（分析化学专业论文）纳米金rrs法测定半胱氨酸、6苄胺基嘌呤和环丙沙星.pdf

。，_，囊二 11 at h e s i si na n a l y t i c a lc h e i i l i s t r y r e s o n a n c er a y l e i 曲s c a t t e r i n gm e t h o dv i a n a n o - g o l df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fl c y s t e i n e ， 6 b e n z y l a m i n o p u i i n ea n dc i p r o n o x a c i no - j j e n z v l a m l n 0 d u n n ea n du l d r o t l 0 x a c l n b yy u a nj i a n p e i s u p e i s o r ：p r o f e s s o rx us h u l 【u n n o r t h e a s t e m u n i v e r s i t y j a n u a r y2 0 0 8 ， i；e氆照盍圩 p ，+ 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 。， 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 立 思o 学位论文作者签名：敖逮诜 日 期：洲易耳弓目日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 每 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 ( 如作者和导师不同意网上交流，请在下方签名；否则视为同意。) 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字目期： 东北大学硕士学位论文摘要 纳米金一r r s 法测定半胱氨酸、6 苄胺基嘌呤和环丙沙星 摘要 近年来，一种新的分析技术，共振瑞利散射( r r s ) 光谱法，由于具有高灵敏度和 简易性而引起人们的关注。金纳米微粒具有特殊的物理化学性质，在许多研究领域中表 现出了潜在的应用价值，目前，已在物理学、化学、生物学、光学、电子学、药物及临 床医学等领域得到广泛的研究和应用。本文研究了金纳米微粒与半胱氨酸、6 _ 苄胺基嘌 呤和环丙沙星相互作用的r r s 光谱特征、影响因素、分析化学性质及其分析应用，分 别建立了三种物质的r r s 测定方法。要点如下： 在p h3 3 的b r ( b r i n o n r o b i n s o n ) 缓冲介质中，金纳米微粒与半胱氨酸依靠静电 引力相互作用形成大体积的结合产物时，引起纳米微粒的粒径增大，从而使得体系的共 振瑞利散射强度急剧增强，最大散射峰位于3 8 9 衄，同时在3 6 2 砌处有较强的散射峰。 考察了适宜的反应条件、方法的灵敏度和选择性。观察到当半胱氨酸在0 0 4 o 2 0m g l 1 的浓度范围内其浓度与r r s 强度成正比( r = o 9 9 9 0 ) ，检出限( 3o ) 为6 5 肛g l - 1 ，测定 的相对标准偏差( r s d ) 为2 o ( 浓度为o 0 8m g l 1 ，n = 1 1 ) ，方法具有较好的选择性。 据此提出了用共振瑞利散射技术测定半胱氨酸的方法。 在p h3 o 的b r 缓冲介质中，6 _ 苄胺基嘌呤本身的r r s 强度很弱，金纳米微粒本身 有一定的r r s 强度，当它们依靠静电引力相互作用结合形成大体积的聚集体时，引起 纳米微粒的粒径增大，从而使得体系的共振瑞利散射强度急剧增强并出现新的r r s 光 谱，在3 0 0 4 2 0l 硼之间产生散射带，最大散射峰位于3 8 8n m ，同时在3 7 1 砌处有明 显的散射峰。6 苄胺基嘌呤在2 0 4 8 o g l 1 的浓度范围内其浓度与r r s 强度成正比 ( r = 0 9 9 8 6 ) ，检出限( 3o ) 为1 4n g l _ 1 ，测定的相对标准偏差( r s d ) 为1 7 ( 浓度 为4 0 0 g l 1 ，n = 1 1 ) 。本文研究了适宜的反应条件、共存物质的影响和方法的灵敏度， 建立了用共振瑞利散射技术测定6 苄胺基嘌呤的方法，用于m s 培养基中6 苄胺基嘌呤 的测定，获得较好的结果。 在p h3 4 的b r 酸性缓冲溶液中，金纳米微粒与坏丙沙星相互作用形成大体积的结 合产物时，引起纳米微粒的粒径增大，从而使得体系的共振瑞利散射强度急剧增强，并 出现新的r r s 光谱，最大散射峰位于3 6 1n m ，同时在3 8 9n m 和4 2 2n m 处有较强的散 射峰。本实验选用3 6 1n m 为测量波长。考察了适宜的反应条件、光谱特征及方法的灵 敏度和选择性。研究结果表明：在o 2 0 o 8 0m g l 1 的浓度范围内，环丙沙星的浓度与 r r s 强度成正比( f = 0 9 9 9 3 ) ；其检出限( 3o ) 为3 5 o g l 1 ，测定的r s d 为2 0 ( 浓 度为0 4 0m g l 1 ，n = 1 1 ) 。方法可用于某些药物中环丙沙星的测定。 关键词：纳米金；半胱氨酸；6 苄胺基嘌呤；环丙沙晕；探针 1 i 一 1 东北大学硕士学位论文 a b s t r a c t r e s o n a n c e r a y l e i g hs c a t t e r i n gm e t h o d v i a n a n o - g o l d f o rt h ed e t e r m i n a t i o no f l c y s t e i n e ， 6 b e n z y l a m i n o p u r i n ea n dc i p i 0 n o x a c i no - j ，e n z v i a m l n 0 d u r l n ea n nl ：1 1 ) i 0 1 1 0 x a c l n a b s t r a c t r e c e n t l y ，a san e w 柚a l ”i c a lt e c l l l l i q u e ，r e s 彻觚c cm y l e i g hs c a t t e r i n g ( r r s ) m e t h o dh 弱 a t t r a c t e dm o r ea t t e n t i o n 锄di n t e r e s t so f 锄a l y t i c a ls c i e n c ef o ri t sf c m a r k a b l ec h a r a c t e r i s t i c so f h i g l ls e n s i t i v i t y 锄ds i m p l i c i t y g o l dn 猢p a n i d e ，i e n 卸o g o l d ，s h o wm u c hp o t e n t i a la p p l i e d v a l u eb e c a u s e0 ft l l e i rs p e c i a lp h y s i c a l 孤dc h e m i c a lp r o p e n i e s a tp r e s e n t ，i th 弱b e e n w i d e l y 印p l i e dt op h y s i c s ，c h e m i s t 彤b i o l o g y o p t i c s ，e l e c t r 伽i c s ，m e d i c a t i o n 觚dd i i l i cm e d i c i l l e k t h i s s t u d y r r ss p e c t m0 ft h ei n t e 豫c t i o no f 9 0 l dn 卸0 p a n i d e w i t h l c y s t e i l l e ， 6 一b e i l z y l 锄i n o p u r i n e 锄dc y c l o p r o p 柚ew e r c i l l v e s t i g a t e d t h es p e c 仃a lc h a f a c t e f i s t i c s ， a 骶c t i n gf a c t o r s ，p r o p e n i e so fn a n o g o l dc o n j u n c t sw i t l lt h et h r c el 【i n d so fm a t t e ra n dt h e i f 觚a l y t i c a l 印p l i c a t i o n sh a v eb e e ns t u d i e d ，a n dt h r e er r sm e t h o d sf o ft h e i rd e t e m i n a t i o n w e r ed e v e l o p e d ，r c s p e c t i v e l y t h em e r i t sa r ca sf o l l o w i n g ： h lt h eb r ( b r i t t o n - r o b i n s o n ) b u 虢rs o l u t i o no fp h3 3 ，g o l dn 锄o p a n i c l e 卸dl c y s t e i n e r e a c tw i t he a c ho t h e rt of 0 珊ab i n d e dc o n j u n c tw i t hb i g g e rv o l u m eb yt h ee l e c t f o s t a t i c a t t r a c t i o ni n t e r a c t i o n ，w h i c hm a k et h ed i 锄e t e r s0 ft h ep a n i c l e si n c r e a s e dm a r k e d l y ，t h e r e f 研e ， t h er r s i n t e n s i t yc 觚b ce n h 柚c e d 胖a t l y - t h em a 】【i m u mr r sp e a ki sa t3 8 9l 瑚锄d 柚o t h e r p e a l ( a t3 6 2 姗n er r si n t e n s i t yi sd i r e c t l yp r o p o n i o n a l t ot h ec o n c c n t r a t i o no fl c y s t e i n e i nt h e 啪g eo f0 0 4 0 2 0m g l ( r = o 9 9 9 0 ) u n d e rt h eo p t i m u mf e a c t i o n n d i t i o n s ，a d e t e c t i o nl i m i t0 f6 5 g l 1 i ，c y s t e i n ea tas i g n a l t on o i s em t i o0 f3w 弱0 b t a i n e dw i t ht h e r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) o f2 0 ( 0 0 8m g l 1 ，n = 1 1 ) m e a n w h i l e ，t h em e t h o d s h o w e dag o o ds e l e c t i v i t y0 v e rt h ec o - e x i s t i n ga m i n oa c i d s t h e r e f o r c ，ar r sm e t h o df o rt h e d e t e n n i n a t i o no fl j c y s t e i n ew i t h9 0 l dn a n o p a n i c l ep r o b ew a sd e v e l o p e d h lb rb u 骶rs o l u t i o nw i t hp h3 0 ，g o l dn a n o p a n i d e si n t e r a c t e dw i t h6 b e n z y l a m i n o p u r i n e t of 0 姗t h ea g 伊e g a t i o no fb i g g e rv o l u m eb yt h ee l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o n 卸dh y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n i tm a d et h ed i a m e t e r so ft h ep a n i c l e si n c r e a s e dm a r k e d l y ，s ot l l a tt h er r s i n t e n s i t yw a s 黟e a t l ye n h a n c e da n dan e wr r ss p e c t n l mw a so b s e n ，e d t h e r ci sap c a l 【b a n d b e 觚e e n3 0 0n m 柚d4 2 0n m t h em a x i m u mr r sp e a ki sa t3 8 8 啪强dt h e f ei sa n o t h e r o b v i o u ss c a t t e r i n gp e a l 【a t3 7 1n m t h e0 p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h er e a c t i o n ，t h ee f f e c t0 f c o e x i s t i n gs u b s t 柚c e sa n dt h es e n s i t i v i t yh a v eb e e ns t u d i e d u s i n gt h eo p t i m u mp a r a m e t e r s ， t h e r e l a t i v e r r s i n t e n s i t y i s d i r e c t l yp r o p o n i o n a l l ot h ec o n c e n t r a t i o no f 6 一b e n z y l a m i n o p u f i n ei nt h er a n g c0 f2 0 4 8 o g l 1 ( r = o 9 9 8 6 ) b a s e0 nl h i sr e s u l t ，an e w r r sm e t h o df o rt h ed e t e 姗i n a t i o no f 昏b e n z y l a m i n o p u r i n ew a sd e v e l o p e d t h ed e t e c t i 咖 l i m i to f1 4n g l 16 一b e n z y l a m i n o p u r i n ew a so b t a i n e dw i t ht h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n 1 1 1 东北大学硕士学位论文a b s t r a c t ( r s d ) o f1 7 ( 4 0 0 g l - 1 ， n = 1 1 ) t h i sm e t h o dw a s a p p l i e d t od e t e 彻i n et h e 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n ei nm sc u l t u r em e d i u ms a m p l ew i t hs a t i s f a c t o r vr e s u l t s i l la c i d i cb rb u 虢fs o l u t i o no fp h3 4 ，擘r o l dn a n o p a r t i c l e sa n dc i p r o f l o x a c i nr e a c t e dw i t h e a c ho t h e rt of o 姗ab i n d i n gc o n j u n c tw i t hb i g g e rv o l u m e ，w h i c hm a d et l l ed i a m e t e r so ft h e p a n i c l e si n c r e s e n e d0 b v i o u s l y ，t h e r e f o r e ，t h er r si n t e n s i t yw a se i l l l a l l c e d 伊e a t l y 柚dan e w r r ss p e c t m mw a so b s e n ，e d t h em a x i m u mr r s p e a l 【i sa t3 6 1n ma n dt h e r ca r es 0 m eo t h e r o b v i o u ss c a t t e r i n gp e a k sa r ea t3 8 9n ma n d 4 2 2n m i nt h i ss t u d y ，3 6 1n mw a ss e l e c t e df o r t h e m e a s u r e m e n t0 fr r si n t e n s i t y t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h er e a c t i o n s ，m er r ss p e c t r a l c h a i a c t e r i s t i c sa n dt h es e n s i t i v i t vw e r er e s e a r c h e da n dar r sm e t h o df o rt h ed e t e m i n a t i o no f c i p r o n o x a c i nw a sd e v e l o p e d t 1 l er e l a t i v er r si n t e n s i t yi sd i r e c t l yp r o p o r t i o n a lt 0t h e c o n c e n t r a t i o no fc i p r o n o x a c i ni l lt h em g eo fo 2 0 0 8 0m g l 1 ( r = 0 9 9 9 3 ) t 1 l ed e t e c t i o n l i m i to f3 5 o g l - 1c i p f o n o x a c i nw a so b t a i n e dw i t ht h ef e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) o f i s2 o ( o 4 0m g l 1 ，n = 1 1 ) t 1 l ep r o p o s e dm e t | l o di ss u c c e s s f u l l yu s e dt od e t e 珊i n e d p r o n o x a d ni nt a b l e tb yr r s w i l hg o l dn a i l o p a r t i c l ep f o b e k 沁y w o r d s ：n 柚o g o l d ；l c y s t e i n e ；6 一b e n z y l a m i n o p u r i n e ；c i p r o n o x a c i n ；p r o b e i v 东北大学硕士学位论文目 录 目录 独创性声明i 摘要i i a b s t r a c t i i i 第一章绪言1 1 1 金纳米微粒概述。1 1 1 1 金纳米微粒及其制备l 1 1 2 金纳米微粒在分析化学中的应用2 1 2 共振瑞利散射技术概述6 1 2 1 共振瑞利散射技术6 1 2 2 共振瑞利散射光谱在分析中的应用研究9 1 3 半胱氨酸概述1 0 1 3 1 半胱氨酸。1 0 1 3 2 半胱氨酸的分析现状1 1 1 46 苄胺基嘌呤概述1 3 1 4 16 苄胺基嘌呤1 3 1 4 26 苄胺基嘌呤的分析现状1 3 1 5 环丙沙星概述1 3 1 5 1 环丙沙星1 3 1 5 2 环丙沙星的分析现状1 4 1 6 本项研究的目的和意义1 6 第二章纳米金作探针共振瑞利散射法测定半胱氨酸1 7 2 1 试剂1 7 2 2 仪器一1 7 2 3 实验方法1 7 2 3 1 金纳米微粒的制备1 7 v 东北大学硕士学位论文目录 2 3 2 半胱氨酸的测定。1 8 2 4 结果与讨论1 8 2 4 1 纳米金与半胱氨酸作用的共振瑞利散射光谱1 8 2 4 2 适宜的反应条件1 9 2 5 分析应用2 2 2 6 小结。2 2 第三章纳米金作探针共振瑞利散射法测定6 一苄胺基嘌呤2 3 3 1 试剂。2 3 3 2 仪器2 3 3 3 实验方法2 3 3 3 1 金纳米微粒的制备2 3 3 3 2 共振瑞利散射( r r s ) 的测定2 3 3 4 结果与讨论2 4 3 4 1 纳米金与6 一苄胺基嘌呤作用的共振瑞利散射光谱2 4 3 4 2 适宜的反应条件2 5 3 5 分析应用2 8 3 6 小结一2 8 第四章纳米金作探针共振瑞利散射法测定环丙沙星3 0 4 1 试剂3 0 4 2 仪器3 0 4 3 实验方法3 0 4 3 1 金纳米微粒的制备3 0 4 3 2 环丙沙星的提取3 0 4 3 3 环丙沙星的测定一3 1 4 4 结果与讨论3 1 4 4 1 纳米金与环丙沙星作用的共振瑞利散射光谱一3 1 4 4 2 适宜的反应条件3 2 4 4 3r r s 强度与环丙沙星浓度的关系3 4 v 1 东北大学硕士学位论文 目 录 4 5 分析应用一3 5 4 5 1 方法对照3 5 4 5 2 实验结果3 6 4 6d 、结。3 6 第五章结论3 7 参考文献3 9 致 射4 9 一v l i 东北大学硕士学位论文第一章绪言 第一章绪言弟一早强苗 在宏观领域和微观领域之间的介观领域一即纳米尺度范围内进行研究的纳米科技 成为近年来研究的热点，开辟了人类科学研究的一个全新层次。由于纳米粒子的小尺寸 效应、界面效应和量子效应等，使其在许多领域得到广泛的应用f h l 。而就纳米颗粒在 分析化学中的应用研究方面而言，纳米金占有十分重要的位置，其中金纳米微粒作为光 谱探针与生物大分子的相互作用已经成为一个持续性的研究热点。 共振瑞利散射( r e s o n 锄c cr a y l e i 曲s c a t t e r i n g ，r r s ) 作为一种新的分析技术，因其 具有较高的灵敏度和简易性而受到人们的重视。随着共振瑞利散射分析技术和纳米粒子 在分析化学中应用研究的不断深入和发展，人们发现纳米微粒及其与某些有机化合物和 生物大分子的反应产物表现出一些独特的r r s 光谱特征和分析化学性质【6 】，这既为利用 这种光谱技术研究和表征纳米微粒创造了条件，也为纳米微粒在r r s 中的分析应用提 供了可能。这是本文的主要研究背景。 1 1 金纳米微粒概述 1 1 1 金纳米微粒及其制备 金纳米微粒是一种最为稳定的纳米粒子，是金原子在纳米尺度的聚集体，它具有很 多优点。制备方法成熟、简单。到目前为止，已经发展了许多制备金纳米微粒的方法， 总体上可分为物理方法和化学方法。 1 1 1 1 物理法 ( 1 ) 真空蒸镀法1 7 l ：用真空蒸发、激发、加热、电弧高频感应等方法使金原子气化或形 成等离子体，然后骤冷使之凝结，便可得到纳米尺寸的金微粒。 ( 2 ) 激光消融法：m a f t l r e 等【8 】用激光烧蚀在十二烷基磺酸钠水溶液中的金盘以获得金纳 米微粒。在制备过程中要使用表面活性剂以阻止金纳米微粒重新聚集。实验发现， 随着表面活性剂的浓度增加，金纳米微粒的直径变小。当表面活性剂的浓度超过1 0 - 2 m 0 1 m 一，就能形成稳定的金纳米微粒。直径大于5n m 的金纳米微粒可用5 3 2n m 的 激光粉碎成粒径为1 5n m 金微粒。 ( 3 ) 磁控溅射法【9 】：在有适量氩气的真空中，在磁控溅射电极之间施加一定的电压，即 会产生辉光放电等离子体，氩气被电离，产生气体离子并高速撞击金，使会表面原 子脱离而飞溅出来，沉积在单晶盐片衬底上形成金团簇纳米颗粒。 东北大学硕士学位论文第一章绪言 1 1 1 2 化学法 ( 1 ) 溶液还原法：此法通常是在含a u ( i i i ) 的溶液中加入还原剂，金离子被还原而聚集 成纳米金微粒。1 9 7 3 年，f r e n s 【1 0 】采用柠檬酸钠制备出尺寸在1 6 1 4 7n m 连续变化 的金纳米微粒。还有一些其它的还原剂如没食子酸【1 1 】、紫花苜蓿生物质【1 2 l 、丝素 蛋白剧1 3 1 、葡萄糖【1 4 l 、抗坏血酬1 蜘、鞣酸【1 6 l 等。 ( 2 ) 晶种法：晶种法制备金纳米微粒分为两步，第一步是采用强还原剂将a u ( i i i ) 还原成 小的金纳米微粒作为晶种；第二步是在另一份含有a u ( i i i ) 的溶液中，用较弱的还原 剂使a u ( i i i ) 还原为a u ( i ) ，再与晶种溶液混合，使a u ( i ) 在晶种上进一步 被还原为纳米金微粒。利用此法容易得到不同形状、尺寸可控且均一的纳米金微粒。 b r o w n 【1 7 l 以1 2n m 的胶体金为晶种，加入适量的氯金酸和羟胺，利用金纳米微粒表 面的自催化反应使晶种逐渐长大，控制条件可制得3 0 1 0 0n m 的纳米金微粒。朱梓 华等f 1 8 l 在b r o w n 方法的基础上，进一步扩大了粒径的控制范围，制得了粒径为6 0 1 6 0n m 的一系列单分散金纳米粒子水溶胶。 ( 3 ) 胶束与反胶束法：该法也叫微乳液法。当表面活性剂浓度较大时，表面活性剂分子 或离子自动缔合成胶体大小的质点，并与溶液离子之间处于平衡状态，这种在溶液 中形成的聚集体叫做胶束。而当表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，在非极性有 机溶剂中形成的胶束叫做反胶束。采用反胶束法制备的纳米金微粒表面包裹有一层 表面活性剂，可以有效地阻止纳米金微粒的聚集，使得分散性比较好。c h i a l l g 等【1 9 】 报道了在a 叩，【s p 柚8 0 】i s o o c t 卸e 反向胶束中用硼氢化钠还原氯金酸制得纳米金微 粒。e s u m i 等【2 0 l 报道了在2 一乙烯基吡啶调聚物的存在下，在水中用硼氢化钠还原氯 金酸制备纳米金微粒。s h e n 等【2 1 1 在庚烷乙醇的微乳液中用微波照射地c 1 4 制得粒 径为3 6n m 的纳米金微粒。 ( 4 ) 模版法：此法是以有微孔结构的基质为模版，在其微孔中制备纳米金微粒。该法通 过合成适宜尺寸和结构的模版，可以获得所期望的窄粒径分布、粒径可控、易掺杂 和反应易控制的纳米金微粒。w a i l g 等【2 2 1 以4 一吡啶酮的树枝状高分子材料为模版， 采用液一液相转移反应的方法制备了纳米金微粒。 1 1 2 金纳米微粒在分析化学中的应用 1 1 2 1 用于检测金属离子 n a + 和k + 都是血清中存在的碱金属离子，其浓度的高低对各种生理活动都有重要的 影响，对其进行定量检测的方法也较多。b o h r e r 等1 2 3 l 以聚乙烯作为吸附剂在线去除血液 中的蛋白，用高效液相色浒法测定了血清中的n a + 、k + 。“n 等1 1 4 l 住纳米金微粒表面修 一 东北大学硕士学位论文第一章绪言 饰巯烷基衍生物的1 5 一冠_ 5 ，通过1 5 一冠一5 的超分子作用与k + 形成2 ：1 夹心式结构， 建立了通过凝聚反应测定血清中k + 的新方法。研究表明冠醚对碱金属离子具有选择性 识别，溶液中存在的其它碱金属离子和碱土金属离子对检测均没有影响。也有入利用2 ， 9 一二丁基一5 ，6 一二正巯乙基邻二氮菲与u + 形成夹心结构的性质检测污染物中的 i j + 【2 5l 。l ( i m 等1 2 6 】利用羧基与p b “、c d 2 + 、h 孑+ 形成2 ：1 配位化合物的特性建立了简便快 速的方法检测环境水污染物中的p b 2 + 、c d “、h 孑+ ，最近利用羧基与c u 2 + 的配位作用， 在电极表面捕捉金纳米探针，建立了电化学法检测c u 2 + 的方法【2 刀。许鑫华等【冽改进了 活细胞内游离钙离子浓度的测定方法，即用惰性基体纳米微粒包埋荧光材料，将荧光纳 米微球转运进细胞，用于细胞内游离钙离子浓度的实时测定。该方法与传统方法相比， 染料不易泄漏，不会出现分室现象，不易光漂白，是一种非常有实用价值的测量活细胞 内游离钙离子浓度的方法。 1 1 2 2 在生物传感器中的应用 ( 1 ) 基于纳米金的表面等离子体共振( s p r ) 效应的光学检测技术 金纳米粒子聚集后粒子间距减小，将导致表面等离子体传播( s u m c ep l a s m o n p o l 撕t o n ，s p p ) 模式和传播特性的改变以及局域表面等离子体( 1 0 c a l i z e ds u 血c cp l a s m o n ， l s p ) 模式和s p p 模式的相互作用。这种相互作用同时也受到外界环境介电特性的影响 【2 9 j ，以致出现吸收光谱发生蓝移等现象。e l g l l 锄i 觚等【3 0 l 根据这种特性采用直接的颜色 检测法来分析寡聚核苷酸的杂交特性，他们还通过改变温度，造成生物分子变性，观察 到原先聚集的纳米粒子的重新分散，证明纳米金一生物分子聚集过程的可逆性。而从经 典的s p r 检测的角度考虑，由于纳米金属颗粒可以结合更多的生物大分子，使得单位面 积质量变化增大，导致折射率变化增大。所以l v o n 等1 3 l 】采用纳米金或纳米金标记的生 物大分子来修饰金膜，构造s p r 检测系统的敏感薄膜，从而检测到具有较大偏移的反射 波谷，达到对s p r 信号的放大作用。由于纳米金属颗粒造成光散射，这种等离子体的散 射特性又是和外周紧邻介质的介电常数相关的，所以其散射谱也可以用来描述表面局部 的介电常数变化。日本的h i m m e l h a u s 等1 3 2 1 采用漫反射结构的检测系统所得到的研究结 果进一步表明：金属粒子所产生的等离子体可以增强其表面周围环境的电场。这种增强 的电场和周围的环境发生相互作用，可以明显地改变共振粒子和周围环境的散射谱特 性。例如，表面增强拉曼光谱( s e r s ) 就是利用局域化的等离子体共振来增强其散射 特性1 3 3 3 4 l 的。胶体金对s p r 的增强作用在一个三明治夹心结构【3 5 l ( 见图1 1 ) 中得到 应用，右旋糖酐经n h s 活化后，一端与金相连，另一端与氨化的d n a 相连，形成靶分 子，与被寡核苷酸修饰的金纳米粒子杂交，增强了s p r 的信号，达到提高d n a 检出限 东北大学硕士学位论文第一章绪言 的目的。 歹歹 a u g l 锺s s 图1 1 三明治夹心结构 f i g 1 1s 锄d w i c hs 咖c t u r c ( 2 ) 基于纳米金标记物介电特性的检测技术 纳米金作为光学标记在免疫检测领域已经获得了广泛的应用。最近的研究发现纳米 金不仅是非常好的光学标记物，也许更能成为免疫检测中很好的电学标记物。纳米金中 的金是非常好的导电材料，而在纳米金免疫检测过程中出现的纳米金的大量聚集，必定 会使体系的电导增强，从而使通过电导检测免疫反应成为可能【刈。最近科学家开始注意 纳米金介电特性的应用。如p a r k 等1 3 7 j 研究表明，结合了纳米金的寡聚核苷酸，在发生 特异性结合反应后，含有纳米金的颗粒薄膜导电性发生很大变化，对这样的体系同样还 可以采用a g n 0 3 增强。检测下限可达5 1 0 书m 0 1 l - 1 。类似地，尉m 等【3 8 】通过交流电 导法检测了在交叉电极上的纳米金标记的免疫凝聚物，从而实现对经典纳米金免疫层析 法的电学检测，并且通过在纳米金上包被导电聚合物聚苯胺，提高交流电导法测定金标 免疫反应的灵敏度。研究表明电导值的大小与纳米金标记抗体的浓度在一定范围内有很 好的线性关系。s y v a n e n 等【3 9 j 认为，这种纳米金电检测的思路无疑是一种简便有效的解 决方案，但还存在一定的问题，比如检测下限还有待降低、检测电路设计有待进一步优 化等。 g o n z a l e z g a r c i am b 等【4 0 4 2 l 把纳米金作为电化学标记物。其中纳米金直接作为电化 学反应物质，参与氧化还原反应。其电化学过程为： 4 东北大学硕士学位论文第一章绪言 妊 ，。- 一 每 a u + 4a _ a u a 2 + 3e ( 1 2 5v ) a m c l 2 - + 3e 叶a m + 4c r ( o 4 3v ) 研究者采用碳糊电极吸附生物素化的牛血清白蛋白，并与标记有纳米金的亲和素进 行免疫反应。在0 1m o l l - 1 的盐酸溶液中，对修饰电极应用极化电位1 2 5v 进行氧化， 然后进行伏安扫描。检测还原峰电流。研究表明，峰电流的大小与纳米金颗粒的浓度有 很好的线性关系。 ( 3 ) 基于纳米金催化性质的检测技术 随着纳米金直径减小，比表面积增大，表面原子数增多及表面原子配位不饱和性增 强导致大量的悬键和不饱和键等，使得纳米金具有很大的生物活性和很好的催化作用， 并且提高化学反应的选择性。因为金的氧化还原电位为+ 1 6 8 v ，有极强的夺电子能力。 对于那些有氧化还原电位较小的生物大分子参加的生化反应，具有很强的催化作用，能 明显提高生物大分子的活性。因此也可以通过对生物大分子活性的变化测定纳米金标记 抗体的浓度。例如应用纳米金增强葡萄糖氧化酶( g o d ) 的活性【4 3 删。研究发现，当颗 粒小到一定程度时，g o d 分子与纳米金能够发生电子传递，进而影响g o d 催化能力。 所以纳米金修饰的葡萄糖氧化酶可以增强酶的催化活性，提高灵敏度。江丽萍等i 掣利用 金纳米颗粒与明胶一起固定g o d ，大幅度地提高了固定化酶的催化活性，制得具有纳 米增强效应的葡萄糖传感器。 蜘二 ( 4 ) 基于纳米金高密度特性的检测技术 嫩7 由于纳米金密度比较大，金标记的抗体抗原与相应的抗原抗体结合后，复合物的 质量有较大的变化，可以用来提高石英晶体微天平( q c m ) 、声表面波( s a w ) 等生物 传感器的灵敏度l 删。虽然目前的研究对于这种灵敏度的提高还只是停留在2 3 倍，但 是由于纳米金标记抗体可以形成分子量巨大的复合物，使得提高检测灵敏度还具有很大 的潜力。 1 1 2 3 在蛋白质检测和免疫分析中的应用 蛋白质是生命活动的执行者，负责完成生物体所需的各种功能。蛋白质的分析一直 是生命科学中的重要课题。随着人类基因组计划的基本完成，蛋白质组研究的计划已经 启动。因此，研究普遍适应性好、操作简便、灵敏度高的蛋白质检测技术已f 1 益迫切。 抗体作为一种特殊的蛋白质，广泛地存在于人的免疫系统中，在疾病控制中起着举足轻 重的作用。免疫分析在生物化学、分子生物学、生物技术和临床诊断等各个领域具有很 大的发展潜力。金纳米粒子由于其独特的优势，在蛋白质检测和免疫分析中的应用越来 东北大学硕士学位论文 第一章绪言 越受到研究者的重视。 蛋白质修饰的金纳米粒子在生物分析技术中已得到广泛的应用。金纳米粒子标记蛋 白质的原理一般认为是由于p h 值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性， 此时蛋白质分子与金纳米粒子相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最 大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金纳米粒子的表面。由于蛋白质分子牢固地 结合在金纳米粒子表面，形成一个蛋白层，阻止了金纳米粒子的相互接触，使纳米金处 于稳定状态。金纳米粒子探针可用于定量标记生物体的抗原位点。常规电子显微镜能够 观测到金纳米粒子的最小半径为1 4 舳，当共价连接到抗体时有7n m 的空间分辩率。 在组织学上，用表面吸附有抗体分子的金纳米粒子( 1 0 4 0n m ) 特异性标记生物样品， 对生物样品的不同区域进行标记、分析，而微小的金晶体( 0 8n m 或1 4n m ) 可以通过 位点特异性标记生物大分子m 。c u 撕s e 等【4 8 】基于在一定p h 值条件下金纳米粒子与蛋白 质结合后共振光散射强烈增强的原理，建立了微量蛋白质的检测方法。该方法具有很高 的灵敏度，并且实验操作快速方便，干扰因素少，适合普通实验室的检测研究。如果把 目标多肽链两端修饰上半胱氨酸，使金纳米粒子通过多肽链自组装起来，可导致金纳米 粒子溶液的颜色由粉红色变为蓝色。在有对目标多肽序列选择性水解的蛋白酶存在的条 件下，多肽链被切断，金纳米粒子不能聚集而保持单分散状态，颜色不变，由此可指示 出该蛋白酶的存在【4 9 】。 金纳米粒子在免疫分析中一般作为标记物来指示免疫反应的发生。金纳米粒子在固 相免疫中应用最早。利用金纳米粒子标记二级抗体并与结合在支持表面吸附的一级抗体 上的抗原结合，达到检测抗原的目的，俗称“三明治 法。然后，通过对金纳米粒子的 分析来获取免疫反应的信息。用瑞利散射技术监测免疫反应导致的金纳米粒子聚集体， 可检测出1 0m g l - 1 的抗原。比紫外可见光度法检出限低一个数量级【5 0 1 。用表面增强拉 曼散射技术还可检