（细胞生物学专业论文）日本沼虾生精细胞体外增殖与分化的研究.pdf

摘要 摘要 精子体外发生的研究是生殖生物学领域的一个研究热点。目前，在哺乳类、两栖类 和鱼类方面，通过人为激素调控，精子体外发生的研究基本上都实现了精原细胞的增殖 分化，精母细胞经减数分裂形成精子细胞的过程。但是精子细胞的完全成熟尚未实现。 通过单精子细胞向卵细胞的注射以完成受精，可以形成正常的胚胎，并能够产生健康的 幼体，尽管成功率仍然较低。甲壳类动物精子发生的体外研究目前报道较少。 甲壳类细胞培养主要是在研究虾类病害病理中发展起来的，虽然目前虾类细胞培养 可以满足病毒学和一些生理学研究的基本要求，但是仍然未能像昆虫类成功地建立起永 生细胞系，表现出一定的特殊性。甲壳动物细胞培养研究中报道较多的是对卵巢和血淋 巴的培养，而对增殖能力很强的精巢的培养报道较少，因此研究虾类精子体外发生，也 可以尝试建立虾类永生细胞系。 论文以日本沼虾的精巢生精细胞为培养对象，研究了日本沼虾生精细胞体外培养所 需的基本条件，观察描述了生精细胞增殖和分化的基本情况，并初步地研究了前脑粗提 液对精原细胞增殖分化的影响。结果如下： ( 1 ) 通过测定细胞在接种2 4 h 后的贴壁率，以及两周内的细胞存活率，发现日本 沼虾生精细胞体外培养的最适渗透压为4 0 0m m o l l ，最适p h 为7 2 7 4 。培养基中添 加1 0 2 0 胎牛血清能促进生精细胞的贴壁和存活，不添加胎牛血清细胞贴壁率会下 降，浓度太高也会使细胞存活率下降。 ( 2 ) 利用细胞培养和组织培养方法进行形态观察和定位跟踪，同时结合碱性磷酸 酶染色的辅助鉴定，描述了各生精细胞特点，以及体外增殖和分化情况：以精巢发育 早期的冬季虾为材料，通过单位重力沉降和差速贴壁分离细胞，可以获得约5 6 的精原 细胞。精原细胞至少分为两种，一种较小约6 8 岬，另一种较大，1 0 - - 1 2 岬。单个 精原细胞只能存活3 7 d 左右，且分裂能力较弱。组织培养中的精原细胞则具有很强的 存活和分裂能力，但分裂活动不超过1 周。少数初级精母细胞可以在体外进行减数分 裂形成一个精子细胞的四分体。分裂过程细胞膜并不完全分开，而是形成合胞体。多数 精母细胞不能分裂。日本沼虾精原细胞和精母细胞接种后仍然为圆形，并以克隆形式 分裂生长，子代细胞彼此不分开，形成一个团聚体。处于早期的精子细胞在体外可以 i 捅要 完成部分的分化。早期精子细胞会产生丝状物，细胞形状由圆形逐渐变为椭圆形。随后， 细胞内出现明亮的顶体囊泡，囊泡逐渐变大，将细胞质细胞核挤向另- t 贸l l 。少数精子细 胞可见棘突的产生。精巢体细胞接种后表现为两种形态，一种呈上皮样，另一种呈成 纤维样：部分细胞有分裂现象，但分裂缓慢，且存活时间不超过2 周，不能很好地形成 单层，建立与精原细胞的共培养体系。 ( 3 ) 前脑粗提液可以促进组织培养中的精原细胞不断分裂，但不能促进细胞培养中 单个精原细胞的分裂。 关键词日本沼虾生精细胞细胞培养增殖分化精子发生 i i a b s t r a c t a b s t r a c t s p e r m a t o g e n e s i si nv i t r oi sar e s e a r c hh o t s p o ti nt h eb i o l o g yo fr e p r o d u c t i o nf i e l d s a t p r e s e n t , b ym e a n so ff a c t i t i o u sh o r m o n e sr e g u l a t i o ns t u d yo ns p e r m a t o g e n e s i si nv i t r oh a s c o m et r u et h ep r o c e s so fp r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fs p e r m a t o g i n u m ，a n dt h ep r o c e s s o fm e i o s i sf r o ms p e r m a t o c y t et os p e r m a t i di nm o d e l so fm a m m a l i a , a m p h i b i aa n df i s h b u t m a t u r eo ft h es p e r m a t i dw a ss t i l lh a r dt oa c h i e v e d t h r o u g hai n t r a c y t op l a s m i cs p e r m i n j e c t i o n ( i c s i ) t e c h n o l o g y ，t h ef e r t i l i z e de g g s 丽t l li m m a t u r es p e r m a t i d sc o u l dp r o d u c e n o r m a le m b r y o s ，w h i c hf i n a l l yd e v e l o p e dah e a l t hg e r m l i n g ，e v e nt h o u g ha tal o w e rs u c c e s s r a t i o s of a r , r e p o r to ns p e r m a t o g e n e s i s nv i t r oi nc r u s t a c e a nw a sl a c k i n g c e l lc u l t u r eo fc r u s t a c e a nd e v e l o p e dw i t hs t u d yo nt h ep r a w n sp a t h o l o g y t h o u g h s o m eb a s i cr e q u i r e m e n tf o rv i r o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a ls t u d i e sc o u l db ec o n t e n t e d ，c e l l c u l t u r eo f p r a w ns t i l lf a i l e dt oe s t a b l i s hap e r m a n e n tc e l ll i n el i k ei ni n s e c t s c u l t u r es y s t e mo f c r u s t a c e a ns h o w ss p e c i f i c i t y i nc e l lc u l t u r eo fc r u s t a c e a n ，c u l t u r eo fo v a r i e sa n dh e m o l y m p h t i s s u ew a sr e p o r t e dm o r et h a nt e s t i s at i s s u e 、析t hs t r o n g e rc a p a b i l i t yo fc e l ld i v i s i o n s o s p e r m a t o g e n e s i s nv i t r ow a sa l s oa na t t e m p tt oe s t a b l i s h ap e r m a n e n ts h r i m pc e l ll i n e i nt h i sp a p e r ，s p e r m a t o g e n i cc e l l si nt e s t i so fm a c r o b r a c h i u mn i p p o n e n s ea sar e s e a r c h o b j e c t i v e ，t h ec u l t u r ec o n d i t i o no fs p e r m a t o g e n i cc e l l so fmn i p p o n e n s i sw a ss t u d i e d ，b a s i c k n o w l e d g ea b o u tp r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no f t h e s ec e l l sw a so b t a i n e d ，a n dt h ee f f e c t o fp r o s e n c e p h a l o ne x t r a c to ns p e r m a t o g i n u mw a ss t u d i e dt e n t a t i v e l y t h e s er e s u l t sw e r e f o l l o w i n g ： ( 1 ) o nt h eb a s i so ft h ed a t aa b o u tc e l la d h e r e n c er a t ea t2 4hp o s t s e e d i n ga n dc e l ls u r v i v a l r a t ei n2w e e k s ，t h er a n g eo ft h eo p t i m u mp ha n do s m o t i cp r e s s u r ef o rs p e r m a t o g e n i c c e l l s nv i t r ow a sd e t e r m i n e d ，r e s p e c t i v e l y , p h7 2 7 4a n d4 0 0 5 0 0m m o l l b e s i d e s ， m i x e d10 0 旷2 0 f e t a lb o v i n es e r u m ( f b s ) ，t h em e d i u mr e d o u d e dt oc e l la d h e r e n c ea n d s u r v i v a lo fs p e r m a t o g e n i cc e l l s c e l la d h e r e n c er a t ew o u l db er e d u c e d 、杭t l lf b s - f r e e m e d i u m ，b u tc e l ls u r v i v a lr a t ew o u l da l s ob ed e c l i n e di nh i g hc o n c e n t r a t i o no ff b s i i i a b s t r a c t ( 2 ) i nc e l lc u l t u r ea n dt i s s u ec u l t u r e ，c h a r a c t e r so fs p e r m a t o g e n i ec e l l sa n di n f o r m a t i o na b o u t t h e i rp r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n nv i t r ow e r ed e s c r i b e dt h r o u g hm o r p h o l o g i c a l o b s e r v a t i o na n dl o c a l i z a t i o nt r a c k ，私w e l la si d e n t i f i c a t i o nb ya l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( a p ) s t a i n i n g s h r i m p si nw i n t e r 嬲r e s e a r c hm a t e r i a l ，c e l l si nt e s t i sw e r ei s o l a t e db yt h e m e t h o do fu n i tg r a v i 锣s e d i m e n t a t i o na n dd i f f e r e n t i a ls p e e da d h e r e n c e ，f i f t y s i xp e r c e n to f s p e r m a t o g i n aw e r ec o l l e c t e d c u l t u r e ds p e r m a t o g i n ac o n t a i n e dt w ot y p e sa tl e a s t ，o n eo f t h e mw a ss m a l l ( d i a m e t e ro f6 8 岬) a n da n o t h e rw a sl a r g e r ( d i a m e t e ro f10 12 岬) ( 虿) i s o l a t e ds p e r m a t o g i n u ml i v e do n l ya b o u to n ew e e k , a n di t sd i v i s i o nc a p a b i l i t yw a s w e a k 舔w e l l b u ts p e r m a t o g i n ai nt i s s u ec u l t u r es h o w e ds t r o n g e rs u r v i v a la n dd i v i s i o n c a p a b i l i t y , d i v i s i o nu s u a l l yr e m a i n e do n ew e e ko rs o ( 要) m i n o r i t yo fs p e r m a t o c y t e s o c c u r r e dm e i o s i st of o r maq u a d r a n to fs p e r m a t i d s nv i t r o d u r i n gc e l ld i v i s i n g ，t h e p l a s m am e m b r a n ed i dn o ts e p a r a t et h o r o u g h l y ，b u tf o r m e dap l a s m o d i u m m a j o r i t yo f s p e r m a t o c y t e sc o u l dn o td i v i s e s p e r m a t o g o i n aa n ds p e r m a t o c y t e ss h o w e dar o u n d o u t l i n e nv i t r o ，a n dg r e wi n t ot h ec l o n e ，d a u g h t e rc e l l sf o r m e di n t oac o a c e r v a t e s p e r m a t i d si nt h ee a r l yp h r a s ec o u l d f u l f i l p a r t i a ld i f f e r e n t i a t i o n t h e yg r e ws o m e f i l a m e n t ，a n dc h a n g e dt h e i rs h a p ef r o mr o u n dt oo v a l w h e r e a f t e r ，i te m e r g e dar o u n d b r i g h ta e r o s o m a lv e s i c l ei nt h es i d eo fc e l l t h ev e s i c l eb e c a m el a r g e r ，w h i c hm a d e c y t o p l a s ma n dn u c l e a rs q u e e z et h eo t h e rs i d e m i n o r i t yo fs p e r m a t i d sd e v e l o p e di n t o s p i n o u sp r o c e s s c u l t u r e ds o m a t i cc e l l sf r o mt e s t i ss h o w e dt w ok i n d so fs h a p e s ，o n e w a se p i t h e l i o i d ，a n dt h eo t h e rw a sf i b r o b l a s t l i k e p a r to fs o m a t i cc e l l sc o u l dd i v i s e ，b u t s l o w l y s o m a t i cc e l l su s u a l l ys u r v i v e dn om o r et h a n2w e e k s ，a n dw e r en o ta b l et of o r ma m o n o l a y e rt oe s t a b l i s ha c o c u l t u r es y s t e m 诵ms p e r m a t o g o n i a ( 3 ) e x t r a c to fp r o s e n c e p h a l o np r o m o t e ds p e r m a t o g o n i a sc o n s t a n td i v i s i o ni nt i s s u ec u l t u r e ， b u tn o ti s o l a t e ds p e r m a t o g o n i u mc e l li nc e l lc u t u r e k e y w o r d s 彪n i p p o n e n s e ；s p e r m a t o g e n i cc e l l s ；c e l lc u l t u r e ；p r o l i f e r a t i o n ；d i f f e r e n t i a t i o n ； s p e r m a t o g e n e s i s w 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了致谢。 作者签名：日期：丝2 年月尘日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方格内打“”) t 作者签名： 导师签名： 日期：至盟年月j l 日日期：型么年止月卫日 日期：群年月且日 第1 章绪论 1 1 研究现状 第1 章绪论 1 1 1 虾类细胞培养研究现状 上世纪8 0 年代以来，世界养虾业迅速发展，成为海水养殖的重要支柱产业。但由 于生态环境恶化、病毒流行等诸多因素的影响，养虾业在8 0 年代末9 0 年代初出现大幅 度滑坡，造成严重的经济损失【l 】。为了搞清导致虾病的原因，科学家们进行了大量的研 究，从传统的形态学观察( 光学显微镜观察，组织病理学观察和电子显微镜观察) 【2 3 】 到9 0 年代后利用基因检测等现代生物技术研究病原体，有力促进了虾病的研究工作【4 卅。 而细胞培养作为一种重要的实验方法和手段，在虾病研究，尤其是虾类病毒的研究方面 有着不可替代的作用。细胞培养可以用于虾类病害的发生、蔓延、防止以及虾自身防御 机制的研究；可以评价环境对机体的影响；可以进行病毒的生产和分离；单克隆抗体的 生产和特定条件下建立生物模型。所以，虾类细胞培养本身的研究对于虾病的防治是非 常必要的。 甲壳动物的细胞培养始于上世纪6 0 年代末7 0 年代初，但迄今仍未建立起这类动物的 永生细胞系。早在1 9 7 1 年p e p o n n e t 等就报道了螯虾、龙虾的类淋巴、心脏、卵巢等组织 的体外培养【7 1 。随后p a t t e r s o n 又报道了美洲龙虾( h o m a r u sa m e r i c a n u s ) 血细胞的原代培 养【舯。c h e n 等 9 1 在8 0 年代报道了斑节对虾( p e n a e u sm o n o d o n ) 的卵巢、心脏、肌肉、 神经、肠道、肝胰腺和鳃的组织培养，发现只有卵巢和心脏能够生长。之后c h e n 等【l o 】又 报道斑节对虾淋巴器官的原代培养。l u e d e m a n 【l 】利用g r a c e 培养基对细角滨对虾( p s t y l i r o s t r i s ) 和凡纳滨对虾( pv a n n a m e i ) 的卵巢上皮细胞进行了原代培养，证实最佳的 培养条件是g r a c e 培养基+ 1 0 胎牛血清( f b s ) + 1 ( 青霉素1 0 4i u m l ，链霉素1 0 4 l x g m l ，脯氨酸2m g m l ，碳酸氢钠4 0r a g m e ，氯化镁2m o l l ，氯化钠5t o o l l ) ，渗透 压为7 5 3m m o l k g ，2 8 c 培养。在该条件下细胞培养2d 后有8 0 形成单层，每3d 更新1 次 培养基，细胞能维持1 0d 。 1 9 9 9 年是报道虾类细胞培养较多的一年，这些文献总结了上世纪9 0 年代该领域的进 展情况。t o u l l e e 【1 1 】在甲壳动物细胞培养技术指南一文中较全面地总结了各种虾类( 对虾、 河北大学理学硕士学1 1 ) = 论文 螯虾和龙虾等) 的细胞培养条件，如p h 、渗透压、培养基的比较、抗细菌真菌处理、培 养基添加物、获取细胞的方法和注意事项等。k a s o m e h a n d r a 等【1 2 】对斑节对虾的淋巴器官 和卵巢进行了体外培养，证实了在培养基中添加o 0 1 的胆固醇能增强淋巴器官的生 长，培养两天后观察到了上皮样细胞和成纤维细胞样细胞，并且只有淋巴器官能形成单 层，能传至3 代。f r a s e r 等【1 3 】通过改良的g r a c e 培养基和l 1 5 培养基对斑节对虾的卵巢组 织作了原代培养，比较了添加不同的生长因子对卵巢4 种类型细胞的影响。结果显示了 上皮样细胞在g r a c e 培养基上生长最好，但存活时间不超过两个月。纤维样细胞在2 x l 1 5 培养基中能形成单层并能传至3 代，存活1 7 个月，同时观察到圆形细胞从组织中迁出， 能存活1 0 个月，巨核的上皮细胞容易形成单层，但不易传代。两种细胞被证实有合成卵 黄蛋白原的功能。该实验尝试了一些添加物如磷酸胰蛋白胨肉汤，有利于细胞的健康生 长。然而添加的表皮生长因子( 从小鼠下颌腺获得) 以及碱性成纤维生长因子( b f g f ) 并没有促进细胞的分裂。i t a m i 1 4 】利用日本对虾( p j a p o n i c u s ) 的淋巴组织和血细胞进行 原代培养，结果显示上皮样细胞和成纤维样细胞能存活5 4d ，但细胞经胰蛋白酶、胶原 酶、透明质酸酶等消化后，细胞不易存活。同时指出胰岛素和细胞分裂素不能促进细胞 的增殖。w e s t 等【1 5 】也报道了斑节对虾淋巴细胞和卵巢细胞的原代培养，其结果与c h e n 和f r a s e r 的结果一致。m u l f o r d 等【l6 】对螯虾( n e p h r o p sn o r v e g i c u s ) 的造血组织进行了原 代培养，实验中偶尔看到细胞的有丝分裂，并证明了成纤维生长因子和胰岛素生长因子 对细胞的生长没有增强作用，这与i t a m i 的研究结果一致。 在国内，刘凯于i l7 】利用l 1 5 培养基，添力n 1 0 的f b s ，在p h 值7 0 条件下对斑节对虾 的淋巴器官、造血组织、血细胞、心脏、甲壳下表皮和肌肉等组织进行了原代培养，结 果显示前3 种组织生长较好。魏静等【1 8 】报道了克氏原螯虾( p r o c a m b a r u sc l a r k i i ) 血淋 巴细胞的培养情况，发现细胞于1 2 h 内贴壁，形态不一，多数不分裂，可维持1 5d 以上。 王宏伟等【1 9 1 对日本对虾血细胞进行了培养，他们以r n a d n a 比例为指标，参考超微结 构，确定了日本对虾体外培养的最适p h 值为7 2 。张晓华等【2 0 】对中国明对虾( f e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s ) 进行了原代培养，获得3d 内细胞覆盖面积为9 0 的良好结果。 传代培养方面，c h e n t 9 】曾将斑节对虾的卵巢组织传至3 代。h s u l 2 l 】对斑节对虾的淋 巴器官进行体外培养，添加2 0n g m lb f g f 后，能使细胞传9 0 代之久，为传代最长的一 株。王立平等 2 2 1 对中国明对虾的上皮组织进行了体外培养，获得了传代细胞1 1 株，其中 第1 章绪论 1 株传至2 5 代。f r a s e r 1 3 】将卵巢组织中的纤维样细胞传至3 代，存活1 7 个月。为了使传代 细胞成为永生性的细胞系，研究者们进行了不同方法的探索。l y n n ( 2 3 】把建立昆虫细胞系 的方法推广应用到对虾细胞系的建立，是一种很好的尝试。c r a n e 【2 钥利用电离辐射使原 代培养的细胞发生变化或变异，虽没成功得到永生性的细胞系，但也是建立对虾细胞系 的一次探索。h u 2 5 , 2 6 | 利用t c 1 9 9 培养基加上平衡盐溶液，添j j i a l 5 f b s ，1 0 0 g m l 青 霉素和链霉素，在2 8 的情况下进行了中国明对虾肝胰腺细胞的传代培养，成功地把肝 胰腺细胞传至2 8 代，历经5 个多月，但最终因真菌的污染而死亡。郎刚华等【27 】成功地进 行了中国明对虾淋巴组织的原代培养，并进行了化学诱变，发现诱变后有的细胞呈现出 转化细胞的形态，并形成了转化灶。 在日本沼虾( m a c r o b r a c h i u mn i p p o n e n s e ) 方面，王宏伟等【2 8 】培养了肝胰腺细胞， 发现p h7 0 , - , 7 2 、渗透压为6 0 0i j a n o l g 时，细胞长势最好。以此作为培养条件，在培养 基中加入亚油酸，发现其促生长作用明显，其中亚油酸浓度为1 6x l o 4m o l l 时，效果 最好。日本沼虾肝胰腺细胞共传代2 次，存活时间约4 5d 。王军霞【2 9 】对日本沼虾的血细 胞进行了培养，渗透压4 7 2r n m o l k g 适于细胞生长，加入lg l 葡萄糖，o 1m g l 维生素c 有利于传代血细胞的贴壁与生长。同时发现c u 2 + 浓度在2 岭几时碱性磷酸酶的活性最强。 综上所述，从上世纪7 0 年代以来，人们对虾类细胞的体外培养进行了广泛的研究。 探索虾类细胞体外培养的分裂规律，以至建立起虾类细胞系，将为虾类病理，生理学的 研究打下坚实基础，而且也会在在如下几个方面有重要应用： 1 ) 培养虾类免疫细胞，研究虾类免疫机制和筛选免疫增强药物。 2 ) 遗传学方面，检查虾类染色体和基因定位，利用细胞融合培育新品种。 3 ) 通过培养虾的内分泌及生殖器官，研究虾类的激素功能和对生殖的调控作用。 4 ) 毒理学研究及环境因素评价。 1 1 2 生精细胞的体外培养研究现状 1 1 2 1 哺乳动物生精细胞体外培养研究 1 9 2 0 年c t l a i n p y 【3 0 1 首次报道用血浆培养睾丸组织研究体外精子发生以来，随着对 睾丸的组织结构、各种细胞的功能和精子体内发生过程的逐步认识以及体外培养技术 的发展，睾丸未成熟生精细胞的体外培养方法和技术有了很大改进。 2 0 世纪2 0 年代至6 0 年代末取得了四个方面的成就：所设计的组织培养系能使 河北大学理学硕十学位论文 生殖细胞进入减数分裂前期；初级精母细胞能从细线前期向粗线期分化。在器官培 养方面，体外培养未分化的生殖腺能产生性分化。确立了雄性生殖细胞的培养条件 为含5 c 0 2 ( v ) 的空气、p h 值7 2 + 0 2 、温度3 2 0 - - 3 5 0 ( 2 3 1 3 2 】；改变了培养基的 营养成分，应用丙酮酸作为培养基的能量底物，加入了胎牛血清、各种氨基酸以及维 生素类物质。用3 h ( 氚) 胸腺嘧啶脱氧核苷( 3 h t d r ) 作为放射性标记物，跟踪 生殖细胞的分化过程【3 3 1 ，为检测生殖细胞的体外分化阶段提供客观依据。这些早期研 究成果为后来的研究者提供了可靠的研究基础，即使在现阶段仍具有重要意义。 7 0 年代以前在培养方法上多采用组织培养法，这种培养方法保留了睾丸或生精小 管的结构，细胞存活和增殖更多地依赖于原有的精子发生微环境，不能进一步研究精 子发生所需的条件以及睾丸中生精细胞与体细胞之间的相互关系【3 4 1 。然而，随着对睾 丸生精小管结构和特点的进一步认识，科学家们改进了早期简单的器官培养方法， p a r v i n e n 等【3 5 】在立体显微镜下采用透视辅助微分离技术( t r a n s i l l u m i n a t i o na s s i s t e d m i c r o d i s s e c t i o nt e c h n i q u e ) 制备处于精子发生特定生精阶段的生精小管片段进行培养。 发现大多数大鼠精母细胞在培养2d 内可完成所有的减数分裂过程，分化为早期的精 子细胞，至培养扣6d 可得到晚期( 细长) 精子细胞。阶段特异性生精小管培养现在 己成为一种很有价值的、并可用于研究调控精子发生不同阶段的方法【3 6 1 。例如，y a n 等【3 7 】分离了大鼠阶段的生精小管片段进行培养，观察干细胞因子( s t e mc e l lf a c t o r ， s c f ) 对精子发生的影响，证明s c f 是大鼠生精细胞成熟的重要调控因子，促卵泡激 素( f o l l i c l es t i m u l a t i n gh o r m o n e ，f s h ) 对生精细胞的作用部分也是通过s c f c k i t 途径 介导的。 将睾丸生精小管进行简单的物理分离或酶消化处理，得到非常细小的小管碎片， 然后进行培养，这是一种更为精致的、也是目前使用较多的一种培养方法。h u e 3 s 采用 胶原酶和d n a s e 对s d 大鼠睾丸生精小管进行消化，将获得的全部细胞在d m e m f 1 2 培养液中培养，添加胰岛素、转铁蛋白、维生素以及f s h 和睾酮( t e s t o s t e r o n e ，t ) 等， 共培养了3 周。结果使粗线期精母细胞分化为圆形精子细胞。s m u b 等 3 9 1 采用此法对 2 0 - - - 2 2d 大龄w i s t a r 大鼠的睾丸生精细胞培养了4 周，结果从细线期精母细胞至圆形精 子细胞的所有减数分裂过程均可发生，这是第一次使正常的哺乳动物生精细胞在体外 发生完整的减数分裂过程。这种培养方法成功的关键在于生精小管碎片的大小和酶消 第l 章绪论 化的程度。 2 0 世纪7 0 年代发明了单位重力沉降法( v e l o c i t yg r a v i t a t i v es e d i m e n t a t i o n ) 分离各 个阶段的生精细胞，再结合差速贴壁选择以及细胞离心淘洗方法，使得单独培养各种 生精细胞成为可能，但研究发现这种生精细胞仅能存活2 3d ，因而支持细胞( s e r t o l i c e l l ) 的关键作用被人们认识，故分离和培养支持细胞也在这时取得了进展【钟】。最终科 学家创立了模拟体内微环境的体外培养方法，即生精细胞和支持细胞的体外共培养 ( c o c u l t u r e ) 。共培养按其对支持细胞的营养供给方法分为非渗透性和渗透性支持物共 培养两种。 非渗透性支持物培养是将支持细胞置于非渗透性支持物上，如塑料、玻璃培养皿 等，培养成细胞单层后，再将生殖细胞直接种植在这一单层上共同培养。 m a g u e r e s s e b a t t i s t o n i 等【4 l 】曾用成年大鼠睾丸粗线期初级精母细胞与2 0d 龄大鼠的支 持细胞共培养7d ，约有1 0 的粗线期初级精母细胞能发育成早期精子细胞。 渗透性支持物培养也称为双室培养( b i o c a m e r a lc u l t u r e ) ，在普通培养皿内放置一 个套皿( i n s e r t ) ，套皿底部装有微孔滤膜或生物材料构成的渗透性薄膜，使培养皿分 隔为上下两小室，培养液置于下室，当上室培养的支持细胞形成细胞单层后，再将生 殖细胞置于支持细胞单层上共培养。1 9 9 2 年，t r e s 等【4 2 1 改进了双室培养的渗透膜，用 透明的细胞外基质( 胶原及粘多糖) 构成的聚合体作为渗透膜，可以在体外培养过程 中观察细胞的形态变化。他们用此方法观察到精原细胞扩增，并分化至减数分裂前期； 初级精母细胞发生减数分裂分化；圆形精子细胞形成长形精子细胞，有结构正常的顶 体和可活动的鞭毛。现代的双室培养系的渗透性薄膜采用聚乙烯对苯二酸( p o l y e t h y l e n e t e r e p h t h a l a t e ，p e t ) 膜制成，操作简便，使培养的效果更为稳定、可靠。 生精细胞的体外分化具有明显的激素依赖性。虽然不同文献激素使用浓度有差别， 对于哺乳动物生精细胞的培养，f s h 和t 均是不可缺少的两种激素。s t a u b 等【3 9 】采用 的培养系统取得了较好的培养效果：1 5m m o l lh e p e s 缓冲的d m e m f 1 2 培养液，添 加抗生素、n a h c 0 3 ( 1 2e e l ) 、胰岛素( 1 0i _ t g m l ) 、转铁蛋白( 1 0 t g m l ) 、维生素 c ( 1 0 4 m o l l ) 、维生素e ( 1 0p t g m l ) 、t ( 1 0 t o o l l ) 、视黄酸( 3 3 1 0 。m o l l ) 、 维生素a ( 3 3 1 0 m o l l ) 、丙酮酸( 1 0 刁m o l l ) 以及羊f s h ( 1n g m l ) 。其他报道 的可促进细胞增殖的因子有干细胞因子s c f 3 6 , 3 7 1 及白血病抑制因子( 1 e u l ( e m i ai n h i b i t i o n 河北大学理学硕十学位论文 f a c t o rl i f ) 4 3 1 等，但并非必须添加，因为培养的支持细胞本身能产生s c f 等因子。 对体外培养的生精细胞的检测是这方面研究的基础内容。目前所采用的检测方法 有：光镜及电镜观察培养细胞的形态变化。染料( 如台盼蓝) 排斥试验检测培养 细胞的存活力。检测培养液中是否有培养细胞产生的物质，如支持细胞产生的转铁 蛋白、间质细胞( l e y d i gc e l l ) 产生的t 等，可说明培养细胞的生长情况。对培养前 细胞新合成的d n a 标记，从而证明培养期末获得的细胞是否来自于培养初接种的细 胞。b r d u ( 5 b r o m o - 2 d e o x y u r i d i n e ) 是目前常用的标记物，它可掺入新合成的d n a 中，然后用抗b r d u 单克隆抗体进行检测 3 8 , 3 9 , 4 4 。利用p c r 等技术检测培养细胞特 异性基因表达的变化。如编码磷蛋白( p h o s p h o p r o t e i n ) p 1 9 和睾丸特异性组蛋白t h 2 b 的m r n a 特异性地表达于粗线期精母细胞；而编码过渡蛋白( t r a n s i t i o np r o t e i n ) t p l 和t p 2 的m r n a 主要表达于单倍体的精子细胞。因此，分离制备的粗线期精母细胞中 p 1 9 t p l 和t h 2 b t p 2 之比显著高于圆形精子细胞组分，在粗线期精母细胞和支持细胞 培养时可观察这2 个比值的变化，从而说明培养细胞的变化m ，这是一种非常有价值 的指标。检测圆形精子细胞特异性表达基因( 如鱼精蛋白基因p r m i ，p r m 2 ) 也可证 明培养系统中有无圆形精子细胞生长【4 5 1 。流式细胞仪分析培养细胞的倍体变化晰j 检测各种生精细胞特征性的标志，如细胞膜蛋白，s c f 的受体c k i t 等，采用相应的单 克隆抗体检测。 现代的生精细胞体外培养系已能使生精细胞在体外经历减数分裂，分化到精子细 胞阶段，但是精子细胞进一步发育成为有鞭毛的成熟精子尚未能实现，这是生精细胞 体外培养中有待解决的难题。但通过精子细胞显微注射法直接与卵细胞结合而完成受 精的方法已可以获得正常个体【4 7 。 在2 0 0 6 年，n a y e m i a 等【4 8 】利用胚胎干细胞获得了精原干细胞系。这些精原干细胞在 体外减数分裂，可以产生单倍体的雄配子。他们通过细胞质注射方法，使这些细胞与卵 细胞融合完成受精，随后该细胞发生分裂，将产生的2 细胞胚胎移入输卵管，成功地获 得健康的小鼠。 1 1 2 2 两栖类生精细胞体外培养研究 两栖类动物生精细胞的体外培养，在上世纪8 0 年代已有不少报道。r i s l e y 等 4 9 1 利用细胞悬浮方法第一次培养了非洲爪蟾( x e n o p u sl a e v i s ) 的生精细胞( 精母细胞为 第1 章绪论 主) ，他们描述了处于细线期和偶线期的初级精母细胞可以通过减数分裂形成圆形精子 细胞，而圆形精子细胞最终发育到带有鞭毛和顶体的不完全成熟的精子。他们发现精 子细胞形态不断拉长时，精子特异性核碱性蛋白开始在胞质中积累。但是，实验没有 发现精子细胞的染色体完全浓缩。 n i s h i k a w a 等【5 0 】培养东方蝾螈( c y n o p sp y r r h o g a s t e r ) 生精细胞时，7 0 的处于粗 线期以后的初级精母细胞可以发育到具鞭毛的圆形精子细胞，而处于偶线期之前的初 级精母细胞发育到精子细胞的比率较低。但至少1 3 的细线期初级精母细胞仍可以在 体外发育到减数分裂i 的分裂中期。他们也发现羊促卵泡激素( o v i n ef o l l i c l es t i m u l a t i n g h o r m o n e ) ，5 a 二氢睾酮以及睾丸酮对精母细胞的分化没有明显的促进作用。在体外培 养发育形成的蝾螈精子细胞，3 4 周后，圆形的精子出现明显的极化，圆形的细胞核 移到了细胞的一边，鞭毛伸至最长。富含顶体颗粒的顶体囊贴附于核膜，但是核没有 发生进一步延长。 以上两个物种的总体特征：粗线期以后的初级精母细胞可以在体外经历减数分裂 发育到具鞭毛和顶体的圆形精子细胞 4 9 - 5 1 】。至少约一周后，精子细胞开始确定极性， 形状逐步发生伸长，其细胞核移至细胞一侧。两个物种其鞭毛都形成于次级精母间期 5 2 , 5 3 1 。支持细胞与初级精母细胞或圆形精子细胞的接触，对于精母细胞向精子细胞的 这个分化阶段不是必须的，胎牛血清同样没有影响。然而，r i s l c y 在培养非洲爪蟾精巢 组织片段时观察到完整的精子发生过程【5 4 】，这可能意味着支持细胞或精巢微环境对于 精原细胞向初级精母细胞的分化以及精子发生的最后阶段是必须的。 在蝾螈精子发生的激素调控方面，有研究表明哺乳动物促卵泡激素，可以通过刺 激支持细胞，间接促进精原细胞合成，使其分化至前期的初级精母细胞。另外哺乳动 物促卵泡激素对精子细胞的进一步成熟也是必需的【5 5 - 5 7 】；人类重组干细胞因子( h u m a n r e c o m b i n a n ts t e mc e l lf a c t o r , h r s c f ) 也可促进精原细胞有丝分裂，但不能起始减数分裂 【5 引，而胰岛素样生长因子( i n s u l i n 1 i k eg r o w t hf a c t o r ，i g f ) 可以促进精原细胞向初级精 母细胞分化【5 9 1 。 1 1 2 3 鱼类生精细胞体外培养研究 鱼类生精细胞体外培养在上世纪9 0 年代开始有较多的报道。1 9 9 1 年，m i u r a 等利 用组织培养方法，在促性腺素( g o n a d o t r o p i n ) 和1 1 - 酮基睾酮( 1 1 k e t o t e s t o s t e r o n e ，1 1 k t ) 河北大学理学硕士学位论文 激素的诱导下，成功地在体外将日本鳗鲡( a n g u i l l aj a p o n i c a ) 的精原细胞培养分化到 精子 6 0 , 6 1 】。1 9 9 6 年m i u r a 等又利用生殖细胞和体细胞共培养法同样在体外得到精子， 并且发现1 1 酮基睾酮的