（神经生物学专业论文）间歇性低氧对新生小鼠空间学习记忆的影响.pdf

g cg rs g km w mo fc n sm rn f r , bmn c a mi h百u c o c o r t i c o i d中英文缩略糖皮质激素g l u c o c o r t i c o i dr e c e p t o r糖皮质激素受体s e r u ma n dg h c o c o r t i c o i dr e g u l a t e dp r o t e i nk i n a s e血清糖皮质激素诱导激酶m 0 r r i sw a t e rm a z eo p e n - f i e l dc e n t r a ln e u r a ls y s t e mm i n e r a lr e c e p t o rn u c l e a rf a c t o r - r bl o n g - t e r mp o t e n t i a t i o n水迷宫开放场中枢神经系统盐皮质激素受体核因子一1 c b长时程增强电位n e u r a lc e l la d h e s i o nm o l e c u l e神经细胞粘附分子i n t e r m i t t e n th y p o x i a间歇性低氧中文摘要低氧影响动物的学习记忆行为，当低氧强度过大或时间过长时这种影响往往是一种损伤，而适度的低氧对学习记忆产生促进作用。有人认为这是因为低氧激活h p a 轴，诱导糖皮质激素( g l u c o c o r f i c o i d ，g c ) 的释放。适量的糖皮质激素会促进长时程增强电位o o n g - t e r mp o t e n t i a t i o n ，l t p ) 的形成，从而促进学习记忆。本文在实验室条件下用低压氧舱模拟海拔2 k m ( 1 6 o 0 2 ；p a 0 2 ，6 0 m m h g ) 和5 k m ( 1 0 8 0 2 ：p a 0 2 ，4 1 m m h g ) 高原低压低氧环境，观察了出生后间歇性低氧( 4 小时天) 暴露对小鼠空间学习记忆的影响。用水迷宫( m o m sw a t e rm a z e w m w ) 测试小鼠的空间学习记忆能力，同时检测血浆中g c 和雌性小鼠雌激素的浓度，用r t - p c r 和w e s t e r nb l o t 检测糖皮质激素受体( g t u c o e o r t i c o i dr e c 印t o r ，g r )和血清糖皮质激素诱导激酶( s e r u ma n dg l u c o c o r t i c o i dr e g u l a t e dp r o t e i nk i n a s e ，s g k ) m r n a 和蛋白表达情况。结果：1 、和对照组( 设为海平面，2 1 0 0 2 ) 比较，出生后3 周和4 周2 k m 和5 k m 间歇性低氧显著地缩短了雄性小鼠( 出生后3 6 至3 9 天，p 3 6 3 9 ) 在水迷宫中寻找站台的路程。在新生雌性小鼠中，发现间歇性低氧2 k m2 周和4 周显著延长了水迷宫中寻找站台的路程。在雄性和雌性第4 0 天的记忆保持测试中，低氧组和对照组相比无显著差异。2 、间歇性低氧4 周可以显著提高新生小鼠在出生后第2 8 天海马中g r 和s g k的表达，但是在出生后第4 j 0 天时，海马中g r 和s g k 基因和蛋白表达降低。和对照组相比，间歇性低氧5 k m1 周、2 周血浆皮质酮水平显著升高。3 、间歇性低氧抑制新生小鼠的体重增加，但是随着低氧的结束，这种抑制作用逐渐消失。以上结果提示。鼢1 、间歇性低氧促进新生雄性小鼠的空间学习记忆，并对雌性小鼠的空间学习记忆，这种促进或者损伤是和出生后低氧暴露的时间相关的。2 、间歇性低氧影响了新生小鼠海马中s g k 和g r 的表达，同时激活了h p a 轴，提示s g k 和g r 可能参与了低氧对空间学习记忆的促进或损伤作用。3 、低氧抑制新生小鼠体重的增重，没有发现和空间学习记忆有相关性。2创新性：本研究首次揭示了模拟海拔2 k m 和s k i n 间歇性低氧3 周和4 周能够促进雄性新生小鼠的空间学习记忆能力；这种促进作用和海马中的g r 和s g k 的蛋白和基因表达的上调相关；研究同时发现模拟海拔2 k m 间歇性2 周和4 周低氧损伤了雌性新生小鼠的空间学习记忆。a b s t r a c ts t r e s sc a na f f e c tt h ea n i m a l s l e a r n i n ga n dm e m o r yb e h a v i o r h e a v ys t r e s sw i l li m p a i rl e a r n i n ga n dm e m o r y ，w h i l em o d e r a t es t r e s sh a sa ni m p r o v e m e n te f f e c t g l u c o c o r t i c o i d s ，s u c ha sc o r t i c o s t e r o n e ，a r e r e l e a s e db yt h ea d r e n a lc o r t e xi nr e s p o n s et oaw i d er a n g eo fs t r e s s o r sa n dr e l a t e dw i t hl e a r n i n ga n dm e m o r y t h e s en o t a b l yb i n dt om i n e r a l c o r t i c o i da n dg l u c o c o r t i c o i dr e c e p t o r s ( m r sa n dg r s ) i nt h eh i p p o c a m p u s ，w h i c hi si n v o l v e di nt h ep r o c e s s i n go fs p a t i a la n dc o n t e x t u a li n f o r m a t i o n t h ee f f e c t so fs t r e s sa n dg l u c o c o r t i c o i d so nh i p p o c a m p u s - d e p e n d e n tl e a r n i n gf o l l o wa l li n v e r t e du s h a p e dd o s e r e s p o n s er e l a t i o n s h i p ；e x t r e m el o wa n dh i g hl e v e l sm a yi m p a i rc o n s o l i d a t i o n ，w h e r e a sm o d e r a t ea c t i v a t i o ns e e m st ob eap r e r e q u i s i t ef o rt h el o n g - t e r ms t o r a g eo fi n f o r m a t i o n s g k ( s e r u ma n dg l u c o c o r t i c o i dr e g u l a t e dp r o t e i nk i n a s e ) w h i c hi sak i n do fk i n a s es t i m u l a t e db yg l u c o c o r t i c o i dc a nr e g u l a t em a n yi o n i cc h a n n e l sa n dh e l p f u lt on e u r o n ss u r v i v a la n da x o nr e g e n e r a t i o n s o m er e s e a r c h e sn a r r a t e dt h a ts g kh i i g he x p r e s s i o nc a ni m p r o v es p e c i a ll e a r n i n ga n dm e m o r y t h ep r e s e n ts t u d yi sd e s i g n e dt od e t e c th o wi n t e r m i t t e n th y p o x i a ( m ) a f f e c t sm i c el e a r n i n ga n dm e m o r yw h e nm i c ew e r ee x p o s e dt oi h m i c ew e r ee x p o s e dt oas i m u l a t e dh y p o b a r i ch y p o x i a ，b yt h ew a yo f4 w d a y ，a n ds e ta ta r o u n da l t i t u d eo f2k m( 1 6 0 0 2 ；p a 0 2 ，6 0 m m h g ) o r5k m ( 1 0 8 0 2 ；p a 0 2 ，4 1 m m h g ) s p a t i a ll e a r n i n ga n dm e m o r ya b i l i t yw a st e s t e di nt h em o m sw a t e rm a z e ( m w m ) g l u c o r c o r t i c o i da n dg ra n ds g kw e r ed e t e c t e d r e s u l t s1 、c o m p a r e dw i t hc o n t r o l s ( s e ta ts e al e v e l ，2 1 0 2 ) ，p o s t n a t a li h - 3 wa n di h _ 4 wa t2k r aa n d5k ms i g n i f i c a n t l yr e d u c e dt h el e n g t ht ot h ep l a t f o r mo fm a l em i c ea tp o s t n a t a l d a y ( p ) 3 6 ( p 3 6 ) - p 3 9 i n m w m t a s k ，w h i l e i n f e m a l e g r o u p s ，i h2 w a n d4 wa t2 k mi n c r e a s et h el e n g t ht ot h ep l a t f o r m t h e r ei sn oc h a n g ei nt h er e t e n t i o nt e s ta tp 4 0o fm a l ea n df e m a l em o u s e 2 、a f t e ri hf o r4w e e k s ，t h eg i v g r m r n ae x p r e s s i o ns i g n i f i c a n t l yi n t e n s e d e p e n d e n t l yi n c r e a s e di np 2 8m i c e sh i p p o c a m p u s ，w h i l ed i dn o ti np 3 5m i c e t h es g k s g k m r n ae x p r e s s i o nw a ss i g n i f i c a n t l yu p r e g u l a t e di nb o t hp 2 84a n dp 3 5m i c e 3 、i hh a v ean e g a t i v ee f f e c to nt h en e o n a t a lm i c eb o d yw e i g h ti n c r e a s i n g b u tt h i sn e g a t i v ee f f e c td i s a p p e a r e df e wd a y sa f t e ri h c o n c l u s i o n1 、n e o n a t a le x p o s u r et oi n t e r m i t t e n th y p o x i ae n h a n c e do rd e p r e s s e dm i c es p a t i a ll e a r n i n ga n dm e m o r y w h i c ha l er e l a t e dt ome x p o s u r et i m e 2 、i hc a ni n c r e a s eg ra n ds g ke x p r e s s i o ni nh i p p o c a m p u sa n ds t i m u l a t eh p aa x i s ，s u g g e s t i n gt h a ts g ka n dg rm a yr e l a t et ol e a r n i n ga n dm e m o r yb e h a v i o r 3 、b o d yw e i g h tw a si n h i b i t e db ym b u ti tw a sn o tr e l a t e dt ot h es p a t i a ll e a r n i n ga n dm e m o r y 5第一章前言在日常生活中，人们在高原旅游、科学考察或者居住时，会面临不同程度的低氧。同时，现代人由于生活紧张、心理压力增加、恐惧等心理反应以及心一脑、心一肺等疾病，也会面临低氧应激。据w h o ( 1 9 9 6 ) 的统计报告，全世界居住在海拔2 5 0 0 m 以上的人数为1 4 亿，其中亚洲占5 6 。低氧在体育训练方面有很多应用，被认为能够提高运动员的成绩。在认知方面，低氧对动物的学习记忆能力的影响是倍受学者所关注的，以前的研究多认为低氧损伤学习记忆能力，但是我们的研究表明适度的低氧暴露是有利于空间学习记忆能力的，这是因为不同的低氧方式、强度以及动物暴露于低氧应激的发育阶段对学习记忆的影响不同。低氧对认知的影响研究表明低氧能够影响动物和人类的认知功能。早在1 9 7 1 年，有人报道登山运动员在回到平原后，会出现类似于急性器质性脑部综合症的症状以及记忆力减退。实验研究中，成年大鼠暴露低氧( 5 5 0 0 、5 9 5 0 和6 4 0 0 米) 显著损害动物在m o r r i s水迷宫中的空间记忆( s h u k i t h a l ee ta 1 ，1 9 9 4 ) 。连续7 天暴露于( 5 5 0 0 或6 0 0 0米) 低氧，发现低氧严重影响爬杆实验中习得的速度( 隋建峰等，2 0 0 2 ) 。对出生后7 天的大鼠给予模拟海拔5 k m 的低压低氧( 1 2 x 时天，连续2 8 天) 及胎鼠在母体妊娠1 0 一1 7 天进行3 5 0 0 米低氧暴露，第3 5 天行为测试发现两组动物爬杆实验中习得的速度减慢，消退速度加快，在m o r r i s 水迷宫中的学习记忆能力显著下降( 黄辉等，2 0 0 2 ) 。大鼠出生后立即给予7 k m 间歇性低氧1 9 天( 8 小时天) 后，出生后2 3 3 2 天和1 0 0 - 1 0 9 天的水迷宫学习记忆能力比对照组明显下降( s i m o n o v ae ta l 一2 0 0 3 ) 。在我们先前的研究中，发现出生后间歇性低氧3 周或4 周可以促进新生小鼠的空间学习记忆能力，在w i t t n e r 的研究中也显示对新生小鼠或成年大鼠低压低氧能够促进动物空间学习记忆( w i t t n e ra n dr i h a 2 0 0 5 ) 。因此，低氧的方式、强度、时间、动物暴露于低氧的年龄不同以及不同的检测学习记忆的方法对学习记忆产生的影响是不同的，适度的低氧可以促进新生小鼠的学习记忆，这种不同是否和低氧激活的h p a 轴程度相关。本实验运用低压氧舱模拟海拔2 k m ( 1 6 o 0 2 ；p a 0 2 ，6 0 m m h g ) 和5 k m ( 1 0 8 0 2 ；p a 0 2 ，4 1 m m i - i g )低氧环境，研究不同程度间歇性低氧对空问学习记忆的影响，从g c 水平的变化，与空间学习记忆紧密相关的海马中g r 和s g k 的表达差异，来阐述低氧促进或损伤空间学习记忆的机制。糖皮质激素及其受体在低氧应激中的作用应激是指应激原破坏了机体内环境的稳态而引起的机体非特异性反应，主要应激原为外界环境的变化，精神心理因素，如抑郁、焦虑、情绪改变等。任何生理或者心理的刺激，只要达到一定的强度，都可以成为应激原。应激反应的基础是体内一系列神经内分泌免疫网络系统反应，其中下丘脑一垂体一肾上腺皮质( h p a ) 轴最为重要。人类和大多数哺乳动物糖皮质激素是皮质醇，鼠类则是皮质酮，在h ：p a 轴调控下由肾上腺皮质释放糖皮质激素具有广泛的组织和条件依赖特异性的生理功能，受昼夜节律和多种应激原调节，常常代表机体的应激程度。低氧作为一种外界刺激，无论是对新生或是成年动物都会激活i - w a 轴，使下丘脑释放c r f ，提高血浆皮质酮水平( c h e na n dd u ，1 9 9 6 ；w a n go ta 1 ，2 0 0 4 ；r a f te la 1 ，2 0 0 3 ；r a f t c ta 1 ，2 0 0 4 ) 。皮质类固醇受体有两种，分别是m r ( 1 型受体，盐皮质激素受体或者糖皮质激素高亲和受体) 、g r ( 2 型受体，糖皮质激素低亲和受体)( o d o n n e l le ta 1 ，1 9 9 4 ) ，近年研究证实g r 又可分为低亲和性和高亲和性g r 。两型受体被纯化克隆后，人们发现它们的一级结构具有相当高的同源性，特别是与激素及d n a 结合的那些结构域同源性更高。纯化和体外重组的m r 和g r 与g c都具有很高的亲和力，而且前者高于后者，但后者对地塞米松却有较高的亲和力。g r 广泛存在于脑内神经元和神经胶质细胞中，在海马、下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素( c r h ) 神经元和垂体促肾上腺皮质激素分泌细胞中最为丰富。m r的表达则较局限，主要存在于海马、外侧隔核、杏仁核、脑干内的部分核团及下丘脑调节水盐平衡和血容量的有关区域，其他脑区虽有m r 表达，但水平很低。海马与认知行为密切相关，其c a l 区的锥体细胞和齿状回( d e n t a t eg y m s ，d g ) 的颗粒细胞中的皮质激素结合位点晟丰富，而c a 3 区锥体细胞中的结合位点数i f l 最少。g r 的m t l n a e 海马的c a l 区和c a 2 区有强表达，而m r 的m r n a 则在海马的所有亚区中都有较高的表达，其中d g 的表达最为丰富，可见g c 同海马的联系非常密切的。糖皮质激素发挥生物效应主要通过一下途径：1 、糖皮质激素向受体的迁移程度；2 、细胞内受体分布和密度；3 、受体激活的类型( g r 和m r比例) ：4 、和细胞核因子结合的同源或异源二聚体的形成：5 、相关的目的基因片断。6 、g r 和m r 调节神经元核内不同片断基因，这些片断有交叉性( 赵刚和蔡定芳，2 0 0 2 ) a糖皮质激素及其受体对动物认知行为的影响糖皮质激素( g c ) 对神经兴奋性和认知行为的影响是通过大脑来实现的。海马被认为是与记忆形成密切相关的结构，而海马的长时程增强( l 1 曙) 则是衡量记忆的指标之一。g c 可以阻断大鼠海马中u 限效应的产生，聚氨酯麻醉的大鼠海马中产生l 1 限的幅度与循环中g c 的水平呈负相关。但d i a m o n d 等( d i a m o n dc ta 1 ，1 9 9 2 ) 的实验结果并不完全支持这一结论，在切除肾上腺的大鼠( a d x ) 皮下植入不同剂量的皮质酮缓释药片，测定海马l t p 效应与首次爆发增强( p b p ，u 四的初始形式) 水平，结果发现皮质酮剂量与l t p 之间的关系不是单纯的负相关，而是倒“u ”字曲线关系，即低剂量皮质酮对p b p 有正性作用，高剂量皮质酮则对p b p 有负性作用，在这两种剂量之间存在着一段峰值平台剂量区间，提示g c 对l t p 的影响呈剂量依赖性双相反应。g c 还可以直接影响认知行为。成年大鼠切除肾上腺后表现出空间记忆的缺失，随后在这些大鼠的饮水中加入皮质酮( 2 0 u g m 1 ) ，l o d 后这些大鼠的空间记忆又得到了恢复( m c c o r m i c ke ta 1 ，1 9 9 7 ) 。在年幼的f i s c h e r 鼠的皮下植入皮质酮缓释药片( 2 0 0 r a g 3 周，连续9 周) ，使鼠体内血浆g c 浓度始终维持在较高水平，停药3 周后发现其空间记忆力明显减退。以上结果表明g c 水平过低或过高都会损害动物的空间记忆能力( d a c h i re ta 1 ，1 9 9 3 ) 。新近的研究发现，过高的g c 水平能够抑制海马d g 和c a l 区脑源性神经营养因子( b r a i n d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r ，b d n f ) 的m r n a 表达及蛋白合成。其可能的机制是，高水平g c 可以活化g r ，g r 活化后能够同一些特异转录因子如a p l 、n f - r b 等相互作用并对其活性产生抑制作用，而b d n f 基因上有多个a p l的结合位点，b d n f 基因的表达需要这些转录因子的调控，因此高水平的g c 抑制了b d n f 的m r n a 表达，也就抑制了b d n f 蛋白的生成( s c h a a fe ta 1 ，2 0 0 0 ) ，进而损害认知能力和记忆形成( 孙刚等，2 0 0 2 ) 。+c or t t e x to fl e a r n i n gp a r a d i g mls t r g s o r su n r e l a t e d1 0l e a r n i n gp a r a d i g mjo fs y n a p t i cp l a s l i c 时o fi n p u t sa c t i v a t i n gi p t i o nf a c t o r sg rm rf i g u r e1 当海马中大部分m r s 被激活并且只有一部分g r s 被激活时，这时会促进l t p 的形成。譬如适度的刺激会促进学习记忆。当刺激强度过大时l t p 形成就会被抑制，同时l d p被促进形成。l t p 和l d p 的形成不仅仅依赖于皮质激素受体的活性，像突触可塑性或者其他刺激因素也会影响( d ek l o e te ta 1 ，1 9 9 9 )s g k 的生理作用及表达调节1 9 9 9 年s g k 作为一个糖皮质激素从a 6 细胞中分离了出来。s g k 是一个即刻早基因，在启动子中有一个糖皮质激素反应元件。s g k 作为一个醛固酮的下游调节因子，它可增加细胞表面e n a c 的表达而促进细胞对n a 离子的吸收。最近的研究发现，s g k 与人的n c d d - 4 起调节上皮对n a + 的吸收。s g k 通过与n c d d - 4 相互作用并使之磷酸化，n c d d 4 的磷酸化抑制其与d e n a c 的结合，从而促进细胞对n a 离子的吸收( c h c ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。2 0 0 3 年i m a i 等人( i m a ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 通过对大鼠卵细胞体外培养的方式，说明了钙离子的内流可以促进s g k 的表达，并且证实了这是通过c a - - c a m - - c a m 贼路。胰岛素可以使s g k ；在半小时后表达量升高1 0 倍，在加入了钙离子的鳌和剂b a p t a - - a m ，s g k 的表达和对照组相比就没有显著性差异。在培养基中加入增fi一ucqjgosocel8。lld爵呈田o1le|e正加钙离子内流的试剂( 1pm 的i o n o m y c i n 或者5pm 的t h a p s i g a r g i n ) 都会导致s g k 的表达量增高5 6 倍，这种升高不会被p b k 的阻滞剂( 1 0 0 n m 的w o r t m a n n i n )所抑制，但是w o r t m a n n i n 会抑制胰岛素引起的s g k 表达升高( k u m a r ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。s g k 会对一系列的外界条件的变化产生快速的反应，包括一些生长因子、内固醇、氨基酸激素、细胞因子( c y t o k i n c s ) 、细胞体积的变化和脑损伤。目前不清楚醛固酮在调节s g k 表达时，是通过促进e p i t h e l i a ls o d i u mc h a n n e l ( e n a c ) 开放还是e n a c 的数目增多，但是可以肯定的是醛固酮并非直接作用于e n a c 的基因转录( c h e nc ta 1 ，1 9 9 9 ) 来调节s g k 鲋j 表达。通过使用p c r 技术所建立的c d n a 3 库，发现了在a 6 细胞中s g k 会被地塞米松诱导，在大鼠肾单元中s g k 会被醛固酮( 5 0 u g l o o g ) 所诱导，后来在共表达实验中发现s g k 能够促进e n a c 的活性，2 0 小时后通过双极膜片钳观察发现，钠电流增加了六倍。研究发现来自小脑的神经元粒细胞，a k t 能, 够被4 种细胞存活因子所激活，包括高浓度的钾离子，i g f 一1 ( 2 5 n g m 1 ) ，c a m p 和t 睡( 1 0 m m ) ，进行免疫沉淀反应时发现一个4 9 k d a 的蛋白同样被以上4 种因子激活，经证实就是s g k ，这种激活是通过p 1 3 幻金径。在中枢神经系统中，损伤一侧顶叶到颞叶8 周的大鼠，在损伤部位的神经胶质细胞中发现s g k 有特异性表达，这种表达在1 4 天后都能保持一个很高的水平。该研究同时发现大鼠出生后第1 天和第7 天，s g k 表达水平比较高；而成年大鼠脑中表达量较低。原位杂交研究显示s g k 在皮层中表达是在海马的多形层，锥体细胞层，丘脑核的后外侧和背外侧，腹后外侧，后正中丘脑核团中表达量特别高。同时在少突细胞中s g k 的表达比较高，因此认为s g k 的基因产物可以促进轴突的生长。脑损伤后海马的c a 2 和c a 3 区，s g k 在锥形神经元中表达特别高，而这些神经元中糖皮质激素的受体水平也是很高的( i m a i z u m ie ta 1 ，1 9 9 4 ) 。在人肝h e p g 2 细胞中，促进s g k 基因转录的因子包括糖皮质激素、醛固酮、t g f - b1 、血清、钙离子内流以及p h o r b o l e s t e r s ，与此同时c a m p 能够降低s g k 基因的表达。在爪蟾卵细胞中，s g k 能够促进一些离子通道，包括钠通道e n a c ，n m “2 c l 协同转运系统。人肝肿瘤h e p g 2 f l t t 胞收缩使s g k 得到表达，即在高渗( 3 9 0m o s m o l l i t e r ) 的情况下s g k在3 0 分钟内就会得到显著性表达，反之则使s g k 抑制。研究表明s g k 基因表达不依赖于d en o v o 蛋白的合成( w a l d e g g e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。1 01 9 9 9 年研究者通过体外培养的方式，证实在家兔c c d ( r e n a lc o r t i c a lc o l l e c t i n gd u c t ) 细胞中，3 0 分钟醛固酮的刺激可以极大的诱导s g k m r n a 的表达，研究证实s g k ：是- - 个高度保守的基因，人和大鼠s g k 在核苷酸的水平上有8 8 一9 4 的同源性，在氨基酸水平上有9 6 一9 9 的同源性( n d r a y f e i e s - t 6 t he ta 1 ，1 9 9 9 ) 。s g k 是丝氨酸苏氨酸蛋白激酶的一个成员，和其他蛋白激酶不同的是，它主要是在转录水平上进行调节。有报道地塞米松( d e x a m e t h a s o n e ，一种人工合成的糖皮质激素) 能够迅速地诱导非洲爪蟾肾细胞( a 6 ) 中的s g k 基因的表达，原位杂交研究证实醛固酮能够诱导大鼠肾细胞中s g km r n a 的表达。一般认为，醛固酮是直接调节s g k 基因的表达的。在人体肝肿瘤细胞中，细胞的体积会改变s g k 基因的表达，就是体积缩小可以促进s g km r n a 表达，同时，细胞体积膨大的时候就减少s g km r n a 的表达。在人体的五种细胞的培养基上( 上皮细胞( h 4 4 1 ，t 8 4 和h t 2 9 ) 和淋巴单核细胞( u 9 3 7 和t h p 1 ) ) 添加地塞米松，发现s g k 在3 0 分钟内表达显著升高，能持续保持数小时，在2 4 j 、时后还能保持一个较高的水平。醛固酮虽然对g r 有一定的亲和力，但是醛固酮被证实是和m r 结合相作用的，g r 和m r 受体是在连续的基因序列上的( 糖皮质激素反应元件) 。随后f r a n c i n e 等人证实了在体内糖皮质激素也能够迅速诱导s g k 基因的表达，摘除肾上腺的大鼠注射醛固酮( 5 0 u g k g ) 、地塞米松( o 5 m g k g ) 、u 2 8 3 6 2 ( 0 5 m g k g )以及生胃酮钠( 8 0 m g k g ) 后，发现在注射了地塞米松的大鼠结肠末梢细胞中s g km r n a ； e 3 0 分钟后开始显著升高，2 h 后m 砌q a 达到最高，4 h 后还能保持一个很高的水平，而在肾细胞中在4 小时内一直保持一个很高的水平f f r a n c i n ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 。体外细胞培养研究证实，在事先注射蛋白质合成抑制剂( 放线菌酮) 并不会影响皮质类固醇对s g k 表达的影响，施以放线菌酮和地塞米松( a 6 细胞)或者放线菌酮和醛固酮( 结肠末梢细胞) ，会大大增强s g k 的表达，这就证实了s g k ；是- - 个直接由皮质激素所调节的。s g k 与学习记忆的关系2 0 0 2 年，k u e n 等人( k u e ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 首次阐述了s g k 与空间学习记忆固化作用的关系，通过行为学筛选方法、n o r t h e r nb l o t 和免疫组化等方法检测，发现在水迷宫中上台时间短的大鼠海马背根的s g k 的表达量是上台时间长的小鼠的4倍。还发现海马c a l 区载有野生型s g k 的质粒的大鼠，和空的载体以及载有突变型s g k 的质粒的大鼠相比，其水迷宫中的空间学习记忆表现明显优秀。这表明s g k 作为糖皮质激素诱导的激酶对动物豹认知行为有明显影响，并且是一种促进作用。大鼠空间记忆的固化能力直接与s g k 的表达量呈正相关。同时发现多样化环境刺激对大鼠空间学习的促进作用是和s g k 的表达相关的，实时r t - p c r 和w e , s t e m b l o t 的检测发现s g k 蛋白和m r n a 在海马都有显著性升高；他们发现这种环境刺激对s g k 的表达增强作用主要是通过a m p a 受体来调节的( k ee ta 1 2 0 0 3 ) ，第二章间歇性低氧对新生小鼠空间学习记忆的影响一系列实验表明，将新生大、小鼠，成年大鼠暴露于间歇性模拟海拔低压低氧会促进或者损伤动物的空间学习记忆能力( 黄辉等，2 0 0 2 ；s i m o n o v ae ta 1 2 0 0 3 ，z h a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 。模拟呼吸睡眠暂停综合症模型的间歇性低氧也会影响大鼠在水迷宫中的空间学习能力( r o w , 2 0 0 3 ；g o z a le t a l ，2 0 0 3 ) 。因此低氧对动物在水迷宫中的表现的影响和低氧暴露的阶段、强度、时间等密切相关。适度低氧可能会促进动物的空间学习记忆，当低氧强度过大，时间过长时产生损伤作用。本实验将新生雌性和雄性小鼠分别暴露于2 k m 或5 k m 间歇性( 4 小时天) 低氧1 4 周，观察其不同发育阶段小鼠空间学习记忆能力的变化。一、材料和方法1 动物所有i c r 小鼠由浙江省医学科学院实验动物中心提供( n o 2 0 0 1 0 0 1 ) 。给所有动物提供足够的食物和水。饲养环境明暗周期为1 2 ：1 2hf 光亮时间在0 7 ：0 0 一o1 9 ：0 0 ) ，室温控制在2 2 4 - 1c 。行为学实验在0 8 ：0 0 1 5 ：0 0 之间完成。低氧采用间歇性形式，每天4 小时，模拟海拔2 k m 和5 k m 高度。对照组设置在相当于海平面高度( 2 1 0 2 ) 。低氧暴露时间在0 8 ：0 0 1 2 ：0 0 。实验用新生小鼠在本实验室繁殖。种鼠购进后按雌：雄= 3 ：2 的比例进行交配。出生后，新生鼠立即和母鼠放置于低压氧舱中进行低氧暴露。新生小鼠分别低氧1 、2 、3 和4 周( i h 1 w 、i h 2w 、i h - 3 w 和i h 4 w ) 鉴于大鼠在出生后3 0 天记忆才发育成熟( c i m a d e v i l l ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 】。每组由4 只母鼠所产的幼鼠组成。在出生后第1 9 天断奶后，雄性幼鼠和雌性幼鼠分开饲养和进行实验。2 实验仪器和方法2 1 低氧模拟和分组用低压氧舱模拟高原低氧，用一真空泵不断补充新鲜空气，同时将舱内小鼠呼出的二氧化碳排出舱外造成模拟高原低压低氧环境。动物在舱内的光线、温度、湿度都与饲养环境相同，舱内有足够的食物和水。低氧组小鼠分为1 、2 、3 和4周，低氧暴露天数分别从p 2 2 p 2 8 ，p 1 5 p 2 8 ，p 8 p 2 8 ，p 1 p 2 8 。低氧暴露时间从8 ：0 0 ，1 2 ：0 0 ，每天4 小时。对照组放置在另一个相同形状和大小的舱内，不给予任何低氧。2 2 动物处理第一批小鼠在出生后第2 8 天低氧暴露结束，立即牺牲取血，离心后收集血浆，检测血浆皮质酮和雌性激素。同时剥离大脑海马区，左侧用于r t - p c r ，右侧用于w e s t e r nb l o t 检测。第二批动物从第2 8 天开始称量体重一直到第4 0 天。第3 5 天开放场测试和m w m 预适应，第3 6 3 9 天进行m w m 测试实验。2 3 开放场测试( o p e n f i e l d )o p e n f i e l d 是一个由不透明的有机玻璃制成的盒子( 5 0 5 0 x 3 0 厘米) 。盒子底部画成2 5 个面积相等的正方形，上方1 5 米的两盏4 0 w 日光灯照明。摄像头捕获小鼠的活动，图像传入计算机。在每次观察之前，小鼠被一个不透明的有机玻璃盒( 1 0 1 0 x 1 0 厘米) 罩住，5 秒钟后移去盒子，观察记录开始，记录时间为2 分钟。在每次观察间期，酒精纱布檫去上一个小鼠留下的气味。计算小鼠所走的内外方格数、爬壁次数及大便粒数。2 4m o r r i s 水迷宫m o r r i s 水迷宫( m o r r i sw a t e rm a z e ，m w m ) 为内面漆成黑色的铁制圆形水池，直径l m ，水深5 0 c m 。水温控制在2 2 1c ，水中加入黑墨水使之不透明。水池放置于木架上，离地面4 5 c m 高。一直径为1 0 e m 平台低于水面1c m 放在水迷宫一假想象限内。水迷宫置于隔音室内( 2 4 x 2 4 x 3 2 m ) ，室内设置的参照物有：实验人员，门，日光灯。小鼠的行为通过悬挂在水迷宫正上方的摄像头捕获进入计算机保存。在进行学习训练的前一天让小鼠在水迷宫中适应2 分钟。训练时，每只动物记录游泳时间为6 0 秒。小鼠找到水下站台后，让其在站台上停留1 5 秒。如果小鼠在6 0 秒未找到站台，由实验者引导到站台上。连续训练4 天，每天3 次，间隔1 小时，三次从不同假想象限把小鼠放入水迷宫中。第五天撤去站台后进行探测实验，记录其穿过先前站台所在位置的次数和小鼠在站台周围游泳路程( 以原站台中点为圆心，半径1 2 5 c m 的圆) 和总路程。利用d i g b e h v m w m 软件分析( 上海吉量1 4生物软件公司1 所得数据。t a b l e2 1t h es c h e d u l eo fe x p e r i m e n t a lp r o c e d u r eme x p o s u r eg r o u p1d e c a p i t a t e dp 2 2 _ 2 8m 1 w( i m m e d i a t e l yp 1 5 2 8知a f l c t 呻p 8 0 8i h - 3 wp 1 2 8m _ 4 wg r o u p 20 d w m t d 、g m u p3d e c a p i t a t e dd e c a p i t a t e d ( 2g r o u p 3 ：o p e np 3 6 - 3 9l e e m i n gr a i na f t e rf i d d ( 2 m l n ) 1 d ( 3 d )r c t c n t l o nt e s t )a d a p t a t i o nm1 3 5p 4 0r e k n t j ( 1 r a h )m ，i n t e r m i t t e n th y p o x i a ；l v l w m ，m o r r i sw a m rm a z e ；p ，p o s t n a t a ld a y ( s ) ；w ，w e e k ；d ，d a y 二、统计学分析所有数据都用s p s s ( v e r s i o n1 1 0c h i c a g o ，i lu s a ) 软件进行分析。水迷宫实验中小鼠寻找水下站台所用的路程( t e s td a y s x h y p o x i a ) ) 习t w o w a y a n o v a w i t hr e p e a t e dm e a s u r e s 分析组间差异。水迷宫中的探测实验) 及o p e n f i e l d 测试f h y p o x i a ) 用o n e - w a y a n o v a 分析。三、结果1 、间歇性低氧对新生小鼠o p e n f i e l d ( o f ) 行为的影响1 1 对雄性新生小鼠的影响在水迷宫测试前1 天进行的o p e l l f i e l d 观察中，与对照组比较，模拟海拔5 k m低氧3 周( p o 0 0 1 ) 和4 周( p 0 0 0 1 ) 的小鼠在o p e n f i e l d 中所走的格数明显减少。说明随着出生后低氧时间的延长，动物更容易习惯新环境( 1 曲l e2 2 ) 。1 a b l e2 2v & l u c sa r em e 姐s e m + p 0 0 5 ；p 0 0 1 + p o 0 0 1 v s c o n t r o l s 1 2 对雌性新生小鼠的影响和对照组相比，各项指标均没有显著性差异，所走的方格数和粪便粒数比对照组要少，但是没有显著性差异，低氧对雌性小鼠在o f 测试并没有造成显著性影响( t 曲l e2 3 ) 。1 a b l e2 3v f l u e sa r em e a n s e m + p 0 0 5 ；+ + p 0 0 1 + + + p 0 0 0 1 v s c o n t r o l s 2 、间歇性低氧对新生小鼠体重增长的影响2 1 对雄性新生小鼠体重增长的影响经低氧暴露的小鼠，在低氧结束后几天内体重和对照组相比明显减轻，但是随后体重逐渐恢复。通过单因子方差检验，发现以下各组和常氧对照组相比存在显著性差异：1 w 2 k i n ：p 3 7 ，p 0 0 5 ；1 w 5 k m ：p 2 8 ，p 0 0 5 ；p 2 9 ，p 0 0 5 ；p 3 0 ，p 0 0 5 ；p 3 4 ，p 0 0 5 ；2 w - 2 k i n ：p 2 8 ，p 0 0 5 ；2 w 一5 k m ：p 2 8 ，p 0 0 5 ；p 2 9 ，p 0 0 5 ；p 3 0 ，p 0 0 5 ；p 3 1 ，p 0 0 5 ；p 3 3 ，p 0 0 5 ；p 3 5 ，p 0 0 5 ；3 w 一2 k i n ：p 2 9 ，p 0 0 5 ；3 w 一5 k i n ：p 2 8 ，p 0 0 5 ；p 2 9 ，p 0 0 5 ；4 w - 2 k i n ：p 2 8 ，p 0 0 5 ；4 w 一5 k m ：p 2 8 ，p 0 0 0 1 ；p 2 9 ，p 0 0 1 ；p 3 0 ，p 0 0 1 ；p 3 1 ，p 0 0 5 。说明低氧抑制雄性小鼠的发育，但这种抑制作用随着低氧的结束而逐渐消失( t a b l e2 4 ) 。具体差异见下表( p 3 4 以后数据省略) ：t 曲l e 2 4v a l u e sa r em e a n s e m + p 0 0 5 ；p 0 0 1 ，p 0 0 0 l v s c o n t r o l s 2 2 对雌性新生小鼠体重增长的影响低氧影响明显雌性小鼠体重增长。通过单因子方差检验，发现在低氧1 w - 2 k m 组中，体重比对照组轻一直持续到p 4 0 。其他低氧组和雄性小鼠情况相似，在低氧结束后几天内体重和对照组相比明显减轻，但是随后体重逐渐恢复：1 w 2 k i n ：p 2 8 ，p 0 0 0 1 ；p 2 9 ，p 0 0 1 ；p 3 0 ，p 0 0 1 ；p 3 1 ，p 0 0 1 ；p 3 3 ，p 0 0 5 ；p 3 4 ，e 0 0 5 ；p 3 5 ，p 0 0 5 ；p 3 6 ，p 0 0 5 ；p 3 7 ，p 0 0 1 ；p 3 8 ，p 0 0 5 ；p 3 9 ，e 0 0 1 ；p 4 0 ，p 0 0 5 ；1 w - 5 k m ：p 2 8 ，p 0 0 1 ；p 3 4 ，p 0 0 5 ；2 w -