c h e m i l u m i n e s c e n c et or e s e a r c ht h ea p p l i c a t i o no fc li np h a r m a c e u t i ca n a l y s i s ，f o o d a n a l y s i sa n dt h es p e c i f i cs e q u e n c ed n aa n a l y s i s t h ed i s s e r t a t i o ni sc o m p o s e do f f o u r c h a p t e r sa sf o l l o w i n g s ： c h a p t e rl ：i n t r o d u c e dt h em a i nc lp r i n c i p l e , o f t e nu s e dr e a c t i o ns y s t e m ，t h e a p p l i c a t i o no fc li nt h ea n a l y s i so fp r o t e i na n dd n a ，f o o da n dm e d i c i n e ，a n ds o m e c o u p l i n gt e c h n i q u e sw i t h c l , i n c l u d i n gf l o w - i n j e c t i o na n a l y s i s ，h i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa n dm i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m s a tl a s tp o i n t e do u tt h ep l l q q o o s ea n dm e a n i n go f t h ed i s s e r t a t i o n c h a p t e r2 ：f l o wi n j e c t i o n - c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e r m i n a t i o no fs u l f a d i a z i n e c o m p o u n du a r i s t i l l a e a s i m p l e ，s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v ef l o wi n j e c t i o n c h e m i l u m i n e s c e n c em e t h o df o r 2 华东师范大学申请硕士学位论文 t h ed e t e r m i n a t i o no f s u l f a d i a z i n ei nc o m p o u n dn a r i s t i l l a eh a sb e e ni n v e s t i g a t e d i ti s b a s e du p o nt h ec h e m i l i m u n e s c e n c er e a c t i o no f s u l f a d i a z i n e ，f o r m a l d e h y d ea n d p o t a s s i u mp e r m a n g a n a t ei np o l y p h o s p h a t ea c i dm e d i u m t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o r t h ec h e m i l u m i n e s c e n c ee m i s s i o nw e r ei n v e s t i g a t e d u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ， t h el i n e a rr a n g ef o rm ed e t e r m i n a t i o no fs u l f a d i a z i n ew a s8 0 x1 0 7t o2 0 x1 0 - 4 m o l lw i t had e t e c t i o nl i m i to f 2 o 1 0 1m o l lc a l c u l a t e da sp r o p o s e db yi u p a ca n d ar e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no f2 5 3 f o r1 1s o l u t i o n so f5 0 1 0 。m 0 1 l s u l f a d i a z i n eo nt h es a m ed a y i tw a sa l s of o u n dt h a tt h ec o e x i s t i n ge p h e d r i n e h y d r o c h l o r i d ed i dn o ti n t e r f e r ew i t l lt h i sd e t e r m i n a t i o n t l i sl e dt ot h es u c c e s s f u l a p p l i c a t i o no ft h ep r o p o s e dm e t h o df o rt h ed i r e c ta n ds e l e c t i v ed e t e r m i n a t i o no f s u l f a d i a z i n ei nc o m p o u n dn a r i s t i l l a e c h a p t e r3 ：d e t e r m i n a t i o no fr e s v e r a t r o li nr e dw i l l eb y s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n f l o w i n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c em e t h o d as e n s i t i v ef l o wi n j a c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c em e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e df o r t h ed e t e c t i o no fr e s v e r a t r o li nr e dw i n eb a s e do nt h ef a c tt h a tr e s v e r a t r o lc a ng r e a t l y e n h a n c ec h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o nb e t w e e nk m n 0 4a n dh c h oi ns u l f u r i ca c i d m e d i u m a n a l y t ew e r ep r e c o n c e n t r a t e do ns o l i ds o r b e n t ( c t ss o l i d p h a s ee x t r a c t i o n c a r t r i d g e ) u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ep r o p o s e dm e t h o da l l o w s t h e m e a s u r e m e n to fr e s v e r a t r o lo v e l t h er a n g eo f1 3 2 x 1 0 8t o1 3 2 x 1 0 5m o l lw i t ha d e t e c t i o nl i m i to f3 3 0 x 1 0 - 9 m o l l a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nf o r1 3 2 l o 。5 m o l lr e s v e r a t r o l ( n = l1 ) i s3 8 1 葡sm e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e df o r t h e d e t e r m i n a t i o no ft h er e s v e r a t r o li nr e dw i n e f u r t h e r m o r e ，t h ep o s s i b l er e a c t i o n m e c h a n i s mw a sa l s od i s c u s s e d c h a p t e r4 ：d n ah y b r i d i z a t i o na tm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw i t hf l o wi n j e c t i o n e h e m i l u m i n e s c e n td e t e c t i o n ad n a o p t i c a ls e n s o rs y s t e mf o rd n ah y b r i d i z a t i o na s s a yh a sb e e nd e v e l o p e d t h em e t h o di n v o l v e sm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sf o rs s d n ai m m o b i l i z a t i o na n dc o p p e r s u l f i d en m l o p a r t i c l ea so l i g o n u c l e o t i d el a b e la n df l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c e 华东师范大学申请硕士学位论文 ( f i - c l ) f o ra s s a yd e t e c t i o n t h em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sh a v et h ea d v a n t a g e so fe a s y p r e p a r a t i o n , e a s ys u r f a c em o d i f i c a t i o na n dl o wc o s t t h es s d n aw i t ht h ea m i n o g r o u pa tt h e5 e n dw a sc o v a l e n t l yi m m o b i l i z e dt ot h ec a r b o x y l t e r m i n a t e dm a g n e t i c h e a d si nt h ep r e s e n c eo f1 - e t h y l - 3 一( 3 - d i m e t h - y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d e 压d a c ) t h ec o p p e rs u l f i d e ( c u s ) n a n o p a r t i c l e l a b e l e do l i g o n u c l e o t i d e sp r o b ew a su s e dt o i d e n t i f yt h es s d n ai m m o b i l i z e do nt h em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sb a s e do nas p e c i f i c h y b r i d i z a t i o nr e a c t i o n a f t e rb e i n ga n c h o r e do nt h eh y b r i d s ，c o p p e rs u l f i d e n a n o p a r t i c l e sa r ed i s s o l v e dt oc ri nh n 0 3s o l u t i o na n ds e n s i t i v e l yd e t e r m i n e d b a s e do nt h ec a t a l y z er e a c t i o no fc 矿+ - a l k a l i n el u m i n o l - 2 0 2i nf i - c ls y s t e m t h e p r o p o s e ds y s t e mc o u p l e dt h es e n s i t i v ec lm e t h o d ，e f f e c t i v em a g n e t i cs e p a r a t i o nf o r d i m i n a f i n gn o n s p e c i f i ca d s o r p t i o ne f f e c t sw i t ht h ea b u n d a n tc u 2 + r e l e a s e df r o me a c h h y b r i da n da l l o w st h ed e t e c t i o no fs p e c i f i cs e q u e n c ed n at a r g e t sa tl e v e l sa sl o w a s 0 0 2 p m 0 1 m e a n w h i l e ，i to f f e r sg r e a tp r o m i s ef o rd n ah y b r i d i z a t i o na n a l y s i s k e y w o r d s ：f l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c e ，d n a ，f o o da n a l y s i s ，p h a r m a c e u t i c a n a l y s i s 4 华东师范大学申请硕士学位论文 第一章绪论 1 化学发光法 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，简称c l ) 是指某些化学反应发出可见光的 现象。几百年i j 人们就已经观察到化学发光现象了。最早发现的化学发光现象发 生在生物体内，即萤火虫发光，现在称为生物发光( b i o l u m i n e s c e n c e ，简称b l ) 。 物质分子在吸收能量被激发到较高的电子能态之后，在返回基态的过程中， 必须将这部分能量释放出来，如以发射辐射的方式释放能量这就是发光现象。基 态分子激发到激发念所需要的能量可以有多种来源，如光能、化学能、电能、热 能等。在化学反应过程中，分子吸收反应释放出来的化学能而产生激发态物质， 当回到基态的时发出的光辐射称为化学发光【1 】。 在1 9 世纪后期人们发现一些有机化合物的化学发光现象，然而，由于大多 数化学发光非常微弱，且存在寿命很短，因此化学发光的研究发展缓慢。直到二 十世纪6 0 年代，随着电子技术的迅速发展，集成电路的广泛使用，高灵敏度光 电倍增管的出现，才使化学发光的检测成为可能【1 ，2 】。目前，化学发光分析法 因其高的灵敏度，宽的线性范围，同时仪器设备又很简单、廉价、易微型化，在 二十世纪的最后十年发展非常迅速。在无机物、有机痕量和超痕量分析领域内都 得到了广泛应用。特别是近年来。化学发光在复杂有机物质，生物活性物质的分 析，免疫分析，芯片分析研究中得到了广泛地应用。为生命科学、环境科学、临 床医学的研究提供了许多新的、灵敏的、有效的分析手段，推动了这些学科的科 学理论及新技术的发展。 1 1 化学发光的原理及特点 化学发光是指在没有任何光、电、热的作用下，只是由于反应体系中某种物 质( 反应物、产物、中间体或荧光物质) 的分子吸收了反应所释放的能量两由基 态跃迁至激发态，然后再从激发态返回基态，同时将能量以光辐射的形式释放出 来，产生化学发光的现象。在固相、液相、气相反应中均能观察到化学发光。常 用的化学发光反应可归纳成两类，第一种类型，反应物a 和b 反应生成激发念 的c ，激发念的c 回到基态时产生光辐射； a + b _ c ， 华东师范大学申请硕士学位论文 c c + h u 第二种类型，反应物a 和b 反应生成激发态的c ，激发态的c 把能量转移 给荧光物质f 激发态的f 回到基态产生光辐射【3 】。 a + b _ c + + d ，c + f _ f + c f 奉一f + h 可见任何一个化学发光反应都包括两个关键步骤：激发和发射。因此，能产 生化学发光的反应必须满足以下几个条件：第一是反应必须能够提供足够的激发 能。通常只有那些反应速度相当快的放能反应，其焓变介于1 7 0 3 0 0 1 d m o l 之间， 才能在可见光范围内观察到化学发光现象。第二是化学反应的能量至少能被一种 物质所接受并产生激发态。最后，处于激发态的分子或原子能够释放出光子或者 将其能量转移给另一个分子，使此分子激发，然后以辐射光子的形式回至基态 【1 】。 化学发光强度( i c l ) 取决于反应的速度( d p d0 和化学发光量子效率( m c l ) i c “t ) = t b c l d p d t( 1 ) 式中m c l 可表示为：o c l ；o ，魄其中研为生成激发态产物分子的量子效率，嘶为 激发态产物分子的发光量子效率。对于一定的化学发光反应，由c l 为一定值，其反 应速度可按质量作用定律表示出与反应体系中物质浓度的关系。因此，通过测定 化学发光强度就可以测定反应体系中某种物质的浓度。原则上讲，对任何化学发 光反应，只要反应是一级或假一级反应，都可以通过公式( 1 ) 进行化学发光定量 分析。例如，在上述化学发光反应中，如果物质b 保持恒定，而物质彳的浓度变 化可视为一级或假一级反应，则 k = i c l ( t ) d t = p d a t t ) d t a t = 。o ( 2 ) 即化学发光强度与a 的浓度成正比。 化学发光分析测定的物质可以分为三类：第一类物质是化学发光反应中的 反应物：第二类物质是化学发光反应中的催化剂、增敏剂或抑制剂；第三类物质 是偶合反应中的反应物、催化剂、增敏剂等。这三类物质还可以通过标记方式用 来测定人们感兴趣的其他物质，迸步扩大了化学发光分析的应用范围【3 】。 化学发光分析突出的优点在于不使用任何外来光源，从而避免了瑞利散射和 拉曼散射等的干扰，大大提高了信噪比，因而化学发光分析法一般都有很高的灵 敏度，特别是对一些气体及痕量金属离子的监测，其检出限一般可达p p b 级，个 华东师范大学申请硕士学位论文 别达到p p t 级。若与酶法结合，检测限可达分子水平：线性范围宽达六个数量级 【4 】；而且化学发光分析仪器设备简单、操作方便、快速，易于实现自动化。 1 2 常见的化学发光体系 1 2 1 酰肼类 酰肼类如鲁米诺( 3 。氨基一邻苯二甲酰胼) 、异鲁米诺( 4 氨基邻苯二甲酰胼) 、 萘一2 ，3 二羧基酸酰肼等都有化学发光性能。人们已经对鲁米诺的化学发光反应 进行了详细的研究【5 9 1 。最早由a l b r e c h t 在1 9 2 8 年提出，鲁米诺及其衍生物在 碱性条件( p h = 1 0 一1 1 ) 下能够被很多氧化剂( h 2 0 2 、k 1 0 4 、k m n 0 4 、活性氧等) 氧化发出微弱的光。其中h 2 0 2 最为常用。进一步加入某些氧化剂或者催化剂， 如n a c l o 、f e ( i i ) 、m n ( i i ) 、c u ( i i ) 配合物离子、黄嘌呤氧化酶、辣根过氧化 物酶、h e r o i n 、过度金属离子、一些增敏剂等，可以大大地提高化学发光强度。 研究表明，鲁米诺的化学发光量子产率与溶液的p h 值，反应介质、自身结构及 氧化条件等都有关系，如在二甲基亚砜中鲁米诺量子产率约为0 0 5 ，在水溶液系 统中约为o 0 1 0 0 2 1 1 0 1 2 1 。这些氧化剂、催化剂、增敏剂不但可以氧化、催化、 增敏鲁米诺的化学发光反应，而且发光强度直接与鲁米诺、氧化剂、催化剂、或 增敏剂的浓度呈线性关系，由此可以对这些物质进行测定。所有鲁米诺及其衍生 物的化学发光反应均为氧化反应，鲁米诺被氧化剂氧化生成3 氨基邻苯二酸的激 发态中间体，当其回到基态时发出光子，产生4 2 5 4 3 5 n m 波长的光。鲁米诺及其 衍生物由于具有量子产率商、易合成、水溶性好等特点，已成为迄今应用最为广 泛的化学发光试剂之一，广泛应用于金属离子、氨基酸、蛋白质、抗原抗体等物 质的分析检测。 1 2 2 酸性高锰酸钾化学发光发光体系 在酸性分质中，由于高锰酸钾的强氧化性，大部分有机化合物及无机物可以 与其发生氧化还原反应，其能量的转移过程往往伴随着化学发光现象，已用于生 物碱及药物等的分析测定【1 3 1 9 】。高锰酸钾化学发光反应体系的灵敏度一般较 低，常常需要在体系中加入增敏剂，常用的有：还原性物质，如：甲醛、乙二醛、 戊二醛、m n ( i i ) 、h 2 0 2 、甲酸等，荧光类物质，如罗丹明b 、核黄素、奎宁及一 9 华东师范大学申请硕士学位论文 些表面活性剂和b 环糊精等。如儿茶酚胺类药物在硫酸介质中被k m n o 。氧化， 以甲醛作增敏剂，可使发光强度提高1 0 倍 2 0 1 。k m n 0 4 氧化还原性药物如维生 素b 6 2 1 1 、核黄素【2 2 】等产生化学发光信号较弱，连二亚硫酸钠的存在可使发光 强度大大提高，其检出限可以大大降低。由于很多的有机物能够被高锰酸钾氧化， 所以高锰酸钾化学发光反应在化学发光检测中有着越来越广泛的应用。 l 2 3 过氧草酸酯类 1 9 6 3 年，c h a n d r o s s 2 3 在实验中首次发现并报道了过氧化草酸酯的化学发光 现象。过氧草酸酯化学发光反应指芳基草酸酯、氧化剂( 通常为过氧化氢) 和某 些荧光化合物的化学发光反应，是已知的最有效的非酶化学发光反应，量子产率 高达2 5 2 7 。在化学反应中，芳基草酸酯与氧化荆发生化学反应，生成一种 双氧基中间体储能物，然后将能量转移给荧光物质，激发态的荧光物质回到基态 产生光子。发生反应时，荧光物质的分子结构通常保持不变，只是起转移能量和 发射荧光的作用。化学光谱图与体系中的荧光物质的荧光光谱相同。过氧化草酸 酯类化学发光体系主要用于直接测定过氧化氢 2 4 2 6 1 ，通过过氧化氢间接测定其 它样 2 7 - 3 0 1 ，也可以用于荧光物质 3 1 - 3 4 的分析。但是，由于反应物的水溶性 较差，限制了它在分析中的应用。 1 2 4 吖啶类 1 9 3 5 年发现光泽精具有化学发光性质( 3 5 l ，后来又发现很多吖啶类化合物具 有这样的特性。研究最多的是吖啶酯类化合物。这类化合物只要在过氧化氢和碱 存在下就能迅速产生化学发光，且具有很高的发光效率。吖啶酯类化合物常应用 于化学发光免疫分析。即用吖啶酯或者吖啶磺酰胺标记抗原或抗体，用h 2 0 2 等 作为发光启动试剂。根据得到的光信号强弱来确定待测抗原抗体的量，从而用于 定性定量分析。吖啶酯类化合物标记核酸探针的优点是标记物就是发光物，体系 简单，标记效率、发光效率均很高，可以在中性或者微碱性条件下标记多肽、抗 体和抗原等，已成为性能优良的化学发光免疫分析标记试剂。水解不稳定性是吖 啶酯类化学发光标记物的一大弱点，但研究人员发现，吖啶酯可以嵌入核酸杂交 双链之间，且在嵌入后其酯键得到保护而不易被水解，由此设计出核酸杂交保护 1 0 华东师范大学申请硕士学位论文 分析( h p a ) 探针。将吖啶酯标记于探针的某个部位，探针体与待测核酸序列形成 杂交体后，探针上的吖啶酯自发地嵌入核酸杂交双链之间，过量的游离探针上的 吖啶酯迅速水解失活，而吖啶酯标记的d n a 探针与靶d n a 杂交后由于空间位 阻，吖啶酯水解很慢，保持了发光性能，这样无需分离就除去了未杂交探针的干 扰。最后通过测定被保护的吖啶酯的化学发光强度对待测核酸序列进行定量分 析。h p a 可应用于细菌和病毒的鉴别和分型以及d n a 点突变分析和染色体变芋 检测【3 6 】。 1 2 5 联吡啶钌配合物类 用于化学发光分析的钌( i i ) 配合物主要是三( 2 ，2 - 联吡啶) 钌( i i ) 【r ( b i p y ) 3 2 + 】和三( 1 ，1 0 一菲咯啉) 钌( i i ) r u ( p h e n ) 3 2 + 】。联毗啶钌是灵敏的化学发光自 剂，通过化学发光反应或电化学方式均能产生化学发光。由于r u ( b i p y ) 3 3 + 可以噩 过控制电极电势氧化而得到，分析物在电极表面与r u ( b i p y ) 3 3 + 作用，发光反应后 又生成r u ( b i p y ) 3 ”，在电极上又可以被氧化成r u ( b i p y ) 3 ”，从而使反应可以循舅 进行，因此钌联吡啶体系在电致化学发光法( e c l ) 应用最为广泛。 1 2 6 生物发光体系 生物发光( b i o l u m i n e s c e n c e ，简称b l ) 是化学发光中的特殊类型，特指芽 生在生物体内的化学发光现象，主要是由酶催化产生的。萤火虫体内的荧光素 荧光素酶是最有名的生物发光体系。其发光机理一般认为是a t p ( - - - - 磷腺酸苷) 才 解产生能量提供给荧光素，在荧光素酶的催化下氧化生成氧化荧光素，同时发身 光子。另一类生物发光体系是1 9 6 2 年从水母中提取的发光蛋i 刍1 3 7 1 ，这种发爿 蛋白不需要加入荧光素酶，只需加入钙离子或者铁离子便能通过分子内反应劣 光。发光蛋白可以被生物素化后作为生物发光标记物，具有很高的灵敏度。生彰 发光体系发光效率高、灵敏度高、选择性好，因此它在分析复杂体系中低含量玺 分时具有很大的优越性，在生物医学、临床化学等方面有巨大的应用前景 3 8 】。 2 化学发光法的应用 化学发光技术在生物技术、分子生物学、药学、临床医学以及环境科学等钮 华东师范大学中请硕士学位论文 域都有广泛的应用，有关化学发光的应用己经有很多的文献及综述报道 3 9 - 4 4 1 ， 本文仅就和论文相关的方面做一些简单的概述。 2 1 化学发光在d n a 、蛋白质等生物分子分析中的应用 蛋白质与核酸都是生命活动中最基本的物质，承载着生命体完成各种功能的 任务。蛋白质与核酸分析一直都是生命科学中的重要课题。抗原抗体分子作为一 种特殊的蛋白质，广泛存在于人的免疫系统中，对生命活动尤其在疾病控制中起 着重要的作用，因此免疫分析一直都是生命科学的前沿课题，在生物化学、临床 诊断等方面有很大的发展潜力。脱氧核糖核酸( d n a ) 是遗传信息的承担着，现代 医学的研究成果表明，许多疾病如癌症和遗传病的发生都与基因的突变有关。因 此对特定序列d n a 的分析以及对d n a 链中的碱基突变的检测在基因筛选、遗 传病的早期诊断和治疗都有深远的影响 4 5 】。 d n a 生物传感器是进行核酸的结构分析和检测的重要手段，其原理是将一 段已知序列的单链寡聚核苷酸片断( d n a 探针) 固定在某种固体基质表面，在一定 的条件下( 适当的温度、p h 值以及离子强度等) ，与特定序列的目标d n a 杂交， 并用适当的方法将样品中的目标d n a 加以检测和定量分析。在核酸杂交分析中， 制备特异、灵敏的标记探针是至关重要的。化学发光核酸探针所采用标记物是一 些能直接或者间接通过化学发光检测的物质。标记物通过酶促反应标入探针中或 通过化学修饰法将标记物连接到d 1 q a 分子上。 o a t e sm r 等人 4 6 】发展了一种h p l c 分离、化学发光检测甲状腺素( t 4 ) 新技 术。该技术先将t 4 样品与过量的吖啶酯标记的t 4 抗体反应，一定时间后将反应 液注入h p l c 进行分析；柱上固定的t 4 捕获未结合的标记抗体，而己与样品中t 4 结合的标记抗体则不被保留流出色谱柱，柱后与碱性过氧化氢溶液混合产生化学 发光；据此检测样品中的t 4 含量。 赵利霞等人 4 7 1 以磁性酶免疫测量分析为模型，建立了微板式磁化学发光酶 免疫分析法。该法是将待测物分别与碱性磷酸酶和异硫氰酸荧光素( f i t c ) 标记的 单克隆抗体反应，形成酶标抗体一抗原f i t c 标记抗体的双抗体夹心复合物； 再加入含有f i t c 修饰的磁性微球，待复合物与磁性微球结合后，加一磁场使其 沉淀到管底，分离出游离酶标抗体；然后，利用碱性磷酸酶一3 - 2 ( 27 2 - 螺旋金刚 1 2 华东师范大学申请硕十学位论文 烷) - 4 甲氧基一4 ( 3 ”磷酰氧基) 苯1 ，2 二氧杂环丁烷( a m p p d ) 化学发光体系进行 测定。采用此方法测量了绒毛膜促性腺激素，其灵敏度较商品化的分光光度法提 降。量k 文献报道的还有基于过氧化物酶【4 9 5 2 】以及r u ( b p y ) 3 2 + 5 3 5 5 】等标记的化学 发光免疫分析。 近年来，除了上述一些常见的化学发光标记物，无机纳米粒子因其独特的优 势在分析化学尤其是d n a 、蛋白质等生物分析中应用越来越广泛。纳米粒子之 所以能够引起如此广泛的兴趣，主要是因为当物质的尺寸小至日纳米范围内时，就 会具有表面效应、小尺寸效应、量子效应、隧道效应等几种特性。纳米粒子作为 生物分析的标记物，可大大改善标记物的性能，提高分析方法的灵敏度。另外， 纳米粒子具有独特的生物兼容性，蛋白质、d n a 等生物分子联结到纳米粒子表 面不会失去活性，因此，纳米粒子成为生物分析领域的新宠。有很多化学发光分 析方面的研究者将纳米技术应用到化学发光免疫分析以及核酸序列分析。 在文献 5 6 1 中，p a v o l v 等人先用金表面修饰的第一探针来捕获目标d n a ，然 后用d n a 酶功能化的金纳米颗粒作为催化标记来增强检测待定序列d n a ( f i g 1 ) 和端粒酶活性( f i g 2 ) 。如下图： 华东师范人学申请硕士学位论文 f i g 1 f i g 2 a i p i n gf a n 5 7 等建立了基于金胶标记、磁球分离的的金属免疫分析法用于 免疫球蛋白g 的测定。整个分析是这样进行的( f 嘻3 ) ：固定在磁性微球表面的第 一抗体与抗原结合后，再与金胶标记的抗体结合形成三明治结构，然后将该结构 溶解在h c l - n a c l - b r 2 中，溶解产物a u c l 4 。对l u m i n 0 1 h 2 0 2 化学反应体系有很 强的催化能力，化学发光信号与a u c l 4 。浓度成正比，以此来间接检测免疫球蛋白 g 的量。 c h e n g h u il i u 5 8 等将人类p 5 3 基因片断的一段末端巯基化的d n a 标记在 银纳米粒子上，以此为探针，通过a g + m n 2 + - k 2 s 2 0 s h 3 p 0 4 一l u m i n o t 化学发光体 系对银离子的高灵敏度测定间接的研究了d n a 的固定、杂交、错配，建立了对 特定序列d n a 片断进行超微量检测的高灵敏度的方法。 另外一些无机纳米材料纳米微晶量子点也有用做标记物在电化学 5 9 6 2 、 荧光 6 3 6 5 分析中都有广泛的应用。