（遗传学专业论文）蛋白激酶a抑制因子家族基因的功能研究.pdf

复旦大学博士学位论丈 y t h s ： b d ： a d ： p k a ： p k i ： n e s ： n l s ： c d l c ： n l p i ： h s p 7 0 ： n n o s ： a k a p s g f p ： 英文缩写简表 y e a s tt w o - h y b r i ds y s t e m d n a b i n d i n gd o m a i n d n aa c t i v a t i o nd o m a i n p r o t e i nk i n a s ea p r o t e i nk i n a s eai n h i b i t o r n u c l e a r e x p o r ts i g n a l n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l c y t o p l a s m i cd y n e i nl i g h tc h a i n n u c l e o p o r i n e l i k ep r o t e i n l h e a ts h o c kp r o t e i n7 0 n e u r o n a ln 0 s y n t h a s e a k i n a s e a n c h o r i n g p r o t e i n s g r e e nf 】u o r e s c e n c ep r o t e jn 酵母双杂交体系 d n a 结合结构域 d n a 转录激活域 蛋白激酶a 蛋白激酶a 抑制因子 核输出信号 核定位信号 细胞质动力蛋白轻链 核孔素样蛋白1 热休克蛋白7 0 神经型一氧化氮合成酶 蛋白激酶a 锚分子蛋白 绿色荧光蛋白 复旦大学博士学位论文 中文摘要 在大规模新基因克隆工作结束后，基因功能研究将是今后若干实验室的主要 研究工作。在选择用何种方法研究新基因功能时，依据季湖实验室的具体条件， 7 嘲以酵母双杂交技术作为研究新基因功能切入点。以蛋白激酶a 抑制因子 ( p k i ) 为研究对象，从酵母双杂交入手研究了p k i 基因的功能。 在继u h l e r 克隆了人的p k i 。基因后，我们实验室利用同源克隆策略，克隆到 了p k i 。的两个同源新基因p k i 。，p k i ，。为了研究人类p k i 。和p k i ，是否能和p k a 的c 亚基结合，以及p k i 。，p k ib ，p k i ，与c 。，c 。，cy 之间的结合强度是否有差 异，我们将p k ac 亚基的三种异型体以及p k i 的三种异型体分别克隆到g a l 4 酵 母双杂交系统的a d 和b d 载体上，在酵母中表达。通过检测报告基因的表达产物 量，我们发现人的p k i 。，p k i 。与p k i 。一样都能与c 亚基结合。p k i 。，p k i 。，p k i ，与在脑组织中特异表达的c 。亚基能特别强地结合。 蛋白激酶a 抑制因子( p k i ) 不仅是蛋白激酶a ( p k a ) 有效而特异的抑制因 子，而且在研究中还发现它具有协助c 一亚基出核的功能，但是对于p k i 具体的 活动机制以及其它的生物学意义到目前为止还不是很清楚。为进一步研究p k i 二一一 气 基因的功能，本研究利用酵母双杂交体系对p k i 基因进行了蛋白间相互作用的研 究，并获得三个p k i 蛋白的相互作用蛋白( 细胞质动力蛋白轻链，核孔素样蛋白 一1 ，热休克蛋白7 0 ) 。 为了进一步在哺乳动物细胞中证实我们从酵母双杂交中得到的结果，我们把 c d l c 及p k i 。，p k i8 ，p k i ，分别构建到p c m v h a 及p c m v c m y c 真核表达载体中。 通过在哺乳动物细胞中表达，利用细胞免疫共沉淀技术，我们证实了c d l c 可以 与三种不同的p k i 亚型结合。依据有关文献及我们的实验结果，我们提出：p k a 特异性磷酸化n n o s ( 神经型n o 合成酶) 的过程很可能是由c d l c 和p k i 。所介导 的。在特定的细胞内，p k i 。象r 亚基一样，不仅能发挥p k a 抑制剂的功能，而且 还起着p i ( a 锚定分子的的作用。在研究核孔素样蛋白一1 ( n l p 1 ) 与p k i 。互作关 系时，我们应用反义寡核苷酸技术来确证酵母双杂交中得到的结果。我们将 n l p 一1 反义寡核苷酸转入已经转染了p e g f p n 1 一p k i 。的细胞中。经c o n f o c a l 显 微镜证实n l p 一1 直接参与了p k i 。介导的出核过程。在研究h s p 7 0 与p k i 。互作关 复旦大学博士学位论文 系时，我们同样应用反义寡核苷酸及共聚焦显微镜技术证实，h s p 7 0 与p k i 。蛋白 能相互结合的功能意义在于，h s p t o 参与了p k i 蛋白的出核运输过程。 此外，我们通过g f p 融合蛋白定位技术证实p k i 。、p k i 。、p k i 。都具有功能性 的n u c l e a re x p o r ts i g n a l ( n e s ) ，而且n e s 功能不受c f p 融合方向的影响， n e s 序列保守性不在一级结构上，而在蛋白的高级结构上。、 关键词：蛋白激酶a ，蛋白激酶a 抑制因子， 细胞质动力蛋白轻链， 核孔素样蛋8 - i ，热休克蛋白7 0 墨兰查兰苎主兰坠 a b s t r a c t a f t e rt h el a r g es c a l en e wg e n ec l o n i n gi sc o m p l e t e d ，g e n ef u n c t i o n r e s e a r c hist h em a i np u r p o s eo fo u rl a b o r a t o r y i nr e g a r dt o o u rc u r r e n t s i t u a t i o n ，w eu s ey e a s tt w o h y b r i dm e t h o da s t h ef i r s ts t e pt or e s e a r c h g e n ef u n c t i o n i nt h i sp a p e r w eu s ey e a s tt w oh y b r i dt os t u d yt h ef u n c t i o n o fp r o t e i nk i n a s eai n h i b it o rg e n e s o nt h eb a s eo fc l o n i n gh u m a np k i 。( p r o t e i nk i n a s eai n h i b i t o r ) g e n e b yu l h e r ，o u rl a b o r a t o r yh a dc l o n e d t w oo t h e ri s o f o r m s ，p k ib ，p k i ， o fp k i 。g e n e i no r d e rt os t u d yt h eb i n d i n gb e t w e e nt w op k i 。is o f o r m sa n d cs u b u n i to fp k a ，a n dt oc o m p a r et h ea f f i n i t yd i f f e r e n c e sb e t w e e np k i i s o f o r m sa n dcs u b u n i ti s o f o r m s ，p k i 。，p k ib ，p k i y a n dc 。，c ，c y w e r e c l o n e di n t oa dv e c t o ro rb dv e c t o ro fy e a s tt w oh y b r i d ，r e s p e c t i v e l y ，a n d w e r ee x p r e s s e di ny e a s t b ym e a s u r i n gt h ee x p r e s s e dp r o d u c ti o no fr e p o r t g e n e ，w ef o u n dt h a tp k l 日a n dp k i 。c o u l db i n dw i t hcs u b u n i ta sp k i 。，a n d t h a tt h ea f f i n i t yb e t w e e np k i 。，p k ib ，p k i ，a n dc # s u b u n i ti sm o s th i g h p r o t e i nk i n a s eai n h i b i t o r ( p k i ) i sn o to n l yae f f e c t i v ea n ds p e c i a l i n h i b i t i v ef a c t o ro fp r o t e i nk i n a s ea ( p k a ) ，b u ta i s op l a y sap o t e n ti a l p h y s i o l o g i c a lr o l ei ne x c l u d i n gt h ecs u b u n i to fp k af r o mt h en u c l e t j s d e s p i t eb e i n gi d e n t i f i e dy e a r sa g o ，t h ef u n c t i o na n dt h ed e t a i lm e c h a n i s m o fp k ii nv i v or e m a i n so b s c u r e i na na t t e m p tt ou n d e r s t a n dt h ef u n c t i o n o fp k i ，w et o o ky e a s tt w o h y b r i dt or e s e a r c ht h ei n t e r a c ti o nb e t w e e nt h e p k i a n do t h e rp r o t e i n ，a n dg o t3i n t e r a c t i v ep r o t e i n sw i t hp k ip r o t e i n ( c y t o p l a s m i cd y n e i nl i g h tc h a i n ，n u c l e o p o r i n e l i k ep r o t e i n 1 h e a ts h o c k p r o t e i n7 0 ) i no r d e rt oc o n f i r mo u r y e a s tt w oh y b r i de x p e r i m e n t a lr e s u lt si n m a m m a l i a nc e l l s ，c d l ca n dt h r e ep k ii s o f o r m sw e r ec i o n e di n t o p c m v h a v e c t o ro rp c m v c m y cv e c t o r ，r e s p e c t i v e l y ，a n de x p r e s e di nm a m a l i a nc e l l s w ev e r i f i e dt h a tc d l cc o u l d b i n d w i t hp k it h r e eis o f o r m s b y i m m u n o p r e c i p i t i o n s o ，i nr e g a r dt ot h el i t e r a t u r ea n do u re x p e r i m e n t a l 4 夏旦大学博士学位论叉 r e s u i t s ，w es u g g e s t ：t h ep r o c e s so f p k as p e c i f i c a l l yp h o s p h o r y l a t i n gn n o s i sm e d i a t e db yc d l ca n dp k i 。：i ns p e c i a lc e l l s ，p k i 。n o to n l yi n h i b i t s t h ea c t i v i t yo fp k ab u ta l s oa n c h o r sp k aj u s t a srs u b u n i t i no r d e rt ov e r i f yt h ep h y s i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c eo fp k i db i n d i n g w i t hn l p 1 w eu s ea n t i s e n s eo l i g o n u c e o t i d em e t h o d ，n l p 一1a n t i s e n s e o l i g o n u c l e o t i d e s a n dp e g f p n 1 一p k i 。p l a s m i dw e r ec o t r a n s f e c t e di n t o h e k 2 9 3c e l l s b yc o n f o c a lm i c r o s c o p y ，w ei n d i c a t e dt h a tn l p 一1p l a y e da r o l ei nt h er t u c l e a re x p o r tm e d i a t e db yp k i 。f u r t h e rm o r e ，b ya n t i s e n s e o l i g o n u c l e o t i d e sa n dc o n f o c a lm i c r o s c o p ew ea l s oi n d i c a t e dt h a th s p 7 0 p r o t e i na l s op l a y e dar o l e i nn u c l e a re x p o r to fp k i 。 i na d d i t i o n ，b yg f pf u s i o np r o t e i nl o c a li z i n gm e t h o dw ei n d i c a t e d t h a tp k i 。，p k i 目，p k i ya l lh a df u n c t i o n a ln e s ，a n dt h a t t h eo r i e n t a t i o n o fg f pf u s i n gd i dn o ti n f l u e n c et h ef u n c t i o no fn e s t h ep r i m a r ys t r u c t u r e o fn e si sn o tc o n s e r v e da n dt h et e r n a r ys t r u c t u r eo fn e si sc o n s e r v e d ， k e yw o r d s = p r o t e i nk i n a s ea ，p r o t e i nk i n a s eai n h i b i t o r ，c y t o p l a s m i c c y n e i nl i g h tc h a i n ，n u c l e o p o r i nl i k ep r o t e i n - 1 ，h e a t s h o c k e d p r o t e i n7 0 墨兰垄兰堡主堂堡笙查 苎= 主旦壁兰兰生奎垫查堡兰! ! ! 竺塑兰竺旦墨皇 第一章用酵母双杂交技术筛选p k i 的相互作用蛋白 前言 随着基因组计划的深入，对基因功能的研究显得日益重要。目前基因功能研 究的主要方法有：基因转导，反义技术，核酶，基因重组，染色体转导技术， d n a 微阵列技术( d n am i c r o a r r a y ) ，基因表达的系列分析( s a g e ) ，肽质谱分析 法，蛋白双向胶电泳技术及酵母双杂交体系( y e a s tt w oh y b r i ds y s t e r m ) 等。其中 酵母双杂交技术以其简便，灵敏，高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的 相互作用等特点在基因功能的研究中得到了广泛的应用。8 0 年代的研究证明， 大多数真核细胞的转录活化因子是模块化的，通常具有两个可分割的结构域，即 d n a 特异结合域( d n ab i n d i n gd o m a i nb d ) 与转录激活域( a c t i v a t i o nd o m a i n a d ) t “，这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的能激活特定基因表达 的转录激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成转录激活功能。不同 来源转录因子b d 区与a d 结合后也能特异地激活被b d 结合的基因表达。基于 这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同 一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥 梁作用使a d 与b d 形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。 通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互 作用( 见图1 ) 。在大规模的人类新基因克隆工作结束后，基于我们实验室的条 件和具体情况，我们选择了“酵母双杂交”作为切入点研究我们实验室所克隆的 一批新基因功能的手段。在本论文中，我们利用酵母双杂交系统初步研究了蛋白 激酶a 抑制因子( p r o t e i nk i n a s eai n h i b i t o r ) p k i 基因的功能。 1 9 6 5 年，从兔的骨骼肌中发现- 9 十热稳定的易被胰蛋白酶消化的因子，该因 子能特异的抑制c a m p 诱导的磷酸化【”。随后，不久便从兔的骨骼肌中分离纯化 到该蛋白【3 】并被称为蛋白激酶a 抑制蛋白p r o t e i nk i n a s eai n h i b i t o r ( p k i ) 。 此后，从其他物种的脑，睾丸，心，和骨骼肌都分离到了具有相同酶学特性的 p k i 【4 _ 8 1 。p k i 是一种小肽( 约8 k d ) ，是一种有效的，特异的p i c a 抑制因子。通 过氨基酸序列分析，证明了兔骨骼肌的p k i 含有7 5 个氨基酸以及它的抑制区是 位于氨基端【9 - 1 。该区包括p k a 的一个假底物位点( a 唱一a 唱一a s n a i a ) ，它 墨兰查芏堡主芏堡堕查 苎二主旦壁苎竖童奎垫查堑兰! ! ! 竺塑兰笪旦! 垦旦 由p k i 的1 8 2 l 位氨基酸所组成。像r 亚单位一样，p k i 如同竞争性底物一般 结合在c 亚基的特异识别位点上，从而抑制了游离c 一亚基的活性。由1 8 - - 2 1 位 氨基酸所构成的短肽已被广泛用来研究p k a 的结构和功能，以及被用作纯化 c 亚单位的不同异形体。另外，p k i 还被广泛地用作研究蛋白磷酸化作用的工具 。1 3 】 图1 双杂交原理图 m o u s e 中有三种类型的p k i ( 。p ，t ) 。它们之间除了有一个保守的假底物序列 外，还有一个高度保守的富含亮氨酸的n u c l e a re x p o r ts i g n a l ，n e s 序列( 核输出 序列) 14 1 。现已证明p k i 。除了具有抑制c 亚基磷酸化活性的功能外，还具有协 助转运c 一亚基出核的功能【1 ”。1 9 9 1 年，u h l e r 等人克隆了人的p k i 。蛋白，人的 p k i 。蛋白与兔的骨骼肌型p k i 。的序列1 0 0 一致。在u h l e r 克隆了人的p k i 。 基因的基础上，利用同源克隆策略，我们克隆了蛋白激酶a 抑制因子p k i 。的两 个同源基因p p ，p k v l 7 o 尽管早在1 9 6 5 年就发现了p k a 除r 亚基以外的另 一个抑制蛋白p k i 【l “，随后的研究又发现p k i 具有协助c 一亚基出核的功能，但 对p k i 在p i c a 信号传导中的作用，同为抑制蛋白的r 亚基与p k i 之间的关系如 何，p k a 存在两种抑制蛋白的意义何在，p k i 是如何协助c 一亚基单位完成出核 任务都知之甚少。 基于基因功能最终体现在蛋白质上这一理论，为进一步研究p i g 基因的功能， 我们利用酵母双杂交体系进行了p k i 与其他蛋白相互作用研究，以期获得能与该 蛋白相互作用的蛋白，并通过对p k i 蛋白与其他蛋白之间的互相作用的研究来深 入了解p i g 的生理功能。 复旦大学博士学位论文第一章用酵母双杂交技术筛选p k i 的相互作用蛋白 材料： 材料方法 1 p k i 。，p l ( i 卧p 藩因的g e n b a n k a c c e s s i o nn u m b e r ： 1 1 p k i 。：h u m a n ，$ 7 6 9 6 5 1 2 p k i 3 ：h u m a n ，a f 0 8 7 8 7 3 1 3 p k i t ：h u m a n ，a f l1 5 9 6 6 2 p c r 引物( 上海生工生物工程有限公司合成) ： 2 1l e x a 酵母双杂交体系表达载体上的鉴定引物： p l e x a - a ： 5 - c g tc a g c a g a g ct t ca c ca t tg - 3 p l e x a - b ： 5 一a t ta g ct t gg c tg c ag g tc g a 一3 p b 4 2 a d a ：5 - c c a g c ct c tt g ct g ag t gg a ga t g 一3 p b 4 2 a d b ：5 - c t g g c aa g gt a g a c a a g cc g 2 2 本实验中使用的克隆引物： p k i a 一1 ：5 一a g cg a at t ca t ga c tg a tg t gg a aa c 一3 p k i a 2 ：5 c t ag c gg c cg c tt a gc t tt c ag a tt t tg c tg 一3 p k i b 1 ：5 - t g cg a at t ca t ga g ga c ag a tt c at c a 3 p k i b 一2 ：5 一c g tg c gg c c g c tc a tt t tt c tt c at t tt g a g g c 3 p k i c - 1 ：5 - g c tg a at t ca t ga t gg a gg t cg a g t c c 一3 p k i c 一1 ：5 - t a tg c gg c cg c tc a a g a cg a gg t gg t c c c 3 3 m a t c h m a k e r l e x a 酵母双杂交体系( c l o n t e e h 公司) ： 3 1 菌株( 表1 ) ： 表1 所用茵株的实验背景资料 堕盐叁璺型 ! 垦兰垫堕堑堡垒堡叠塑 酵母e g y 4 8 m a t a ，h i s 3 ，t r p l ，u r a 3 ，l e u 2 h i s 3 。t r p l l e x a o p ：x 6 ) 一l e u 2 u r a 3 e c o l ij m l 0 9 r e c a l ， s u p e 4 4 ，e n d a ， a m d r s d 凡j 7 ， g y r a 9 6 , r e l a l t h i a ( 1 a x - p r o a b ) f t r a d 3 6 , p r o d b + ，l a 印i a c z a m l 5 1 e c o l ik c 8 h s a r 1 e u b 6 0 0 , t r p c 9 8 3 0 , la m g 础r f ：t n 5 ，h i s b 4 6 3 ，l a c a x 7 47 曼丝理! 竖墨 墨兰查兰堡主兰堡堕查 笠二兰旦壁兰兰生皇苎苎堂堂型型旦曼笪! ! 墨旦 3 2 载体( 表2 ) ： 表2 所用栽体的实验背景资料 克隆载体 p l e x a l e x a ( 1 2 0 2 ) ，h i s 3 ， 1 0 2 5 2 ，48 ，0 2p e g 2 0 2 ； a m d g y u r i s e ta l ，1 9 9 3 p b 4 2 a d 1 3 4 2 。t r p i 。a m p 7 ， 6 4 5 3 , 4 ，2 1 ，0 , 6 ，o 3 5p j g 4 - 5 ； h a s p i t o p et a g g y u r i se ta l ，1 9 9 3 对照质粒 p l e x a 5 3 p b 4 2 a d t 含鼠源p 5 3 ( 7 2 3 9 0 ) ， h i s 3 ，a m p 。 含s v 4 0 大t 抗原 f 6 7 7 0 8 ) ，玎己p ，a m p 。 1 l15 7 ，5 2 ，0 , 2 8 5 3 4 ，2 1 ，1 0 ，09 0 6 0 5 报告质粒 p s o p i a c z含l e x a o p ( ，6 ) 操纵的 1 0 3 6 3 ，2 1 ，1 9 l a c z ，u r a 3 ，a m p 1 w a b u c h i 甜d f 1 9 9 3 e 9 l i & f i e l d s ，1 9 9 3 2 0 l c h i e ne ta 1 ，1 9 9 1 1 2 p s h l 8 - 3 4 ； g 0 1 e m i sp l ，1 9 9 4 t 2 2 3 3 人胎脑c d n a 文库：构建于p b 4 2 a d 载体。( c l o n t e c h 公司) 4 实验试剂 4 1 1 0 x d o ( - h i s ，一l e u ，t r p ，u r a ) 溶液：为不舍h i s ，t r p ，l e u ，u r a 等成份的 1 0 x d r o p o u t 溶液： ( 1 ) l - i s o l e u c i n e 3 0 0m g ( 2 ) l v a l i n e 1 5 0 0m g ( 3 ) a d e n i n e 2 0 0 m g ( 4 ) l a r g i n i n eh c l 2 0 0m g ( 5 ) l - l y s i n eh c i 3 0 0 m g ( 6 ) l - m e t h i o n i n e 2 0 0m g ( 7 ) l p h e n y l a l a n i n e 5 0 0m g ( 8 1l t h r e o n i n e2 0 0 0m g ( 9 ) l - t y r o s i n e 3 0 0 m g 加d d h 2 0 定容至1 0 0 0m l ，4 保存 复旦大学博士学位论文第一章用酵母双杂交技术筛选p k i 的相互作用蛋白 4 22 0 x 氨基酸储备液： 每1 0 0 m l 溶液中分别含有下列成份，配制后保存于4 。 2 0 h i s 2 0 x t r p 2 0 x l e u 2 0 x u r a l h i s t i d i n eh c i m o n o h y d r a t e l - t r y t o p h a n l l e u c i n e u r a c i l 4 0 m g 4 0 m g 2 0 0 m g 4 0m g 4 3 酵母转化缓冲液( 表3 ) 加d d h 2 0 定容至1 0 0m 1 4 c 保存 表3 酵母转化援冲液的配制 缓冲液体积缓冲液配制 1 0 。t e1 0 0m lt r i s1 2 1 g ，e d t a n a 2 2 h 2 00 3 7g ，盐酸调p h 7 ，5 ，d d h 2 0 定容 1 0 x l i a c1 0 0m l l i a c 2 h 2 01 0 2 0g ，冰醋酸调p h 7 5 ，d d h 2 0 定容 5 0 p e g ”1 0 0m jp e g 3 3 5 05 0 0g ，d d h 2 0 定容 4 4 其他常用试剂( 表4 ) 表4 常用试剂的配制 1 0 x b u 缓冲液1 0 0m l n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 09 3 0 g ，n a i l 2 p 0 42 h 2 03 9 0g ， d d h 2 0 定容 酵母裂解液1 0 0m l1 0 t r i t o nx 1 0 02 0 0m l ，1 0 s d s1 0 0m 1 n a c l 0 5 8g ，t r i s0 1 2g ，e d t a n a 2 2 h 2 0o 0 4 g 1 0n h c i 调p h 8 0 ，d d h 2 0 定容 5 x m 9 缓冲液1 0 0m l n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 08 5 5g ，k h 2 p 0 415 0g ，n a c l0 2 5 g ，n h 4 c 10 5 0g ，d d h 2 0 定容 5 培养基： 5 1 s d 一u r a 液体培养基 d i f c o n i t r o g e no6 7g 葡萄糖 2 0 0e 1 0 x d o ( - h i s ，l e u ，- t r p ，- u r a )1 0 0m l 2 0 x h i s 5 0m l 2 0 x l e u 5 0m 1 ! ! ：! 里 ! ：! 翌! _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ - - _ _ - _ _ - - ，- _ _ - - 一一 加d d h 2 0 定容至 1 0 0 m l 墨兰查堂壁圭兰垡堕查 星二主旦壁苎璺鱼奎苎查堑兰! 坠! 堕墅望型! ：墨曼 5 2s d 一u m h i s 液固体培养基、s d u r a ，一h i s ，t r p 固体培养基、s d 一t r p 液体培养基：分别减去或补充相应的氨基酸溶液，固体培养基舍2 o 琼 脂，其余成份与s d u r a ，h i s 液体培养基一致。 5 3s d g a l r a f f u r a ，h i s ，一t r p ，一l e u 固体诱导培养基 s d g a l r a f ( c l o n t e c h 公司) 1 0 d o ( h i s ，l e u ，t r p ，- u r a ) 3 7 9g l oo m 垒曼苎! 三：竺竺g 加d d h 2 0 定容至 9 0 0 m l 灭菌( 1 1 5 c ，l o l b f i n 2 ) 2 0 m i n ，冷却至5 0 c ，加入下列成分后混匀铺扳 1 0 x b u 1 0 0m l 2 0m g m | x g a l 0 , 4m l 5 4m 9 d o t r p 固体培养基： 葡萄糖 a g a r 5 x m 9 缓冲液 1 0 x d o ( - h i s ，一l e u ，- t r p , - u r a ) 2 0 x h i s 2 0 x l e u 2 0 u r a 1 2g 6 0g 6 0 m l 3 0 m l 1 5m 1 1 5m l 1 5m l 加d d h 2 0 定容至 灭菌( 1 1 5 c ，1 0 1 b f i n 2 ) 2 0 m i n ，冷却至5 0 c 1 0m t h i a m i n e h c i ( v m ) 1 0 0 m g m la m p 5 5y p d 液体培养基： p o l y p e p t o n b a c t o - y e a s te x t r a c t 3 0 0 m l 加入下列成分后混匀铺板 03m l 0 3 m l 6 0g 3 0g 煎箜塑! ：! g 加d d h 2 0 定容至 3 0 0 m l 注：以上培养基灭菌条件均为11 5 c ，l o l b f i n 2 ，2 0m i n 6 其它分子生物学试剂： 6 1 d n a 连接试剂盒( p r o m e g a 公司) 6 2 p c r 试剂盒( p r o m e g a 公司) 复旦大学博士学位论文第一章用酵母双杂交技术筛选p k i 的相互作用蛋白 6 3p c r 产物纯化试剂盒( b o e h r i n g e r 公司) 6 4 凝胶回收纯化试剂盒( 华舜公司) 6 5 质粒抽提试剂盒( b o e h r i n g e r 公司) 6 6 酵母双杂交转库试剂盒( c l o n t e c h 公司) 6 7 p g e m t 载体( p r o m e g a 公司) 二、主要仪器设备： 1 p c r 扩增仪：p t c 一1 5 0 ，p t c 2 0 0 ( m jr e s e a r c h 公司) ，p e9 6 0 0 型( p e 公司 产品1 。 2 s u p r a f u g e2 2 型高速冷冻离心机：德国h e r a e u s 公司 3 t g l 1 6 台式离心机：上海医用仪器厂 4 a b l 3 7 7 型全自动d n a 测序电泳仪：p e 公司 5 凝胶成像系统：u v p 上海复日公司 6 紫外检测仪：上海复生公司 7 h z c 型台式恒温振荡器：江苏太仓科教器材厂 8 电脉冲仪及电转化杯：b i o r a d 公司 9 微量加样器：1 0 0 0 t l 2 0 0 9 l 2 0 9 l ( g i l s o n 公司) 1 0 g d s 一8 0 0 型凝胶成像系统及相应配置扫描仪：美国b i o r a d 公司 三、计算机分析软件： 1 国际n c b i ( n a t i o n a lc e n t e rf o r b i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ) 信息途径： 非重复数据库( n o n r e d u n d a n td a t a b a s e l b l a s t n ：h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t n n r b l a s t p ：h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t p n r 2 生物电泳凝胶成像及扫描分析软件： a n n u t a t i n gg r a b b e r - 1 t 2 5 1 及u v pg e l w o r k si da d v a n c e dv e r s i o n2 5 1 四、方法： 复旦大学博士学位论文第一章用酵母双杂交技术筛选p k i 的相互作用蛋白 1 技术路线和实验方案如下图所示： j 图2 双杂交技术流程图 m c s e c o r 鼬m h s a t i n c o l n o t l x h o i $ a 1 6 6 m 眦c gc g g t c c 6 7 c 6 c 呷g c g g c c gc 亿g 6 c g c c t g c g ： 洲i 捌鼬圳蹦”n a l 而川 图3 b d 载体图 3 幸 墨兰垄兰堡主兰堡丝墨 箜二兰星竺兰竖量壅垫查堡垒坠! 塑塑兰笪望墨鱼 2 p l e x a p k i 。b t 重组子的构建： 2 1 以t - p k i 。，t - p k i6 ，t p k i y 为模板，以p k i a ( b c ) 一1 ，2 引物( 分别含e c o r i 和n o ti 酶切位点) 分别p c r 扩增p k i 。o yc d n a ，1 琼脂糖胶电泳检 测，并割胶回收，纯化定量。 p c r 反应体系： 2 5m m 引物p k i a ( b c ) - 1 2 5m m 引物p k i a ( b c ) - 2 1 0 x p c rb u f f e r 2 5 m m m g c l 2 2 0 m m d n t p 模板质粒d n a 5n g ! ! 9 2 型垒鉴垒：竺! 型 d d h 2 0 补充至总体积5 0p 1 p c r 反应条件： 9 4 。c1m i n 9 4 0 c1m i n 6 0 0 c3 0s e e 7 2 。c3 0s e c 7 2 。c5m i n 11 1 型! !j 2 2 用e c o r i 和n o t i 双酶切p c r 产物，割胶纯化并定量。 反应体系p c r 产物 1 0 x b u f f e r e e o r 1 ( 1 0 u r a l ) 1 r a g 5r a l 5u 丝! ! l ! ! ! ! 业! 竺 d d h 2 0 补充至 5 0 l 反应条件：h 3 7o c2 小时 2 3 与2 ) 类似双酶切p l e x a 质粒，割胶纯化并定量。( 见图3 ) 2 4 t 4 连接酶连接经双酶切处理过的p c r 产物和p l e x a 质粒。 连接体系：酶切p c r 产物 3 0n g 酶切p l e x a 载体 1 0n g l o x t 4 连接酶b u f f e r1 5u l t 4 连接酶( 3 u r a l ) 1 0 l a l d d h 2 0 补充至1 5 0l a l 连接条件：1 4 1 6o c 连接过夜 以连接产物转化j m l 0 9 感受态菌( 参见分子克隆* ) ，涂布l b a m p 平板，p c r 鉴定转化子，抽提质粒，测序验证阅读框是否正确。 d 漩m m 州州 o p 肛x 5 2 掣l，l o 3 p l e x a p k i 。b y 重组子分别转化酵母感受态细胞： 3 1 将酵母茵e g y 4 8 ( p 8 0 p l a c z ) 接种于1 0 0 m ls d 一u r a 液体培养基，3 0 。c ， 2 5 0r p m 培养1 6 - 1 8h ，至o d 6 0 0 1 5 ； 3 2 取6 0 8 0m l 新鲜培养菌液转接于3 0 0 m ly p d ，至0 0 6 0 0 = o 2 - 0 3 ，3 0 ”c ， 2 5 0r p m 培养约3 5h ，至o d 6 0 0 = o 4 - 0 5 ； 3 3 室温离心5 0 0 0r p m x 5r a i n ，去上清，加入1 0 2 5m ld d h 2 0 重悬洗涤酵母 细胞，离心弃上清，沉淀即为酵母感受态细胞。 3 4 准备下列无菌试剂( 表5 ，2 0 个转化反应) ： 表5 酵母转化试剂的配制 3 5 分装待转化的质粒d n a ：p l e x a p k i 。p y 质粒d n a ( 1 0 0n g ) 各sp l ， 1 0m g m ls p e r m d n a + ( 1 0 0l a g ) 1 0p l ，混匀； ( ：新配制时水浴煮沸2 0m i n ，立即插入冰浴，保存于一2 0 0 c ) 3 6 加入1 0 0u 1 用1 5m 1 1 x t e l i a c 重悬浮的感受态酵母细胞，振荡混匀， 加入5 0 0 6 0 0l a l p e g l i a c ，3 0 0 c ，2 5 0 r p m 振荡培养3 0m i n ，加入7 0 “l d m s o 缓和倒置混匀，4 2 0 c 热休克1 5r a i n ，迅速插入冰浴； 3 7 室温离心3 0 0 0r p m x 5m i n ，弃上清，以2 0 0u l1 x t e 重悬，涂布 s d 一u r a ，h i s 固体培养板，3 0 0 c 倒置培养3 5 天。 4 人胎脑e d n a 文库分别转化含p l e x a p k i 1 3t 重组子的酵母细胞： 转化效率是酵母双杂交文库筛选时成败的关键之一，特别是对低丰度e d n a 库进行筛选时，必须提高转化效率。转化时可采用共转化或依次转化，相比 之下共转化省时省力。而依次转化则可以大大的提高转库的效率，所以我们 转库是采用依次转化的方法。 4 1 以生长于s d - u r a ，一h i s 固体培养板上的分别含有p l e x a p k i 。p y 质粒 及报告基因( p