（发育生物学专业论文）cortical+hem起源的cr细胞的迁移路线及最终定位分析.pdf

at h e s i ss u b m i t t e dt o s o u t h e a s tu n i v e r s i t y d i s t r i b u t i o n d e r i v e d h e m f o rt h ea c a d e m i cd e g r e eo fm a s t e ro fs c i e n c e b y z h a n g y i n g s u p e r v i z e db y p r o f z h a oc h u n - ji e so u t h e a s tu n i v e r s i t y m a y2 0 10 东南大学学位论文使用授权声明 研究成果。尽我所 写过的研究成果， 同工作的同志对本 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电 子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相 一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括以电子信息形式刊登) 论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布( 包括以电子信息形式刊登) 授权东南大 学研究生院办理。 研究生签名：祝导师签名： 日期：型! ! ：；! 空 定 1 i n 中 的 发生密切相关，因此明确c r 细胞的发育将为深入研究相关疾病的发生机制提供 线索。 我们在前期工作中制作了f r i z z l e d l o c r e e r 转基因小鼠，发现在该转基因 小鼠中c r e 的表达与内源性的f r i z z l e d l 0 表达模式一致，主要表达在c r 细胞最主要 的起源地一端脑的皮质信号中4 , c o r t i c a lh e m ( c h ) ，而且这些c r 细胞来自于 f r i z z l e d l 0 阳性的前体细胞。在本课题中，我们利用该工具鼠对c h 起源的c r 细胞 的产生时间、分布、迁移路线等做了详细的研究。通过f r i 2 才e d l 0 - c r e e r 与 r o s a 2 6 一l a c z 报告小鼠交配，在不同的发育阶段注射t a m o x i f e n ( t m ) ，借助x g a l 染色的方法，我们发现c r 细胞的发育早在胚胎e 6 5 就已经开始启动，而且在出 生后仍然有少量的c r 细胞产生。在区间分布上，由c h 起源的c r 细胞主要定位在 海马和新皮层的d o r s a l c a u d a l 区。不同时间产生的c r 细胞，其数量和迁移路线 有着明显的区别。这些结果为我们进一步研究c r 细胞发育的调控机制以及c h 起 源的c r 细胞在端脑发育中的功能提供了重要的线索。 关键词：c a j a l r e t z i u s 细胞，c o r t i c a lh e m ，海马，皮质，神经元迁移 d e p e n d so nt h ea p p r o p r i a t en e u r o g e n e s i sa n dt h em i g r a t i o no fg e n e r a t e dc e l l t h e c a j a l - r e t z i u s ( c r ) c e l l sa r eo n eo ft h ef i r s tc e l lp o p u l a t i o n sg e n e r a t e di nt h ec o r t i c a l n e u r o e p i t h e l i u m ，w h i c hl o c a t e da tt h em a r g i n a lz o n eo fc e r e b r a lc o r t e x d u et ot h e i r s t r a t e g i cp o s i t i o na n dt h eh i g hl e v e le x p r e s s i o no ft h eg l y c o p r o t e i nr e e l i n ( r e i n ) ，t h e y a r ec a p a b l eo fo r g a n i z i n gt h er a d i a lm i g r a t i o no ft h ec e l l sg e n e r a t e di nt h eg e r m i n a t i v e v e n t r i c u l a ra n ds u b v e n t r i c u l a rz o n e s ，o r c h e s t r a t i n gt h ec o r r e c tl a m i n a t i o no ft h e c e r e b r a lc o r t e x m o r ei m p o r t a n t ，m a n ym e n t a ld i s o r d e r sh a v eb e e ns h o w nt ob e r e l a t e dt ot h ed e f e c t i v ef u n c t i o no fc rc e l l sa n dr e e l i n t h u s ，i d e n t i f m gt h e d e v e l o p m e n t a lm e c h a n i s mo fc rc e l l sm a yp r o v i d eu s e f u lc l u e sf o rs t u d y i n gt h e m e c h a n i s mo ft h eo c c u r r e n c eo ft h ed i s e a s e s i no u rp r e v i o u s w o r k s ，w eh a v er e p o r t e d at r a n s g e n i ce r em o u s el i n e f r i z z l e dlo c r e e r t mi nw h i c hc r ei sm a i n l ye x p r e s s e di nt h ec o r t i c a lh e m ，as i g n a l i n g c e n t e rd u r i n gt e l e n c e p h a l i cd e v e l o p m e n t h e r ew es h o wc rc e l l sa r ep r i m a r i l y o r i g i n a t e di nt h ec o r t i c a lh e m ，a n dt h e s ec e l l sa r eg e n e r a t e df r o mf r i z z l e d lop o s i t i v e p r o g e n i t o r su s i n gt h i sm o u s et 0 0 1 b yc r o s s i n gt h ef r i z z l e d lo c r e e r t mm o u s ew i t h t h er o s a 2 6r e p o r t e rl i n e ，t a m o x i f e n ( t m ) a d m i n i s t r a t i o na td i f f e r e n td e v e l o p m e n t p o i n t sa n dx - g a ls t a i n i n g ，w ef o u n dt h eg e n e r a t i o no fc rc e l l ss t a r t e da se a r l ya se 6 5 ， m o r e o v e rt h e r ea r es t i l ls o m ec rc e l l st ob ep r o d u c e da f t e rb i r t h c rc e l l so r i g i n a t e d m 缩略词表 主要缩略词表 缩写词 英文中文 a p o e r 2a p o l i p o p r o t e i ner e c e p t o r 2载脂蛋白e 受体 v l d l r v e r yl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i nr e c e p t o r极低密度脂蛋白受体 d a b ld i s a b l e dl p p p r e p l a t e 前板 v zv e n t r i c u l a rz o n e 脑室区 s v zs u b v e n t r i c u l a rz o n e脑室下区 c hc o r t i c a lh e m p s b p a l l i a ls u b p a l l i a lb o u n d a r y v pv e n t r a lp a l l i u m c m w tc a u d o m e d i a lw a l lo ft h et e l e c e p h a l i cv e s i c l e s m z m a r g i n a lz o n e边缘层 s p s u b p l a t e皮质下板 c pc o r t i c a lp l a t e皮质板 h h i p p o c a m p u s 海马 p i r p i r i f o r mc o r t e x梨状皮质 m om o l e c u l a rl a y e r 分子层 i v 第二节实验材料和方法1 6 1 材料16 1 1 实验小鼠与取材1 6 1 2 主要仪器1 6 1 3 溶液配置1 7 2 方法2 0 2 1 基因型鉴定2 0 2 2x - g a l 染色2 0 2 3 免疫荧光21 2 4b r d u 染色21 第三节实验结果与分析。2 2 1 c r e 的表达与内源性f r i z z l e d l o 表达一致，c r 细胞来源于c h 中f r i z z l e d l o 阳性 的细胞2 2 2c r e 泄漏的鉴定2 4 v 目录 3c r 细胞产生的时间段跨越了生前和生后发育阶段2 5 4 不同阶段产生的c r 细胞迁移路线。3 2 5c h 起源的c r 细胞主要定位3 6 6 讨论3 8 参考文献4 0 作者简介4 4 致谢4 5 v i 日l j 舌 大脑皮质在发育期间产生了大量的细胞，细胞正确的迁移对于皮质的正常发 育至关重要。细胞从起源地迁移到终点，并在终点和靶细胞建立起突触连接形成 神经回路来整合和处理各种信息，完成对各种生命活动的调控。 c r 细胞是皮质神经上皮发育过程中最早产生的一类细胞，这类细胞定位在 大脑皮质的第一层，在皮质发育早期分泌大量的r e e l i n ，并通过调控v z 和s v z 区所产生细胞的放射状迁移，进而调控了皮层神经元的迁移。自c r 细胞被发现 到现在已经有1 0 0 多年了，在这期间人们围绕c r 细胞做了大量的研究。人们发现 这是一类异质的细胞，具有不同的起源地，目前已知的包括c h ，s e p t u m ，p a l l i a l s u b p a l l i a lb o u l l d a r y ( p s b ) 等起源地【1 枷】。这些不同来源的c r 细胞通过切线方式迁 移并定位到大脑皮质第一层。 研究表明c r 细胞的产生和分化与多种基因相关，而且不同来源的c r 细胞的 分化机制是否相同还不明了。研究表n p 7 3 1 1 ，1 2 1 、p 2 1 1 3 1 、z i c 3 1 4 】与c h 和s e p n l i n 来源的c r 细胞的发育相关，而e b f 2 1 5 】调控 v e n t r a lp a l l i u m ( v p ) 起源的c r 细胞。 事实上，基因芯片的结果显示这些基因主要表达在e 1 3 5 天的小鼠胚胎的c r 细胞 中。另一方面，f o x g l 和l h x 2 抑制了c r 细胞的表型，从而使c r 细胞在限定的区 域分化【1 5 - 1 s 。但是尽管如此，人们对于调控c r 细胞的迁移机制仍不清楚。 我们在前期研究工作中利用r n a 原位杂交技术发现w n t 受体之一 f r i z z l e d l 0 ( f z d l 0 ) 在发育过程中主要表达在大脑皮质的信号中心c h 以及背侧 神经管【1 9 1 ，而在我们制作的f r i z z l e d l o c r e e r 刑转基因小鼠中，c r e 的表达基本与 内源性的f r i z z l e d l o - - 致【5 】。通过将该小鼠与r o s a 2 6 l a c z d , 鼠交配并且在不同 的发育阶段注射t a m o x i f e n ( t m ) ，在不同发育阶段从c h 产生的细胞可被报告基因 l a c z 标记上，因此可通过l a c z 的表达来追踪不同发育阶段c h 产生的c r 细胞。因 此利用这个转基因小鼠研究不同时间点c h 产生的c r 细胞的发育是个非常好的 工具。 实验结果表明早在e 6 5 注射t m ，就已经可以标记到c h 来源的c r 细胞，说明 c r 细胞的产生早在e 6 5 天就已经开始启动；而且我们发现在出生后仍然有少量 c r 细胞的产生。在胚胎发育的不同时间注射t m 所标记的c r 细胞主要定位在海 马( h i p p o c a m p u s ，h ) 和新皮层的d o r s a l c a u d a l 区。另一方面，我们发现在e 1 1 5 东南大学硕士学位论文 注射t m ，标记到的c i 洳胞最多。e 1 5 5 注射t m 及b r d u ，通过b r d u 和g f p 的双标， 发现在这个期间c h 仍然存在正在分裂的细胞。我们发现不同时间诱导打开的c r 细胞迁移路线存在着差异。在e 1 0 5 、e 1 2 5 、e 1 3 5 、e 1 4 5 、e 1 6 5 诱导打开的c r 细胞主要从r o s t r a lc o r t i c a lh e m ( r c h ) 和m e d i a lc o r t i c a lh e m ( m c h ) 向背侧皮质迁 移，而在e 1 1 5 和e 1 5 5 诱导打开的c r 细胞从整个c h 向皮质都有很明显的迁移。 因此，这些结果为c r 细胞复杂的迁移机制和区域性特化的研究提供了有价值的 线索。 2 第一节文献综述 第一节文献综述 哺乳动物新皮质的构建在发育过程是一个非常复杂的生物过程。最早的神经 干细胞经历增殖，迁移、分化成为成熟的神经元。细胞从生发区向外迁移生成皮 质板，先产生的神经元定位在皮质板的内层，后产生的神经元穿过先产生的神经 元定位在皮质板的外层。而在发育过程中新皮质神经元的迁移依赖于r e e l i n 信号 通路来确定这种经典的i n s i d e o u t 模式【2 0 之5 1 。研究证明c 匈a 1 r e t z i u s ( c r ) 细胞以及 它的分泌蛋白r e e l i n ，在神经回路发育过程中发挥着重要的作用，c r 细胞的发育 缺陷常会导致许多神经发育相关疾病。 1c r 细胞的定义 c r 细胞是大脑皮质发育过程中最早产生的一类神经元。它们位于大脑皮质 最外层，胞体呈卵圆形，具有丰富的水平轴突丛。 这类神经元首先被r e t z i u s 在1 8 9 3 年利用人的标本描绘出来。c a j a l 在1 8 9 1 年 利用非灵长类的标本也绘制了类似的但形态更简单的神经元。虽然他们绘制的神 经元形态有着较大的差别，但是由于他们利用的物种不同，且发育的阶段也不同， 因此人们普遍认为他们绘制的神经元是同一类神经元，并且把这一类的神经元定 义为c a n r e t z i u s ( c r ) 细胞。c r 细胞自1 9 世纪被发现迄今已经有一百多年的历 史，几年来的研究发现这类细胞特异性地分泌r e e l i n 蛋白，因此人们利用r e e l i n 做为m a r k e r 来研究c r 细胞的功能及生物学性质。最近科学家们对c r 细胞的研究 取得了很大的进展。首先，在功能方面，人们发现c r 细胞及其分泌蛋e t r e e l i n 在大脑皮质的分层及神经元迁移中具有重要作用。其次，科学家们在对c r 细胞 本身的生物学研究中也做了不少工作，比如，c r 细胞的起源、迁移、亚型分析 等。但是尽管如此，我们对c r 细胞的产生、分化及维持等发育过程还知之甚少， 还有许多问题尚待解答。 2c r 细胞和r e e l i n 与神经、精神疾病 c r 细胞与多种神经元迁移异常所致的人类疾病相关。r e e l i n 基因的突变可 导致无脑回以及小脑发育不全，血液中r e e l i n 水平降低会导致重度精神发育迟 缓和小脑发育畸形【2 6 1 。多脑回病人出生后的皮质中出现c r 细胞的异常聚集【2 7 1 。 另外，越来越多的证据表明c r 细胞及其所分泌的r e e l i n 与许多精神疾病密切 3 东南大学硕士学位论文 相关，包括自闭症、孤独症、精神分裂症和双向抑郁症。在自闭症病人中出现 r e e l i n 信号受损和r e e l i n 基因的多态性【2 8 , 2 9 】。r e e l i n j 丕被认为是精神分裂症和双向 抑郁症的一个易感因子【3 0 ，3 。在精神分裂症和双向抑郁症的病人中可以观察到 r e e l i n 蛋白在额前皮质和海马的表达明显地下降，而且在成人期r e e l i n 水平的异 常伴随着行为缺附3 2 1 。另一方面，r e e l i n 影响突触的形成。在精神分裂症的病人 中，由于一些中间神经元r e e l i n 水平的下降，会导致突触以及树突数量的减少【3 3 1 。 同样，人们在孤独症病人的小脑中发现r e e l i n 的表达也是降低的【3 4 】。因此，以上 研究结果表明r e e l i n 是导致这些疾病的一个重要的影响因子，它主要在两个阶段 对神经发育产生影响：神经迁移以及突触形成。 此外，在r e e l e r d , 鼠中，由于r e e l i n 的缺失，造成了皮质分层异常以及明显的 神经系统和行为缺陷，包括共济失调，蹒跚步态等。 3c r 细胞的研究现状 3 1c r 细胞的起源与迁移 3 1 1c r 细胞的多种起源 c r 细胞是一类非常独特的神经元，在皮质发生的初始阶段就已经在皮质中 存在，而且大部分的c r 细胞最后都经历了凋亡。在啮齿类动物，利用b r d u 追踪研 究发现大约9 5 的c r 细胞在出生后一周时间内都死亡了，也就是神经元迁移完成 的时候【3 5 1 。在人类和灵长类中，也观察到类似的现象【3 6 】。因此，人们对c r 细胞 的起源及其在皮质发育中的作用产生了极大的兴趣。 事实上，c r 细胞的发育一直存在着争议。以前，根据c r 细胞表达的分子 m a r k e r 的模式，人们争议于c r 细胞是否既起源皮质外，也起源于皮质内，但是 由于这种手段在时间上的局限性，并没有得出一个明确的结论。最近的细胞谱系 追踪实验终于改变了这种情形。利用局部胚胎电转的方法，t a k i g u c h i h a y a s h i 2 1 等人首先发现在端脑泡的c a u d o m e d i f lw a l l ，包括c h ，产生了大量的r e e l i n 阳性 的细胞，定位于m z ，这些细胞通过切线迁移的方式分布于整个新皮质。随后， g r o v e 3 】等人证实了c h 在c r 细胞的产生中具有非常重要的作用。他们利用 w n t 3 a - c r e 转基因小鼠追踪产生于c h 的细胞谱系，发现大量的c r 细胞起源于c h 。 d y e 标记实验【4 ，5 ，3 7 1 以及我们的前期工作也证实了这一点。利用d b x l e r e 转基因小 鼠，b i e l l e i s 】等人发现在皮质外c r 细胞还存在着两个其他的起源地，包括p s b 和 4 第一节文献综述 s e p t u m o 最新的研究提示预期的脉络丛上皮在发育过程中也可能产生c r 细胞。因此 布满整个大脑皮质表面的c r 细胞至少存在三个c a u d a l m e d i a lw a l l ( 包括c h 和脉络 丛上皮) 、p s b 、s e p t u m 等不连续的皮质外起源区。从不同位点起源的c r 细胞在 适当的时间内迅速迁移，覆盖到整个大脑皮质表面，确保c r 细胞能正常地调控 大脑皮质的发育。c r 细胞为什么会有不同的起源? 存在一种假设，认为c r 细胞 祖先细胞区域的多样性可能与新皮质、嗅皮质以及海马之间细胞组织结构的差异 性相关。那么不同起源的c r 细胞的发育调控机制、迁移路线以及它们在端脑发 育过程中的作用是否相同? 有诸多问题尚待解答。 3 1 2c r 细胞的迁移 在皮质发生过程中，主要存在三种类型的神经元迁移：兴奋性神经元前体细 胞的放射状迁移，中间神经元及c r 细胞的切线迁移。在过去的几年里人们在这 三种神经元的迁移是如何调控以及相互协调等方面做了很多工作，对c r 细胞在 神经元的放射状迁移中的重要调控研究取得很大的进展，但是关于c r 细胞自身 迁移的研究却是刚刚开始。 研究发现起源于不同区域的c r 细胞的最终定位是不同的。利用遗传追踪和 d i i 标记的方法，b i e l l e t g 】等人发现起源于s e 砷埘的c r 细胞通过切线方式向m e d i a l c o r t e x 和p i r i f o r mc o r t e x ( p i r ) 迁移，而起源于p s b 区域的c r 细胞则向d o r s a l a t e r a l c o r t e x 和p i r 迁移。而起源于预期的脉络丛上皮的c r 细胞特异性的定位在p i r p 引。 对起源于c h 的c r 细胞迁移是g a r c i a - m o r e n o 4 等人通过体外全胚培养，将荧光追 踪剂d i i 注射到c h ，然后分析e 1 0 5 及e 1 1 5 天被标记的细胞的迁移的情况，发现这 些细胞向侧前方移动，遵循一条倾斜的路线从c a u d a l 移向r o s t r a l 区域。其迁移路 线依赖于c r 细胞在c h 的位置，相邻位点产生的c r 细胞之间的迁移路线并不交叉 ( 图1 ) 。c r 细胞的多种起源和不同的迁移路线可能更有利于c r 细胞的区域性 及细胞特异性地分化。但是关于c h 起源的c r 细胞的最终分布和定位以及不同发 育阶段产生的c r 细胞具体的迁移路线及其在端脑发育中的作用尚不明了。 东南大学硕士学位论文 o 莱p v 图1 不同起源的c r 细胞的迁移路线 c r 细胞的切线迁移是其发育过程中一个非常重要的部分。处于大脑皮质第 一层的c r 细胞是如何进行迁移进而保持准确的定位? 其调控机制是什么? m a r i na n dp l e a s u r el a b s 对此过程提供了一个关键的线索。b o r r e l la n dm a r i n 【3 9 ，柏】 等人发现皮质的脑脊膜不仅是c r 细胞迁移时的支持物，而且对c r 细胞的迁移具 有化学吸引的作用。更重要的是脑脊膜表达的趋化因子c x e l l 2 ( s d f ) 可以模拟 脑脊膜对c r 细胞的吸弓i 和分散作用。而当使用c x c r 4 的抑制剂，使c x e l l 2 的受体 功能缺失，导致c r 细胞不能够应答脑脊膜的信号时，同样引起c r 细胞定 位的改变，部分c r 细胞异常定位到c p 的深处。类似地，当p a r e d e s 【柏】等人用致畸 因子使脑脊膜中的基底膜损伤及c x e l l 2 表达的缺失时，也导致了c r 细胞的异常 定位，c x c r 4 突变的小鼠中，部分c r 细胞异位到皮质深层。同时c x e l l 2 信号在维 持到达皮质后的c r 细胞层具有极为重要的作用。有趣的是，p a r e d e s 同时发现了 c x e l l 2 能挽救由致畸因子引起的c r 发育的异常，将致畸因子处理过的片子与对 照片子共培养时能够恢复c r 细胞的正常发育【4 l 】。然而c x c l l 2 信号的缺失只能够 引起部分c i 洳胞出现在皮质深层，说明c x c i l 2 可能不是c r 细胞正确定位的必要 因子，很可能还存在其他未识别的因子调控着c r 细胞的正确定位( 图2 ) 。 6 帔c r k c p o b e t l t o n l l 二忆卜蛳 胚胎发育的e 1 0 5 e 1 3 5 种不同的起源。这一结 果开始让人们思考这些不同起源的c r 细胞产生的具体时间是怎样的? 它们产生 的时间段是否有区别? 不同来源的c r 细胞的亚型是否一致? 调控这些细胞产生 的机制是否相同? 对于这一系列的问题，科学家们做了大量的研究。首先是亚型 的分析。b i e l l e 【8 】等人的研究结果显示了起源于s e 雕瑚和p s b 的c r 细胞虽然都来 自于d b x l 阳性的前体细胞，但是这些细胞具有不同亚型，如起源于s e p t u m 的c r 是r e e l i n + c a l r e t i n i n 一p 7 3 一的，1 i i i p s b l f f 域来源的c r 细胞是r e e l i n + c a l r e t i n i n + p 7 3 一 的。h a n a s h i m a t s l 等人发现起源c o r t i c a lh e m 的c l 洳胞在早期e 1 1 5 是p 7 3 + r e e l i n 一。 而e 1 3 5 天在l a t e r a lp a l l i u m 有很多的的r e e l i n + p 7 3 + c l 洳胞。另外起源于h e m 的c r 细胞也能够表达c a l r e t i n i n 引。然而对于胚胎发育早期，围产期和出生后有无c r 细 胞产生及其亚型鉴定还不清楚，分析c r 的亚型可以使人们进一步分析其不同的 功能。因此明确不同时间c r 的亚型对于不同时间产生的c r 的功能研究是非常必 要的。 b i e l l e 嘲等人将起源于s c l m 蚰和p s b 区域的c r 细胞去除，发现在e 11 5 天r e e l i n 在s e p t u m 和梨状皮质的表达明显减少，但这种减少在1 4 5 天被其他来源的c r 细胞 所补偿。尽管如此，侧皮质的厚度出现明显的变薄，而扣带回皮质并无明显改变， 这种皮质区域选择性的缺陷说明起源于d b x l 的c i 蜘胞对侧皮质的发育有一定的 作用。m i c h i oy o s h i d a 3 1 等人将h 啪起源的c r 细胞去除时却出现了一个反常的结 7 东南大学硕士学位论文 果。虽然在新皮质区c r 细胞大量甚至完全缺失，而且这种缺失并不能被其他来 源的c r 细胞所挽救，但是他们发现新皮质的分层并没有出现异常。同样的结果 出现在p 7 3 突变的小鼠中【1 2 】，艮1 p 7 3 的突变导致新皮质区的c r 细胞大量缺失，而 新皮质的分层结构未受到影响。但是由于m i c h i oy o s h i d a 3 1 等人所用工具小鼠的 局限性，对于h e m 起源的c r 细胞的作用需要做进一步的研究。 其次是c r 细胞的发育，不同起源地产生的c r 细胞发育以及c r 细胞最终定位 的不同可能由不同的机制调控。n a n a s h i m a t 7 l 等人研究发现f o x 9 1 在皮质发生的 早期以细胞自主性的方式抑制了c r 细胞的产生。在f o x g l - - 突变的小鼠中，大量 的r e e l i n 的c r 细胞布满整个皮质，显示f o x g l 抑制了c r 细胞的特化。而且通过药 物d o x y c y c l i n e 在e 1 3 天选择性地去除f o x g l 的表达，同样使c r 细胞的数量明显的 增加，并且他们发现这些增加的c r 细胞是由于f o x g l 的缺失，使那些在e 1 3 产生 本应该分化为皮质深层神经元的祖先细胞重新恢复产生c r 细胞的能力。有趣的 是，最新的研究表明起源于不同区域的c r 细胞的发育过程是不一样的。 h a n a s h i m a ”】对c r 细胞的产生做进一步研究，发现背侧信号中心和f o x g l 对不同 来源的c r 细胞的作用是不同的。虽然f o x g l 的缺失可以同时使起源于c h 和p s b 区域的c r 细胞增加，但是在e 1 3 天敲除f o x g l 时，并不能使背侧信号中心扩张， 仅仅是具有p s b 样表型的c r 细胞增加。而在g l i 3 突变的小鼠中，背侧中线的信号 缺失，导致了起源于c h 的c r 细胞减少，却不影响起源于p s b 区域的c r 细胞的特 化。这些结果说明，背侧信号中心只对c h 来源的c r 细胞的产生是必要的，而 f o x g l 能抑制整个皮质中的c r 细胞的命运。 那么f o x g l 是如何抑$ 1 j c r 细胞发育? s i e g e n t h a l e r t l 3 】等人发现起源于c h 的 c r 细胞的产生受t g f l 3 f o x 信号通路的调控，f o x g l 与f o x 0 3 是f o x 家族中的具有 相反作用的两个因子。f o x g l 能抑制依赖t g f i b 信号 拘p 2 1 的表达，而在c r 细胞产 生过程中，f o x 0 3 却协助t g f i b 促进t p 2 1 在c r 细胞中表达，从而调控了c r 细胞 的产生，但是p 2 1 的表达是暂时的，因为当c r 细胞从产生区域向外迁移时，f o x 0 3 移位到核周体，使t g f f ) 信号不能够维持p 2 1 的表达。然而t g 邛f o x 信号通路不 是调控c r 细胞产生的普遍机制，因为他们不能调控其他起源地的c r 细胞的产 生。而_ 且f o x g l 对c r 细胞分化的调控也只是一个初步的研究。 除t f o x g l ，人们还发现其他的基因也能够调控c r 细胞的产生。i m a y o s h i 3 6 l 8 第一节文献综述 等人在研究中发现n g n 2 基因能够调控起源于背侧中线( c h 和脉络丛上皮) 的c r 细胞的产生( 图3 ) ，利用子宫内电击实验和n g n 2 突变的小鼠，证明了此观点。 在e 9 5 天电击，使n g n 2 在背侧中线异位表达，促进了c r 细胞的产生。而在e 1 1 5 天电击，却发现只有起源于c h 的c l 洳胞增加，而不能促进预期的脉络丛上皮中 产生的c r 细胞的增多。在- n g n 2 突变的小鼠中，起源于背侧中线的c r 细胞是减少 的。p a x 6 是一个皮质转录因子，以前的研究表明这个因子与多种发育过程相关， 包括调控迁移细胞的增殖，迁移及其粘附性质的特化，轴突生长和侧副支的延伸 4 2 - 4 6 1 等。事实上，p a x 6 基因的突变，可以使大脑皮质m z 中r e e l i n + c a l r e t i n i n + 的细 胞数日增加，但是这种改变是由于细胞的重新特化或者是控制细胞迁移的机制 改变还不清楚 4 7 1 。 a ，舰 图3 n g n 2 与h e s 基因相互拮抗调控c i t 细胞的产生 以上研究提示多种因子如f o x g l 、e m x 2 、背侧中线信号、以及调控脉络从 发育的基因h e s 和n g n 等都参与了c r 的发育调控，研究报道f g f 8 也参与了调控c r 细胞的特化【铝l 。另一方面，c r 细胞自身表达的某些基因也参与了调控c r 细胞的 发育成熟和分化。利用基因芯片的方法，y a m a z a k i l 4 9 等人发现某些基因在c r 细 胞中的表达具有时空差异性( 图4 ) 。例如，在e 1 3 5 天p 2 l 和g d n 主要表达在起源 于c a u d o m e d i f lw a l lo ft h et e l e c e p h a l i cv e s i c l e s ( c m w t ，包括c h ) 的c r 细胞中，而 e b f 2 选择性的表达在靠近v p 的m z 。既然p 2 l 与c h 来源的c r 细胞的产生有关，也 许我们可以推测e b t 2 与v p 起源的c r 细胞的产生相关。 9 照鲁 大量的研究表明c r 细胞的存活可能与脑脊膜密切相关，是脑脊膜提供了c r 细胞生存所必需的某些营养因子。而且多种基因通过影响脑脊膜而间接地影响了 c r 细胞的生存。s u p e r 5 0 】等人发现通过化学或机械的方法去除脑脊膜可导致c r 细胞的明显减少。在c x c i l 2 4 和c x c r 4 - - 的小鼠中，s t i 】m m 【5 l 】等人同样发现t o p 细胞的减少，而c x c l l 2 只在脑脊膜中表达，因此c x c l l 2 可能也是通过脑脊膜促进 了c r 细胞的存活。h a r t m a n n 5 2 】等人认为p r e s e l l i l i n - 1 ( p s l ) 对于c r 细胞的存活是必 要的，因为在p s i - d , 鼠中，在e 1 3 天，m z 中的细胞密度并没有明显的减少，然 而在e 1 8 天，c r 细胞却明显地减少，说明c r 细胞可能发生了成熟前的退化。但 是，w i n e s s a m u e l s o n 5 3 1 等人利用在神经元中条件性敲除p s l 的小鼠，发现c r 细 胞无论是在e 1 3 5 ，还是在e 1 7 5 天都没有明显地改变，因此说明c r 细胞在p s i - 小鼠中的成熟前减少可能是由于p s l 在非神经元组织中缺失所致，p s l 通过非细 胞自主性的方式影响了c r 细胞的存活。他们通过研究进一步发现与p s l 4 条件性 敲除小鼠相比，在p s l - - 突变小鼠中，脑脊膜中的细胞增殖增加，因此可能这些 细胞的增加损伤了它们正常提供营养因子的能力，从而使c r 细胞的存活受到了 影响。另外在z i c l 3 1 5 4 1 双突变的小鼠中也进一步证实了脑脊膜提供了c r 细胞生存 所必须的某些营养因子。另一个影响c r 细胞存活的基因是e m x 2 ，与p s l - - 小鼠 相似，在e m x 2 - - 的小鼠中，m a l l a m a c i 【5 5 】等人也观察到c r 细胞发生了成熟前的 减少，但是与p s l 4 不同的是，早在e 1 5 5 天c r 细胞减少的表型就已经很明显了。 然而e m x 2 是否以细胞自主性方式影响c r 细胞的存活还不清楚。以上研究结果提 l o 第一节文献综述 示c r 细胞的存活不仅受到内在因素的调控，其最终定位的环境也对其存活有着 重要的影响。 3 3c r 细胞的功能 c r 细胞的主要功能之一是通过分泌r e e l i n 蛋白调控大脑皮质的神经元迁移。 在r e e l e r t , 鼠中由于r e e l i n 基因的缺失，使神经元的迁移和定位出现异常，进而导 致大脑皮质分层倒置，同时也引起了海马、小脑、嗅球发育的异常，更重要的是 在此突变小鼠中，p r e p l a t e ( p p ) 不能正常的分裂为m o l e c u l a rl a y e r ( m o ) 和 s u p l a t e ( s p ) ，说明r e e l i n 在几种层结构的形成中起到非常重要的作用。然而关于 r e e l i n 信号如何影响神经元的迁移仍有许多的问题需要解决5 6 1 。十年前，人们发 现了非常重要的线索，当d i s a b l e d l ( d a b l ) 或脂蛋白受体a p o l i p o p r o t e i ne r e c e p t o r 2 ( a p o e r 2 ) 和v e r yl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i nr e c e p t o r ( v l d l r ) 突变时，其表型 与r e e l e r t j , 鼠相似，并确定t d a b l 、a p o e r 2 和v l d l r 为r e e l i n 信号的下游分子【5 7 ， 5 8 1 。最近，研究显示r e e l i n 信号级联与非常广泛的胞内信号分子相互作用，包括 a k t 、g s k 3 1 3 、c r k 家族激酶、c d k 5 和l i s l 等【5 9 】( 图6 ) 。但是r e e l i n 信号调控神 经元迁移和层定位的精细机制仍然不清楚。关于r e e l i n 功能的各种模型显示它可 能促进神经元迁移，也可能它在p p 的分开中具有作用，从而使i n s i d e o u t 分层模 式能够开始，亦或者它做为终止信号，指导神经元从放射胶质上解离，从而进行 分化。 3 3 1r e e l i n 作为终止信号并能促进神经元从放射胶质解离 有观点认为，在大脑皮质第一层高表达的胞外蛋白r e , e l m 是调节神经元迁移 的终止信号。因为当迁移中的神经元遇到位于第一层的r e e l i n 蛋白时，即从放射 胶质上脱落下来，终止迁移。在一些病理环境下，如c r 细胞或第一层损伤时， 迁移的神经元会进入到第一层【砷 6 1 1 。 h a c k t 等人经过研究证实j r e e l i n 能够阻止迁移中的神经元进入m z 。介导 r c e l i n 信号通路的信号分子包括a p o e r 2 和乙d l r 以及接头蛋白d a b l 和一些细 胞内的信号传导分子。有趣的是他们发现是v l d l r 介导了r e e l i n 的终止作用，从 而阻止迁移神经元进入m z 。在v l d l r 突变体中，早期产生的锥体神经元异常侵 入n m z 。而a p o e p 2 受体调控了晚期产生神经元的迁移。因为a p o e r 2 突变体中 显示出晚期神经元的异常迁移。a p o e r 2 、v l d l r 、奶p l 整合蛋白在放射状迁移 的神经元中表达阮6 3 1 。在神经元迁移过程中，迁移的神经元通过o t 3 1 3 1 整合蛋白 与放射胶质结合，当神经元迁移停止时，由于配体的选择性，奶p l 整合蛋白转而 与r e e l i n 结合，并通过v l d l r 和a p 0 e r 2 形成复合体，r e e l i n 受体的复合体进而 使接头蛋白d a b l 的磷酸化，从而使迁移的神经元从放射胶质纤维上脱落下来【删 ( 图7 ) 。 1 2 图7r c e l i n - u 3 p l 整合蛋自相互作用模型 3 3 2r e e l i n 促进神经元的迁移 也有研究报道，r c e l i n 在大脑皮质发育过程中对迁移的神经元有吸引作用， 原因主要有三点。首先r e e l i n 蛋白是在皮质的第一层一也就是神经元迁移的终点 表达f 6 5 l ；其次，迁移的皮质神经元能够与r e e l i n 蛋白和磷酸化的d a b l 结合；最后， 通过n e s t i n 的启动子将r e e l i n 异位表达到v z 区后，神经元立刻停止了迁移【6 6 】。这 种说法也符合r e c l 盯小鼠的表型。因为在r e e l e r d 、鼠中，神经元离开v z ，在中间层 和c p 异常迁移，最终定位在皮质深层，在大脑皮质的第一层以下并没有大量神 经元的累积。 3 3 3c r 细胞和r e e li n 影响了放射胶质的形态和成熟 放射胶质是中枢神经系统发育过程中的一种非常重要的细胞。新生的c p 细 胞沿着放射胶质纤维迁移到目的地，最终形成一个有序的皮质层结构。许多的研 究表明当c r 细胞去除后，放射胶质会减少。s u p e j 6 7 】等人发现，在新生小鼠中利 东南大学硕士学位论文 用a m p a k a r 的拮抗剂