（水产养殖专业论文）长江草鱼群体mhc+classⅡb基因的克隆、表达及多态性分析.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 否 如霈保密，解密时间 劫，9 年l ；月7b 独创性声明 本人声明所至交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知。除了文中特舅0 加以标洼和致谢的地方外论文中不包含其他人巴经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 面使用过的材科。指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均巳在论文中做了明确的说明。并表示了谢意 碱蜷和旅蕉、 蜊：湘年7 日 学位论文使用授权书 本入完全了解华中农业大学关予保存使用学位魂 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保j 并提供目录检索和阅览服务可以采用影印缩印或差 论文本人同意华中农韭大学可以用不同方式在不同捌 部或部分内客。同时本人保留在其他媒体发表论文的掴 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密宵韭秘密或中嗣 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者张旅蔼导师张l 矜 签名日期：2 , o t o 年6 月7 日签名日f i t ：扣, t ，年占月，日 注；请将本衷直接装订在学位论文的扉页和目录之间 _ 。一 长江草鱼群体m h cc l a s sl ib 基因的克隆、表达及多态性分析 目录 摘要1 a b s l r a c t 一3 第l 章文献综述5 l m h c 的发现。5 2m h c 的结构和功能5 3m h c 分子进化特点。7 3 1 高度多态性7 3 2 连锁不平衡9 3 3 基因倍增与重组1 0 4m h c 在渔业上的应用l l 4 1 脊椎动物适应性免疫系统的分子进化1 l 4 2 种群及生态遗传学1 4 4 3 抗病与遗传育种1 6 5 本研究的目的、意义和研究思路1 7 第2 章长江草鱼群体m h cc l a s s b 基因的表达、多态性和进化分析1 9 l 材料与方法2 0 1 1 材料2 0 1 1 1 多态性与进化分析材料2 0 1 1 2 表达材料2 0 1 2 实验仪器、试剂及溶液的配制。2 0 1 2 1 实验仪器2 0 1 2 2 实验试剂2 1 1 2 3 溶液配制2 1 1 3 总d n a 的提取2 3 1 4 草鱼总r n a 的提取2 3 1 5 总r n a 的消化( r q lr n a s e f r e ed n a s e ，p r o m e g a ) 2 4 1 6 第一链c d n a 的合成( m - m l vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e ，p r o m e g a ) 。2 4 1 7 半定量r t - p c r 2 5 1 7 1 目的片段的i m p c r 2 5 1 7 2p c r 产物琼脂糖凝胶电泳检测2 6 1 8 目的基因的克隆2 6 1 8 1 目的片段的扩增2 6 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 1 8 2 目的片段的回收纯化( t a k a r a ) 2 7 1 8 3 连接反应( t a k a r a ) 一2 8 1 8 4 感受态细胞的制备与转化( c a c 也法) 2 8 1 8 5 克隆的筛选一2 9 1 9 数据分析3 0 2 结果与分析3 1 2 1 序列的多态性一3 1 2 2 选择压力检测3 2 2 3 等位基因的系统关系3 3 2 4 种群遗传结构一3 7 2 5 用r t - p c r 检测草鱼m h ci ib 基因的表达3 7 2 5 1r t - p c r 检测草鱼m h c b 基因在正常组织中的表达一3 7 2 5 2r t - p c r 检测草鱼m h c i i b 基因在病原菌感染后组织中的表达3 9 ：、j i 屯；0 ：一一a 、 3 1 草鱼m h cc l a s s l ib 基因的进化模式4 2 3 2 种群变异及应用意义4 3 3 3 草鱼m h ci ib 的表达分析4 4 参考文献4 6 硕士期间完成的论文5 8 致谢5 9 长江草鱼群体m h cc l a s si ib 基因的克隆、表达及多态性分析 摘要 主要组织相容性复合体( m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ，m h c ) 是在脊椎动 物中发现的编码免疫球蛋白样受体的高度多态的基因群，并且其某些基因型与生物 体抗病能力存在一定的关联关系。本研究以我国重要淡水养殖经济鱼类草鱼为实验 材料，利用p c r 、r t - p c r 等技术研究了m h c i ib 基因的克隆、表达、等位基因的 多态性以及等位基因的多态性与鱼体抗病力之间的关系，为筛选抗病相关m h c i i b 基因标记和建立基因标记辅助选育技术提供基础。 ( 1 )克隆及测序了草鱼长江3 个群体的主要组织相容性复合体( m h c ) c l a s si ib 基因编码p 1 和p 2 区的第2 和第3 个外显子及两个外显子之间的内含子，分析了草鱼 m h c 的进化模式和种群遗传结构。结果共定义了3 4 个等位基因，每条序列包括长为 1 3 0 1 3 6 b p 的第2 个外显子，长为2 1 8 b p 的第3 个外显子以及长8 1 一3 7 1 b p 的内含子。 序列分析揭示，第2 个外显子有1 0 6 个核苷酸变异位点( 7 8 ) 和4 0 个氨基酸变异位 点( 8 8 ) ，而第3 个外显子有1 0 0 个核苷酸变异位点( 4 5 ) 和4 1 个氨基酸变异位点 ( 5 6 ) ，p l 变异要大于p 2 区。用邻接法( n j ) 分别构建的p 1 和d 2 序列系统树均获 得5 个高支持率的谱系，结合序列变异特点和内含子长度，推测草鱼至少存在5 个 m h cc l a s si i 座位。分别计算p l 的肽结合位点( p b r ) 、非肽结合位点及d 2 的非同义 替换率( 幽) 和同义替换率( 西) ，结果显示p b r 的d d s 为2 0 3 ( p o 0 5 ) ，非肽结合 位点和p 2 则小于1 ，表明草鱼m h c 受到歧化选择作用。根据不同群体中m h c 等位基 因分布频率的分子方差分析( f s t = o 3 7 ) ，长江草鱼群体间无遗传分化。 ( 2 )用嗜水气单胞菌感染健康草鱼，分别在感染5 h 、1 6 h 、4 0 h 、6 4 h 、8 8 h 、l1 2 h 时收集草鱼各组织材料提取总r n a ，另取健康草鱼组织作对照。以反转录合成的第 一链c d n a 为模板，应用r t - p c r 半定量检测方法对草鱼感染嗜水气单胞菌前后的 m h ci ib 基因组织表达特点进行了研究。结果表明，在正常草鱼组织中，除脑组织 以外，m h c i i b 基因均扩增出约3 5 0 b p 的片段，m h c i i b 基因较强的表达于肾脏、心 脏和肠中，中等程度表达于肝脏、脾脏和鳃中，在肌肉中表达最弱。嗜水气单胞菌 感染后，在草鱼的肝脏、肾脏、心脏、肠和鳃组织中，感染初期m h ci lb 基因表达 量都有所下降，而在感染8 8 h 的时候m h ci ib 基因表达量在所有时间点中达到最大， 1 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 感染1 1 2 h 后表达量慢慢回落至正常值；其中肠组织在1 1 2 h 时，m h c i ib 基因表达水 平依旧较高。脾脏在感染后，表达量总体处于上升趋势，8 8 h 时表达量达到最大值， l1 2 h 后慢慢回落至正常值。 关键词：草鱼；m h c ：进化模式；遗传变异；组织特异性表达 2 长江草鱼群体m h cc l a s sl ib 基因的克隆、表达及多态性分析 a bs t r a c t t h em a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ( m h c ) i sag r o u po fc l o s e l yl i n k e dl o c i p r e s e n t e di nr e m a r k a b l ys i m i l a rf o r mi na l lm a m m a l sa n dp e r h a p si na l lv e r t e b r a t e s i ti s h e t e r o d i m e rg e n ee n c o d i n gg l y c o p r o t e i nw h i c hp r e s e n t sp e p t i d e st ot 4c e l l ，a n dp l a y sa c e n t r a l r o l ei ni m m u n e s y s t e m t h i s r e s e a r c hs t u d i e dt h e c l o n i n g ，e x p r e s s i o n ， p o l y m o r p h i s ma n dt h ea s s o c i a t i o n sb e t w e e ns o m eg e n o t y p e sa n dr e s i s t a n c ea b i l i t yo f m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ( m h c ) u s i n gt h em e t h o d so fp e r , r t - p c rf r o mt h e i m p o r t a n tf r e s h w a t e rf i s hi no u rc o l l l l t r y , c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a o u ra i mw a st os c r e e n s o m em h ci iba l l e l e sa s s o c i a t e dw i t hr e s i s t a n c ei no r d e rt or e a l i z ea p p l i c a t i o no f m o l e c u l a rm a r k e r si nf i s hb r e e d i n g ( 1 ) t oi n v e s t i g a t et h ee v o l u t i o n a r yp a t t e r n sa n dp o p u l a t i o ng e n e t i cv a r i a t i o no fg r a s sc a r p ( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a ) m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ( m h c ) ，t h ed n af r a g m e n t s o fe x o n2a n de x o n3 ，e n c o d i n g1 31d o m a i na n d6 2d o m a i no fm h cc l a s si idr e s p e c t i v e l y , a n dt h ei n t r o nb e t w e e nt h e m f r o mt h r e eg r a s sc a r pp o p u l a t i o n so fc o l l e c t e df r o my a n g t z e r i v e rw e r ec l o n e da n ds e q u e n c e d at o t a lo f3 4a l l e l e sw a sd e f i n e df r o m5 7 2c l o n e s ，e a c h i n c l u d i n ga ne x o n2o f1 3 0 - 1 3 6 b p ，a ne x o n 3o f 2 1 8 b pa n d a ni n t r o no f 8 1 3 7 1 b pi nl e n g t h a n a l y s i so fa l i g n m e n t so fn u c l e o t i d ea c i da n dp u t a t i v ea m i n oa c i ds e q u e n c e sr e v e a l e d t h a tt h e r ew e r e10 6v a r i a b l en u c l e o t i d ea c i d ( 7 8 ) a n d4 0a m i n oa c i d ( 8 8 ) s i t e si n e x o n2 ，1 0 0v a r i a b l en u c l e o t i d ea c i d ( 4 5 ) a n d4 1a m i n oa c i d ( 5 6 ) s i t e si ne x o n3 ， s u g g e s t i n g m o r ev a r i a b i l i t yi n 1 31 t h a ni n1 3 2 t w op h y l o g e n e t i ct r e e sc o n s t r u c t e d s e p a r a t e l yf r o ms e q u e n c e so f61a n d6 ed o m a i n ss h o w e d5d i s t i n c tl i n e a g e sw i t hh i g h b o o t s t r a pv a l u e s ，c o n s i d e r i n gt h ed i f f e r e n ti n t r o n so fa l l e l e si nl i n e a g e s ，w h i c hi n d i c a t e di t s h o u l dh a r b o r5l o c ia tl e a s ti ng r a s se a r l ) t h en u m b e r so fs y n o n y m o u ss u b s t i t u t i o n sp e r s y n o n y m o u ss i t e ( d s ) a n do fn o n s y n o n y m o u ss u b s t i t u t i o n sp e rn o n s y n o n y m o u ss i t e ( d n ) w e r ec a l c u l a t e df o rp e p t i d eb i n d i n gr e s i d u e s ( p b r ) a n dn o n - p b ro ft h e81d o m a i na n d 6 2d o m a i n t h er e s u l t ss h o w e dt h er a t i oo fd nt od si np b rw a s2 0 3 ( p 0 0 5 ) ，w h e r e a s r a t i o si nn o n - p b ra n d1 3 2d o m a i nw e r el o w e rt h a nl ，i m p l y i n gd i v e r g e n ts e l e c t i o n i m p a c t e da tm h co fg r a s se a r l ) a n a l y s i so fm o l e c u l a rv a r i a n c e ( a m o v a ) b a s e do n a l l e l ef r e q u e n c y , f s t = 0 3 7 ，r e v e a l e dl i t t l eg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o na m o n g p o p u l a t i o n so f g r a s sc a r pi ny a n g t z er i v e r 3 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 ( 2 ) s e m i q u a n t i t a t i v er t - p c rd e m o n s t r a t e dt h a th i g he x p r e s s i o nw a sd e t e c t e di nk i d n e y , i n t e s t i n ea n dh e a r t ，l o we x p r e s s i o ni nm u s c l ea n dt h eb r a i nw a sn o te x p r e s s e d c h a l l e n g e o fg r a s sc a r pw i t hp a t h o g e n i cb a c t e r i a ，a e r o m o n a sh y d r o p h i l a ，r e s u l t e di nas i g n i f i c a n t d e c r e a s ea n dr i s ei nt h ee x p r e s s i o no fm h cc l a s si ibm r n af r o m5ht o8 8 ha f t e r i n f e c t i o ni nf i v e r , k i d n e y , h e a r t ，i n t e s t i n ea n dg i l le x c e p ts p l e e ni nw h i c ht h ee x p r e s s i o n m a i n t a i n e dt h eu p w a r dt r e n d ，f o l l o w e db yar e c o v e r yt on o r m a ll e v e la f t e rl12 h ，a n dt h e e x p r e s s i o ns t i l lk e p tu pah i g hl e v e li ni n t e s t i n ea tl12 h k e yw o r d s ：g r a s sc a r p ( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a ) ；m h c ；e v o l u t i o n a r yp a t t e r n ；g e n e t i c v a n a t i o n ；e x p r e s s i o n 4 长江草鱼群体m h cc l a s sl ib 基冈的克隆、表达及多态性分析 第1 章文献综述 1m h c 的发现 m h c 最初的发现是在研究排斥反应的过程中。2 0 世纪三十年代英国科学家 p e t e rg o r e r 在进行小鼠近交系血清移植时发现抗原排斥反应，经鉴定共发现4 组红 细胞抗原，其中抗原1 i ( a n t i g e n2 ) 只存在于某一品系的小鼠而不存在于其他品系 中，经证实这种抗原与肿瘤细胞移植易感性相似( g o r e r 1 9 3 7 ) 。其后，美国科学家 g e o g e rs n e l l 等利用近交系小鼠做肿瘤细胞移植中易感性及耐受性遗传机制的实验， 发现肿瘤只在抗原i i 阳性小鼠体内生长，在抗原i i 阴性小鼠体内被排斥。二战后， g o r e r 和s n e l l 意识到他们之前的发现其实是相同的，并且重新命名抗原1 1 为组织相 容性2 ( h i s t o c o m p a t i b i l i t y 2 ，h 一2 ) 抗原( g o r e r 鲥a l , 1 9 4 8 ) 。1 9 5 8 年，法国科学家 d a u s s e t 在首先发现人也有类似h 2 的抗原，并将人的这一抗原称为h l a ( h u m a n l e u k o c y t e a n t i g e n ) 。现在我们已经知道，所有有颌脊椎动物均存在组织相容性抗原， 它们是由一系列关系密切，相互连锁且具有高度多态性的基因编码的，这些基因群 位于染色体的一个区域上，被称为主要组织相容性复合体( m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t y c o m p l e x ，m h c ) ，如人的m h c 位于第6 号染色体的短臂( 6 p 2 1 3 ) 上。研究表明 m h c 不仅在移植排斥中起重要作用，而且也在有颌脊椎动物的适应性免疫应答中具 有重要的生物学意义。 2m h c 的结构和功能 组成m h c 的基因传统上分为i 类、i i 类和i i i 类。一是经典的m h c ( c l a s s i c a l m h c ) i 类和i i 类基因，它们是一类细胞表面糖蛋白，可识别和结合多肽，然后将 多肽呈递给t 细胞，从而引起适应性免疫反应，在结构、组织分布和功能上各有特 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 点。二是其他的基因，包括传统的类基因，以及新近确认的多种免疫功能相关基 因，它们一般不具备上述激活t 细胞的功能。 c l a s s1 分布于所有的有核细胞表面，识别和结合病毒及细胞内多肽，并呈递给 细胞性t 淋巴细胞( c y t o t o x i ctl y m p h o c y t e s ，c t l ) ( z i n k e m a g e la n dd o h e r t y , 1 9 7 4 ； d o h e r t ya n dz i n k e m a g e l ，1 9 7 5 ) 。c l a s s1 分子是一个异二聚体( h e t e r o d i m e r ) ，由一条0 【 链( 也称重链) 和一条p 2 一微球蛋白( p 2 - m i c r o g l o b u l i n ，p e m ) 组成。a 链f l t m h ci 类基因编码，具有高度多态性，可分为3 个胞外结构域( a l 、以、a 3 ，区为t 细胞 上c d s + t 的识别部位。) 、1 个跨膜结构域和1 个胞内结构域。p 2 m 形成单个结构域， 与0 【3 非共价结合。编码p 2 m 的座位不是位于m h c 复合体中，而是位于不同的染色体 上，不属于经典的m h c 。尽管p 2 m 没有多态性，不直接参与i 类分子的抗原递呈过 程，但是它能促进内质网中新合成的i 类分子向细胞表面运输，并对稳定i 类分子 的结构具有一定作用。1 9 8 7 年，获得了人类的c l a s s1 分子的晶体结构，在分子的顶 部有一个由2 个0 【螺旋衔着1 个p 折叠构成的沟槽，沟槽对应于a l 和以结构域的氨基酸 残基( b j o r k m a n e ta l ，1 9 8 7 a ，b ) 。经对c l a s s1 分子与多肽复合体的晶体检测证实，这个 沟槽就是c l a s s1 分子的多肽结合区( p e p t i d e b i n d i n gr e g i o n ，p b r ) ( s i l v e re la l ，1 9 9 2 ； g u oe ta t , 1 9 9 2 ) 。c l a s s1 分子的p b r 包含5 个口袋( p o c k e t sa f ) ，与多肽的残基特异 结合( s a p e r e ta t , 1 9 9 1 ) 。在正常情况下，c l a s s1 分子结合内源性多肽，机体感染病 毒或胞内寄生虫时，被感染细胞的c l a s s1 分子就会与抗原肽结合形成复合物。细胞 表面受体( tc e l lr e c e p t o r s ，t c r ) 能够识别自身c l a s s1 分子和自身多肽，从而让复 合物表达于细胞表面，m h cc l a s s1 分子将抗原肽提呈给c t l 。当c t l 遇到这样的细 胞就会产生细胞毒性反应，把被感染的细胞杀死。这种特定t 细胞识别特定类别的自 身m h c 分子而发挥免疫学效应的现象就叫作m h c 的限制性。 c l a s s1 1 只表达于淋巴样组织中的各种细胞表面，如b 细胞和巨嗜细胞，识别并 结合细胞外病原多肽，表达于a p c 表面，提呈给辅助性t 细胞( h e l p e r tc e l l s ，t h ) ， 触发t h 细胞产生细胞分裂素( 包括抗体) ，而发生适当的免疫反应。c l a s si i 与c l a s si 相似，也有4 个胞外结构域，但这几个域的组成方式是不同的。c l a s s1 1 分子由一条a 链和一条b 链组成异二聚体，每一条链包含两个胞外结构域，一个跨膜区和一个胞内 区，如图1 1 ，b 2 为t 细胞i - - c d a + t 分子的识别部位。c l a s s1 1 分子顶部也有一个类似 与c l a s s1 分子的由2 个a 螺旋衔着一个b 折叠构成的沟槽，其作用与c l a s s1 分子类似， 6 长江草鱼群体m h cc l a s si lb 基因的克隆、表达及多态性分析 即为多肽结合区( p b r ) 。与c l a s s1 分子不同的是，一个o r 螺旋和半个p 折叠来自0 【链， 另一个0 【螺旋和另一半个p 折叠来自p 链。此外，c l a s si i 与c l a s s1 分子所呈递的多肽氨 基残基的数目也不同，一般c l a s s1 分子呈递的长度为9 个氨基酸，而c l a s s1 1 分子为1 1 至1 7 个不等( r a m m e n s c ee ta l ，1 9 9 5 ) 。 p b r p b r c l a s slc l a s si i e x t r a c e l l u l a r t 阳n s m e m b r a n e c y t o p l a s m i c 图l - 1m h cc l a s sl 和c l a s s1 1 分子结构示意图 f i g 1 - 1t h es t r u c t u r eo fm h c c l a s sia n dc l a s si i m h c 复合体c l a s si 与c l a s si i 之外存在的一些与免疫功能相关的基因( 传统的 c l a s si i i 和一些新确定的基因) ，其产物不与多肽结合，故不参与肽呈递，但在免疫 应答和免疫调节中起重要作用。c l a s si i i 的表达产物主要是一些血清补体成分，如 c 4 b 、c 4 a 、b f 和c 2 等。此外，c l a s si i i 还编码一些与免疫无关的分子。 3m h c 分子进化特点 3 1 高度多态性 m h c 是迄今为止在脊椎动物发现的多态性最高的基因家族，其多态性表现为群 体内存在大量的、具有一定频率的等位基因以及等位基因间高度的序列( 包括核苷 酸和氨基酸) 变异。例如，在斑马鱼中鉴别出多达1 4 9 个m h c 座位及同种异型基因 7 1 j r _ i _ 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 ( p a r a l o g u e ) ( s a m b r o o ke ta 1 ，2 0 0 5 ) 。人类的h l a a 、一b 、一d l 也座位分别至少 有2 4 3 ，4 9 9 ，3 21 个等位基因( g a u d i e r ie ta t , 2 0 0 0 ；g a r r i g a na n dh e d r i c k , 2 0 0 3 ) 。等 位基因的序列变异主要发生在p b r 区，通过检测发现，人类p b r 区核苷酸的非同义 替换速率( 幽) 显著大于同义替换速率( 蝴( h u g h e sa n d n e i ，1 9 8 8 ) ，这种现象被称 为正向达尔文选择( p o s i t i v ed a r w i ns e l e c t i o n ) 。其它脊椎动物的m h c ，包括硬骨鱼 类( d i x o ne ta l ，1 9 9 6 ；c o n s u e g r ae ta t , 2 0 0 5 ；r e u s e ha n dl a n g e f o r s ，2 0 0 5 ) 、两栖类( b o s a n dw a l d m a n , 2 0 0 6 a ) 、爬行类( b o sa n dd e w o o d y , 2 0 0 5 ；g l a b e r m a ne ta t , 2 0 0 9 ) 、鸟类 ( a l c a i d ee ta l ，2 0 0 7 ；b u r r ie ta t , 2 0 0 8 a ，b ) 、哺乳类( o l i v e re ta l ，2 0 0 6 ；c u t r e r aa n dl a c e y , 2 0 0 7 ) ，同样发现幽大于魂，特别是多肽结合位点尤为明显，说明m h c 与环境关系 十分密切且普遍受到正向选择作用。免疫球蛋白样区，如c l a s si i8 2 通常受到趋异选 择( d i v e r g e n ts e l e c t i o n ) 作用( n e ie ta l ，1 9 9 7 ；b e l o ve ta t , 2 0 0 6 ；g l a b e r m a ne la l ，2 0 0 9 ) 。 但有一些种类，如环颈雉的c l a s si i8 2 ( w i t t z e l le ta t , 1 9 9 9 ) 和海鬣蜥( a m b l y r h y n c h u s c r i s t a t u s ) c l a s sia 3 ( g l a b e r m a na n dc a c c o n e ，2 0 0 8 ) 都受到协同进化( c o n c e r t e d e v o l u t i o n ) 影响。 m h c 还有一种多态性现象，表现为近缘物种间共享相同的等位基因，称为跨种 多态性( t r a n s s p e c i e sp o l y m o r p h i s m ，t s p ) 。其产生原因是等位基因在物种形成前已 经出现，而在成种后继续保留下来。欲检测跨种多态性可以使用系统发育的方法构 建近缘物种m h c 等位基因的系统关系，可以发现等位基因的谱系不是按照物种的 关系来聚类，( k l e i ne ta l , 1 9 9 8 ) 。迄今，m h c 的跨种多态性已在许多脊椎动物中被 发现和证实( g r a s e re ta l ，1 9 9 6 ；o t t o v f ie ta l ，2 0 0 5 ；b o sa n dw a l d m a n , 2 0 0 6 b ；b u r r ie ta l ， 2 0 0 8 a ) 。但是，跨种多态性在不同物种间维持的时间不同，同一物种中c l a s si 和c l a s s i i 能够维持的时间也不同。例如，灵长类h l a d q 、d r 座位能够维持约8 5 百万年 ( b o n t r o pe ta t , 1 9 9 9 ) ，而h l a c l a s s1 只能维持约6 百万年( v o g e le ta t , 2 0 0 6 ) ；虹 鳟鱼c l a s si 可持续1 5 2 0 百万年( s h u me ta t , 2 0 0 1 ) ，鲤科鱼类c l a s siz e 系则可持 续10 0 百万年( k r u i s w i j ke ta l ，2 0 0 2 ) ，但硬骨鱼类c l a s si i 跨种多态性则较少见( o t t o v f i 甜a l ，2 0 0 5 ) 。 一般认为，m h c 通过突变、重组、基因转换等机制获得多态性。但是如何保持 基因的多态性却一直存在争议。m h c 多态性水平高于其它基因的两个数量级，脊椎 动物能够保持如此高的多态性必然存在一定的维持机制。一般认为，m h c 多态性是 8 长江草鱼群体m h cc l a s si ib 基因的克隆、表达及多态性分析 有通过病原驱动的平衡选择( b a l a n c i n gs e l e c t i o n ) 维持，现在有几个平衡选择的假 设来解析m h c 多态性：( 1 ) 超显性假设( t h eo v e r d o m i n a n c eh y p o t h e s i s ) 。也叫杂 合子优势( h e t e r o z y g o t ea d v a n t a g e ) 。这个假设认为，一个群体处在有各种各样病原 的环境中，m h c 座位杂合的个体能够识别及呈递更多的病原，能抵抗更多的病原， 从而得到保存下来。如果考虑到突变会产生新等位基因的情况，这个假设是可以解 析现存高水平多态性的( m a r u y a m aa n dn e i ，1 9 8 1 ) ，但是难以验证。( 2 ) 依赖频率 的选择( 仔e q u e n c y - d e p e n d e n ts e l e c t i o n ) ，也称依赖稀有频率的选择( r a r e f r e q u e n c y d e p e n d e n ts e l e c t i o n ) 。这个假说认为，群体中存在频率不等的各种等位基 因，由于m h c 抗原的主要功能在于识别、结合并提呈病原，而后者有逃避识别的 倾向且种类不断变化，这样频率低的等位基因更有机会对付新出现的病原体，因而 有较高的选择优势，其频率也会因此而提高。( 3 ) 早期还有一种假说认为m h c 座 位具有异乎寻常的突变率( b a i l ya n dk o h n ，1 9 6 5 ) ，因为魂可以反应突变率。但是通 过比较m h c 与其它基因的以，发现m h c 的施并不比其它基因的高。因而，这种 假说已经被否定了。 还有一些其它假说，如会杂化交配、聚进化等，能够解析一些多态性现象，但 不能解析其它一些现象，可能不是主要机制。最近，又出现一种新的假设，称为联 合平衡复合进化( a s s o c i a t i v eb a l a n c i n gc o m p l e xe v o l u t i o n ) ( v a no o s t e r h o u t ，2 0 0 9 ) 。 这个假说是针对上述假说难以解析的现象而提出。该假说提出，m h c 附近的一些有 害的隐性突变是可以积累的，因为它们极少表达，以及纯化选择在低重组率时对突 变作用不大，而这些积累的突变能够增加平衡选择作用，并且通过上位作用来影响 m h c 的选择。尽管人们相信m h c 高多态性受到某些形式的平衡选择的作用，但是现 在还没有一种假说能够解析m h c 多态性的所有现象，可能m h c 多态性的维持是多重 因素作用的结果。 3 2 连锁不平衡 由于m h c 复合体的各基因座是紧密连锁的，因而分属两个或两个以上基因座位 的等位基因，同时出现在一条染色体上的机率高于随机出现的频率，则某一单倍型 出现频率应取决于该单体型各基因是否比其它基因能更多或更少地连锁在起，从而 9 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 出现连锁不平衡( 1 i n k a g ed i s e p u i l i b r i u m ) 。人类h l a 在不同人群中等位基因频率存 在较大差异( a l p e re ta t , 1 9 9 2 ；张明军等，2 0 0 1 ) 。 3 3 基因倍增与重组 脊椎动物m h c 中发现数目不等的座位( g a u d i e r ie ta l , 2 0 0 0 ；g a r r i g a na n dh e d r i c k , 2 0 0 3 ：s a m b r o o ke ta t , 2 0 0 5 ) ，这些座位是的增加是通过基因倍增( d u p l i c a t i o n ) 的方 式获得，发生复制，有的座位因突变而成假基因，随后丢失，另外一些座位被保留 下来( k l e i ne ta t , 1 9 9 8 ) 。m h c 这种通过倍增获得新的座位，而后有的变成假基因 或丢失、有的被保留的进化方式，称为“生灭进化模式”( b i r t h a n d d e a t hm o d e lo f e v o l u t i o n ) ( n e ie ta t , 1 9 9 7 ) 。由于m h c 的“生灭进化模式”，可以在m h c 发现大量 的假基因( m h cs e q u e n c i n gc o n s o r t i u m ，19 9 9 ) 。 在脊椎动物的演化过程中，m h c 的“生灭进化”是一个动态过程，即在不同的时 间、不同的动物谱系里，m h c 座位的扩张和收缩程度并不相同( m i l l e ra n dw i t h l e r , 1 9 9 8 ；e d w a r d se la l , 1 9 9 9 ；w i t t z e l le la t , 1 9 9 9 ；b o n t r o p ，2 0 0 6 ) 。如棘鳍类的鱼发生大 规模的基因倍增( m i l l e re ta t , 2 0 0 2 ) 。而对三刺鱼( g a s t e r o s t e u sa c u l e a t u s ) c l a s si i 的研究得到较晚发生倍增的两个并系同源座位，这两个座位发生倍增的时间只有 1 2 2 4 百万年，比已发现的其它鱼类、鸟类和哺乳动物都要晚得多( r e u s c he la l ， 2 0 0 4 ) ，如有袋类负鼠两个c l a s si 座位m o d o u b 和m o d o u c 的倍增时间约为4 百万 年( m i s k ae ta t , 2 0 0 4 ) ：新西兰知更鸟c l a s si i 发生过多次基因倍增( m i l l e re la t , 2 0 0 4 ) 。 由于快速进化掩盖了进化信息，m h c 很难鉴别出直系同源基因。目前研究最清楚的 是，哺乳动物c l a s si i 有3 个直系座位- - d r 、d p 、d q 。而人的e l a s sih l a a 、b 、 c 座位只能在灵长类的一个分支中找到直系同源序列( b o n t r o p ，2 0 0 6 ) 。鸟类也能够 鉴别出一些c l a s si i 的直系同源座位( m i l l e re ta t , 2 0 0 4 ；b u r