（植物学专业论文）芦荟属植物叶的解剖结构与有效成分相关性研究.pdf

摘要 芦荟属( a l o e ) 植物隶属于百合科( l i l i a c e a e ) ，是多年生、常绿、肉质草本植物， 原产于南非。其泌出物已经广泛用于医药和日化中。芦荟的主要有效成分是芦荟素等葸 醌类物质。本研究应用荧光显微镜观察、薄层层析紫外光谱分析、高效液相色谱分析、 超薄切片技术相结合的方法，研究和比较芦荟葸醌类物质的含量以及叶脉维管束结构和 有效成分积累的关系。 薄层层析( t l c ) 改进实验表明，在制作硅胶薄层板时加入一定比例的n a o h ，可以 有效防止层析时的拖尾、扩散现象，层析距离、薄层板厚度等因素均可影响层析效果。 因此做如下改进：( 1 ) 制作硅胶薄层板时按照0 1 的比例加入n a o h ；( 2 ) 硅胶薄层板的 厚度以：4 9 ：l o m l ：i o x1 5c n f 为层析效果最好；( 3 ) 层析展层距离以7 8 c m 为好，既能保 证各荧光点分开，又不至于扩散太严重。 用t l c 法结合荧光显微镜( f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ，f m ) 观察，发现大多数芦荟 品种含有芦荟大黄素等葸醌类物质，但是不同品种的蒽醌类物质的含量并不相等，高效 液相色谱结果显示，不同芦荟品种的芦荟大黄素含量有显著差异。 应用植物解剖学、荧光显微镜、薄层层析和高效液相色谱等方法，研究了芦荟属植 物叶的结构与芦荟大黄素等蒽醌类物质积累的关系，结果表明，叶维管束的大型薄壁细 胞为芦荟大黄素的主要贮存结构。该属植物叶内维管束大型薄壁细胞的大小、数目与芦 荟大黄素的含量呈正相关。即维管束大型韧皮薄壁细胞数量越多，芦荟大黄素等葸醌类 物质的含量就越多。维管束鞘和大型韧皮薄壁细胞越发达，芦荟叶片中蒽醌类物质含量 越高。所以，具有维管柬大型薄壁细胞可作为选育芦荟大黄素高含量品种的解剖学指标。 该研究筛选出5 个具有开发价值的芦荟新种。 关键词：芦荟属，叶，结构，有效成分，t l c ， i p l c a b s t r a c t t h e p l a n t so f a l o eb e l o n gt ol i l i a c e a e ，t h e ya r em u l t i p e r e n n i a lf v c t g t l * q la n ds u c c u l e n tp l a n t sa n di t i si n d i g e n o u st os o u t ha f r i c a t h ee x u d a t a so fa o e # a n t sh a v eb e e nu s e da sd r u g so rc o s m e t i c s w i d e s p r e a d l y t h em a i n l yb i o l o g i c a la c t i v i t yc o n s t i t u e n t so f t h ea l o ee x u d 砒e sw e r ea n t h r a q u i n o n e s s u c ha s a l o i n 、a l o ee m o d i n i n t h i ss t u d y , w e i n v e s t i g a t e d t h es m c m m s o f l e a v e s a b o u t t h e 5 7 s p e c i e s o f a l o e s , t h e c o n t e n to f a n t h r a q u i n o n e s ，f i x e dt h es t o r i n gl o c a t i o no fa l o i ni na l o ep l a n t , d e t e r m i n e dt h ec o n t e n to f a l o i nb yu s m ga n a t o m i c a l p h y t o c h e m i s 衄, f l u o r e s c e n tm i c r o s c o p em u l t i p l y ，t h j nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y a n dh i g hp e r f o r m a n c 1 i q u i dc h r o m a t o g r a p h y b e t w e e nt h es t r a c t u r e so f l e a v e sm i dt h e i rr e l a t i o n sw i t ht h e a c c u m u l a t i o no f a l o c - e m o d i nw e r ed i s c u s s e d i tc a l lb ep r o v i d eu s e f u lr e f e r e n c ef o rt h en e x ts t u d y t h ei m p r o v ee x p e r i m e n to ft l cs h o w ，i td o e ss o m er e s e a r c ho ne x p e r i m 砷，s u c ha st h ep h v a l u e , t h i c k n e s so ft h et h i n - l a y e ra n dt l l ed i s t a n c eo ft h ec h r o m a t o g r a p h y f i n dt h eb a t t e rw a y so f t l c ( 1 ) a d dt h en a o h 0 1 ；( 2 ) t h i c ko f t h et h i n - l a y e ri s4 9 ：1 0 m l ：1 0 x 1 5 c m 2 ；( 3 y r h ed i s t a n c eo f t h e w i t ht h ef l u o r e s c e n tm i c r o s c o p ea n dt l c ，5 7 s p e c i e so f a l o e sw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e a n t h r a q u i n o o e si nd e f f e r e n ts p e c i e so fa l o e l a r en o te q u a t h e yc m n t a l nt h ea n t h r a q u i n o n e si s i k i j l g t h em e t h o d so fs e m i - t h i ns e c t i o n ，f l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e ，t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，h i g h p e r f o r m a n c e h q u i dc h r o m a w g r a p h yw a 5u s e dt oi n v s t i g a t et h es t r u c t u r eo fl e a v e sa n da c c u m u l a t i o no f a l o e - e m o d i ni nt h el e a v e so f a l o e l r e s u l t ss h o wt h a tt h el a r g ep a r e c h y m a t o u sc e l l so f v a s c u l e rb o n d l a sm m a i n l ys t o r a g e s i t eo fa l o e - e m o d i n t h e y e l l o w - g r e e nf l u r e s c e u c ea p p e a r e di nt h el a r g ep h l o e m p a r e c h y m a t o n sc e l l sw h e nt h es e c t i o no fl i f em a t e r i a lw a so b s e r v e db yf l u o r , e n tm i c r o s c o p ew i t hb l u e h i l i g h t s ot h el a r g ep h l o e mp a r e n c h y m 加u sc e l l so f v a s c u l a rb t m d l e sw e r et h em a i n l ys 觚l g el o c a t i o no f a l o e - e m o d i n w h e t h e ro rn o tw i t hl a r g ep l l l o e mp a r e n c h y m a t o u sc e l l si nv a s c u l a rb u n d l e sc o u l db eu s e da s t h ea n a t o m i c a li d e xt oj u d g et h ea l o e p l a n tw h e t h e ro rn o tc o n t a i na l o e - e m o d i n w eh a v es i f t e d5s p e c i e so f k e y w o r d s ：a l o e l ，s t r u c t u r eo f l e a v e s , e f f i c i e n c yc o m p o n e n t s ，t l c ，h p i c i v 缩写与简称 f m f l u o r e s c o n c m i c r o s c o p y 荧光显微镜 t l c t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y 薄层层析 h p l c h i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 c a tc a t a l a s e 过氧化氢酶 s o d s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 超氧化物歧化酶 p o dp e r o x i d a s e 过氧化物酶 c a t c a t a l a s e 过氧化氢酶 艾滋病( 获得性免疫缺陷 a i d s a c q u i r e di m m l m ed e f i c i e n c ys y n d r o m e 综合症) r p h p l c r p h i gh p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 反相高效液相色谱 c a m c r a s s u l a c e a ea c i dm e t a b o l i s m 景天酸代谢 核酮糖一l ，5 - - - - 磷酸羧化 f i b u l o s e - i ，5 - b i s p h o p h a t e r u b i s e o c a r b o x y l a s e o x y g e n a s e 酶加氧酶 t e mt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e 透射电子显微镜 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 g a g l u t a r a l d e h y d e戊二醛 c m c n ac a r b o x y m e t h y lc e l l u l o s e羧甲基纤维素钠 m r n a m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d 转运核糖核酸 独创性声明 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河 南师范大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢 意。 签名： 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权河南师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 签名：獬导师签名：缺日期：二盈丝z 上 1 前言 1 前言 1 1 芦荟属植物的应用历史和现状 芦荟属( a l o e ) 植物隶属于百合科( l i l i a c e a e ) ，是多年生、常绿、肉质草本植物， 已定名的芦荟属植物有5 0 0 余种i n 。尚有新种不断被发现和命名 2 - q 。芦荟属植物原产于 非洲，大部分种类生长在热带和亚热带干旱地区 5 1 。在中国野生的芦荟属植物只有中国 芦荟( a l o ev e r al v a rc h i n e n s i sf f l a w ) b e r g ) ，分布于云南元江地区、海南岛和雷州半岛 等地 0 3 。现在药用价值较高的芦荟属植物，如库拉索芦荟( a l o e v e r a l ) 和木立芦荟( a l o e a r b o r e s c e n sm i l l ) 等已被世界各地广为引种栽培【刀。 在埃及金字塔中发现的医书 e b e r sp a p y r u s ) ) 莎纸草医学一书中，记载公元前1 5 5 2 年埃及人将芦荟作为致泻、催眠、强身和苦昧剂入药。此书目前藏于德国莱比锡大学， 是目前发现的芦荟用作药用植物的最早文字记载。经世代相传将芦荟作为一种草药沿 用至今，由此可见，人类利用芦荟的历史至少已有3 5 0 0 多年 g l 。公元3 7 - 6 8 年，罗马 帝国的医生迪欧斯可里帝所著的希腊本草中写道，芦荟具有收殓、催眠、强身、清 胃和通便的作用，还用于治疗痔疮、外伤、脓肿、眼疾、性器官溃疡和口腔炎症。与其 它药物配合则可治疗黄胆和吐血【9 】。 最早出现在中国的芦荟产品是由波斯生产的，由芦荟汁经煎熬和干燥而获得的黑色 块状物。在汉字中，“芦”为黑色，“荟”是聚集之意，故称这种黑色块状中药为芦荟。 后来将这种中药的原植物也称为芦荟【l 川。中国的本草纲目记载了芦荟的功效：“芦 荟可食用，其昧微苦，兼能药用，有消炎阵痛解毒之功效。”【1 1 1 。公元1 2 世纪，芦荟被 收入德国药典，这是芦荟第一次正式进入国家药典，不过当时对芦荟的研究利用， 在传统医学界限于治疗外伤、通便利尿及美容。现在，芦荟已被中华人民共和国国家的 药典收录( 1 2 1 。在漫长的历史中，尽管人类对芦荟的认识和利用积累了不少实践经验，但 限于当时的科技发展水平，直到2 0 世纪中期，人类对芦荟的研究仍然停留在本草药物 这一较狭窄的范围内。l 2 0 世纪3 0 年代，人们发现新鲜的芦荟汁可以促进遭受辐射的损伤的皮肤恢复健康。 1 本研究得到国家自然科学基金( 编号3 0 4 7 0 1 0 5 ) 的资助 i 前言 1 9 4 5 年，美国在日本的广岛和长崎使用原子弹，大量幸存者被核辐射灼伤。受害者用鲜 芦荟汁涂抹后伤口愈合得很好，且不留疤痕。从而引起科学界和医学界的高度重视，对 芦荟开展了广泛的基础科学研究和临床医学研究。使芦荟的研究和应用进入一个新的时 期。自此，人类开始了对芦荟的化学组成、有效成分及其功能、初深加工、栽培育种等 全面深入的研究与探索，开发生产了许多芦荟产品，如化妆品、饮料食品、保健品、医 药品以及畜牧用品等。日本著名芦荟研究专家添田百枝还发现了三种重要的活性成分， 她于1 9 7 0 年在东邦医学会杂志上以关于芦荟的抗肿瘤研究为题发表了自己的 论文，并引起了极大的轰动。这三种成分是：具有抗癌解毒作用的a l o m i c i n ；具有抗茵、 抗霉作用的a o c t m ；可治疗烫伤和胃肠溃疡的a l o e u l c i n 。添田百枝虽然没有搞清楚这三 种活性成分的结构，但她通过小鼠试验已证明这三种活性成分具有非常突出的生物活性 【1 3 】 1 2 芦荟属植物的化学成分及其生理活性的研究概况 随着人们对芦荟成分研究的深入，一些新的现代分离技术不断被发明和应用，如膜 分离技术( m e m b r a n es e p e r a t i o nt e c h n o l o g y ) 、高效液相色谱技术( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h yt e c h n o l o g y ) 、电泳技术( e l e c t r o p h o r c s i st e c h n o l o g y ) 、气相色谱技术( g a s c h r o m a t o g r a p h y t e c h n o l o g y ) 、核磁共振法( n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e ，n m r ) 和气一质联 用技术( g a sc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t e r t e c h n o l o g y ) 等的大量应用，芦荟化学成 分相继被发现和分离，目前，已从芦荟叶中分离得到化学成分近2 0 0 余种1 纠6 1 。特别是 一些具有生物活性化合物的发现，促进了芦荟的开发利用。 1 9 9 2 年美国卡林顿实验室将由芦荟叶中所得的成分分成两部分，一部分是叶片切口 渗出的黄色汁液，另一部分是黄色汁液渗完后留下的凝胶。前者主要含有蒽醌及其苷、 萘酮、树脂、有机酸；后者主要含糖类( 单糖、多糖及聚合体) 、蛋白质、草酸钙、纤维 等1 1 7 1 。 1 2 1 蒽醌类化合物 蒽醌类化合物属于酚类衍生物，是芦荟的主要有效成分，主要存在于叶子的维管束 鞘和大型韧皮薄壁细膨堋，c h a u s e r - v o l f s o n 等1 9 1 指出，这些蒽醌类物质的总含量有时可 达叶汁干重的8 5 。已检出的蒽醌类化合物有6 0 余种，主要有芦荟素( a l o i n ) ( 也称芦 2 1 前言 荟大黄素甙) 、芦荟大黄素( a l o e e m o d i n ) 、芦荟大黄酚( c h n y s o p h a n a l ) 、异芦荟素( i s oa l o h a ) 、 高那特芦荟素( h o m o n a t a l o i n ) 、蒽酚( a n t h r a n 0 1 ) 、芦荟苦素( a l o c s i ne ) 、芦荟q ( a l o e n i n ) 、 芦荟皂草甙( a 1 0 e s o p o n o lg l u e o s i d e ) 、芦荟酶素伽伽呵c 岫等口嘲。 h o g l u 芦荟素( a l o i n ) o 芦荟大黄酚( c l m y s o p l m a l ) o 芦荟苦素( a l o e s i n ) o c h 3 芦荟宁( a l o e n i n ) 一符一c h 3 o o g l u 高纳特芦荟素( h o m o n a t a l o i n ) g l u 异芦荟素o s oa l o i n ) 芦荟属植物中常见蒽醌类化合物分子结构式 e l e m e n ts t r u c t u r e so f a n t h q u e ni na l o e i 前言 葸醌类物质遇铅、镁等金属离子后能产生沉淀；被紫外光或蓝光激发后产生桔黄色 或黄绿色荧光；遇n a o h 、k o h 等碱性溶液后呈红色。此类物质带有苦味，呈黄褐色， 遇空气和阳光极易被氧化成黑褐色。具有杀菌、抑菌、分解毒素、消炎、促进伤口愈合 的作用。芦荟的主要有效成份为芦荟大黄素甙( a l o i n ) 即芦荟素，在芦荟中大量存在，能 促进肠内细菌的分解和活性化，同时促进肠内肌肉的收缩，加快肠蠕动，因而有通便利 尿作用，对治疗便秘有明显效果。芦荟素本身致泻作用很弱，但是当被氧化成为芦荟大 黄素后，不但苦昧增加，而且致泻作用明显增强。芦荟大黄素能促进大肠部位蠕动而对 小肠无大的影响，发挥其泻下功能，所以对治疗便秘和痔疮有特殊疗效 2 3 1 。此外芦荟素 还能抑制组织胺的游离，对治疗气喘、过敏性鼻炎、花粉过敏症等疗效显著。 1 2 2 糖类 从芦荟中已检出的碳水化合物有4 0 余种。其中具有生物活性的碳水化合物主要是 多糖、粘多糖，胺基糖、聚糖的衍生物和配糖体 2 4 - 2 8 1 。芦荟叶肉中的粘性物质主要成分 为甘露聚糖。据有关资料报道，芦荟多糖对癌症和艾滋病的防治都有一定作用，它主要是 通过提高人体免疫功能而发挥作用的阿。 库拉索芦荟和木立芦荟所含的芦荟多糖能降低小鼠肿瘤细胞膜脂流动性、膜交联蛋 白百分比含量和唾液酸的含量，且两种多糖中、高剂量组具有显著性( p 基部的特点。t r a c h t e n b e r g e 把它称作粘液组织 【9 1 1 。 维管束芦荟具有维管束一轮，位于同化薄壁组织和储水组织之间。此轮维管束的 数量在不同叶龄的叶、同一叶片的不同部位密度不尽相同，通常在幼叶及叶中、上部的 维管束数多于老叶和叶基部。维管束的韧皮部内都有大型薄壁细胞为该属的结构特征 嗍，维管束大型薄壁细胞外由l 2 层薄壁细胞组成的微管束鞘包被。韧皮部处于同化 组织细胞包围之中，而木质部则紧邻储水组织细胞。韧皮部纤维少，薄壁组织发达，其中 有数个大型的薄壁细胞和周围细胞明显有别( 图2 ) 。木质部的管状分子加厚式样较原始， 主要是环纹和螺纹加厚。李景原等人即1 对木立芦荟“a r b o r e s c e n s ) 、库拉索芦荟口v e r a l ) 等的解剖结构研究发现，在光合组织和储水组织之间有一层不含叶绿体的小型薄壁细 胞，包围着储水薄壁组织，称之为储水组织鞘。此外，中华芦荟v e r al v 能c h i n e 琊i s ) 叶的基部，除上述一轮维管束外，在储水组织中还有另一轮维管束，但数量较少。其结 构与外轮维管束的区别在于：维管束直径小得多，韧皮薄壁组织不发达，没有大型薄壁细 胞。 1 5 3 不同种芦荟属植物化学成分的研究 芦荟属植物有5 0 0 余种，变种和杂交种更多。虽然同属植物的化学成分有类似之处， 芦荟属植物一般都含葸醌类化合物、多肽和各种多糖。但是，不同种之间化学成分也存 在差异【舛删。不同种类的芦荟不仅化学成分不同，且含量也存在显著差异。胡正海、沈 i 前言 宗根等研究了中华芦荟( a l o ev 伽v a g c h i n e n s i s ) 、库拉索芦荟( 爿v e r a ) 、木立芦荟( 彳 a r b o r e s c e n s ) 等9 种芦荟叶中芦荟素的含量，发现不同芦荟种类中芦荟素含量差异很大 脚 鹞】。 胡正海、廖海民、沈宗根、李景原应用半薄切片、高效液相色谱法和荧光显微镜观 察了木立芦荟、库拉索芦荟、易变芦荟、中华芦荟、皂叶芦荟和绿芦荟等6 种芦荟叶的 结构、芦荟素含量与含芦荟素结构特征之间的关系。结果表明，6 种芦荟叶的基本结构 相同，但木立芦荟与易变芦荟的同化组织细胞呈长柱形，其余4 种则呈等径形；木立芦荟、 易变芦荟、库拉索芦荟和中华芦荟的维管束中具大型薄壁细胞，而皂叶芦荟和绿芦荟的 维管束中无大型薄壁细胞。荧光显微镜观察，在紫外光和蓝光下，黄色和黄绿色小球体 主要在维管束的大型薄壁细胞内，由于6 种芦荟的大型薄壁细胞的发达程度不同，因而 呈现出明显不同的图像。 i p l c 测量结果表明，木立芦荟叶中芦荟素含量最高( 0 1 6 0 2 ) 、 依次为库拉索芦荟( 0 1 2 6 6 ) 、易变芦荟( o 1 1 2 3 n $ ) 、绿芦荟( 0 1 0 7 6 ) 、中华芦 荟( 0 1 0 1 1 ) 、皂叶芦荟( 0 1 0 0 9 ) 【驯。芦荟属植物叶中维管束的密度、大型薄壁细 胞的发达程度和同化组织的厚度与其芦荟素含量呈正相关，可以作为选育高含量芦荟品 种的解剖学指标阳。 1 5 4 芦荟属植物不同叶龄及叶的不同部位的化学成分的研究 根据木力芦荟不同叶龄的比较解剖观察，李景原等认为不同叶龄的木立芦荟叶的主 要区别是维管束中大型薄壁细胞的大小不同，植株上部幼叶和成熟叶的维管束中，大型 薄壁细胞体积大；而植株下部老叶的维管束，其大型薄壁细胞已萎缩，细胞体积小，呈 狭窄状。在维管柬横切面上，大型薄壁细胞占维管束横切面上的百分比从上到下随着叶 龄的增大而减小，其芦荟素的含量也逐渐降低【婀。胡正海、李景原等应用植物解剖学和 植物化学方法，比较研究了中华芦荟和木立芦荟等同一植株上不同叶龄的叶以及叶片的 不同部分的结构和芦荟素的含量，发现其维管束的分布密度和大型薄壁细胞的发达程度 为幼叶 成熟叶 衰老叶，叶片的上部 中部 基部，其芦荟素的含量也是幼叶 成熟叶 衰 老叶，叶片的上部 中部 基部，两者呈正相关蚍辩1 姒9 ，】。研究结果为芦荟叶的合理采 收、加工以及化学防御提供了科学依据。 c h a u s e r - v o l f s o n 等1 0 1 1 曾报道，芦荟叶中芦荟素的含量在叶片的不同部分间存在差 异。胡正海、王太霞、李景原等应用植物解剖学和植物化学方法，比较研究了1 1 种芦荟 1 2 l 前言 属植物同一植株上不同叶龄的叶，以及叶片不同部分的结构和芦荟素的含量，发现其维 管束的分布密度和大型薄壁细胞的发达程度及同化组织的厚度呈正相关口7 鹄妍1 0 0 , 1 0 2 ，在 不同叶龄的叶片及叶片的不同部分中，幼叶和叶尖部芦荟素含量最高，叶缘部分的含量 高于中央部分的含量。他们推测这种分布特点是抵御草食动物啃食的防御机制，一旦芦 荟叶被咬破，芦荟素或高那特芦荟素等会被氧化成芦荟大黄素等氧化产物，此时不仅苦 味增加，而且致泻作用也明显增强，这种较差的口感和致泻特性会对食草动物产生拒食 效应，从而免遭啃食。 1 5 5 生态因素对芦荟属植物葸醌类物质含量影响的研究 芦荟为多年生植物，季节和气温的变化会影响芦荟的生长和蒽醌类物质的含量。 m c c a r t h y f g i v a nr h e e d ev a no u d t s h o o m 1 明还发现了芦荟叶片中芦荟素的季节性变化，即 从冬天到夏天芦荟素的含量随着温度升高而升高。他们还指出，风通过摇动叶片而影响 芦荟素的生产。后来c h a u s e r - v o l f s o n 和g u t t e r m a n l l9 ，1 州，p a r kv ta 1 【1 0 5 1 ，h i d e h i k ob e p p ue t a 1 【1 0 6 1 ，分别对不同种类的芦荟研究时也注意到蒽醌类物质的季节性变化。h i d e h i l ( o b e p p u 发现，芦荟素和异芦荟大黄素甙浓度在4 月份高，8 月又一高峰，1 0 月开始降低直 至最低水平，接着逐渐上升至4 月。此外，b y u nmw 等人“似1 0 8 1 证实，地理位置和栽培 条件对芦荟叶中葸醌类物质的含量都有显著影响。 c h a u s e r - v o l f s o n , e t 和o u t t e r m a n , y 的研究证明，光照强度对芦荟叶中芦荟素的含 量有显著影响。处于阳光直射中的芦荟叶中芦荟素的含量高，而位于遮荫处的芦荟叶中 芦荟素的含量底f 1 0 9 1 。他们的研究还发现幼叶中蒽醌类物质的含量高于老叶，同一叶片 中，叶尖高于叶中部，叶基部含量最低。一年之中，夏季芦荟叶中蒽醌类物质的含量高 于冬季0 1 0 l 。此外，b y u n , i v lw 等人的研究证实，地理位置和栽培条件对芦荟叶中蒽醌 类物质的含量都有显著影响1 1 1 3 1 。 1 5 6 蒽醌类物质在芦荟叶结构中的定位 c l 】l l e r 【1 1 川和b e a u m o n t 等1 1 1 1 认为芦荟素可能贮存在韧皮部的大型薄壁细胞，即芦荟 素细胞内( a l o i no d l l 。而b n m i 和t o s i | 1 1 6 用荧光显微镜( f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ) 观察了5 种 芦荟属植物叶的蒽醌类物质的分布情况，发现以小球体形式存在的蒽醌类物质在3 6 5 n m 的紫外光下。会发出橘黄色荧光，这种小球体同时存在于绿色同化组织细胞和储水组织 1 前言 细胞内，维管束中并没有观察到类似的橘黄色荧光，认为同化薄壁组织和中央贮水组织 是蒽醌类物质的累积场所而与维管束无关，并推测这两类组织所含的蒽醌类物质有各自 独立的生物合成途径。b e a m o n t 等【1 1 7 】认为蒽醌类物质可能贮存于维管束中，r e y n o l d s t t m l ，h a u s e n n g 也报道，维管束的大型韧皮薄壁细胞是芦荟素等蒽醌类物质的合成和 储藏场所。n o b u y u k i 等 1 捌认为，葸醌类物质就存在于表皮下方的同化薄壁组织之中。 胡正剐碉、沈宗根 1 2 1 - 1 2 2 、王太霞等【1 3 1 根据芦荟素经紫外光或蓝光激发后能发出橘黄色 荧光这一特征，应用植物解剖学、组织化学和植物化学方法相结合的方法，对中华芦荟、 木立芦荟和库拉索芦荟的叶进行了研究，在荧光显微镜蓝光下观察，发现维管束韧皮部 的大型薄壁细胞发出橘黄色荧光，无大型韧皮薄壁细胞的维管柬，荧光显微镜下没有橘 黄色荧光，周围的同化组织发出红色荧光，而储水组织无荧光。但在白光下，同化组织 呈绿色，上述大型薄壁细胞和储水组织都无色，同时薄层层析( t h i nl a y e r c h r o m a t o g r a p h y ，t l c ) 结果也证明大型薄壁细胞含有芦荟素。从以上研究可以确定，芦 荟叶维管束的大型韧皮薄壁细胞是芦荟素等蒽醌类物质的储藏场所，并且维管束内的大 型韧皮薄壁细胞与芦荟素等葸醌类物质的积累密切相关，因此，可把维管束内大型韧皮 薄壁细胞的有无及其发达程度，作为选育芦荟素高含量品种的解剖学指标。 1 5 7 蒽醌的合成部位、转运途径和贮存场所 b r o n i 和t o s i 1 2 3 j 利用荧光显微镜观察到的黄色荧光小球体，反映了芦荟素或高那特 芦荟素从合成部位到维管束的细胞中的转移倾向。b e a u m o n t 等 1 2 4 研究观察了 a n y e z i e n s i s 和a g i l b e r t i 叶维管束鞘细胞和芦荟素细胞的超微结构，发现在鞘细胞细胞质 中有灰色膜包嗜锇小体，鞘细胞的质体及芦荟素细胞中有黑色嗜锇小泡。他们推测黑色 小泡可能和叶内积累的酚类有关，而灰色小体可能是黑色小泡的前体。因此，鞘细胞可 能是蒽醌类物质的合成场所，两个地方同时出现的嗜锇小体，说明了一种产物从合成部 位到积累部位的转移倾向。而绿色同化组织也可能是它的合成场所。 胡正海阳根据葸醌类物质能与醋酸铅p b + 2 离子以及其他金属离子结合形成络合 物，并在碱性条件下形成沉淀析出的醋酸铅沉淀性质，应用细胞化学和透射电镜技术 ( t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p e t e m ) ，对木立芦荟叶内芦荟素进行细胞化学定位， 确定了葸醌类物质的合成部位、转运途径和贮存场所。研究结果显示，蒽醌类物质在质 体中形成，形成后以囊泡形式脱离质体，进入细胞质，与内质网相连，然后与质膜接触 1 4 1 前言 并融合以胞吐方式通过细胞壁，进入细胞间隙，并经质外体途径运送到维管束的鞘细胞 内，在鞘细胞内通过内质网运送到与大型薄壁细胞相邻的一侧，再经其胞间连丝运送到 大型薄壁细胞的大液泡内贮存起来。由此看来，芦荟叶中葸醌类物质的合成和运输过程 是由细胞内膜系统完成的。沈宗划1 翻认为芦荟叶内的葸醌类物质的贮存可能是多位点 的，但主要贮存在维管束的大型薄壁组织细胞即芦荟素细胞中，表皮和同化薄壁细胞可 能仅仅是蒽醌类物质前体的供应场所。 1 6 本研究的目的和意义 本研究应用荧光显微镜观察、薄层层析紫外光谱分析、高效液相色谱分析、超薄切 片技术相结合的方法，研究芦荟蒽醌类物质的含量以及叶脉维管束结构和有效成分积累 的关系，为探索和发现有较高利用价值的芦荟新种。 2 研究材料和方法 2 研究材料和方法 2 1 研究材料 研究用的中华芦荟( a l o e v e r a l v a r c h i n e n s i s ) 、库拉索芦荟( a l o e b a r b a d e n s i s l ) 和 木立芦荟( a l o ea r b o n e s c e n sm i l l ) 均采自河南师范大学生物园地，其余4 9 种芦荟属植 物全部采自深圳仙湖植物园，见表1 。 表2 - i ：实验材料列表 2 研究材料和方法 1 7 2 研究材料和方法 2 2 研究方法 2 2 1 解剖学方法 ( 1 ) 荧光显微镜观察 将材料切成边长约5 m m 的小块，在2 0 c 下用l c i c a c m l 8 5 0 型冰冻切片机切片，切片 厚度4 0 - - 6 0 岬( 切片较厚，以减少对细胞的损坏和芦荟素从细胞中流出) 。切片立即置于 l d c a 3 0 1 1 8 5 1 0 4 0 0 0 型荧光显微镜下，分别在紫外光和蓝光下观察芦荟素等蒽醌类物质 在叶中的储藏场所并照相。 ( 2 ) 超薄切片法 分别取不同芦荟的叶片，在其中部维管束部位切取小块，长2 3 m m ，宽l m m 。在 4 c 下用3 戊二醛( g l u t a r a l d e h y d e ，g a ) 固定2 h ，再用1 的锇酸固定4 h ，经系列 乙醇脱水后用e p o n 8 1 2 树脂包埋。r e i c h e r t - - j u n g 超薄切片机切片，切片厚度1i iu l 。 亚甲基蓝天青i i 染色，染色方法同李正型1 7 6 ，l e i c a 显微镜观察并照相。 2 2 2 植物化学方法 ( 1 ) 薄层层析法 ( i ) 薄层层析研究方法的改进 在4 1 种芦荟中选择6 种作为实验材料，见下表。分别研究氢氧化钠含量、薄层厚 度、展层距离对实验结果的影响。 表2 - 2 ：薄层层析改进实验的6 中芦荟材料 2 研究材料和方法 实验材料的处理：将6 种芦荟叶切成薄片后置于烘箱，4 0 条件下烘干，于研钵中 研碎为干粉，使用时各称取0 i g ，用0 2 5 m i 甲醇浸提2 h ，取上清液做为样液。 层析液的配制：以乙酸乙酯：甲醇：水= 1 0 0 ：1 7 ：1 3 ( 体积比) 的比例配制层析液， 剧烈振荡，直至分层现象消失，备用。 粘合剂的配制：取3 9 羧甲基纤维素钠，加入蒸馏水9 9 7 m i ( 即：配制浓度为0 0 3 ) ， 4 5 恒温水浴促使其完全溶解，备用。 p h 值对层析结果的影响 p h 值可影响物质的解离及流动相中的含水量，p h 值升高或者降低，都会使极性物 质r f 值增大，在制作硅胶薄层板时加入n a o h ( 按0 1 的比例加入) ，可以减弱层析后 荧光点的拖尾、扩散等现象，使层析效果更好，有利于各种成分的分离和实验结果分析。 按照每l g 硅胶加2 5 m l 粘合剂( 0 0 3 羧甲基纤维索钠) 的比例混合后研磨制作硅胶薄 层板。制板2 个，编号为i 、2 ，成分配比见表2 ，晾干后于烘箱中1 0 0 一i i o c 活化3 0 r a i n 。 表2 - 3 ：p h 值对层析效果影响的实验薄层板个成分配比 在已活化后的硅胶薄层板上用铅笔在距下边缘i 5 c m 处划线作标记，且用微量进样 器点样，各样点间距为i 3 c m ，点样量均为5i ll ，为避免样点过大，每次点样1l il ，风 干后再点。 点样晾干后，首先置于密闭容器中，用层析液蒸汽熏蒸1 5 m i n ，使薄层饱和，有利 于层析，然后于层析缸中层析，展层距离7 c a ，取出晾干后于3 6 5 n m 波长的紫外分析仪 上观察并照相，结果如图版1 - 9 、卜1 0 。 1 9 2 研究材料和方法 硅胶薄层的厚度对实验结果的影响 按照表3 的成分配比制作不同厚度的硅胶薄层板3 个，编号为3 、4 、5 。 表2 - 4 ：薄层板厚度对层析效果影响实验的薄层成分配比 制板时将硅胶、粘合剂和氢氧化钠混合后研磨2 5 m i n ，晾干后在1 0 0 一l l o c 条件下 活化3 0 r a i n ，3 个板均点6 个样，每样点间隔距离均为1 3 c m ，点样量5 l ll ( 每次点1 i ll ，晾干后再点) ，层析距离7 c m ，于3 6 5 n m 紫外光下观察并照相。 层析距离对实验结果的影响。 按照表5 成分配比与展层距离进行实验。制硅胶薄层板4 个，编号为9 、1 0 、1 1 、1 2 。 表2 - 5 ：层析距离对层析效果影响实验的薄层成分配比与展层距离 制板时均研磨2 5 m i n ，晾干后于1 0 0 - 1 1 0 c 条件下活化3 0 r a i n ，每板均点6 个样，每 样点间隔距离均为1 3 c m ，点样量每个样5l il 。按表中要求层析后于3 6 5 n m 紫外光下观 察并照相。 ( i i ) 薄层层析法研究4 1 种芦荟 上述4 1 种芦荟属植物均取其叶片，切薄片后于4 0 条件下烘干，研磨为干粉。各 称取粉末0 1 9 ，加入0 2 5 m l 甲醇浸提2 h ，取上清液供点样用。吸附剂为硅胶g 删c n a ( 硅胶g 为青岛海洋化工有限公司制造) ，取4 9 硅胶，加入c g c a ( o 3 5 ) l o m l ，再加 入0 0 1 4 9 n a o h ，研磨2 5 r a i n 后铺板i o x1 5 c m 。晾干后于1 0 0 1 1 0 ( 2 条件下活化3 0 r a i n 。 2 研究材料和方法 按照乙酸乙酯：甲醇：水= 1 0 0 ：1 7 ：1 3 ( 体积比) 的比例配制层析液，混合后剧烈振 荡，直至无分层现象。取点样液各5pl ，为防止样点过大，每次点样1l ll ，晾干后再 点，各样点间距1 3 c m ，距板下缘1 5 c m 。点样完毕后要置于层析液蒸汽中先饱和1 5 m i n ， 然后再层析，展层距离7 c m 。取出后晾干，于3 6 5 n m 紫外光下观察荧光斑点并照相。 ( 2 ) 高效液相色谱法 取不同芦荟的叶片，全叶在干燥箱中8 0 烘干，研成粉末，分析天平精确称取l o o m g ， 加入2 m l 甲醇，超声波提取6 0 分钟，0 4 5 岫微滤器过滤，滤液适当稀释。高效液相色谱 仪为w a t e r s 2 9 9 6 ，色谱柱为伊利特o d s 2 ，c 。分析柱，柱长木内径为2 5 0 * 4 6 m ，颗粒度5 岫， 流动相为甲醇：0 0 2 磷酸( 9 ：1 ) ，柱温3 0 ，流速1 - o m lm i n - 1 ，以芦荟大黄素为标准品， 在2 9 4 n m 波长检测，根据峰面积计算各种芦荟叶片干粉中芦荟大黄素的含量。 3 实验结果 3 实验结果 3 1 荧光显微镜观察 从荧光显微镜的照片可以看出，在紫外光和蓝光下，具有散发荧光特征的葸醌类物 质在芦荟叶表皮以及维管束中均有分布，维管束内的大型薄壁细胞荧光强度最大，证明 此处含有的葸醌类物质最多。其次是角质层，细胞壁也发出荧光，但是强度比较弱。储 水组织没有荧光，说明储水组织不含蒽醌类物质。5 2 种芦荟的荧光强度以及荧光点数量 不同，说明不同芦荟含有的葸醌类物质的量和种类不等。见图版1 4 。 3 2 超薄切片观察 从观察结果看，所研究的4 8 种芦荟叶脉维管束结构并不完全相同。有的芦荟叶脉 维管束只有一层维管束鞘，有些种类有两层维管束鞘。叶脉维管束韧皮部存在显著区别， 有些芦荟种类叶脉维管束有典型的大型韧皮薄壁细胞，有些芦荟完全没有大型韧皮薄壁 细胞，还有些种类具有不典型的大型韧皮薄壁细胞。根据维管束鞘和韧皮部结构不同将 4 8 种芦荟叶脉维管束分为如下几种类型：1 ，维管束鞘一层，具有典型的大型韧皮薄壁 细胞；2 ，维管束鞘二层，具有典型的大型韧皮薄壁细胞；3 ，维管束鞘一层，没有典型 的大型韧皮薄壁细胞；4 ，维管束鞘二层，没有典型的大型韧皮薄壁细胞；5 ，维管束鞘 一层，具有不典型的大型韧皮薄壁细胞；6 ，维管束鞘二层，具有不典型的大型韧皮薄 壁细胞。结果见表6 及图版3 。 表3 - 1 ：4 8 种芦荟叶维管束部位超薄切片观察结果与芦荟大黄素含量对比 3 实验结果 51 - l 5 a a f r i c a n a h ym i l l 非洲芦荟 l 典型，较多 1 7 3 1 0 6 61 - i - 6a e x c e l s ab e r g e r 高大芦荟 2 典型。较多 2 0 2 5 1 2 71 1 -