（老年医学专业论文）高糖及糖浓度波动对单核巨噬细胞分泌mmp9的影响.pdf

专业：老年医学 导师：亓文波教授 中文摘要 目的 本实验采用不同的葡萄糖浓度的培养液以及甘露醇培养液孵育人单核 巨噬细胞，观察在不同的环境中单核巨噬细胞表达m m p 9 的不同，探讨不 同的葡萄糖浓度及糖浓度波动对单核巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶9 ( m m p 9 ) 的影响以及渗透压改变是否参与了这一过程。旨在探讨高糖及糖 波动促发糖尿病大血管病变的作用机制，为糖尿病大血管并发症的治疗提供 新的方向及理论依据。 方法 1 t h p 1 细胞的培养：于8 0 冰箱中取出t h p 1 细胞株，在超净工作台 内解冻复苏后接种于培养瓶中，置于5 c 0 2 培养箱中孵育( 3 7 。c ) 。培养的 单核细胞采用胎盘蓝染色法计算细胞活率。 2 单核巨噬细胞的获得：t h p 1 细胞在培养至浓度为l0 5 m l 时经乙酸肉 豆蔻佛波酯( pma ) 孵育4 8 后被诱导成单核巨噬细胞。 3 单核巨噬细胞的鉴定：采用鸡红细胞吞噬法对单核巨噬细胞进行功能 鉴定。 4 实验分组：根据葡萄糖浓度及其变化分为对照组( 5 m m o l l ) 、高葡萄 糖组( 1 5 m m o l l ) 、葡萄糖浓度波动组( 5 1 5 m m o l l ) 及渗透压控制组( 甘 露醇浓度5 1 5 m m o l l ) 。 5 m m p 9 的检测：r t - p c r 测定各组m m p 9m r n a 的表达，并比较各 组间有无统计学差异。 结果 1 高糖组、糖波动组及甘露醇组单核巨噬细胞内m m p 9 的表达均明显 高于对照组( p 0 0 1 ) ； 2 糖波动组m m p 一9 的表达明显高于高糖组【( 0 8 9 7 + 0 0 3 0 v s o 6 2 7 + 0 0 4 1 ) ，( p 0 0 1 ) 】； 1 3 渗透压控制组m m p 9 表达介于高葡萄糖组与葡萄糖浓度波动组之间， 与高葡萄糖组、葡萄糖浓度波动组比较有统计学意义 ( o 8 2 3 - 4 - 0 0 3 6v s o 6 2 7 + 0 0 4 1 ) ，( o 8 2 3 + 0 0 3 6v so 8 9 7 - 4 - 0 0 3 0 ) ( p o 0 1 ) 】。 结论 1 高葡萄糖浓度较低葡萄糖促进单核巨噬细胞内m m p 9 的表达； 2 糖浓度波动的环境较高葡萄糖更能促进单核巨噬细胞内m m p 9 的表 达： 3 糖浓度波动对单核巨噬细胞的影响部分与渗透压改变有关。 关键词巨噬细胞；m m p 9 ；高葡萄糖浓度；糖浓度波动 2 t h ee f f e c to fh y p e r t o n i cg l u c o s ea n d i n t e r m i t t e n th i g hg l u c o s eo fm m p 一9p r o d u c t e d b ym o n o n u c l e a rm a c r o p h a g e s p o s t g r a d u a t e ：z h e n g g u a n l i n s p e c i a l t y ： g e r i a t r i cm e d i c i n e t u t o r ：p r o f q i w e n b o a b s t r a c t u b j e c t i v e t oo b s e r v et h ee f f e c to fg l u c o s eo fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sa n di t s f l u c t u a t i o no nm m p 一9e x p r e s s i o ni nm o n o n u c l e a rm a c r o p h a g e sa n dt os t u d y w h e t h e ro rn o to s m o t i cp r e s s u r ec h a n g e sp a r t i c i p a t ei nt h ep r o c e s si nw h i c h i n t e r m i t t e n th i g hg l u c o s ea f f e c t sm m p 一9e x p r e s s e db ym o n o n u c l e a rm a c r o p h a g e s ， m o n o n u c l e a rm a c r o p h a g e sc u l t u r e di nv i t r oi n d u c e df r o mt h p - 1c e l l t h ea i mi s t o s t u d yt h ei m p o r t a n c e o fi n t e r m i t t e n th i g h g l u c o s ei n t h em e c h a n i s mo f d i a b e t i cm a r c o v a s c u l a rd i s e a s e ，s oa st op r o v i d et h eo r e t i c a ls u p p o r t sa n de x p - e r i m e nt a lb a s e sf o rt h et r e a t m e n to f d i a b e t i cm a r c o v a s c u l a rd i s e a s e m e t h o d s 1 t h p 1c e l lc u l t u r e ：t a k e no u tf r o mt h ef r i d g eo f 一8 0 t h et h p - 1c e l l s t r a i n sw e r et h a w e do nas u p e r c l e a nb e n c ha n dt h e ng r a f t e dt oac u l t u r ef l a s k w h i c hw a sp u ti na ni n c u b a t o rw i t h5 c 0 2 ( 37 ) t h ec u l t u r e dm o n o c y t e s w o u l db es t a i n e db yt r y p a nb l u et oc a l c u l a t et h es u r v i v a lp e r c e n t a g e 2 m o n o n u c l e a rm a c r o p h a g e so b t a i n i n g ：i n c u b a t e dw i t hp m af o r4 8h o u r s ， t h et h p 1c e l l si n d u c e di n t oi t sm o n o n u c l e a rm a c r o p h a g e s 3 m o n o n u c l e a rm a c r o p h a g e si d e n t i f y i n g ：i n c u b a t e dw i t ht h er b co f c h i c k e nt oi d e n t i f yt h ep h a g o c y t o s i so fm o n o n u c l e a rm a c r o p h a g e s 4 g r o u p i n g ：a c c o r d i n g t o g l u c o s e c o n c e n t r a t i o na n di t sf l u c t u a t i o n ， m o n o n u c l e a rm a c r o p h a g e sw e r ed i v i d e di n t o4g r o u p s ：c o n t r a s t ( 5m m o l l ) ， h y p e r t o n i cg l u c o s e ( 1 5m m o l l ) ，i n t e r m i t t e n th i g hg l u c o s e ( 5 15m m o l l ) ，a n d o s m o t i cp r e s s u r ec o n t r o l l e d ( m a n n i t o l5 - 15m m o l l ) 5 t e s to fm m p - 9 ：r t p c rw a su s e dt o t e s tm m p 一9e x p r e s s i o ni n m o n o n u c l e a rm a c r o p h a g e s ，c o m p a r i n gt h ed i f f e r e n c e sf o rs t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e r e s u i t 冀 3 1 m m p - 9e x p r e s s i o ni nh y p e r t o n i cg l u c o s e 、i n t e r m i t t e n th i g hg l u c o s ea n d o s m o t i cp r e s s u r ec o n t r o l l e da r em u c hh i g h e rt h a nt h o s ei nt h ec o n t r a s t ( p 0 01 ) 2 m m p - 9e x p r e s s i o ni ni n t e r m i t t e n th i g hg l u c o s ea r em u c hh i g h e rt h a n t h o s ei nh y p e r t o n i cg l u c o s e ( p 0 01 ) 3 m m p 一9e x p r e s s i o ni no s m o t i cp r e s s u r ec o n t r o l l e da r eb e t w e e nt h o s ei n h y p e r t o n i cg l u c o s ea n di n t e r m i t t e n th i g hg l u c o s e ，b u tc o m p a r e dw i t ht h e m ，i ti s s t a t i s t i c a l l ym o r es i g n i f i c a n t ( p 0 0 1 ) c o n c l u s i o n 1 g l u c o s eo fh i g h e rc o n c e n t r a t i o nc a nl e a dt oam a r k e di n c r e a s e m e n to f m o n o n u c l e a rm a c r o p h a g e st oe x p r e s sm o r em m p 一9 2 g l u c o s eo f i n t e r m i t t e n th i g hg l u c o s ee n h a n c e sm o n o n u c l e a rm a c r o p h a g e s e x p r e s sm o r em m p 一9t h a ng l u c o s eo fh i g hc o n c e n t r a t i o n 3 t h ec o n c e n t r a t i o nf l u c t u a t i o no fg l u c o s ei np r o m o t i n gm o n o n u c l e a r m a c r o p h a g e st oe x p r e s sm m p - 9 i sp a r t l yr e l a t e dw i t ho s m o t i cp r e s s u r ec h a n g e k e yw o r d sm a c r o p h a g e s ；m m p 一9 ；h y p e r t o n i cg l u c o s e ；i n t e r m i t t e n th i g hg l u c o s e 4 英文缩写英文全称 符号说明 m m p - 9m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s - 9 a s s a u a a m i i g t m m p s c h d d m r t - p c r d m s o e c m t i m p f p g v s m c e l i s a h o m a i r a c s i m t i r h b a l c h d l o x l d l n f k b p d g f p k c t h p 1 t n f 0 【 i l a t h e r o s c l e r o s i s s t a b l ea n g i n ap e c t o r i s u n s t a b l ea n g i n a a c u t em y o c a r d i a li n f a r c t i o n i m p a i r e dg l u c o s et o l e r a n c e m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s c o r o n a r yh e a r td is e a s e d ia b e t e s r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n d i m e t h y l s u l f o x i d e e x t r a c e l l u l a rm a t r i x t i s s u ei n h i b i t o ro fm e t a l l o p r o t e i n a s e f a s t i n gp l a s m ag l u c o s e v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l e n z y m el i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y h o m e o s t a s i sm o d e la s s e s s m e n t a c u t ec o r o n a r ys y n d r o m e i n t e i m a m e d i at h i c k n e s s i n s u l i nr e s i s t a n c e g l y c o s y l a t e dh e m o g l o b i n h i g hd e n s i t yl i p o p r o t e i n o x i d i z e dl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n n u c l e a rf a c t o rk a p p a b p l a t e l e t - d e r i v e dg r o w t hf a c t o r p r o t e i nk i n a s ec h u m a nm o n o c y t o i dc e l l s t u m o u rn e c r o s i sf a c t o r q i n t e r 】e u k i n 5 中文全称 基质金属蛋白酶9 动脉粥样硬化 稳定型心绞痛 不稳定型心绞痛 急性心肌梗死 糖耐量受损 基质金属蛋白酶 冠心病 糖尿病 反转录聚合酶链式反应 二甲基亚砜 细胞外基质 基质金属蛋白酶抑制因子 空腹血糖 血管平滑肌细胞 酶联免疫吸附法 胰岛素抵抗指数 急性冠脉综合症 颈动脉内膜中层厚度 胰岛素抵抗 糖化血红蛋白 高密度脂蛋白 氧化型低密度脂蛋白 核转录因子k b 血小板源性生长因子 蛋白激酶c 人单核细胞株 肿瘤坏死因子0 t 白介素 日l j舌 糖尿病( d i a b e t e s ，d m ) 作为一种临床常见病和多发病，是严重影响人 类生活质量的全球性公共卫生问题。近年来，其发病率逐年增高。无论是发 达国家还是发展中国家，糖尿病都表现为一种流行的趋势。与1 型糖尿病相 比，2 型糖尿病更加严重，约占糖尿病总数的9 0 9 5 。目前我国糖尿病患 者人数近一亿。其中糖尿病大血管并发症患病率分别为：高血压31 9 ，脑血 管并发症1 2 ，心血管并发症9 ，下肢血管并发症5 o 。糖尿病大血管病 变以动脉粥样硬化为特征，主要累及冠状动脉、脑血管、外周血管，是糖尿 病患者致死致残的主要原因【。 糖尿病作为冠心病危险等同因素，糖尿病人易患动脉粥样硬化，对其机 制的研究一直是心血管疾病研究领域中的热点。虽然目前关于动脉粥样硬化 的发生过程，存在多种学说及假说。但是r o s s 2 j 提出的“炎症学说”具有重要 的地位及意义。人们普遍认为，动脉粥样硬化是一个慢性炎症过程，是以炎 症反应为基础的疾病。糖尿病人易患动脉粥样硬化，其机制与动脉粥样硬化的 主要危险因素：肥胖、高胰岛素血症、脂质异常、高血压、高凝状态所组成的 胰岛素抵抗综合征有关。有糖尿病或胰岛素抵抗者，其心血管事件死亡率增加 了5 倍。 在欧洲和美国，一t l , 血管疾病构成了首要死亡原因【3 “】，其中动脉粥样硬 化( a s ) 引起的冠心病约占1 2 。基质金属蛋白酶( m m p s ) 在动脉粥样硬化 的发生发展起重要作用，m m p 9 是基质金属蛋白酶家族中的重要成员，在动 脉粥样硬化板块处的血管重构，斑块的不稳定及其破裂诱发的急性冠脉综合 症( a c s ) 都扮演着重要的角色。a s 形成和发展过程也是e c m 重构的过程， m m p 与t i m p 失去平衡，突出表现为m m p 表达增加，活性增强，使e c m 的合成和 降解也失去平衡，通过血管中膜平滑肌细胞迁移、增殖、凋亡及细胞外基质 的重塑促发了a s 及斑块破裂。这其中m m p 9 的作用最突出。m m p 9 对v s m c 的作用主要是促发了v s m c 的迁移和增殖。m a s o n 等1 5 】通过对鼠转染m m p 9 c d n a ，体外用胶原侵入法及博伊登室法测定s m c 迁移，体内通过测量侵犯内 膜和中膜层的s m c 以确定迁移。c h o l 6 】等将实验鼠分成两组，一组为野生型 ( w t ) ，一组敲除m m p 9 基因( m m p 9 - ) 。结扎颈总动脉使之发生重构。于第4 周处死实验鼠。结果w t 组内膜明显增厚，管腔狭窄，平滑肌数目明显增多( p 0 6 0 5 ) ，证明m m p 9 是平滑肌细胞迁移和增殖所必需的。m m p 9 在斑块裂解中的 作用近年来研究比较多，g a l i i s 等研究表明，在人类硬化动脉的斑块肩部及巨 噬泡沫细胞聚集区显示了m m p 9 的表达增高，且所有的斑块抽提物被证实含 明胶酶的活化形式【7 1 。l o f t u s 等1 8 】的研究材料取自于连续7 5 例行颈动脉内膜 切除术的患者，根据症状将他们分为4 组：无症状组、术前症状持续6 4 月组、 症状持续1 6 4 月组、症状出现于1 个月内组。斑块组织学检查并用酶标法和 酶联免疫吸附实验对m m p 9 进行定量分析。结果发现，m m p 9 的水平在第4 组 中显著升高( 均值12 5 7 1 t g l ，其余各组均值 3 2 1 t g l ( p = o 0 0 3 ) 。也表明在人的 不稳定的颈动脉斑块中，m m p 9 的表达也明显升高。k a i 等【9 j 的研究结果显示 不稳定型心绞痛和心肌梗死患者m m p 9 水平明显高于稳定型心绞痛和正常 对照组。殷忠等【lo 】选取冠心病且入院后行冠状动脉造影术的患者7 3 例，其中 最后诊断急性心肌梗死( a m i ) 2 2 例、不稳定型心绞痛( u a ) 1 7 例、稳定型心绞 痛( s a ) 17 例，对照者17 例。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验测定血浆m m p 9 的水平，结果显示a m i 组、u a 组与s a 组患者血浆m m p 9 水平均显著高于对照 组；a m i 组、u a 组患者血浆m m p 9 水平均显著高于s a 组；a m i 组患者m m p 9 水平与u a 组比较均有显著性差异；急性冠脉综合征( a c s ) 患者中m m p 9 水平 无明显相关性。表明冠心病患者m m p 9 水平升高，a c s 患者m m p 9 水平升高 可能提示斑块不稳定。 近年来，关于m m p 9 与糖尿病的关系的研究逐渐增多，m m p 9 与糖尿病 并发症的发生发展有着密切的关系。李佳等】报道，2 型糖尿病患者血清 m m p 9 含量明显高于非糖尿病患者，治疗4 周时，m m p 9 水平即明显下降，且其 降低与h b a lc 的降低呈正相关。王艳【1 2j 等采用e l i s a 法分别检测正常人2 5 例 ( 对照组) 、按体重指数( b m i ) 分成糖尿病非肥胖组2 6 例和糖尿病肥胖组3 4 例患 者的血清m m p 9 水平和胰岛素抵抗指数( h o m a i r ) 等生化指标，应用彩色多 普勒超声测量颈动脉内膜中层厚度( i m t ) 进行相关分析。结果糖尿病2 组的 h b a lc 、f p g 、f i n s 、h o m ai r 、m m p 9 、i m t 的指标较对照组明显增高 ( p 0 0 5 或0 0 1 ) ，糖尿病肥胖组的f i n s 、h o m ai r 、m m p 9 的水平均高于非 肥胖组( p 0 0 5 ) 。 表明糖尿病2 组血清m m p 9 和h o m a i r 指标与i m t 呈正相关，2 型糖尿病患者 颈动脉粥样硬化病变严重程度与血清m m p 9 和h o m a i r 增高有密切的关 7 系。然而，导致2 型糖尿病患者血清m m p 9 浓度高的机理目前尚不是非常清 楚，并且2 型糖尿病动脉粥样硬化的发病率高于讵常人，这是否与m m p 9 有 关，有待进一步探讨。 糖尿病患者高血糖带来的危害已经得到充分证实，而血糖波动正越来越 引起人们的关注。早在19 8 7 ，檀香山心脏研究就提出口服葡萄糖负荷后过度 血糖漂移与心血管疾病的危险性相关；19 9 9 的r a n c h ob e r n a r d o 研究结论是单 独餐后高血糖使老年妇女的致死性c v d 风险增加2 倍以上，仅用空腹血糖筛 查可遗漏很多c v d 高危人群；d e c o d e 研究在19 9 9 年发现糖尿病心血管疾病 的死亡率与餐后2 d , 时血糖的相关性优于空腹血糖，且空腹血糖不能作为判定 c v d 的危险人群的指标：这些实验均说明餐后高血糖较持续高血糖有更大的 危害，由此可以推测餐后高血糖对糖尿病血管并发症的伤害作用可能与由空 腹至餐后所形成的血糖波动环境有关。在2 0 0 1 年，d e c o d e 研究又证实糖尿 病大血管并发症与餐后血糖漂移的程度相关，餐后2 小时血糖是糖尿病心血 管疾病和死亡更好的预测因素。2 0 0 5 年，s t o p n i d d m 研究还发现，在糖耐 量受损( i m p a i r e dg l u c o s et o l e r a n c e ，i g t ) 患者中使用阿卡波糖来降低餐后血 糖水平，不仅能使糖尿病发生风险降低3 6 ，而且能使心血管事件发生风险 降低4 9 t 1 3 1 。以上循证医学研究已证实餐后高血糖对糖尿病血管并发症具有 独立伤害作用，餐后高血糖较持续高血糖有更强的细胞毒性。然而，餐后高 血糖高危害的作用机理目前尚不明确，这是否如我们推测的与血糖波动有 关? 血糖波动是否较持续高血糖有更强的细胞危害性及其机理，有待进一步 征实。 如上所述，m m p 9 与糖尿病动脉粥样硬化的发生发展关系密切，高血糖 可以导致m m p 9 分泌增多，然而其机理是什么? 血糖波动对细胞分泌 m m p 9 是否也有影响? 是否也会导致m m p 9 的高表达? 其作用较之持续高 血糖是否更强? 本实验采用体外培养人单核细胞株( t h p 1 ) ，通过诱导剂将 其诱导为单核巨噬细胞，采用不同的葡萄糖浓度的培养液以及甘露醇培养液 孵育细胞，观察在不同的环境中单核巨噬细胞表达m m p 9 的不同，探讨不 同的葡萄糖浓度及糖浓度波动对单核巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶9 ( m m p 9 ) 的影响以及渗透压改变是否参与了这一过程。进一步研究糖尿病 动脉帮样硬化的发病机理以及血糖波动的危害作用及可能的机理。 8 材料与方法 1 主要仪器及试剂 1 1 主要仪器 普通倒置光学显微镜 o l y m p u s 电子显微镜j e m1 2 0 0 e x 荧光显微镜o l y m p u s 单反数码相机 o l y m p u s m c o 17 5 型c 0 2 孵箱日本三洋 超净工作台苏州，s w c t - 1 f 台式离心机b 16 0 型，河北白洋离心机厂 电子分析天平 f a l 0 0 4 7 2 n 紫外可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司 o 2 2l a m 滤菌器n u n cb r a n dp r o d u c t s ，丹麦 六孔培养板凯基生物科技发展有限公司 血细胞计数板上海医疗器械厂 普通冰箱、一8 0 冰箱日本 微量移样枪 德国e p p e n d o r f 公司 w h 一2 微型旋涡混合仪上海沪西分析仪器厂 m d f 3 8 2 ( 8 0 ) 低温冰箱日本三洋 k d c 一16 0 高速冷冻离心机中国安徽 d g w 9 9 微量离心机宁波医疗设备厂 y x q g 0 2 手提式电热压力蒸汽消毒器上海安得医疗科技有限公司 h 6 6 m c 超声清洗机江苏无锡 多功能p c r 仪p t c - 1 19 6美国m j r e s e a r c h 公司 数码凝胶图像处理系统 g e n eg e n i u s 1 2 主要试剂 d g l u c o s e ( s i g m a )上海伯奥生物科技有限公司 甘露醇上海伯奥生物科技有限公司 p m a ( s i g m a )上海伯奥生物科技有限公司 p b s 北京中杉金桥生物技术公司 q e d t a 抗原修复缓冲液( 1m l ，p h 9 0 ) 福州迈新生物技术有限公司 t r i z o l 试剂购自凯基生物公司 d n a m a r k e r 购自凯基生物公司 m m p 9 引物 i n v i t r o g e n 公司合成 1 3 a c t i n 引物 i n v i t r o g e n 公司合成 r tp c r 试剂盒t a k a r a 产品 d e p c 水 购自美国p r o m e g a 公司 1 3 主要实验溶液及其配制方法 ( 1 ) r p m i 1 6 4 0 完全培养基：r p m i 1 6 4 0 完全培养基由r p m i 1 6 4 0 ( 含 l 谷氨酞胺，h y c l o n e 公司) 培养液( 1o 4 9 袋r p m i 16 4 0 + 10 0 0 m l 三蒸水 + 2 9 n a h c 0 3 ，然后加h c l 调整p h 值为7 2 ) 、1o 胎牛血清( h y c l o n e 公司) 组成，经0 2 2 u m 滤菌器( n u n cb r a n d p r o d u c t s ，丹麦) 过滤，4 保存备用。 ( 2 ) p b s 平衡盐溶液：n a 2 h p 0 4 - 12 h 2 0 ( 2 9 9 ) + n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 ( 3 9 ) + n a c l ( 8 5 9 ) + 双蒸水10 0 0 m l 。用时双蒸水稀释10 倍，高温高压灭菌备用。 ( 3 ) 细胞冻存液：10 二甲基亚砜( d m s o ) 、7 0 r p m i 16 4 0 培养液 和2 0 d , 牛血清组成。 ( 4 ) 0 2 5 胰酶的配制：称取5 0 0 m g 胰酶，加入少量d - h a n k s 平衡液， 搅拌胰酶溶解后，用d h a n k s 平衡液定容至2 0 0 m l ，置4 冰箱过夜后，0 2 滤器过滤除菌后分装，2 0 冻存备用。 ( 5 ) 5 0 x t a e 电泳缓冲液：称量t r i s2 4 2 9 ，n a 2 e d t a 2 h 2 03 7 2 9 置于 1l 烧杯中，向烧杯中加入8 0 0m l 的去离子水，充分搅拌溶解，然后加入5 7 1 m l 的醋酸溶解，再加去离子水溶解定容至1l 后室温保存( p h 8 5 ) 。 ( 6 ) 琼脂糖凝胶：称取2 9 琼脂糖粉转入耐热广1 2 1 瓶内，加10 0m lt a e ， 用微波炉熔化，冷却至6 0 。 ( 7 ) 电泳样品上样缓冲液：称取嗅酚兰o 0 2 5 9 ，蔗糖4 9 置于烧杯中， 向烧杯中加入8m l 的去离子水，充分搅拌溶解，再加去离子水溶解定容至 1 0 m l 。 ( 8 ) 溴化乙锭染色液( 10 m g m l 贮备液) 配制：溴化乙锭( e b ) 10m g 加 三蒸水1m l 溶解，室温避光保存。临用时将贮备液稀释。琼脂糖电泳时e b 终浓度为o 5 p g m l 。 1 0 2 细胞株及生物学特征 人单核细胞株( h u m a nm o n o c y t o i dc e l l s ，t h p 1 ，a t c c ，编号t i b 2 0 2 ) 购自上海生命科学院，建株于一急性单核细胞白血病患儿，具备人单核细胞 大多数的生物学功能和生化特征。h l aa 2 、a 9 、b 5 、d r w l 、d r w 2 相关抗 原阳性，悬浮生长，具密度依赖性( 图1 4 ) 。与人外周血单核细胞相比，t h p 1 细胞更易获得和传代培养，因此被广泛用于a s 方面的研究。 3 实验分组 ( 1 ) 对照组：培养基中的葡萄糖浓度为5 m m o l l 。 ( 2 ) 高葡萄糖组：培养基中的葡萄糖浓度为15 m m o l l 。 ( 3 ) 葡萄糖浓度波动组：将细胞暴露在葡萄糖浓度为l5 m m o l l 持续 12 小时，然后在5 m m o l l 持续12 小时，这样为一个周期。 ( 4 ) 渗透压控制组：甘露醇浓度及波动方式同葡萄糖波动组。 4 研究方法 4 1 单核细胞的培养 取t h p 1 细胞株，于超净工作台解冻复苏后加入含10 小牛血清的 r p m l l6 4 0 培养基制成细胞悬液，接种于含10 m l 培养基的培养瓶中，置于 5 c 0 2 培养箱( 3 7 ，9 0 湿度) 中培养，每2 3 天传代一次。取培养的单 核细胞共1o m l 加入试管中，以3 m l 吸管加入4 滴0 4 台盼蓝溶液，混匀， 3 分钟内用细胞计数板计数活细胞及死细胞数，计算细胞活率，细胞活率达 9 5 ，将细胞密度调整至1 1 0 6 m l 备用。 4 2 巨噬细胞的获得： 取细胞浓度为1 0 6 m l 的t h p 1 ，换入无血清培养基，加p m a ( 至终浓度 为l0 0n m o l l ) ，置于5 c 0 2 培养箱( 3 7 ，9 0 湿度) 中培养2 4 小时， 获得单核巨噬细胞。 4 3 巨噬细胞的鉴定及活力测定： ( 1 ) 鸡红细胞吞噬实验： 取新鲜鸡血1 m l ，肝素抗凝后置于无菌试管中。 取鸡血5u l 加入到单核巨噬细胞培养瓶，轻轻摇晃混匀。 将上述培养瓶置于高倍镜下观察。 ( 2 ) 巨噬细胞活力测定：采用台盼蓝斥染法检测 制备单个细胞悬液，并适当稀释至细胞数为1 0 6 m l 。 台盼蓝染液的配制：称取4 9 台盼蓝，加少量双蒸水，充分研磨后， 加入双用滤纸过滤，4 保存。使用时，用p b s 稀释至0 4 。 细胞染色：取9 滴巨噬细胞悬液移入小试管中，加l 滴0 4 台盼蓝。 细胞计数：3 分钟内，用细胞计数板分别计数活细胞和死细胞，死细 胞被染成淡蓝色，而活细胞未被染色。根据以下公式求细胞活力： 活细胞率( ) = 活细胞总数( 活细胞总数+ 死细胞总数) l0 0 经检测活细胞率在8 5 以上可用。 4 4 巨噬细胞的分组干预 ( 1 ) 对照组：培养基中的葡萄糖浓度为5 m m o l l ，每隔12 小时换液一 次，共培育7 2 小时； ( 2 ) 高葡萄糖组：培养基中的葡萄糖浓度为15 m m o l l ，每隔12 小时 换液一次，共培育7 2 小时； ( 3 ) 葡萄糖浓度波动组：将单核巨噬细胞暴露在葡萄糖浓度为15 m m o l l 持续12 小时，然后在5 m m o l l 持续12 小时，这样为一个周期，共培育3 个 周期； ( 4 ) 渗透压控制组：甘露醇浓度、波动方式及培育时间同葡萄糖波动 组。 4 5r t - p c r 法检测各组细胞内m m p 9 m r n a 的表达 ( 1 ) 实验前准备 清洗提取r n a 用的仪器：p c r 管，吸头等，强酸浸泡，双蒸水冲洗， 消毒，干燥备用。 ( 2 ) 提取细胞总r n a 分别弃去细胞培养瓶中的培养液，用p b s 溶液润洗细胞两次，将培养 瓶瓶口朝下放置2 3 分钟，用滤纸吸去流至瓶口的p b s 溶液。 在培养瓶中加入1m lt r i z o l ，用吸管反复吹打，在冰上裂解5 分钟， 用吸管将裂解液移入1 5 m 的e p 管中。 加0 2 m l 氯仿入e p 管中，盖紧e p 管口，用手剧烈震荡15 秒，冰上 孵育2 3 分钟。 4 。c ，12 0 0 0 9 ，离心15 分钟。样品溶液分为三层：上层为水相，r n a 基本溶于此相，d n a 聚集在中层，下层为酚氯仿相，蛋白质溶于此相。 取上层水相至另一个干净的1 5 m le p 管中，加入0 5 m l 异丙醇，颠倒 混匀，2 0 静置2 小时，使r n a 充分沉淀。 设置高速冷冻离心机为4 ，12 0 0 0 9 ，离心l0 分钟，可见白色的r n a 沉淀。 弃去上清，然后用l m l 7 5 乙醇( d e p c 水配制) 洗沉淀，涡旋混匀。 设置高速冷冻离心机条件为4 ，7 5 0 0 9 ，离心5 分钟。 倾去上清，室温干燥5 1 0 分钟( 注意不要干透) 。 加d e p c 水2 0 “l ，用枪吹打以使沉淀溶解，取出2 i ，t l r n a 溶液至e p 管中留待测r n a 浓度，其余保存至8 0 冰箱中备用。 ( 3 ) r n a 浓度及纯度的鉴定 用紫外可见分光光度仪检测r n a 的纯度及浓度：取r n a 样品l u l ， 加入7 9 u l d e p c 处理的无菌超纯水，在紫外分光光度计上测其0 d 2 6 0 及 0 d 2 8 0 。 按照以下公式计算r n a 浓度及纯度 r n a 浓度( u g u 1 ) = o d 2 6 0 稀释倍数1 0 0 0 ( 稀释倍数为8 0 ) r n a 纯度= o d 2 6 0 0 d 2 8 0 所有标本比值要求在1 8 2 0 之间，低于此值含有蛋白杂质。 ( 4 ) r t - p c r 反应 引物设计合成： 引物设计：由g e n b a n k 检索得到m m p 9 基因的全部e d n a 序列，利用 p r i m 5 0 设计引物并经n c b i 在线序列相似性分析工具b l a s t 检验。 引物合成：目的基因m m p 一9 和内对照3 - a c t i n 引物均由i n v i t r o g e n 公司 合成。 引物序列： m m p 9 正义引物： 5 c c g c ag g g c c c c t t c c t 仉诃 3 反义引物：5 g c c c a c t t g g t c c a c c t g g t t 3 内对照正义引物：5 c t c c a t c c t g g c c t c g c t g t 3 反义引物：5 g c t g t c a c c t t c a c c g t t c c3 反转录反应( r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n ，r t ) 合成e d n a 第一链： 1 3 按下列组成配制反转录反应液 m g c i ：( 2 5 m m ) 2 0u l 1 0 r tb u f f e r1 0u l r n a s ef r e e dh 2 03 7 5 u l d n t pm i x t u r e ( 10 m me a c h ) 1 0 u l r n a s e i n h i b i t o r ( 4 0 u u 1 ) o 2 5 u l a m vr e v e r s e t r a n s e r i p t a s e ( 5 u u 1 ) 0 5 u l r e v e r s e p r i m e r ( 2 0 u m 、 o 5 u l r n as a m p l e1 0 u l t o t a l 1 0 u l 将各组r n a 样品加入反转录反应液内按以下条件进行反转录反应： 5 5 3 0 m i n ，9 9 5 m i n ，5 5 m i n 注：以上总r n a 提取以及逆转录的整个操作过程要求严格遵守无r n a 酶操作环境规则，并且如前所述试验所用器具均用0 1 d e p c 水处理后高压 灭活。 p c r 反应 以c d n a 为模板进行p c r 扩增。取各组r t 产物1 5 9 1 分别扩增 m m p 一9 m r n a 及内参照p a c t i nm r n a 。 m m p 9m r n a 及3 - a c t i nm r n a 扩增： 反应体系( 5 0 t 1 ) ：1 0 x t a qb u f f e r 5 p 1 1 0 m md n t p s 1 “l t a q 酶 1 2 5 9 l s e n s e 0 5 9 l a n t i s e n s e 0 5 “l 2 5 m mm g c l 2 3 9 l c d n a 1 5 9 l d e p c 水补充至总体积5 0 9 l 反应条件：预变性：9 5 2 m i n 变性：9 4 x 3 0 s e c 退火：6 0 x 3 0 s e c 延伸：7 2 1m i n 补充延伸：7 2 x 1 m i n 1 4 循环次数：2 7 2 琼脂糖凝胶电泳 a 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上： b 调整好梳子的高度： c 称取2 9 琼脂糖于10 0 m l t b e 中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解， 冷却至6 0 时倒入制胶板中； d 凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带： e 将电泳样品与嗅酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中：p c r 产物 5 p l + d d h 2 0 3 “l + 嗅酚蓝2 9 l ，共10 9 l 于0 5 9 l 试管中混合后点样； f 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使样品向正极泳 动，电压12 0 v ，电泳时4 0 m i n ； g 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入o 5j _ t g m l 的澳化乙锭( e b ) 溶 液中染色10 15 m i n ，清水漂沈后置于凝胶成像系统观察电泳结果： h 实验重复3 次。 4 6 统计学方法 采用s p s s1 2 0 统计分析软件处理数据。计量资料以均数加减标准差表 示，两组间比较用t 检验，多组间比较用方差分析。以p 0 0 5 为组间比较 差异有统计学意义。 结果 1 p m a 处理t h p 1 后细胞形态学观察：( 见图1 ) 倒置显微镜下观察t h p 1 细胞可见单核细胞呈圆形半悬浮状生长，经 p m a 孵育6 h 后，细胞形态开始发生改变，由悬浮型逐渐转变为贴壁型，到 2 4 h 时基本贴璧，细胞体积增大，形态多样，界限清楚，呈圆形、卵圆形、 星形、梭形、长杆状等不规则形状，贴满时有许多伪足和突起，胞核较小， 呈卵圆形或肾形。 2 单核巨噬细胞吞噬功能鉴定：( 见图2 ，3 ，4 ) 单核巨噬细胞与鸡红细胞共孵育1o 分钟后高倍镜下可见单核巨噬细胞 向鸡红细胞靠近；3 0 分钟后，鸡红细胞被单核巨噬细胞吞噬，单核巨噬细胞 体积增大，形态多样；6 0 分钟后，部分被吞噬的鸡红细胞裂解为细胞碎片， 逐渐被单核巨噬细胞消化掉。 3 单核巨噬细胞m m p 9 r n a 浓度及纯度测定( 见表1 ) 表l ，各组巨噬细胞内m m p 9 r n a 纯度0 d 2 6 0 2 8 0 值及浓度 注：r n