（细胞生物学专业论文）甘油和蔗糖对光系统Ⅰ结构与功能的影响.pdf

摘要 摘要 在光系统i ( p s i ) p 勺部结合有大量的水分子，而这些水分子的生理功能还不清 楚。在本工作中，我们通过外加具有渗透活性和吸水强的多羟基化合物甘油和 蔗糖来改变p s i 环境中水的含量，研究水的改变对p s i 结构与功能的影响。主要结 果如下： 1 甘油和蔗糖对p s i 的电子传递产生影响，影响程度和大小与它们的浓度 有关。一般地，低浓度的甘油和蔗糖可促进p s i 的电子传递，而在高浓度时，这 种促进作用有所减弱。但过高浓度的甘油( 6 0 ，v v ) 会抑锘i j p s i 的电子传递活性。 2 与对p s i 电子传递的影响趋势相类似，在低浓度的甘油和蔗糖存在下， p s i 的光化学反应活性( p s i 反应中心色素p 7 0 0 的光氧化还原能力) 大为增加，而较 高浓度的甘油和蔗糖对p 7 0 0 的氧化还原能力有所抑制。 3 甘油和蔗糖也会改变p s l q j 的主体色素( b u l kc h l o r o p h y l l ) 和长波色素或红 色素( r e dc h l o r o p h y l l ) 之间的能量分布。它们的作用导致激发能分配失衡，使更多 的激发能分配到红色素。 4 甘油和蔗糖的作用还会影响p s i 的蛋白质构象。甘油使p s i 蛋白质内部 的色氨酸残基( 唧别0 处于更加疏水的微环境，而蔗糖却使极性环境中的色氨酸 残基( t r p p o l 0 周围微环境的极性继续增大。它们均会使色氨酸残基邻近的具有淬 灭活性的蛋白质的位置和或方向有所变化。同时，甘油和蔗糖的作用也会导致 p s i 的疏水性增加。 关键词：甘油，蔗糖，光系统i ，电子传递活性，光氧化还原能力，蛋白质构象， 微极性 a b s t r a c t e f f e c t so fg l y c e r o la n ds u c r o s eo ns t r u c t u r ea n d f u n c t i o no fp h o t o s y s t e mi x i a o h u ar e n ( c e l lb i o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f z h e n l ey a n g a b s t r a c t i th a sb e e ns h o w nt h a tal a r g en u m b e ro fw a t e rm o l e c u l e se o o r d i n a t ew i t ht h e p i g m e n t sa n ds u b u n i t so fp h o t o s y s t e mi ( p s i ) ；h o w e v e r , t h ef u n c t i o no ft h e s ew a t e r m o l e c u l e sr e m a i n st ob ec l a r i f i e d i nt h i ss t u d y , t h ep h o t o s y n t h e t i cp r o p e r t i e so fp s i f r o m s p i n a c h w e r e i n v e s t i g a t e du s i n g d i f f e r e n t s p e c t r o s c o p i c a n da c t i v i t y m e a s u r e m e n t su n d e rc o n d i t i o n so fd e c r e a s i n gw a t e rc o n t e n tc a u s e db yi n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n so fc o s o l u t e sg l y c e r o lo rs u c r o s e t h er e s u l t ss h o wt h a t ： 1 a d d i t i o no fg l y c e r o lo rs u c r o s ec a u s e dp r o n o u n c e dc h a n g e si nt h e p h o t o c h e m i c a la c t i v i t yo fp s ip a r t i c l e s a tl o wc o n c e n t r a t i o n s ( 一苗絮圣 第四章甘油和蔗糖对p s i 的结构和功能的影响 下p s i 的8 3 0r i m 吸收变化( a 4 s j o ) 。 从图4 - 3 的埘 d 相对变化可以看出，在0 - 4 0 浓度范围内，甘油对p s i 的 光化学反应活性具有促进作用。在1 0 甘油浓度以下，随甘油浓度的增加，p s i 的活性逐渐增强。在1 0 甘油浓度临界处，p s i 活性达到最大。随后髓甘油浓度 的增加，p s i 活性逐渐降低，但仍然比对照要大。当浓度为5 0 - 6 0 时，甘油对 t i m 0 圉 2 不同浓度甘油处理后的p s i 在8 3 0r t m 处的吸收变化 g l y c , * o l m i 帅( v ) 图4 0 经不同浓度甘油处理的p s i 在8 3 0 n m 处的相对吸收变化( 以对照为1 0 0 ) 。 - 2 9 - #日。霉葛i七8口日c=盛i上u e#o盆；8七o岛c一鞋目黑兰点 中国科学院研究生院硕七学位论文：甘油和蔗糖对光系统i 结构和功能的影响 p s i 几乎没有什么影响。但当甘油含量较大时( 6 0 ，v v ) ，p s i 的光化学反应活 性则明显降低。例如在8 0 的甘油存在下，p s i 的活性只有未处理的8 0 ，表明 高浓度的甘油抑制了p s i 的光氧化还原的能力。 4 1 3p s i 的室温荧光变化 常温下p s i 的荧光产量有8 0 来自于红色素，尤其是l h c i 的红色素。从 p s i 的室温荧光光谱能了解p s i 的大部分主要色素即主体色素( b u l kc h l o r o p h y l l ) 和红色素( r e dc h l o r o p h y l l ) 之间能量的分布情况( c r o c ee ta l ，1 9 9 8 ) 。 图4 4 为经过不同浓度的甘油处理的p s i 室温荧光光谱图。在p s i 中， 6 8 0 - - 6 9 0r l l t l 附近的荧光发射与p s i 主体色素有关，而7 1 0 7 2 0a m 的肩峰则是红 色素的特征峰。由图可见，外加甘油对p s i 的室温荧光产生较大的影响：不仅表 现在两处特征峰的荧光强度变化上，而且也体现在荧光峰型的变化上。随着甘 油浓度的增加，6 8 0 - 6 9 0n l t l 处的荧光逐渐减弱，同时7 1 0 7 2 0n m 长波组分的荧 光增强。当甘油浓度在7 0 以上时，6 8 0 6 9 0n 1 处的荧光由最大发射峰变成相 对小的肩峰，同时7 1 0 7 2 0 姗处的荧光变成最大的荧光发射峰。这个变化同样 可以从7 1 5a m 与6 8 3n t l l 的荧光强度比值变化图中看出来( 图4 5 ) 。这些结果表 明，高浓度的甘油会导致更多能量被长波长色素所捕捉。 4 1 4p s i 的紫外荧光变化 蛋白质具有来自芳香簇氨基酸残基( 色氨酸t r p 、酪氨酸t y r 和苯丙氨酸p h e ) 的内源荧光，由于芳香簇氨基酸的内源荧光对其周围的微环境十分敏感，因此 可作为探针来研究蛋白质微环境的变化或蛋白质构象的变化。用2 7 8n n l 波长光 激发时，蛋白质的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基均会受到激发，激发能以荧 光形式发射出来。而2 9 5a m 波长的光仅能激发色氨酸残基，且所产生荧光的强 度和位置与色氨酸所处环境有关。处于蛋白质分子表面的色氨酸具有3 5 0n m 的 3 0 一 第四章甘油和蔗糖对p s i 的结构和功能的影响 w a v e l e n g t h ( 衄) 图4 - 4 不同浓度甘油处理后的p s i 室温可见荧光光谱 图4 - 5 甘油对p s i 荧光强度( f 7 - s 与f 啪的荧光比值) 的影响。 3 1 n 巴 扫一iiq苔一oocod20tl一皿 中国科学院研究生院硕士学位论文：甘油和蔗糖对光系统i 结构和功能的影响 荧光发射，而包埋于蛋白质分子内部且处于一定极性环境的色氨酸荧光发射峰 通常在3 4 0i 吼，处于非极性环境的色氨酸残基产生的荧光发射峰在3 1 0 3 3 0 衄 范围( l a k o w i c z ，1 9 8 3 ) 。 用2 9 5h i 1 波长激发p s i 时，在3 2 7t i m 处出现有强的特征峰，同时在3 5 0m 左右有弱的荧光峰。这个结果表明，在p s i 蛋白质中，大部分的色氨酸残基出在 疏水的环境中，而只有少量处在极性环境中或有可能位于p s i 的蛋白质分子表 面。我们的实验发现，外加甘油会使p s i 的紫外荧光发生改变。甘油的浓度越大， 其产生的影响也越大( 图4 6 ) 。随甘油含量的增加，3 2 7a m 处的发射峰位逐渐蓝 移，其荧光强度也随之减弱( 图4 - 6 、4 8 ) 。同时，3 5 0n l t l 处的荧光不断增强，从 肩峰逐渐变成独立的发射峰( 图4 6 、4 7 ) 。从f 3 5 0 f 3 2 0 - 3 3 0 的荧光比值可以更明显 看出来( 图4 9 ) ，外加8 0 的甘油，导致3 5 0n l t l 处的荧光增强了近2 倍，即从未 处理的o 5 增加至0 9 。 w a v e l e n g t h ( 脚：1 1 ) 图4 _ 6 不同浓度甘油处理后的p s i 室温紫外荧光光谱。 3 2 爸一盘o_口一。口口oo20j_ 第四章甘油和蔗糖对p s i 的结构和功能的影响 w a v e l e n g t h ( n i n ) 图4 - 7 不同浓度甘油处理后的p s i 室温紫外荧光光谱( 最大值处规一化) g l y c e r o lc o n c e n t r a t i o n ( ，v m 图4 8 不同浓度甘油处理后的p s i 室温紫外荧光峰位的变化 3 3 - 扫_ilo_口_oo口oo2011_ 惫导_ e 中国科学院研究生院硕士学位论文：甘油和蔗糖对光系统i 结构和功能的影响 是 三 鬣 冬， 昌 函 g l y c e r o lc o n c e n t r a t i o n ( ) 图4 - 9 不同浓度甘油处理后的p s i 室温紫外荧光f 3 5 0 f 3 2 0 3 3 0 比值变化 4 1 5p s i 疏水性的变化 蛋白质疏水基的相互作用是维持蛋白质的三级结构最重要的作用力。在天 然蛋白质中，疏水作用是疏水侧链为了避开水相而聚集在一起的一种相互作用。 疏水作用对蛋白质的稳定性、构象和蛋白质功能具有重要意义。疏水性影响分 子间的相互作用，如蛋白质与蛋白质、蛋白质与脂类等小配位体间的缔合作用 或其它大分子间的相互作用。荧光探针法是测定蛋白质疏水性最为常用的方法。 探针的荧光量子产率与最大发射波波长取决于环境中的极性。在水溶液中的荧 光量子产率很低，而当它们结合到蛋白质或膜上时，荧光量子产率大为提高， 这样可以用来指示探针在蛋白质和膜上结合的极性。 疏水性荧光探针1 苯胺基8 萘磺酸( a n s ) 是目前应用最广泛的疏水探针。 a n s 在水溶液中的荧光产量非常低，但在非极性溶液中其荧光大为增加。a n s 可以作用于蛋白质的非极性区域，其与蛋白质之间的疏水作用可导致a n s 的荧 - 3 4 - 第四章甘油和蔗糖对p s i 的结构和功能的影响 光增强，荧光峰位蓝移。即a n s 的荧光特征与蛋白所处的极性环境改变而变化。 因此，a n s 是一种检测溶液中蛋白质构象变化的常用探针( d a u m a n t a se ta l ， 1 9 9 8 ) 。 外加a n s 至对照p s i 溶液中，在5 2 6h i l l 附近( 3 6 0n m 激发) 有不明显的a n s 荧光带，与仅有a n s 时的荧光光谱一致( 图4 1 0 ) ，a n s 的荧光峰位和荧光强度 几乎没有什么变化，表明a n s 没有与p s i 结合，也反映了p s i 的表面没有暴露 的疏水区域，同时也表明了p s i 的紧密状态。 但在p s i 中加入甘油时，会导致a n s 荧光增强( 图4 1 1 ) ，其荧光峰位发生 蓝移( 图4 1 2 ) ，表明甘油的作用使p s i 疏水结构暴露，p s i 表面的疏水性增加。 也有可能是在甘油的作用下，p s i 的结构相对疏松，a n s 进入到p s i 蛋白质内部， 使之处于一个相对疏水的微环境。 w a v e l e n g t h ( m ) 图4 1 0 不同浓度甘油处理的p s i 与a n s 结合的荧光光谱。 3 5 扫一矗。芑一oo譬oo20ni臣 中国科学院研究生院硕士学位论文：甘油和蔗糖对光系统i 结构和功能的影响 喜 重 量 趸 薏 嚣 聋 g l y c e r o lc o n c e n t r a t i o n ( ，v v ) 图4 1 1 不同浓度甘油处理的p s i 与a n s 结合的荧光强度变化。 g l y c e r o lc o n c e n t r a t i o n ( ，v v ) 图4 1 2 不同浓度甘油处理的p s i 与a n s 结合的荧光峰位变化。 - 3 6 - 第四章甘油和蔗糖对p s l 的结构和功能的影响 4 2 蔗糖对p s i 结构与功能的影响 有关蔗糖与p s i i 相互作用的研究表明，蔗糖可以增加p s l l 对热的耐受能力 ( a l l a k h v e r d i e ve ta l , 1 9 9 6 ) 。低浓度的蔗糖也可增强p s i i 的放氧活性( w i l l i a m sa n d g o u n a r i s ，1 9 9 2 ) ，但高含量的蔗糖却会抑制p s i i 的活性( h a l v e r s o na n db a r r y , 2 0 0 3 ) 。甘油和蔗糖可以赋予p s i i 的外周蛋白3 3k d 更好的耐压能力，其中蔗糖 的作用效果强于甘油( r u a ne t 以2 0 0 3 ) 。但蔗糖对p s i 结构与功能的影响则少有 报道。与甘油相比，蔗糖分子含有更多羟基，更容易与水分子结合。蔗糖是否 与甘油一样，对p s i 会产生类似的作用呢? 还是表现出不同的影响呢? 为此，我 们也对蔗糖对p s i 的作用和影响进行了研究。 4 2 1 蔗糖对p s i 电子传递活性的影响 我们发现，在所研究的蔗糖浓度范围内( 0 2m ) ，蔗糖对p s i 的耗氧活性具 有促进作用( 图4 - 1 3 ) 。在1 2m 浓度左右，蔗糖对p s i 的耗氧活性的促进作用比 s u c r o s ec o n c e n t r a t i o n 图4 1 3 不同浓度蔗糖处理后p s i 的耗氧速率。 ( 以未处理p s i 耗氧速率4 2 0g m o lo # m g c h l 晕h 为10 0 ) 3 7 琶害：薏dn g 眦奏o oai童。酲 ! 垦坠耋墼堑塞塞望堡圭兰堡兰三：苎塑竺璧童墼垄垂墼! 篷墼塑型璧墼鬓堕 较明显。在蔗糖浓度临界处( 12h 0 ，p s i 活性达到最大，约为对照的两倍。即使 在较高浓度时( 16 m ) ，仍然能使p s i 的电子传递活性提高近2 0 。 4 22 蔗糖对p s i 光化学反应活性的影响 图4 1 4 表g q t 在外加蔗糖的情况下，p s i 在8 3 0n m 处的吸收变化( a a 8 3 0 ) 情况。从图4 1 5 可以发现，蔗糖对p s i 的p 7 0 0 光反应能力的影响与对p s i 的电 子传递影响相类似。在o 0 m 浓度的蔗糖存在下，p s i 的6 4 8 3 0 值均有所增加。 在1 0 m 浓度左右，a a 8 3 0 具有相对较大的变化值墩高浓度的蔗糖则导致a a 8 3 0 有所减弱，但仍比对照的要大。 图4 - 1 4 不同浓度蔗糖盎理后的p s l 9 3 0 啪处吸收变化 量塑兰塞堡型至堑塑：墼墼堑堡墼塑璧墼鬓堡 图4 一1 5 不同浓度蔗糖处理后的p s l 8 3 0 n m 处吸收变化 4 2 3 蔗糖对p s i 室温荧光的影响 从图4 1 6 中可以看出，蔗糖处理明显改变了p s i 的荧光发射光谱。随着蔗 6 6 0 6 8 07 0 07 2 07 4 07 f i 07 8 0 图4 - 1 6 不同浓度蔗糖处理后的p s i 室温荧光光谱 - 3 9 - 【n毫882匠 中国科学院研究生院硕士学位论文：甘油和蔗糖对光系统i 结构和功能的影响 2 甲 v - 0 s u c r o s ec o n c e n t r a t i o n ( 旧 图4 一1 7 蔗糖对p s i 的室温荧光强度( 以f 7 1 5 f 6 s 3 表示) 的影响。 糖浓度的增加，6 8 0 - 6 9 0n m 的叶绿素荧光强度逐渐减小，在1 6m 以上时，由 最大发射峰演变成相对小的肩峰。同时，蔗糖浓度的增加导致了7 1 0 7 2 0 n m 长 波组分荧光强度的增加，在高浓度蔗糖溶液处理后，变成最大的荧光发射峰。 这个变化同样可以从p s i 室温荧光强度变化图( 图4 1 7 ) 5 b 看出来。这个结果表明， 蔗糖与甘油的作用相类似，也会对p s i 中色素间的能量分配产生影响，尤其是在 高浓度时。 4 2 4 蔗糖对p s i 室温紫外荧光的影响 蔗糖也会对p s i 蛋白质中色氨酸残基的微环境产生影响。随蔗糖浓度的增 加，色氨酸残基室温在3 2 7 姗附近的荧光强度逐渐减小，其特征峰逐渐变为肩 峰直至消失( 图4 - 1 8 ) 。与此同时，在3 5 0 衄处的荧光强度随着蔗糖的浓度加大 而增强( 图4 1 8 ，4 - 2 0 ) ，从肩峰逐渐变成唯一的发射峰，峰位红移( 图4 1 9 ) 。 4 0 篁里兰苎垫墼薹矍塑：墼塑堑丝塑塑墼墼鬈堕 w a v e l e n g t h ( r i m ) 图4 - 1 8 不同浓度蔗糖处理后的p s i 室温紫外荧光光谱 s u c r o s e c m k n 删阻 图4 - 1 9 不同i 袁度蔗糖处理后的p s i 室温紫外荧光光 普( 3 4 0 n m 姓规一化) - lo8s_ 扫；e譬e_u20hs一 土墼坠竺墼錾圣圭墼璺圭兰堡篁圣；苎堡垫童堑墼垄童堡! 堑丝型塑璧塑璧堕 s u c r o s ec o n c c n t r a t l o n ( 圜4 2 0 不同浓度蔗糖处理后的p s i 紫外荧光强度比值变化厢j 2 ，) 4 25 蔗糖对p s i 疏水性的影响 与甘油相似，蔗糖的作用也会导致p s i 疏水性的增加。具体表现在，随蔗糖 浓度的增加，a n s 的荧光发生不断增强( 图4 2 1 、睨3 ) 其峰位蓝移( 图4 - 2 2 ) 。 w a v c m m b c r 图啦! 不同浓度蔗糖处理的p s i 与a n s 作用的荧光光谱 一4 2 。nl弋cd i10ni_ol每；z 第四章甘油和蔗糖对p s i 的结构和功能的影响 s u c r o s ec o n c e n t r a t i o nf m ) 图4 2 2 不同浓度蔗糖处理的p s i 与a n s 结合的荧光峰位变化。 图4 2 3 不同浓度蔗糖处理的p s i 与a n s 结合的荧光峰值变化。 4 3 u志。山弓1 五isa3iiod皇oo20等写oai苗一星 中国科学院研究生院硕士学位论文：甘油和蔗糖对光系统i 结构和功能的影响 4 3 讨论 有研究表明，醇类和糖类等多羟基化合物对光系统的作用表现出较为复杂 的多重影响。例如，浓度大于5 0 ( v v ) 的乙二醇会导致p s i i 外围蛋白尤其是 3 3 k d 的脱落，进而导致p s i i 放氧能力的下降( h i l l i e re ta l , 1 9 9 7 ) 。蔗糖和甘油对 p s i i 具有双重作用，低浓度时它们可促进p s i i 的活性，而高浓度时则抑制p s i i 活性( 1 - i a l v e r s o na n db a r r y , 2 0 0 3 ) 。4m ( 约3 0 ，v v ) 的甘油可以保护杜氏盐藻 ( d u n a l i e l l as a l i n a ) p s h 免受高光强的抑制、高盐的胁迫以及去垢剂t r i t o nx 1 0 0 的破坏( k h r i s t i ne t a l , 1 9 9 8 ) 。3 0 的甘油可以使p s i i 的3 3 k d a 蛋白不易受压力的 影响而导致变性( r u a ne ta l ，2 0 0 3 ) 。低浓度的甘油和其它渗透剂可以增加p s i i 热相变温度( l ie ta t , 1 9 9 1 ) 。有报道指出，甘油的作用可以改变菠菜p s i 中电子 受体f x 的氧化还原状态( e v a n se ta l ，1 9 8 0 ) 。 我们的研究表明，甘油和蔗糖可以影响p s i 的电子传递活性，影响大小与它 们的浓度密切相关。甘油和蔗糖对p s i 的电子传递活性存在“先促进后抑制”的双 重作用。甘油和蔗糖对p s i 的p 7 0 0 光化学反应活性也具有类似的影响。它们所 导致的p s i 活性的变化，可能是由于改变了原初电子供体p 7 0 0 与其电子受体和 ( 或) 天线色素、反应中心之间的距离或方向而造成的( r a j a g o p a l e ta l ，2 0 0 3 ) 。 这种不同浓度所造成的不同的影响也有可能是与多羟基化合物的水合作用 有关。生物体中的蛋白质等生物大分子物质均有一层水化层( h y d r a t i o n l a y e r ) ，该 水化层是维持其结构和功能不可缺少的物质基础。甘油和蔗糖等小分子多元醇 与蛋白质不发生直接作用，而是优先与蛋白质表面的水分子结合，使它们从蛋 白质分子中的溶剂化层中排除出来。结果蛋白质的溶剂化层半径减小，蛋白质 的表观体积减少，分子结构更紧密，构象更稳定，使蛋白具有更好的活性 ( t i m a s h e f f , 2 0 0 2 ) 。但在较高浓度时，甘油和蔗糖等多羟基化合物由于水合作用 却会结合较多的水分子，破坏蛋白质的水化层。加上它们的渗透作用，有可能 夺取蛋白内部紧密结合的水分子，导致蛋白质结构的不稳定如去折叠甚至变性 ( k o m b l a t ta n dk o m b l a t t , 2 0 0 2 ；r o b i n s o na n ds l i g a r , 19 9 5 ；r o b i n s o na n ds l i g a r , 4 4 第四章甘油和蔗糖对p s i 的结构和功能的影响 1 9 9 8 ) o 本工作的结果显示，甘油和蔗糖的作用也会对p s i 蛋白质的微环境和构象产 生影响，p s i 中色素和蛋白质的内源荧光以及p s i 疏水性的改变就反映这一点。 外加甘油和蔗糖能显著改变p s i 的室温叶绿素荧光光谱。随甘油和蔗糖的浓 度的增大，p s i 在6 8 0 - 6 9 0n m 处的叶绿素荧光逐渐减弱，最终由最大发射峰演变 成相对小的肩峰；与此同时，7 1 0 7 2 0n m 长波组分的荧光却不断增强，最后变 成最大的荧光发射峰。这种p s i 色素的室温荧光光谱的变化，被指与p s i 蛋白质结 构的改变有关( r a j a g o p a le ta l ，2 0 0 3 ) 。 p s i 蛋白质的内源荧光实验进一步表明，甘油和蔗糖的确使p s i 的结构发生了 改变。p s i 中至少6 0 的色氨酸残基位于反应中心蛋白p s a a p s a b ，即大部分的色 氨酸残基包埋在蛋白质内部，处在非常疏水的环境中，因而p s i 的内源性荧光在 3 2 7r i m 左右表现出特征发射。只有少部分的色氨酸残基处于极性环境中或者在 蛋白质表面，在3 5 0n m 左右的地方显示很弱的荧光发射。通过分析高等植物p s i 各多肽序列，我们发现，三个外周蛋白p s a c 、p s a d 和p s a e 各含有2 、1 和1 个色氨 酸残基。 甘油和蔗糖的作用均会导致p s i 的色氨酸残基的荧光发射发生改变，但影响 趋势不同。甘油处理时3 2 7n m 处的荧光峰位发生蓝移，强度减弱，表明这些色 氨酸残基处于更疏水的环境，其附近含荧光淬灭基n ( 女n - 硫键、硫醇等) 的蛋白 质可能更加靠近这些色氨酸残基。而3 5 0n m 处的荧光增强，说明处于极性环境 或蛋白质表面的色氨酸残基与含荧光淬灭基团( 如二硫键、硫醇等) 的蛋白质之间 的距离增大( c a s a l se ta l , 1 9 9 3 ) 。与甘油的作用不同，外加蔗糖只使3 2 7n m 处的 色氨酸残基的荧光减弱甚至完全淬灭。与此同时，3 5 0n m 处的色氨酸残基的荧 光增强，发射峰逐渐红移至3 6 0n m ，直至成为特征峰。这些结果说明，这些色 氨酸残基处于极性更大的环境中，有可能暴露于蛋白质表面，与水溶液接触。 p s i 的疏水性研究表明，甘油和蔗糖的作用均会导致p s i 的疏水性增加。受甘 油和蔗糖的影响，p s i 溶液中疏水性探针a n s 的荧光增强，荧光峰位蓝移，标志 着a n s 与p s i 中的疏水基团产生了疏水作用。究其原因，很可能是由于甘油和蔗 4 5 中国科学院研究生院硕士学位论文：甘油和蔗糖对光系统i 结构和功能的影响 皇! ! 曼! 皇曼皇! 曼! ! 苎詈皇皇! ! 曼! 鼍皇鼍i , ；= m m _ jm m ! 皇皇! 皇! 皇! ! ! 曼曼! 曼量 糖的作用改变- p s i 原有的结构，使p s i 的结构相对疏松，或使更多的疏水集团暴 露于溶液中，因而有更多的疏水部位可以接触到a n s 。 4 4 结论 本研究表明，甘油可以影响p s i 的电子传递活性。0 - 5 0 的甘油促进p s i 的 这种活性。而更高浓度的甘油则导致p s i 活性的下降。而蔗糖可以促进p s i 的电 子传递活性，使p s i 耗氧速率有所增加，在1 2m 蔗糖浓度时使其达到最大值， 约为未处理时的2 0 0 。而更高浓度的蔗糖其促进作用出现下降。 甘油对p s i 的光化学反应活性也存在着“先刺激后抑制”的两阶段作用。在 6 0 以下浓度的甘油中，光氧化态的p 7 0 0 总量随着甘油浓度的增加而增加，而 高浓度的甘油( 7 0 ) 则造成p 7 0 0 活性的损失。蔗糖对p s i 颗粒的光化学反应活 性的影响，与对p s i 电子传递影响相类似，在低浓度时，对p s i 的光化学反应活 性具有较大的促进作用，而在高浓度时，促进作用有所减弱。甘油和蔗糖导致 的p 7 0 0 光氧化作用的变化可能是由于改变了原初电子供体p 7 0 0 与其电子受体 或者( 以及) 天线色素、反应中心之间的距离或排列而造成的。 甘油和蔗糖的作用改变了室温叶绿素荧光光谱。未处理的室温叶绿素荧光 光谱表现为由核心色素产生的6 8 0 6 9 0n m 附近的峰以及7 1 0 7 2 0a m 附近由天线 系统中“远红光组分”产生的肩峰。随着甘油和蔗糖浓度的变化，7 1 0n m 与6 8 3n m 附近的荧光强度发生了变化。在低浓度处理过程中，7 1 0n m 与6 8 3n m 附近的荧 光强度比值随着甘油，蔗糖浓度的增加缓慢地增大。而加入高浓度甘油( 7 0 ， v v ) ，蔗糖( 1 6 m ) 后，该比值则显著增大，同时7 1 0 nm 附近的肩峰演变成为明 显的发射峰。这个结果表明甘油和蔗糖可以影响p s i 主体色素和捕光天线系统中 红色素的能量分配。 色氨酸残基荧光变化和a n s 与p s i 蛋白结合实验证明，甘油和蔗糖导致了 p s i 蛋白质构象和微环境极性的改变。加入甘油后，p s i 的内源荧光发生了明显的变 化。p s i 颗粒的3 2 7n m 附近荧光强度随着甘油浓度的增加而减弱，同时其峰位发 生了蓝移。同时，甘油还使3 5 0 - , 3 6 01 1 i l l 处的荧光增强。与甘油相比，蔗糖导致 4 6 第四章甘油和蔗糖对p s i 的结构和功能的影响 p s i 处的3 2 7n m 特征荧光减弱。蔗糖还导致3 5 0n m 处的荧光大为增强，并使其发 生红移至3 6 0n i n 。a n s 与p s i 的疏水作用表明，甘油和蔗糖导致p s i 疏水性增加， 使p s i 与a n s 之间产生疏水作用，从而使a n s 的特征荧光强度增大，峰位蓝移。 由此可见，甘油和蔗糖会显著影响p s i 的电子传递和光氧化还原能力，同时 也使p s i 蛋白的构象和微环境的极性受到影响，影响程度和方向与甘油和蔗糖的 浓度密切相关。 4 5 存在的问题和未来研究的设想 目前我们在p s i 结构与功能的研究方面存在的问题主要集中在p s i 的分离 纯化上。问题之一是分离纯化的产率较低，一般分离p s i 颗粒的产率( 以c h l 含 量计算) 可以达到3 0 5 0 ，而我们分离p s i 颗粒时的产率最大只能达到1 0 。 问题之二是，虽然现在通常采用的蔗糖密度梯度离心方法能够获得较纯的p s i 颗粒，但是需要经过长时间的高速离心过程，分离过程比较繁琐：而其他提取 方法由于受到实验仪器的限制，所获得的p s i 样品其纯度还无法与蔗糖梯度离心 方法相比。这些不利因素严重影响了我们对p s i 开展深入的研究。 尽管本工作初步研究了溶剂水的改变对p s i 结构和功能的影响，但对p s i 中水的作用还没有得到本质上的认识，还需要进行大量和深入的研究工作。在 此基础上可以进一步开展如下几方面工作： 1 研究具有较高渗透活性的渗透剂如聚乙二醇对p s i 结构和功能的影响。 通过在渗透条件下p s i 生理活性和结构上的的变化，也许可深入了解p s i 中水分子的作用。 2 用重水替换溶剂水的方法，研究在完全不同的水环境中p s i 的结构与功 能。 3 利用组培方法，测定在渗透条件下植物活体内p s i 生理功能的变化情况。 比较分析体内生理条件下p s i 变化与体外的异同，植物p s i 在渗透条件 下的应对反应等。 4 7 中国科学院研究生院硕十学位论文：甘油和蔗糖对光系统i 结构和功能的影响 参考文献 a g a l a r o v , r a n db r e t t e l ，k 2 0 0 3 ，t e m p e r a t u r ed e p e n d e n c eo fb i p h a s i ef o r w a r de l e c t r o nt r a n s f e r f r o mt h ep h y l l o q u i n o n e ( s ) a1i np h o t o s y s t e mi ：o n l yt h es l o w e rp h a s ei sa c t i v a t e d b i o e h i m b i o p h y s a c t a6 0 4 ：7 - 1 2 a l l a k h v e r d i e vs i , f e y z i e vy a m , a h m e da ，e ta 1 1 9 9 6 ，s t a b i l i z a t i o no fo x y g e ne v o l u t i o na n d p r i m a r y e l e c t r o n t r a n s p o r t r e a c t i o n si np h o t o s y s t e mi ia g a i n s th e a ts t r e s sw i t h g l y c i n e b e t a i n ea n ds u c r o s e jp h o t o c h e mp h o t o b i o lb ：b i o l3 4 ：1 4 9 - 1 5 7 a l l a k h v e r d i e v ay m , m a m e d o vm d ，f e r i m a z o v an ，e ta 1 1 9 9 9 ，g l y c i n e b e t a i n es t a b i l i z e s p h o t o s y s t e m 1a n dp h o t o s y s t e m2e l e c t r o nt r a n s p o r ti ns p i n a c ht h y l a k o i dm e m b r a n e s a g a i n s th e a ti n a c t i v a t i o n p h o t o s y n t h e t i c a3 7 ：4 2 3 - 4 3 2 a n d e r s o njma n dm e l i sa 1 9 8 3 ，l o c a l i z a t i o no fd i f f e r e n tp h o t o s y s t e m si ns e p a r a t er e g i o n so f c h l o r o p l a s tm e m b r a n e s p r o en a t la c a ds e iu s a ，8 0 ：7 4 5 - 7 4 9 a m o n , d i 1 9 4 9 ，c o p p e re n z y m e si ni s o l a t e dc h l o r o p l a s t s ：p o l y p h e n y l o x i d a s ei nb e t av u l g a r i s p l a n tp h y s i 0 1 1 4 ：l - 1 5 a v r o nm 1 9 9 2 ，o s m o r e g u l a t i o ni nd u n a l i e l l a ：p h y s i o l o g y , b i o c h e m i s t r ya n db i o t e c h n o l o g y , m a v r o n , a n da b e n - a m o t z , e d s ( f l o r i d a ：c r cp r e s s ) ，p p 1 3 5 1 6 4 b a b ake ta 1 1 9 9 5 ，i n ：p h o t o s y n t h e s i s ：f r o ml i g h tt ob i o s p h e r e m a t h i sp ( e d ) v o li i ，1 7 9 1 8 2 ， k l u w e r , a d a d p u b b a b ake t a 1 ，1 9 9 6 ，p h o t o i n h i b i t i o no fp h o t o s y s t e mi e l e c t r o nt r a n s f e ra c t i v i t yi ni s o l a t e d p h o t o s y s t e mip r e p a r a t i o n s w i t hd i f f e r e n t c h l o r o p h y l lc o n t e n t s p h o t o s y n t h r e s ， 4 7 ：1 2 1 - 1 3 0 b a s s i ，ra n ds i m p s o n , 1 9 8 7 ，d c h l o r o p h y l l - p r o t e i nc o m p l e x e so fb a r l e yp h o t o s y s t e mi e u r j b i o c h e m 1 6 3 ：2 2 1 - 2 3 0 b e n - a m o t zaa n da w o nm 1 9 7 3 ，t h er o l eo fg l y c e r o li nt h eo s m o t i cr e g u l a t i o no f t h eh a l o p h i l i c a l g ad u n a l i e l l a p a r v a p l a n tp h y s i 0 1 4 1 ：8 7 5 - 8 7 8 b e n g i sc ，n e l s o nn 1 9 7 5 ，p u r i f i c a t i o na n dp r o p e r t i e so ft h ep h o t o s y s t e mir e a c t i o nc e n t e rf r o m c h l o r o p l a s t s j b i 0 1 c h e m 2 5 0 ：2 7 8 3 - 8 8 b e n - s h e ma ，f r o l o wf n e l s o nn 2 0 0 4 ，l i g h t - h a r v e s t i n gf e a t u r e sr e v e a l e db yt h es t r u c t u r eo f p l a n tp h o t o s y s t e mi p h o t o s y n t h r e s 8 1 ：2 3 9 5 0 b e n - s h e ma ，n e l s o nn 2 0 0 5 ，s y s t e mb i o l o g yo fp h o t o s y s t e mi ：f o r m a t i o no fs u p p e rc o m p l e x e s i np r o e x i i ih a t c o n g r p h o t o s y n t h ，e d db r a c e ，av a nd e re s tp p 7 7 0 7 7 2 4 8 参考文献 皇曼詈詈曼! 暑曼喜皇! ! 詈曼曼鼍曼皇曼詈! 曼曼! ! ! ! i -i 曼m m= lelai l l ：曼皇曼鼍 b e n - s h e m ，a ，f r o l o w , f ，a n dn e l s o n , n 2 0 0 3 ，c r y s t a ls t r u c t u r eo fp l a n tp h o t o s y s t e mi n a t u r e 4 2 6 ：6 3 0 6 3 5 b o bb b ，w i l h e l mg ，r u s s e l ll j ，2 0 0 2 ，b i o c h e m i s t r y & m o l e c u l a rb i o l o g yo fp l a n t , 5 8 7 页， 科学出版社 b r e t t e lk 1 9 9 7 ，e l e c t r o nt r a n s f e ra n da r r a n g e m e n to ft h er e d o xc o f a c t o r si np h o t o s y s t e mi b i o c h i r nb i o p h y sa c t a , 1 3 1 8 ：3 2 2 - 3 7 3 b r u s t e i n , e a ，v e d e n k i n a , n s ，a n di r k o v a , m n f l u o r e s c e n c ea n dt h el o c a t i o no ft r y p t o p h a n r e s i d u e si np r o t e i nm o l e c u l e s p h o t o c h e m p h o t o b i 0 1 1 9 7 3 ，1 8 ：2 6 3 - 2 7 9 b r y a n td m o l e c u l a rb i o l o g yo fp h o t o s y s t e mi 1 9 9 2 ，i n ：b a r b e rj ( e d ) t h ep h o t o s y s t e m s ： s t r u c t u r e ，f u n c t i o na n dm o l e c u l a rb i o l o g y , e l s e i v e r , a m s t e r d a mp p5 0 1 - 5 4 9 c a s a l sc ，m i g u e le ，p e r e z - g i lj 1 9 9 3 ，t r y p t o p h a nf l u o r e s c e n c es t u d yo nt h ei n t e r a c t i o no f p u l m o n a r ys u r f a c t a n tp r o t e i na w i t h